Summary
Vi beskriver metoder för att samla in korbikulärt pollen från honungsbin samt protokoll för färgsortering, acetolys och mikroskopberedning av pollen för taxonomisk identifiering. Dessutom presenterar vi pelletsfärg och taxonomisk mångfald av korbikulär pollen som samlats in från fem odlingssystem med pollenfällor.
Abstract
Forskare samlar ofta in och analyserar korbikulär pollen från honungsbin för att identifiera de växtkällor som de födosöker efter pollen eller för att uppskatta exponering av bekämpningsmedel hos bin via pollen. Häri beskrivs en effektiv pollenfångningsmetod för att samla korbikulär pollen från honungsbin som återvänder till sina bikupor. Denna insamlingsmetod resulterar i stora mängder korbikulär pollen som kan användas för forskningsändamål. Honungsbin samlar pollen från många växtarter, men besöker vanligtvis en art under varje insamlingsresa. Därför representerar varje korbikulär pollenpellets övervägande en växtart, och varje pollenpellets kan beskrivas med färg. Detta möjliggör sortering av prover av korbikulär pollen efter färg för att segregera växtkällor. Forskare kan ytterligare klassificera korbikulär pollen genom att analysera morfologin hos acetolyserade pollenkorn för taxonomisk identifiering. Dessa metoder används ofta i studier relaterade till pollinatorer som pollineringseffektivitet, pollinatörens födosöksdynamik, kostkvalitet och mångfald. Detaljerade metoder presenteras för att samla korbikulärt pollen med hjälp av pollenfällor, sortera pollen efter färg och acetolysera pollenkorn. Dessutom presenteras resultat som rör frekvensen av pelletsfärger och taxa av korbikulär pollen som samlats in från honungsbin i fem olika odlingssystem.
Introduction
Det västra honungsbiet (Apis mellifera L.) är en viktig pollinator av många jordbruksgrödor som är beroende av bi-pollinering1. I mer än ett decennium har betydande förluster av honungsbikolonier rapporterats 2,3,4,5,6,7,8,9. Flera faktorer - inklusive parasiter och sjukdomar, dålig näring och bekämpningsmedel - har varit inblandade i dessa koloniminskningar10. Dålig näring kan hänföras till intensifiering av jordbruket och förlust av födosökshabitat11. Det är absolut nödvändigt att förstå de blommiga resurser som används av bin i olika landskap för att förbättra binäringen och hjälpa till med biskyddsinsatser. Pollen är den primära källan till protein, lipider, vitaminer och mineraler för bin och har använts i många jordbruks- och ekologiska studier för att förstå födosökspreferenser på koloninivå hos honungsbin, utvärdera effekterna av pollenfångst på honungsbikolonier och bestämma exponering för bekämpningsmedel för bin12,13,14.
Honungsbin samlar pollen från blommor, packar pollen i pellets på deras corbicula - en tibial pollenkorg på bakbenet - och återvänder till kolonin för lagring. Korbikulär pollen kan avlägsnas från födosökare genom att fånga dem vid bikupans ingång eller på blommor, kyla dem kort för att immobilisera dem och sedan ta bort pollenpellets från bakbenen med pincett. Den mödosamma processen att handuppsamla korbikulärt pollen från individuellt fångade födosökare är långsam och ineffektiv om man behöver en betydande mängd pollen. En enklare och effektivare metod för att samla in stora mängder pollen är att fånga korbikulära pollenpellets från honungsbin vid bikupans ingångar. Pollenfällor är utformade för att lossa korbikulärt pollen från benen på de återvändande pollenfödarna när de kommer in i bikupan15. Födosökarna måste pressa genom näthål som är dimensionerade för att smalt tillåta passage av en honungsbiarbetarkropp.
När honungsbiet passerar genom ett av dessa hål skrapas de större pollenpelletsen av hennes ben och faller ner i en uppsamlingsbricka16. Studier har visat att pollenfångst stimulerar födosökare att samla mer pollen, vilket ökar pollineringseffektiviteten hos de omgivande grödorna och vegetationen17,18,19,20. Polleninsamlingsmetoder kan också användas för att förstå det foder som används av honungsbin i landskapet som det första steget för att bestämma kvantitet, kvalitet och taxa för blommande växtarter. Effektiva pollenfångningsmetoder underlättar således både pollinering och honungsbinäringsforskning. En jämförelse av dessa pollenuppsamlingsmetoder illustreras i tabell 1. Pollenfödosöksbeteendet kommer att förändras baserat på kolonins behov av lagrat pollen i förhållande till dess ägg- och larvpopulationsnivåer21,22. Eftersom dessa förändringar inkluderar varierande insamlingsintensitet förväntas ofta stora variationer i pollenmängd mellan kolonier på samma plats och mellan olika platser i samma odlingssystem eller landskapstyp23,24. Att öka antalet kolonier och platser för att fånga pollen hjälper till att tillgodose denna variation.
