Summary
Descriviamo i metodi per la raccolta del polline corbicolare dalle api mellifere e i protocolli per la selezione dei colori, l'acetolisi e la preparazione del vetrino da microscopio del polline per l'identificazione tassonomica. Inoltre, presentiamo il colore del pellet e la diversità tassonomica del polline corbicolare raccolto da cinque sistemi di coltivazione utilizzando trappole per pollini.
Abstract
I ricercatori spesso raccolgono e analizzano il polline corbicolare dalle api mellifere per identificare le fonti vegetali su cui si nutrono di polline o per stimare l'esposizione ai pesticidi delle api attraverso il polline. Qui descritto è un efficace metodo di intrappolamento del polline per raccogliere il polline corbicolare dalle api mellifere che ritornano ai loro alveari. Questo metodo di raccolta si traduce in grandi quantità di polline corbicolare che può essere utilizzato per scopi di ricerca. Le api mellifere raccolgono il polline da molte specie vegetali, ma in genere visitano una specie durante ogni viaggio di raccolta. Pertanto, ogni pellet di polline corbicolare rappresenta prevalentemente una specie vegetale e ogni pellet di polline può essere descritto per colore. Ciò consente la selezione di campioni di polline corbicolare per colore per separare le fonti vegetali. I ricercatori possono classificare ulteriormente il polline corbicolare analizzando la morfologia dei grani di polline acetolizzati per l'identificazione tassonomica. Questi metodi sono comunemente usati negli studi relativi agli impollinatori come l'efficienza dell'impollinazione, le dinamiche di foraggiamento degli impollinatori, la qualità della dieta e la diversità. Vengono presentate metodologie dettagliate per la raccolta del polline corbicolare utilizzando trappole per pollini, la selezione del polline per colore e l'acetolisi dei grani di polline. Vengono inoltre presentati i risultati relativi alla frequenza dei colori del pellet e dei taxa di polline corbicolare raccolti dalle api mellifere in cinque diversi sistemi di coltivazione.
Introduction
L'ape mellifera occidentale (Apis mellifera L.) è un importante impollinatore di molte colture agricole che dipendono dall'impollinazione delle api1. Per più di un decennio, sono state segnalate significative perdite di colonie di apida miele 2,3,4,5,6,7,8,9. Diversi fattori, tra cui parassiti e malattie, cattiva alimentazione e pesticidi, sono stati implicati in questi declini delle colonie10. La cattiva alimentazione può essere attribuita all'intensificazione agricola e alla perdita dell'habitat di foraggiamento11. È imperativo comprendere le risorse floreali utilizzate dalle api in diversi paesaggi per migliorare la nutrizione delle api e aiutare negli sforzi di conservazione delle api. Il polline è la fonte primaria di proteine, lipidi, vitamine e minerali per le api ed è stato utilizzato in molti studi agricoli ed ecologici per comprendere le preferenze di foraggiamento a livello di colonia delle api mellifere, valutare l'impatto della cattura del polline sulle colonie di api da miele e determinare l'esposizione dei pesticidi alle api12,13,14.
Le api mellifere raccolgono il polline dai fiori, lo impacchettano in pellet sulla loro corbicula - un cesto di polline tibiale sulla zampa posteriore - e tornano alla colonia per lo stoccaggio. Il polline corbicolare può essere rimosso dai raccoglitori catturandoli all'ingresso dell'alveare o sui fiori, raffreddandoli brevemente per immobilizzarli e quindi rimuovendo i pellet di polline dalle zampe posteriori con una pinza. Il laborioso processo di raccolta manuale del polline corbicolare dai raccoglitori catturati individualmente è lento e inefficiente se si richiede una notevole quantità di polline. Un metodo più semplice ed efficiente per raccogliere grandi volumi di polline è intrappolare pellet di polline corbicolare dalle api mellifere agli ingressi degli alveari. Le trappole per pollini sono progettate per rimuovere il polline corbicolare dalle zampe dei raccoglitori di polline di ritorno quando entrano nell'alveare15. I raccoglitori devono spremere attraverso fori di rete che sono dimensionati per consentire il passaggio di un corpo operaio di api mellifere.
Mentre l'ape passa attraverso uno di questi fori, i pallini di polline più grandi vengono raschiati dalle sue gambe e cadono in un vassoio di raccolta16. Gli studi hanno dimostrato che l'intrappolamento del polline stimola i raccoglitori a raccogliere più polline, aumentando così l'efficienza di impollinazione delle colture e della vegetazione circostanti17,18,19,20. Le metodologie di raccolta del polline possono anche essere utilizzate per comprendere il foraggio utilizzato dalle api mellifere nel paesaggio come primo passo per determinare la quantità, la qualità e i taxa delle specie di piante da fiore. Efficaci metodologie di cattura del polline facilitano quindi sia l'impollinazione che la ricerca nutrizionale delle api. Un confronto tra questi metodi di raccolta del polline è illustrato nella tabella 1. Il comportamento di foraggiamento del polline cambierà in base alla necessità della colonia di polline immagazzinato rispetto ai livelli di popolazione di uova e larve21,22. Poiché questi cambiamenti includono intensità di raccolta variabili, è spesso prevista un'elevata variazione nella quantità di polline tra colonie nella stessa posizione e tra diverse posizioni dello stesso sistema di coltivazione o tipo di paesaggio23,24. Aumentare il numero di colonie e luoghi per intrappolare il polline aiuterà ad accogliere questa variazione.
Le trappole per pollini variano in efficienza25,26. La dimensione dei pellet di polline raccolti dalle api mellifere varia tra le specie vegetali e può cambiare in base ai livelli di depositi di polline nella colonia27,28. Ciò comporta la possibilità che i pellet di polline più piccoli siano sottorappresentati e i pellet più grandi siano sovrarappresentati nei campioni raccolti tramite trappole per pollini. Le api adulte variano nelle dimensioni del corpo, il che può anche influenzare la rappresentazione del polline raccolto nelle trappole. Ci sono anche specie vegetali che producono prevalentemente nettare che non verrà rilevato se solo si valuta il polline raccolto in alcuni paesaggi. L'efficienza di cattura è influenzata anche dalla deriva del raccoglitore e dal disorientamento, che è influenzato dal tipo di trappola del polline e dalle condizioni dell'attrezzatura dell'alveare. Questo problema può essere mitigato utilizzando le tecniche specificate in questo documento. I ricercatori possono prendere in considerazione ulteriori tecniche di ricerca, come il conteggio delle visite ai fiori da parte dei raccoglitori, per integrare i risultati delle preferenze di foraggiamento a livello di colonia. Un metodo utile per valutare la diversità del polline è ordinare il polline corbicolare per colore. Sebbene le api mellifere siano raccoglitrici generaliste, mostrano anche fedeltà ai fiori, dove raccolgono polline dalle stesse specie vegetali nella stessa posizione durante un determinato viaggio di raccolta. Sulla base di questo comportamento di foraggiamento, si presume che ogni dato pellet di polline corbicolare sia prevalentemente rappresentato da una singola specie vegetale 27,29,30,31. Quindi, gli scienziati possono descrivere la diversità del polline ordinando il polline corbicolare per colore del pellet e riportando il numero totale di colori rilevati o la proporzione del totale rappresentato da ciascun gruppo di colori 12,32,33,34. Ciò può essere ottenuto misurando la massa o il conteggio dei pellet di ciascun gruppo di colori. La misurazione del numero di pellet di ciascun gruppo di colori è suggerita se ci sono differenze sistematiche note o sospette nel peso dei pellet di diversi taxa. Le differenze sistematiche potrebbero essere causate dalle dimensioni del pellet o dalla quantità di nettare che i raccoglitori aggiungono al polline quando formano un pellet.
La selezione dei colori è un processo semplice ed efficiente in termini di tempo, ma potrebbe non avere un'accuratezza accettabile per alcuni studi di ricerca sull'impollinazione perché diversi taxa vegetali possono avere colori simili di pellet di polline35,36. Inoltre, esiste un limite logistico al numero di gruppi di colori distinti in cui è possibile separare le palline di polline. Pertanto, la separazione di ogni singolo polline del taxon vegetale nel proprio gruppo di colori del pellet distinto potrebbe non essere sempre possibile negli studi sull'impollinazione. La caratterizzazione morfologica dei granuli di polline tramite microscopia ottica spesso integra la separazione dei colori dei pellet distinguendo il polline di due o più taxa in pellet dello stesso gruppo di colori. Sebbene sia comune trovare granuli di polline di più taxa in un dato gruppo di colori di pellet di polline, i singoli pellet di polline raccolti da un'ape mellifera generalmente comprendono un taxon predominante, possibilmente con altri taxa in quantità minori. Pertanto, è comune assumere la fedeltà tassonomica nei pellet di polline corbicolare delle api mellifere. I pellet di polline di altri impollinatori che non mostrano un comportamento di fedeltà dei fiori, come i bombi, spesso contengono molte specie di piante e potrebbero non possedere un taxon predominante. Nei casi in cui sono richieste stime quantitative delle proporzioni dei taxa in pellet di polline polifloreale, sono inoltre necessari metodi microscopici che includono l'acetolisi per una corretta analisi.
La valutazione delle caratteristiche morfologiche dei grani di polline acetolizzati è il metodo più comune per l'identificazione tassonomica16. La procedura di acetolisi rimuove il protoplasma del granello di polline per esporre le caratteristiche diagnostiche che possono essere osservate al microscopio ottico37,38. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono riportare diversi taxa, frequenza di taxa trovati in specifici sistemi di coltivazione e taxa predominanti di colori pellet33,36. L'acetolisi è la migliore tecnica analitica per rivelare la morfologia del polline28. Tuttavia, alcuni grani di polline acetolizzati, come molti tipi di Rosaceae, non possono essere identificati a livello di genere o specie attraverso l'acetolisi e la microscopia ottica da soli. I ricercatori considerano la microscopia elettronica a scansione o il metabarcoding come metodi alternativi per ottenere l'identificazione a livello di genere o specie. Questi metodi alternativi, tuttavia, forniscono solo l'identificazione qualitativa dei taxon e non riescono a stimare le proporzioni dei diversi taxa di granelli di polline nei pellet di polline polifloreale36,39. Inoltre, la spesa e le competenze necessarie sono considerevolmente più elevate per questi metodi. Un confronto di questi metodi di identificazione è illustrato nella tabella 1.
| Metodi | Ore | Spesa | Risoluzione | Competenza |
| Raccolta pollini | ||||
| Intrappolamento del polline | Basso | Moderato | Variabile | Moderato |
| Raccolta raccoglitrice di pollini | Alto | Moderato | Alto | Basso |
| Identificazione del polline | ||||
| Visivo (solo ordinamento dei colori) | Moderato | Basso | Basso | Basso |
| Acetolisi | Moderato | Moderato | Moderato | Moderato |
| Microscopia elettronica a scansione | Alto | Alto | Alto | Alto |
| Metabarcoding | Variabile | Alto | Alto | Alto |
Tabella 1: Confronto tra diversi metodi di raccolta e identificazione del polline in base a tempi, spese, risoluzione e competenza. I metodi visivi (solo ordinamento dei colori) riportano il numero totale di colori rilevati o la proporzione del totale rappresentata da ciascun gruppo di colori come metrica per determinare le fonti di polline, ma non forniscono l'identificazione del taxon.
Le informazioni disponibili sulla cattura e la selezione del polline e sull'acetolisi dei granuli di polline sono diverse e spesso diffuse su più fonti, diverse per i ricercatori in diversi campi. Questo documento offre approfondimenti dettagliati sui diversi tipi di trappole per pollini che possono essere utilizzate sia dai ricercatori che dagli apicoltori per raccogliere efficacemente grandi volumi di polline corbicolare. Vengono inoltre forniti protocolli per la preparazione di campioni di polline - mediante acetolisi, colorazione e montaggio su vetrino - per l'identificazione dei taxa vegetali. Le metodologie qui descritte sono complete e servono come risorsa unica per identificare le specie vegetali predominanti su cui le api mellifere si nutrono in un determinato paesaggio, in particolare nei sistemi di coltivazione. I risultati basati su questi metodi di uno studio precedente sono stati presentati e documentano la diversità dei colori dei pellet di polline e dei taxa vegetali dal polline corbicolare raccolto dalle api mellifere in cinque sistemi di coltivazione14.
Protocol
1. Raccolta del polline corbicolare dalle colonie di api mellifere utilizzando trappole per pollini
- Determinare quando intrappolare il polline dalla posizione desiderata dell'apiario.
NOTA: Le condizioni climatiche ideali includono piena esposizione al sole, bassa velocità del vento, bassa umidità e nessuna precipitazione prevista durante il periodo desiderato per la raccolta del polline. - Seleziona le colonie di api da miele ottimali per intrappolare il polline all'interno della posizione dell'apiario.
- Valuta la forza della colonia contando i raccoglitori che ritornano all'ingresso della colonia per 2 minuti. Seleziona le colonie con il più alto numero totale di raccoglitori di ritorno.
- Seleziona alveari con stoviglie in buone condizioni, preferibilmente senza ingressi extra e coperchi deformati. Utilizzare colonie con meno ingressi alternativi in quanto hanno una maggiore probabilità di riportare i raccoglitori riorientandosi verso l'ingresso della trappola.
- Seleziona gli ingressi dell'alveare rivolti a sud quando possibile. Se gli alveari sono pallettizzati, installare trappole di polline su ogni colonia rivolta nella stessa direzione su un determinato pallet per evitare la deriva dei raccoglitori negli ingressi degli alveari vicini.
- Se lo si desidera, valutare il nido di covata della colonia ispezionando i telai per la presenza di larve. Seleziona colonie con quantità relativamente grandi di larve.
- Installare trappole per pollini sulle colonie di api da miele selezionate.
NOTA: l'installazione varia in base al tipo di trappola per pollini. I tipi includono a) montaggio frontale, b) montaggio inferiore, c) montaggio superiore o d) montaggio d'ingresso con foro a coclea. Vedere la sezione di discussione per i dettagli.- Per le trappole frontali, attaccare la trappola davanti all'ingresso con graffette, viti e nastro adesivo, oppure collegare la trappola alle corde elastiche avvolte attorno all'alveare. Per le trappole montate sul fondo, posizionare la trappola sotto la scatola dell'alveare più bassa e fissare l'ingresso della trappola vicino all'ingresso originale. Per le trappole per il montaggio a coclea, fissare la trappola direttamente davanti a un foro a coclea di una scatola alveare utilizzando graffette, viti e nastro adesivo. Per le trappole montate dall'alto, posizionare la trappola sopra la scatola dell'alveare superiore e sotto il coperchio.
- Sigillare tutti gli altri possibili ingressi nella colonia utilizzando materiale non adesivo e modellabile, come lattice o schiuma di poliuretano, o panno hardware #8 (apertura 2,7 mm) per fori a coclea. Utilizzare nastro adesivo per piccole crepe.