Pollenfällor varierar i effektivitet25,26. Storleken på pollenpellets som samlas in av honungsbin varierar mellan olika växtarter och kan förändras beroende på nivåerna av pollenförråd i kolonin27,28. Detta innebär en risk för att mindre pollenpellets blir underrepresenterade och större pellets överrepresenterade i prover som samlas in via pollenfällor. Vuxna bin varierar i kroppsstorlek, vilket också kan påverka representationen av pollen som samlas in i fällor. Det finns också växtarter som huvudsakligen producerar nektar som inte kommer att upptäckas om man bara bedömer insamlat pollen i vissa landskap. Fångsteffektiviteten påverkas också av födosöksdrift och desorientering, vilket påverkas av pollenfällans typ och bikupans skick. Detta problem kan mildras genom att använda tekniker som anges i detta dokument. Utredare kan överväga ytterligare forskningstekniker, såsom att räkna blomsterbesök av födosökare, för att komplettera resultaten av födosökspreferenser på koloninivå. En användbar metod för att bedöma pollendiversitet är att sortera korbikulär pollen efter färg. Även om honungsbin är generalister för födosökare, uppvisar de också blomtrohet, där de samlar pollen från samma växtart på samma plats under en viss insamlingsresa. Baserat på detta födosöksbeteende antas det att varje given korbikulär pollenpellets huvudsakligen representeras av en enda växtart 27,29,30,31. Därför kan forskare beskriva pollendiversitet genom att sortera korbikulär pollen efter pelletsfärg och rapportera det totala antalet upptäckta färger eller andelen av den totala som representeras av varje färggrupp 12,32,33,34. Detta kan åstadkommas genom att mäta massan eller pelletsantalet för varje färggrupp. Mätning av pelletsantalet för varje färggrupp föreslås om det finns kända eller misstänkta systematiska skillnader i vikten av pellets från olika taxa. Systematiska skillnader kan orsakas av pelletsstorlek eller mängden nektar som foderhandlare tillför pollen när de bildar en pellets.
Färgsortering är en tidseffektiv och enkel process, men kanske inte har acceptabel noggrannhet för vissa pollineringsforskningsstudier eftersom olika växttaxa kan ha liknande pollenpelletsfärger35,36. Dessutom finns det en logistisk gräns för antalet distinkta färggrupper som pollenpellets kan separeras i. Således kan separationen av varje enskild växttaxonpollen i sin egen distinkta pelletsfärggrupp inte alltid vara möjlig i pollineringsstudier. Morfologisk karakterisering av pollenkorn via ljusmikroskopi kompletterar ofta färgseparation av pellets genom att särskilja pollen från två eller flera taxa i pellets av samma färggrupp. Även om det är vanligt att hitta pollenkorn med flera taxa i en given pollenpelletsfärggrupp, utgör enskilda pollenpellets som samlas in av ett honungsbi i allmänhet ett dominerande taxon, eventuellt med andra taxa i mindre mängder. Således är det vanligt att anta taxonomisk trohet i korbikulära pollenpellets av honungsbin. Pollenpellets från andra pollinatörer som inte uppvisar blomtrohetsbeteende, såsom humlor, innehåller ofta många växtarter och kanske inte har ett dominerande taxon. I fall där kvantitativa uppskattningar av taxaproportioner i polyflorala pollenpellets önskas krävs dessutom mikroskopiska metoder som inkluderar acetolys för korrekt analys.
Bedömning av morfologiska egenskaper hos acetolyserade pollenkorn är den vanligaste metoden för taxonomisk identifiering16. Acetolysproceduren tar bort pollenkornets protoplasma för att exponera diagnostiska egenskaper som kan observeras under ljusmikroskopi37,38. Med hjälp av denna metod kan forskare rapportera olika taxa, frekvens av taxa som finns i specifika beskärningssystem och dominerande taxa av pelletsfärger33,36. Acetolys är den bästa analytiska tekniken för att avslöja pollenmorfologi28. Vissa acetolyserade pollenkorn, såsom många Rosaceae-typer, kan dock inte identifieras till släkt- eller artnivå genom acetolys och ljusmikroskopi ensam. Forskare överväger svepelektronmikroskopi eller metabarkodning som alternativa metoder för att uppnå identifiering på genus- eller artnivå. Dessa alternativa metoder ger dock endast kvalitativ taxonidentifiering och misslyckas med att uppskatta proportionerna av olika pollenkorntaxa i polyflorala pollenpellets36,39. Dessutom är kostnaden och nödvändig expertis betydligt högre för dessa metoder. En jämförelse av dessa identifieringsmetoder illustreras i tabell 1.