- Se si utilizzano trappole per montaggio frontale, posizionare una barriera, come un tappetino di gomma, tra il cestello di raccolta e l'erba per evitare danni da rugiada da umidità.
- Attivare il meccanismo di intrappolamento della trappola per pollini 24 ore dopo l'installazione e prima dell'inizio del volo di foraggiamento del giorno (tarda sera / mattina presto).
Nota : questo passaggio è ideale, ma non necessario. Attivare trappole di polline ogni due settimane se intrappolare il polline sulle stesse colonie durante un determinato periodo. - Raccogliere il polline corbicolare dal vassoio di raccolta, metterlo in sacchetti di plastica o provette da centrifuga e conservare in un refrigeratore con ghiaccio.
- Per valutare la diversità e l'abbondanza delle specie di polline, ad esempio studi nutrizionali a livello paesaggistico, raccogliere il polline in due o tre intervalli di 72 ore40.
- Per l'analisi dei residui di pesticidi, raccogliere il polline in intervalli da 24 ore a 96 ore con un minimo di 3 g per la lavorazione41.
- Pulire il polline rimuovendo parti di api e altri detriti dell'alveare.
NOTA: Utilizzare guanti monouso quando si maneggiano campioni di polline e cambiare i guanti monouso tra i campioni. Utilizzare strumenti separati per rimuovere i detriti dal polline raccolto in ogni trappola. Risciacquare e asciugare prima di utilizzare gli strumenti per un altro lotto di polline intrappolato. - Conservare il polline a -20 °C o inferiore per mantenerne l'integrità di composizione se il polline è destinato all'identificazione della fonte di polline, alla valutazione quantitativa o all'analisi dei residui di pesticidi41,42.
- Dopo aver rimosso le trappole dagli alveari, sterilizzare tutte le apparecchiature in una soluzione di candeggina al 5%, risciacquare e asciugare l'apparecchiatura prima del prossimo utilizzo.
2. Selezione dei colori dei pellet di polline per l'identificazione della fonte di polline a valle e la valutazione della quantità
- Assicurarsi che ci siano almeno 20 g di campione di polline con cui lavorare. Mescolare accuratamente il campione di polline nel suo sacchetto o in un altro contenitore di dimensioni adeguate per ottenere una miscela omogenea di tutti i pellet in esso contenuti. Per evitare distorsioni involontarie nel passaggio successivo, oscurare la composizione del colore del campione dalla vista prima di rimuovere un sottocampione dal sacchetto del campione.
- Usando uno scooper o un cucchiaio grande, raccogliere 10 g di polline come sottocampione rappresentativo del tutto. Versare lentamente i pellet dallo scooper sulla bilancia fino a quando il display non legge 10 g. Se il primo misurino non era abbastanza grande, recuperare un altro misurino dal campione allo stesso modo.
NOTA: questi requisiti di peso specificati (20 g e 10 g) servono solo come esempio. I ricercatori dovrebbero regolare la quantità di polline utilizzata in ogni fase in base alle esigenze specifiche. - Rimuovere tutte le parti dell'ape e altri detriti dal sottocampione da 10 g. Quindi, se necessario, aggiungere un po 'più di polline dal campione originale per ottenere un peso totale di 10 g del sottocampione.
- Ordinare ogni pellet di polline dal sottocampione da 10 g in un gruppo di colori. Usa sia il colore che la consistenza del polline per distinguere tra i gruppi di colori.
NOTA: è prevista una certa variazione all'interno di un gruppo, ma l'utilizzo della guida dei colori Pantone durante l'ordinamento può aumentare la coerenza. - Per garantire almeno 0,25 g di ciascun gruppo di colori per le fasi a valle, inserire i pellet che non sono abbastanza abbondanti da formare un gruppo di colori di almeno 0,25 g in un gruppo miscellaneo. Assegna un nome a ogni singolo gruppo di colori utilizzando la guida dei colori Pantone. Etichettare il gruppo miscellanea misc.
- Pesare ogni gruppo di colori su una carta da pesare separata e/o contare il numero di pellet in ciascun gruppo di colori. Registrare i nomi dei gruppi di colori e i pesi o i conteggi in un foglio dati.
NOTA: La scelta se pesare o contare il numero di pellet in ciascun gruppo di colori dipende dalla metrica di interesse del ricercatore e dagli obiettivi del progetto. - Creare un'etichetta per tubi di microcentrifuga per ciascun gruppo di colori utilizzando una penna resistente ai solventi e etichette per tubi di carta adesiva. Includi nell'etichetta la data corrente, l'identificatore del campione, la data di raccolta del campione e il numero del gruppo di colori. Applicare le etichette su provette da microcentrifuga da 2 ml pulite e asciutte.
- Pesare 0,25 g (± 0,05 g) di pellet di polline da ciascun gruppo di colori e posizionare questa quantità nel tubo di microcentrifuga opportunamente etichettato.
NOTA: Se c'è una leggera variazione di colore o consistenza nel polline di un determinato gruppo di colori, assicurarsi che vi sia un campione rappresentativo di pellet all'interno di ciascun tubo. I volumi del reagente e i tempi di incubazione e centrifugazione che seguono sono appropriati per 0,25 g di polline. Pertanto, utilizzare questa quantità di polline nelle provette della microcentrifuga da utilizzare in acetolisi. Questo protocollo dovrebbe fornire un ampio polline colorato per l'identificazione della fonte vegetale a valle mediante microscopia ottica. Se si utilizza una quantità diversa di polline in acetelisi, le specifiche del volume del reagente e dei tempi di lavorazione devono essere regolate di conseguenza. - Posizionare il polline rimanente di ciascun gruppo di colori in singoli sacchetti di plastica (un sacchetto per colore) etichettati con il nome del gruppo di colori. Conservare queste sacche con le altre parti del campione originale appropriato in un deposito a -20 °C.
- Mescolare accuratamente il polline nel tubo con uno stuzzicadenti di legno pulito per 10-15 s.
3. Preparazione per acetolisi
- Prima di iniziare qualsiasi parte dell'acetolisi per la prima volta, contattare il dipartimento di salute e sicurezza ambientale (EHS) dell'istituzione designata per istruzioni su come devono essere gestiti i reagenti e i rifiuti correlati all'acetolisi.
- Ottenere soluzioni madre dei seguenti reagenti e metterli nella cappa aspirante in conformità con le linee guida EHS per lo stoccaggio chimico: 95% di etanolo; acqua distillata; acido acetico glaciale, anidro; acido solforico concentrato; glicerina; e smalto trasparente.
- Preparare le soluzioni madre dei seguenti reagenti e metterle nella cappa aspirante in conformità con le linee guida EHS per la conservazione chimica: bicarbonato di sodio saturo (soluzione all'8% p/v in acqua distillata); e safranina O (soluzione all'1% p/v in etanolo al 50%).
4. Acetolisi
- Eseguire la procedura di pre-acetolisi del lavaggio dell'acido acetico glaciale. Eseguire i seguenti passaggi all'interno della cappa aspirante con camice da laboratorio, protezione per gli occhi e guanti in nitrile.
- Portare un blocco termico a 80 °C.
NOTA: Assicurarsi che un flacone di bicarbonato di sodio saturo sia facilmente accessibile. Questo può essere usato per neutralizzare le fuoriuscite di acido nella cappa aspirante se si verificano. - Etichettare un bicchiere di vetro per i rifiuti acidi, uno per i rifiuti di etanolo e uno per la miscela di acetolisi.
- Utilizzando soluzioni madre precedentemente preparate, creare aliquote di lavoro dei seguenti reagenti in becher di vetro etichettati e di dimensioni appropriate: ~23,0 ml di acido acetico glaciale; ~33,0 ml di acqua distillata; ~ 23,0 ml di etanolo al 95%; ~25,0 ml di bicarbonato di sodio (per rifiuti solidi contaminati da acidi).
NOTA: Questi sono i volumi necessari per completare le seguenti procedure di acetolisi su un totale di 10 campioni di gruppi di colore (10 provette per microcentrifuga). - Aggiungere lentamente 500 μL di acido acetico glaciale a ciascuna provetta da microcentrifuga contenente 0,25 g di polline del gruppo di coloranti. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare il polline con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato. Posizionare lo stuzzicadenti usato nel becher di rifiuti di bicarbonato di sodio dopo l'uso; Ripeti questo processo per ogni tubo.
NOTA: Utilizzare uno stuzzicadenti nuovo e pulito per ogni tubo. Assicurarsi che il coperchio di ciascun tubo sia ben chiuso. - Centrifugare i campioni per 3 minuti a 1.100 × g. Decantare il surnatante dai tubi nel becher di scarico acido. Quindi, toccare delicatamente e brevemente la bocca aperta del tubo con un tovagliolo di carta pulito per rimuovere l'acido acetico glaciale residuo attorno al bordo del tubo.
NOTA: Fare attenzione a non perdere il pellet di polline durante la decantazione dei surnatanti .
- Portare un blocco termico a 80 °C.
- Eseguire la procedura di acetolisi.
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi all'interno della cappa aspirante con camice da laboratorio, protezione per gli occhi e guanti in vinile butilico.- Preparare la miscela di acetolisi (acido acetico glaciale 9:1:1:acido solforico) aggiungendo prima 10,8 ml di acido acetico glaciale (dall'aliquota di lavoro) alla miscela di acetolisi marcata con becher. Quindi, utilizzando una pipetta da 1000 μL dotata di puntali filtrati da 1250 μL, aggiungere lentamente 1200 μL (1,2 ml) di acido solforico concentrato dalla soluzione madre al becher della miscela di acetolisi contenente acido acetico glaciale. Gettare la punta della pipetta usata nel becher di bicarbonato di sodio.
NOTA: il becher della miscela di acetolisi può diventare caldo al tatto e la miscela può ingiallire. Ci sono due possibilità che fanno sì che la miscela diventi di colore scuro: (a) i reagenti possono aver superato le loro date di scadenza, o (b) potrebbe essere stato aggiunto troppo acido solforico. In ogni caso, se la miscela diventa scura, gettarla nel becher di rifiuti acidi e preparare una miscela di acetolisi fresca. - Mescolare delicatamente la miscela di acetolisi con una bacchetta di vetro o un bastoncino di legno per assicurarsi che sia omogeneizzato. Posizionare l'asta/bastoncino usato nel becher di bicarbonato di sodio.
- Utilizzando una pipetta da 1000 μL con punte filtrate da 1250 μL, aggiungere lentamente 1000 μL di miscela di acetolisi dal becher a ciascun tubo. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato. Posizionare lo stuzzicadenti usato nel becher di rifiuti di bicarbonato di sodio dopo l'uso.
NOTA: Utilizzare uno stuzzicadenti nuovo e pulito per ogni campione. - Posizionare i campioni sul blocco termico preriscaldato (80 °C). Incubare i tubi per 5 minuti, mescolando accuratamente ogni tubo con uno stuzzicadenti pulito a metà dell'incubazione. Posizionare ogni stuzzicadenti usato nel becher di bicarbonato di sodio dopo l'uso.
NOTA: Non lasciare stuzzicadenti nei campioni; L'acido li dissolverà.
- Preparare la miscela di acetolisi (acido acetico glaciale 9:1:1:acido solforico) aggiungendo prima 10,8 ml di acido acetico glaciale (dall'aliquota di lavoro) alla miscela di acetolisi marcata con becher. Quindi, utilizzando una pipetta da 1000 μL dotata di puntali filtrati da 1250 μL, aggiungere lentamente 1200 μL (1,2 ml) di acido solforico concentrato dalla soluzione madre al becher della miscela di acetolisi contenente acido acetico glaciale. Gettare la punta della pipetta usata nel becher di bicarbonato di sodio.
- Eseguire la procedura di lavaggio dell'acido acetico glaciale post-acetolisi.
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi nella cappa aspirante con camice da laboratorio, protezione per gli occhi e guanti in vinile butilico.- Aggiungere lentamente 500 μL di acido acetico glaciale a ciascun tubo. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato. Posizionare lo stuzzicadenti usato nel becher di bicarbonato di sodio dopo l'uso.
NOTA: Utilizzare uno stuzzicadenti nuovo e pulito per ogni campione. Assicurarsi che il coperchio di ciascun tubo sia ben chiuso. - Centrifugare i campioni per 3 minuti a 1.100 × g. Decantare il surnatante da ciascun tubo nel becher di scarico acido. Quindi, toccare delicatamente e brevemente la bocca aperta del tubo con un tovagliolo di carta pulito per rimuovere l'acido residuo attorno al bordo del tubo.
- Risciacquare accuratamente i guanti in vinile butilico sotto l'acqua corrente per almeno 30 secondi, rimuoverli e metterli ad asciugare.
NOTA: Seguire le linee guida del produttore sul riutilizzo dei guanti in vinile butile.
- Aggiungere lentamente 500 μL di acido acetico glaciale a ciascun tubo. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato. Posizionare lo stuzzicadenti usato nel becher di bicarbonato di sodio dopo l'uso.
- Eseguire tre risciacqui con acqua per ogni campione. Eseguire i seguenti passaggi all'interno della cappa aspirante con camice da laboratorio, protezione per gli occhi e guanti in nitrile.
- Aggiungere 1000 μL di acqua distillata dal becher dell'acqua distillata a ciascun tubo. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato. Posizionare lo stuzzicadenti nel becher di rifiuti di bicarbonato di sodio dopo l'uso.
NOTA: Utilizzare uno stuzzicadenti nuovo e pulito per ogni campione. Assicurarsi che il coperchio di ciascun tubo sia ben chiuso. - Centrifugare i campioni per 3 minuti a 1.100 × g. Decantare il surnatante dai tubi nel becher di bicarbonato di sodio. Quindi, toccare delicatamente la bocca aperta del tubo con un tovagliolo di carta pulito per rimuovere l'acqua residua attorno al bordo del tubo.
- Ripetere i passaggi 4.4.1-4.4.2 altre due volte per un totale di tre risciacqui con acqua.
- Aggiungere 1000 μL di acqua distillata dal becher dell'acqua distillata a ciascun tubo. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato. Posizionare lo stuzzicadenti nel becher di rifiuti di bicarbonato di sodio dopo l'uso.
- Eseguire il risciacquo dell'etanolo per ciascun campione.
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi all'interno della cappa aspirante con camice da laboratorio, protezione per gli occhi e guanti in nitrile.- Utilizzando una pipetta da 1000 μL con puntali filtrati da 1250 μL, aggiungere 1000 μL di etanolo al 95% dal becher di etanolo a ciascun tubo. Gettare la punta della pipetta nei rifiuti non pericolosi. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato.