| Metoder | Tid | Utgift | Resolution | Expertis |
| Pollen Samling | ||||
| Pollen fångst | Låg | Moderat | Variabel | Moderat |
| Pollen födosökare insamling | Hög | Moderat | Hög | Låg |
| Pollen identifiering | ||||
| Visuellt objekt (endast färgsortering) | Moderat | Låg | Låg | Låg |
| Acetolys | Moderat | Moderat | Moderat | Moderat |
| Svepelektronmikroskopi | Hög | Hög | Hög | Hög |
| Metabarkodning | Variabel | Hög | Hög | Hög |
Tabell 1: Jämförelse av olika metoder för insamling och identifiering av pollen baserat på tid, kostnad, upplösning och expertis. Visuella metoder (endast färgsortering) rapporterar det totala antalet upptäckta färger eller andelen av det totala antalet som representeras av varje färggrupp som ett mått för att bestämma pollenkällor, men ger inte taxonidentifiering.
Den information som finns tillgänglig om fångst och sortering av pollen och acetolyserande pollenkorn är mångsidig och ofta spridd över flera källor, varierande för forskare inom olika områden. Denna uppsats ger detaljerade insikter i olika typer av pollenfällor som kan användas av både forskare och biodlare för att effektivt samla in stora volymer korbikulär pollen. Det finns också protokoll för beredning av pollenprover - genom acetolys, färgning och glidmontering - för identifiering av växttaxa. De metoder som beskrivs här är omfattande och fungerar som en unik resurs för att identifiera dominerande växtarter som honungsbin födosöker i ett visst landskap, särskilt i odlingssystem. Resultat baserade på dessa metoder från en tidigare studie har presenterats och dokumenterar mångfalden av pollenpelletsfärger och växttaxa från korbikulär pollen som samlats in av honungsbin i fem odlingssystem14.
Protocol
1. Samla korbikulär pollen från honungsbikolonier med pollenfällor
- Bestäm när du ska fälla pollen från önskad apiaryplats.
OBS: Idealiska klimatförhållanden inkluderar full solexponering, låga vindhastigheter, låg luftfuktighet och ingen prognostiserad nederbörd under önskad period för pollenuppsamling. - Välj optimala honungsbikolonier för att fånga pollen inom apiaryplatsen.
- Bedöm kolonistyrkan genom att räkna födosökare som återvänder till koloniingången i 2 minuter. Välj kolonier med det högsta totala antalet återvändande födosökare.
- Välj bikupor med trägods som är i gott skick, gärna utan extra ingångar och skeva lock. Använd kolonier med färre alternativa ingångar eftersom de har ökad sannolikhet att återvända födosökare som omorienterar till fällans ingång.
- Välj ingångar i söderläge när det är möjligt. Om nässelfeber är palleterade, installera pollenfällor på varje koloni som vetter mot samma riktning på en given pall för att undvika drift av födosökare till närliggande bikupaingångar.
- Om så önskas, bedöma kolonins yngelbo genom att inspektera ramar för närvaron av larver. Välj kolonier med relativt stora mängder larver.
- Installera pollenfällor på de valda honungsbikolonierna.
OBS: Installationen kommer att variera beroende på typen av pollenfälla. Typerna inkluderar a) frontfäste, b) bottenfäste, c) toppfäste eller d) skruvhålsingångsfäste. Mer information finns i diskussionsavsnittet.- För främre fällor, fäst fällan framför ingången med häftklamrar, skruvar och tejp, eller anslut fällan till bungee-sladdar lindade runt bikupan. För bottenmonterade fällor, placera fällan under den lägsta bikupan och fixa fällans ingång nära den ursprungliga ingången. För skruvhålsfällor, fäst fällan direkt framför ett skruvhål i en bikupa med häftklamrar, skruvar och tejp. För toppmonterade fällor, placera fällan ovanför den översta bikupan och under locket.
- Försegla alla andra möjliga ingångar till kolonin genom att använda icke-självhäftande och formbart material, såsom latex- eller polyuretanskum, eller # 8 hårdvaruduk (2,7 mm bländare) för skruvhål. Använd tejp för små sprickor.