NOTA: Posizionare lo stuzzicadenti nel becher di rifiuti di bicarbonato di sodio dopo l'uso. Usa uno stuzzicadenti nuovo e pulito per ogni campione. Assicurarsi che il coperchio di ciascun tubo sia ben chiuso. - Centrifugare i campioni per 3 minuti a 1.100 × g. Decantare il surnatante dai tubi nel becher di scarto dell'etanolo e toccare delicatamente la bocca aperta del tubo con un tovagliolo di carta pulito per rimuovere l'etanolo residuo dal tubo.
- Utilizzando una pipetta da 1000 μL con puntali filtrati da 1250 μL, aggiungere 1000 μL di etanolo al 95% dal becher di etanolo a ciascun tubo. Gettare la punta della pipetta nei rifiuti non pericolosi. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato.
- Indossare camice da laboratorio, protezione per gli occhi e guanti in nitrile per macchiare i campioni. Mescolare la soluzione madre di colorante Safranin O utilizzando un'inversione delicata.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica monouso, aggiungere 5-10 gocce di colorante Safranin O a ciascun tubo. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato. Lasciare lo stuzzicadenti nel tubo.
- Utilizzando una pipetta da 1000 μL con puntali filtrati da 1250 μL, aggiungere 1000 μL di etanolo al 95% dal becher di etanolo a ciascun tubo. Gettare la punta della pipetta nei rifiuti non pericolosi. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare con lo stuzzicadenti per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato. Posizionare lo stuzzicadenti usato nei rifiuti non pericolosi dopo l'uso.
- Assicurarsi che il coperchio di ciascun tubo sia ben chiuso. Centrifugare per 3 min a 1.100 × g. Decantare il surnatante nel becher di scarto di etanolo.
NOTA: Questa volta non toccare la bocca del tubo con un tovagliolo di carta. - Aggiungere 10-15 gocce di glicerina a ciascun tubo utilizzando una pipetta di trasferimento usa e getta in plastica. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare il contenuto del tubo con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 secondi e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato.
NOTA: Posizionare lo stuzzicadenti usato nei rifiuti non pericolosi dopo l'uso. Usa uno stuzzicadenti nuovo e pulito per ogni campione. Assicurarsi che tutte le etichette dei tubi siano leggibili.
- Lasciare i tubi aperti nella cappa aspirante per far evaporare l'etanolo per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Controllare i campioni per l'odore di etanolo: se è rilevabile, i campioni non sono pronti e devono essere lasciati asciugare fino a quando l'odore di etanolo non si dissipa.
- Pulire tutti i materiali e smaltire i rifiuti. Spegnere sia la centrifuga che il blocco termico. Smaltire tutti i rifiuti solidi e liquidi in conformità con le linee guida sulla salute e la sicurezza ambientale dell'istituzione designata.
- Preparare vetrini da microscopio per l'identificazione del polline; etichettarli in modo leggibile. Etichettare un vetrino da microscopio in vetro pulito in modo appropriato per ogni gruppo di colori / campione che verrà montato. Durante l'ispezione visiva del tubo, mescolare il campione con uno stuzzicadenti pulito per 10-15 s e assicurarsi che il contenuto del tubo sia accuratamente miscelato.
NOTA: La preparazione delle diapositive può essere eseguita al banco di laboratorio. Gettare lo stuzzicadenti nei rifiuti non pericolosi. Usa uno stuzzicadenti nuovo e pulito per ogni campione.- Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica usa e getta pulita, rimuovere 1 goccia di residui di polline da un tubo e posizionarla al centro del vetrino del microscopio etichettato. Lasciare che la goccia si diffonda leggermente. Posizionare un coprivetrino pulito sopra la goccia sulla diapositiva.
- Dopo che il vetrino si è asciugato, sigillare il vetrino con smalto trasparente. Posizionare una piccola goccia di smalto su ogni angolo del coprivetrino e dipingere un bordo di smalto attorno al perimetro del vetrino in cui incontra il vetrino. Lasciare asciugare completamente lo smalto e dipingere una seconda mano di smalto attorno al perimetro della vetrina.
Representative Results
Uno studio precedente ha riportato la valutazione della diversità del polline raccolto dalle api mellifere nelle seguenti colture agricole: mandorla, ciliegia, mirtillo highbush, carota ibrida e meadowfoam14. Utilizzando i metodi descritti, è stato raccolto il polline corbicolare, ordinato per colore e identificate le fonti vegetali di ciascun gruppo di colori del pellet per valutare la diversità del polline. Le trappole per pollini montate sul fondo sono state installate su colonie in più siti per ogni coltura (Figura 1A). La quantità di polline raccolta da ciascun sito era sufficiente per soddisfare i requisiti di peso del campione dei metodi di selezione del colore e analisi dell'acetolisi. Ogni campione di raccolta di polline aveva più gruppi di colori distinguibili (Figura 2 e Figura 3). In alcuni campioni, i gruppi di colore del polline contenevano solo 4-5 pellet; tuttavia, la maggior parte dei gruppi aveva significativamente più di questo e quindi serviva come proprio gruppo di colori etichettato per l'acetolisi (Figura 4 e Figura 5). Dopo l'acetolisi (Figura 6), è stata utilizzata la microscopia a luce a campo chiaro per identificare efficacemente ciascun gruppo di colori al suo rango tassonomico più basso possibile, confermando le caratteristiche morfologiche con quelle dei campioni di voucher raccolti dall'area circostante ciascun sito di studio (Figura 7).
Figura 1: Trappole per pollini installate su una colonia di api mellifere per raccogliere il polline corbicolare. (A) Trappole montate sul fondo poste sopra la tavola inferiore dell'alveare e direttamente sopra la scatola dell'alveare più bassa. Altri stili di trappole per pollini includono (B) trappole per montaggio frontale e (C) per montaggio all'ingresso con foro a coclea. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Meccanismo di intrappolamento e vassoio di raccolta della trappola per pollini. I raccoglitori di polline di ritorno devono spremere attraverso il meccanismo di intrappolamento della rete prima di raggiungere il loro alveare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Vassoio di raccolta della trappola per pollini. Il polline corbicolare viene raschiato dalle zampe dei raccoglitori di polline di ritorno dalla trappola del polline e cade nel vassoio di raccolta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Ordinamento di un campione di polline corbicolare in gruppi di colori. Il polline corbicolare può essere essiccato e pesato dopo essere stato ordinato in gruppi di colori per segnalare le proporzioni di diversi pellet di colore raccolti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Quattro gruppi di pellet di polline ordinati per colore utilizzando la guida cromatica Pantone. I gruppi di colori sono etichettati come (A) grigio, Pantone 5855C, (B) marrone, Pantone 7557C, (C) giallo, Pantone 458C e (D) marrone chiaro, Pantone 3547C. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Configurazione dell'apparecchiatura di acetolisi all'interno della cappa aspirante. Il blocco termico, i reagenti, i contenitori dei rifiuti solventi e dei rifiuti acidi, i becher etichettati, le pipette, le punte delle pipette, i bastoncini di agitazione e i tubi della microcentrifuga situati all'interno della cappa aspirante. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Micrografia dei grani di polline colorati e acetolizzati. Molte sfaccettature di senape acetolizzata (Brassicaceae) grani di polline con ingrandimento 40x. Barra di scala = 50,398 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Il polline raccolto dai luoghi di coltivazione delle mandorle aveva una diversità di polline relativamente inferiore rispetto al polline raccolto da altre colture, con una media di 3,0 ± 0,5 colori di pellet e 3,2 ± 1,2 taxa vegetali per sito (Tabella 2) 14. I restanti quattro sistemi di coltivazione avevano livelli di diversità del polline più elevati con una media di 6,0 ± 2,0 colori del pellet e 8,0 ± 1,5 taxa di piante per sito in ciliegio, 8,8 ± 1,4 colori di pellet e 13,5 ± 2,0 taxa di piante per sito in mirtillo highbush, 7,0 ± 1,0 colori di pellet e 11,0 ± 0,0 taxa di piante per sito in carota ibrida e 10,0 ± colori di pellet e 13,0 ± 1,5 taxa di piante per sito in meadowfoam14.
| Raccolto | Numero medio di colori/sito di pellet di polline (SE) | Numero medio di taxa/siti vegetali (SE) | Totale taxa identificati | ||
| Famiglia | Genere | Specie | |||
| Mandorla | 3.0 (0.5) | 3.2 (1.2) | 4 | 3 | 4 |
| Mirtillo | 8.8 (1.4) | 13.5 (2.0) | 5 | 10 | 13 |
| Carota | 7.0 (1.0) | 11.0 (0.0) | 3 | 5 | 6 |
| Ciliegia | 6.0 (2.0) | 8.0 (1.5) | 4 | 7 | 5 |
| Schiuma di prato | 10.0 (0.0) | 13.0 (1.5) | 5 | 4 | 14 |
Tabella 2: Diversità del polline corbicolare raccolto dalle api mellifere in cinque sistemi colturali. Le metriche di diversità includono il numero medio di colori del pellet (± SE), il numero medio di taxa vegetali (± SE) e i taxa totali identificati. Questa tabella è stata modificata da14. Abbreviazione: SE = errore standard.
Discussion
Diversi stili di trappole per pollini hanno i loro vantaggi e conseguenze. I vantaggi e i limiti di quattro stili di trappola comunemente usati, (1) montaggio frontale, (2) montaggio inferiore, (3) foro a coclea e (4) trappole per pollini montate in alto sono discussi di seguito. Le trappole per montaggio frontale sono lo stile più versatile (Figura 1B). L'installazione è semplice e veloce; può essere fatto senza sollevare scatole alveari e queste trappole possono adattarsi a qualsiasi tipo di attrezzatura per alveari in stile Langstroth. Poiché il vassoio di raccolta si trova di fronte alla colonia, raccoglie detriti minimi dalla colonia. Tuttavia, il vassoio di raccolta è anche più esposto agli elementi esterni: l'umidità dovuta all'irrigazione dei campi, al clima piovoso o umido o alla rugiada può entrare in contatto con il polline attraverso il vassoio di raccolta, rendendo potenzialmente il polline inutilizzabile se i pellet diventano troppo saturi per separarsi. Il rischio di saturazione del polline può essere ridotto evitando l'intrappolamento durante gli eventi previsti di pioggia o umidità elevata. Posizionare un tappetino di gomma sotto la trappola e materiale di copertura extra (ad esempio, feltro per tetti) sopra la trappola di polline può anche proteggere il vassoio di raccolta dalle intemperie.
Le trappole montate sul fondo sono state utilizzate per raccogliere il polline per i dati in questo documento (Figura 1A). Non sono così convenienti da installare perché devono essere posizionati sotto il nido di covata della colonia. L'installazione richiede molto tempo e si traduce in un elevato volume di detriti che cadono nella trappola dalla colonia, come parti di api e piccoli pezzi di cera. Il pavimento del vassoio di raccolta per la maggior parte delle trappole di montaggio inferiore prodotte è realizzato in rete sottile, che consente una corretta ventilazione per proteggere il polline raccolto dall'umidità. Le trappole per pollini con foro di coclea aiutano a ridurre al minimo il disorientamento delle bottinatrici se usano principalmente fori a coclea come ingressi dell'alveare invece dell'ingresso fatto dalla tavola inferiore dell'alveare (Figura 1C). Poiché il vassoio di raccolta per le trappole di polline a coclea è molto piccolo, deve essere svuotato frequentemente per evitare il trabocco del vassoio di raccolta. Data la sua posizione superiore su un alveare, la trappola per pollini montata in alto è lo stile di trappola più semplice da installare e rimuovere e il campione di polline raccolto è privo di detriti dell'alveare. Tuttavia, questo stile di trappola è estremamente sensibile alle attrezzature dell'alveare danneggiate poiché il vassoio di raccolta sarebbe esposto all'umidità se il coperchio, il coperchio interno e la scatola dell'alveare superiore non sono adeguatamente sigillati insieme.
I protocolli qui descritti richiedono la selezione di colonie con grandi popolazioni adulte e larvali (fase 1.2). Questo metodo di selezione ha lo scopo di produrre grandi quantità di polline intrappolato da queste colonie. Le colonie con consistenti popolazioni di foraggiamento possono sperimentare una forte congestione all'ingresso al momento dell'installazione della trappola. La selezione di un grande ingresso dell'alveare allevierà la congestione. Le grandi popolazioni di foraggiamento possono anche raccogliere grandi quantità di polline che possono superare i limiti del vassoio di raccolta. Utilizzare vassoi di raccolta voluminosi, come si è visto con la maggior parte degli stili di trappola montati in basso o in alto, e vassoi vuoti frequentemente per accogliere grandi quantità di polline intrappolato. Se l'obiettivo della ricerca desiderato è quello di valutare le quantità di polline raccolte dalle colonie in un apiario, selezionare colonie rappresentative invece di ottimizzare le popolazioni adulte e larvali per la selezione. Tutti gli stili di trappole per pollini bloccano l'ingresso dell'alveare e creano un nuovo ingresso che differisce spazialmente dall'ingresso originale16. Le trappole per pollini comunemente non riescono a raccogliere il polline quando i raccoglitori non sono in grado di riorientarsi verso il nuovo ingresso della trappola per pollini al momento dell'installazione. Questi raccoglitori si spostano facilmente verso gli alveari vicini, potenzialmente contaminando altri campioni di raccolta del polline se entrano in un altro alveare con una trappola di polline. Pertanto, i raccoglitori dovrebbero avere almeno 24 ore per acclimatarsi al nuovo ingresso mantenendo il meccanismo di intrappolamento disinnestato dopo l'installazione. La selezione di colonie con pochi o nessun ingresso aggiuntivo dell'alveare riduce anche la confusione quando ci si orienta verso il nuovo ingresso della trappola di polline.
Ulteriori ingressi dell'alveare (ad esempio, fori e coperchi deformati) dovrebbero essere sigillati, ma il rischio che i raccoglitori si spostino verso gli alveari vicini aumenterà con questi ingressi presenti all'inizio dell'installazione della trappola. I raccoglitori andranno facilmente alla deriva anche in altri ingressi dell'alveare se una trappola per pollini è installata solo su un singolo alveare in un gruppo di alveari pallettizzati. I raccoglitori hanno meno probabilità di andare alla deriva se tutti gli alveari che si trovano nella stessa direzione sul pallet hanno trappole installate. Le trappole per pollini montate in alto possono comportare un rischio maggiore di deriva delle api a causa della notevole distanza tra l'ingresso della trappola di polline e l'ingresso originale dell'alveare. Per questo studio, sono state installate trappole per pollini su più colonie di api mellifere in ogni luogo sperimentale per tenere conto della variazione della quantità di polline e della composizione dei taxa tra ciascuna colonia di api mellifere. Pertanto, le trappole di polline dovrebbero essere installate su più colonie per ottenere robuste raccolte di polline dal paesaggio perché la raccolta del polline può variare ampiamente tra le colonie in base al tipo di specie vegetale e alla quantità totale raccolta12,13. Ogni campione di polline ha avuto un periodo di raccolta di 7 giorni. In studi futuri, la raccolta del polline in due o tre intervalli consecutivi di 72 ore aumenterà l'accuratezza della stima del foraggio pollinico40.
Poiché vi è un alto grado di fluttuazione temporale nella raccolta del polline, l'accuratezza della stima del polline potrebbe essere aumentata ripetendo il processo di raccolta del polline nei periodi di fioritura precoce, di picco e tardiva dei sistemi di coltivazione mirati24,27,39. Il polline dovrebbe essere raccolto da più luoghi, anche se con lo stesso sistema di coltivazione o tipo di paesaggio, a causa della variazione prevista nella quantità e nel tipo di specie vegetali tra le posizioni degli apiari 14,27,33,43. L'intrappolamento del polline a lungo termine può essere dannoso per le colonie di api da miele. I potenziali impatti includono la riduzione dell'allevamento delle covate, l'accorciamento del periodo di crescita larvale e il cannibalismo delle uova e delle giovani larve negli alveari 19,44,45,46. Periodi più lunghi di cattura del polline, come l'intera stagione di crescita, possono peggiorare gli effetti dannosi sull'allevamento delle covate nelle colonie. L'intrappolamento del polline può anche causare una riduzione della produzione di miele e un aumento del livello di umidità del miele immagazzinato13. La rotazione delle trappole di polline tra le colonie in un apiario durante il monitoraggio continuo di un paesaggio o di un sistema di coltivazione potrebbe mitigare i danni alle colonie utilizzate per l'intrappolamento del polline. Attivare trappole per pollini a settimane alterne ridurrà gli impatti dannosi, in particolare la perdita nella produzione di miele, se intrappola il polline sulle stesse colonie per un periodo di tempo13.
Inoltre, le trappole di polline sono preferibilmente posizionate su colonie forti. Occasionalmente, le trappole di polline possono impegnarsi involontariamente. Ciò potrebbe essere evitato bloccando il meccanismo della trappola del polline quando non si desidera la raccolta della trappola del polline. Le trappole per pollini non rimuovono tutto il polline corbicolare dalle bottinatrici delle api da miele. L'efficienza di cattura dipende dal tipo di trappola, dalle dimensioni del pellet di polline, dalle dimensioni del corpo delle api, dall'ora del giorno e dalle condizioni meteorologiche. Pertanto, la raccolta corbicolare del polline non è coerente quando si utilizzano trappole per pollini per diverse specie vegetali e periodidi raccolta 25,26. I pellet di polline più piccoli provenienti da piante come Eucalyptus spp. e Tamarix spp. hanno meno probabilità di essere catturati dalle trappole di polline27. In particolare, nessun polline di mirtillo highbush (Vaccinium corymbosum L.) è stato trovato dai siti di raccolta dei mirtilli highbush in questo studio, che supporta prove precedenti che i pellet di polline di mirtillo highbush sono troppo piccoli per la raccolta di trappole di polline47. Al contrario, il polline proveniente dal dente di leone (Taraxacum officinale F.H. Wigg) è stato trovato in ogni sistema di coltivazione in questo studio. I pellet di polline di alcune specie vegetali possono anche essere molto più grandi di altri, come Taraxacum spp., e potrebbero essere sovrarappresentati nell'analisi delle raccolte di polline dalle trappole di polline27. La cattura di singoli raccoglitori di polline e la rimozione manuale del loro polline corbicolare aumenterà l'accuratezza di una valutazione della fonte di polline, ma è molto dispendiosa in termini di tempo e risorse rispetto all'uso di trappole per pollini (Tabella 1). Ordinare i pellet di polline in gruppi di colori è relativamente semplice, anche se richiede molto tempo. A meno che non vi sia un obiettivo o un obiettivo di ricerca specifico, la quantità di pellet di polline dovrebbe essere limitata a 10 g o meno (per un dato campione) per la classificazione in gruppi di colori. La selezione di interi campioni che contengono quantità superiori a questa quantità aumenterà drasticamente il tempo necessario per completare l'analisi. Tuttavia, è fondamentale che un campione di polline sia molto ben miscelato prima che venga prelevato un sottocampione per la selezione dei colori. La mancata miscelazione del campione originale può comportare un sottocampione non rappresentativo dell'insieme, che dovrebbe essere evitato.
Se il contenitore originale del campione non contiene abbastanza spazio libero per consentire una miscelazione accurata dei pellet di polline, dovrebbe essere sufficiente collocare l'intero campione in un grande sacchetto di plastica o in un piccolo sacchetto di carta, anche per campioni di grandi dimensioni. Funzioneranno anche contenitori di plastica dura e coperchiati. La miscelazione del campione deve essere eseguita delicatamente, in modo che i pellet di polline non vengano schiacciati o altrimenti distrutti. Un pregiudizio involontario potrebbe inconsciamente persuadere uno a raccogliere "i graziosi pallini viola", ad esempio, quando si rimuove un sottocampione dal tutto. Pertanto, la composizione cromatica del campione deve essere oscurata dalla vista durante lo scavo di un sottocampione. In questo modo, è più probabile ottenere un sottocampione veramente rappresentativo dell'insieme. Tuttavia, questo metodo di sottocampionamento potrebbe non riuscire a selezionare i pellet di polline che sono in bassa abbondanza nel campione. Pertanto, se l'identificazione di ogni singolo taxon vegetale rappresentato nel campione è un obiettivo di ricerca, la raccolta di un sottocampione non sarà appropriata; L'intero campione deve essere analizzato. Quindi, i pellet dovrebbero essere ordinati in una capsula di Petri di vetro. Una volta completata la selezione, le pagine appropriate della guida dei colori Pantone possono essere posizionate sotto il piatto per facilitare la corrispondenza dei colori tra la guida e il polline selezionato. Un esempio di ciò è illustrato nella Figura 5.
Quando si intrappola il polline dalle colonie di api da miele poste nelle colture per l'impollinazione, non devono essere utilizzati più di dieci gruppi di colori totali: nove singoli colori e un gruppo di colori "varie" composto dai colori minoritari nel campione. Porre un limite ragionevole al numero massimo di gruppi di colori in cui un campione può essere suddiviso impedisce al ricercatore di impantanarsi separando all'infinito i pellet in un numero sempre crescente di gruppi estremamente specifici, che, una volta completata la selezione, potrebbero non contenere individualmente quantità sufficienti per l'acetelisi. Se si catturano da colonie che probabilmente si nutrono di un assortimento molto diversificato di specie vegetali, potrebbero essere necessari più gruppi di colori e i protocolli dovrebbero essere ottimizzati per riflettere tale requisito. Il presente studio si è concentrato sui campioni di polline raccolti dalle colonie di api mellifere che impollinano le colture e più taxa sono stati comunemente trovati in un gruppo di colori, simile agli studi precedenti 29,30,31.
L'acetolisi dissolve i lipidi, le proteine e i detriti organici dalla superficie dei granuli di polline, rivelando i caratteri distintivi dell'esina, in modo che i grani possano essere colorati e identificati più facilmente. Si tratta di una metodologia vecchia e comune utilizzata in molti tipi di ricerca sui pollini37. I passaggi generali sono standardizzati; Variano poco da protocollo a protocollo. Tuttavia, le specifiche delle velocità e dei tempi di centrifugazione, della temperatura e della durata dell'incubazione, dei volumi di reagenti guidati dalla quantità di polline e persino del metodo di rimozione del surnatante (decantazione vs pipettaggio) potrebbero dover essere ottimizzate sperimentalmente in base agli obiettivi della ricerca e, in una certa misura, ai tipi di polline che potrebbero essere incontrati48. Infatti, l'acetolisi può rimuovere importanti caratteri diagnostici del polline da alcuni taxa come Malvaceae e Orchidaceae38. Pertanto, non tutto il polline è suscettibile di metodi standard di acetolisi. Come detto sopra, questi metodi sono stati ottimizzati in questo studio allo scopo di identificare le fonti dominanti di taxon vegetale del polline raccolto dalle api mellifere impollinatrici. I dettagli da considerare se la quantificazione precisa dei grani di polline fa parte dello studio, non sono stati affrontati in questo documento.
L'uso di solventi e acidi richiede un'attenta pianificazione, adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e uno smaltimento responsabile dei rifiuti (Figura 6). È fondamentale che i ricercatori determinino il modo corretto di conservare i reagenti e smaltire i rifiuti prima di iniziare qualsiasi parte dell'acetelisi. In questo laboratorio, i guanti butilici vengono utilizzati durante qualsiasi parte del processo che coinvolge acido solforico e persino acido acetico glaciale in quanto hanno gradi di degradazione e permeazione di gran lunga migliori per entrambi gli acidi rispetto ai guanti in nitrile, senza compromettere la destrezza49. Sarebbe prudente consultare le linee guida di sicurezza della rispettiva istituzione per le raccomandazioni sui guanti appropriati e altri DPI49. L'aggiunta di acido acetico glaciale prima della fase di acetolisi aiuta a rimuovere qualsiasi umidità residua nel campione e lo prepara per l'importante reazione di acetolisi. La miscela glaciale acido acetico-acido solforico nella fase di acetolisi può reagire violentemente con l'acqua, motivo per cui è importante che tutti i bicchieri e le forniture siano completamente asciutti e che tutta l'umidità venga rimossa dal campione prima dell'acetolisi. L'aggiunta post-acetolisi di acido acetico glaciale diluisce e neutralizza la miscela di acetolisi.
L'etanolo e l'acido acetico glaciale, in particolare, possono sciogliere l'inchiostro delle etichette dei tubi di microcentrifuga, se questi reagenti gocciolano all'esterno del tubo, anche con penne resistenti ai solventi. Controlla frequentemente le etichette dei tubi durante tutto il processo per assicurarti che siano ancora leggibili. Se logisticamente fattibile, prendere in considerazione l'utilizzo di etichette stampate LaserJet come salvaguardia contro questa possibilità. Il modo in cui i surnatanti vengono decantati influenzerà se i reagenti gocciolano all'esterno delle provette della microcentrifuga. È importante decantare il surnatante con una mano sicura e liscia, che viene fornita con la pratica. Si deve prestare attenzione per evitare la perdita di campioni di polline dalla provetta della centrifuga durante la decantazione. La decantazione troppo veloce rischia di perdere parte o tutto il residuo di polline; La decantazione troppo lenta può causare il surnatante che scorre lungo il tubo. Sebbene una temperatura di incubazione di 100 °C sia comunemente raccomandata, il polline potrebbe facilmente diventare "troppo cotto" a quella temperatura nelle quantità utilizzate in questo studio (0,25 g), in particolare se incubato per periodi leggermente più lunghi29. Infatti, anche a 80 °C, i granuli di polline possono scoppiare o comunque danneggiarsi se lasciati troppo a lungo nella miscela di acetolisi. La temperatura e la durata dell'incubazione devono essere attentamente determinate per evitare di distruggere i granuli di polline nel campione.
La colorazione del polline aumenta la definizione e il contrasto delle caratteristiche dell'esina, rendendolo più facile da fotografare e identificare (Figura 7). Cinque gocce (da una pipetta di trasferimento di plastica) di Safranin O all'1% hanno effettivamente colorato 0,25 g di polline. Tuttavia, pollini diversi si macchiano in modo diverso. Se i grani di polline sono macchiati troppo leggermente o troppo pesantemente, l'identificazione può essere difficile. Quando possibile, il volume della soluzione di colorazione necessario per colorare in modo appropriato le specie polliniche che si prevede di trovare nello studio deve essere convalidato prima di iniziare il trattamento dei campioni sperimentali. Tuttavia, se uno dei campioni sperimentali non è adeguatamente colorato, può essere corretto. Per alleggerire un campione di polline macchiato troppo pesantemente, sciacquare il campione con acqua e quindi etanolo. Se il polline non è macchiato abbastanza bene da vedere le caratteristiche distintive, è possibile aggiungere alcune gocce aggiuntive di macchia. La macchia di questi campioni deve essere controllata prima di aggiungere glicerina. Allo stesso modo, potrebbero essere necessari alcuni tentativi ed errori per determinare il volume ideale di glicerina per i residui di polline. Quindici gocce di glicerina hanno adeguatamente protetto i campioni in questo studio dall'essiccazione, diluendo anche il residuo di polline a una concentrazione ideale per l'identificazione a valle tramite microscopia ottica. Altre quantità di residui di polline possono richiedere più o meno glicerina per prevenire l'essiccazione e facilitare il montaggio.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la dott.ssa Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) per l'assistenza nella selezione dei colori e nell'analisi dell'acetolisi. Questa ricerca è stata sostenuta da fondi di ricerca forniti a R.R.S. dall'Oregon State Beekeepers Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #8 hardware cloth | 2.7 mm aperture | ||
| 10 mL graduated cylinder | |||
| 1000 uL micropipette tips | |||
| 1250 mL filter micropipette tips | |||
| 15 x 75 mm glass slides | Thickness: 0.93 mm - 1.05 mm | ||
| 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| 250 mL graduated Borosilicate glass beakers (x3) | VWR | 10754-952 | |
| 50 mL graduated Borosilicate glass beakers (x6) | VWR | 10754-946 | |
| 95% EtOH | Pharmco AAPER | 111000200DM55 | ACS/USP/Kosher grade |
| Butyl vinyl gloves | |||
| Centrifuge | 1060 x g maximum speed; horizontal swing preferred | ||
| Chemical safety goggles | |||
| Color guide | Pantone | SKU: GP1601A | Solid coated |
| Coverslip of 1 or 1.5 | Thickness: 0.13 mm - 0.19 mm | ||
| Distilled water | |||
| Forceps | |||
| Fume hood | |||
| Glacial acetic acid | BDH Chemicals | BDH3092 | ACS grade |
| Glass funnel | |||
| Glycerin | Humco | 103196001_1 | USP grade, 99.5%, anhydrous |
| Hazardous waste containers | |||
| Hive tool | |||
| Hot block | Must reach 80 degree C | ||
| Lab coat with long sleeves | |||
| Latex or polyurethane foam | |||
| Microscope | |||
| Nailpolish, clear | |||
| Nitrile gloves | |||
| P1000 pipette | VWR | ||
| Petri dish | |||
| Plastic spoon | |||
| Safranin | Ward's Science | 470302-322 | Lab grade |
| Smoker | For pollen trap installation | ||
| Sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | ACS grade, powder |
| Squirt bottles (x2) | |||
| Sulfuric acid | EMD Millipore | SX1244 | ACS grade |
| Sundance Bottom Mount Pollen Trap | Betterbee Beekeeping Supply | PTRAPB | |
| Tape | |||
| Wooden stir sticks | |||
| Wooden tooth picks |
References
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