- Om du använder främre fällor, placera en barriär, till exempel en gummimatta, mellan uppsamlingskorgen och gräset för att undvika fuktskador från dagg.
- Koppla in pollenfällans fångstmekanism 24 timmar efter installationen och innan dagens födosöksflygning börjar (sen kväll/tidig morgon).
OBS: Detta steg är idealiskt, men inte nödvändigt. Engagera pollenfällor varannan vecka om du fångar pollen på samma kolonier under en viss period. - Samla korbikulär pollen från uppsamlingsbrickan, placera den i plastpåsar eller centrifugrör och förvara i en kylare med is.
- För att bedöma mångfalden och överflödet av pollenarter, t.ex. näringsstudier på landskapsnivå, samla pollen i två eller tre 72 timmars intervall40.
- För analys av bekämpningsmedelsrester, samla pollen i intervaller på 24 timmar till 96 timmar med minst 3 g för bearbetning av41.
- Rengör pollen genom att ta bort bidelar och annat skräp från bikupan.
OBS: Använd engångshandskar vid hantering av pollenprover och byt engångshandskar mellan proverna. Använd separata verktyg för att ta bort skräp från pollen som samlats in i varje fälla. Skölj och torka innan du använder verktygen för en annan sats fångad pollen. - Förvara pollen vid -20 °C eller lägre för att bibehålla dess sammansättning om pollen är avsett för identifiering av pollenkällor, kvantitetsbedömning eller analyser av bekämpningsmedelsrester41,42.
- Efter att ha tagit bort fällorna från bikuporna, sterilisera all utrustning i en 5% blekmedellösning, skölj och torka utrustningen före nästa användning.
2. Pollenpelletsfärgsortering för identifiering och kvantitetsbedömning av pollenkällor nedströms
- Se till att det finns minst 20 g pollenprov att arbeta med. Blanda pollenprovet noggrant i påsen eller någon annan behållare av lämplig storlek för att få en homogen blandning av alla pellets som finns däri. För att undvika oavsiktlig partiskhet i nästa steg, dölj provets färgkomposition från vyn innan du tar bort ett delprov från provpåsen.
- Använd en skopa eller stor sked, skopa ut 10 g pollen som ett representativt delprov av helheten. Häll långsamt pellets ur skopan på balansen tills displayen läser 10 g. Om den första skopan inte var tillräckligt stor, hämta en annan skopa från provet på samma sätt.
OBS: Dessa specificerade viktkrav (20 g och 10 g) fungerar endast som exempel. Forskare bör justera mängden pollen som används i varje steg efter behov efter specifika behov. - Ta bort alla bidelar och annat skräp från 10 g delprovet. Tillsätt sedan vid behov lite mer pollen från det ursprungliga provet för att uppnå en totalvikt på 10 g av delprovet.
- Sortera varje pollenpellets från 10 g delprov i en färggrupp. Använd både pollenfärg och textur för att skilja mellan färggrupper.
En viss variation inom en grupp förväntas, men att använda Pantone-färgguiden under sortering kan öka konsekvensen. - För att säkerställa minst 0,25 g av varje färggrupp för nedströms steg, placera alla pellets som inte är tillräckligt rikliga för att bilda en färggrupp på minst 0,25 g i en diversegrupp. Namnge varje enskild färggrupp med hjälp av färgguiden Pantone. Märk diverse gruppfel.
- Väg varje färggrupp på ett separat vägpapper och/eller räkna antalet pellets i varje färggrupp. Registrera färggruppens namn och tjocklekar eller räkningar i ett datablad.
OBS: Valet om man vill väga eller räkna antalet pellets i varje färggrupp beror på forskarens mått på intresse och projektmål. - Skapa en mikrocentrifugrörsetikett för varje färggrupp med hjälp av en lösningsmedelsbeständig penna och självhäftande pappersrörsetiketter. Inkludera aktuellt datum, providentifierare, provsamlingsdatum och färggruppsnummer i etiketten. Applicera etiketterna på rena, torra 2 ml mikrocentrifugrör.
- Väg ut 0,25 g (± 0,05 g) pollenpellets från varje färggrupp och placera denna mängd i det lämpligt märkta mikrocentrifugröret.
OBS: Om det finns liten variation i färg eller struktur i pollen i en given färggrupp, se till att det finns ett representativt prov av pellets i varje rör. Reagensvolymerna och inkubations- och centrifugeringstiderna som följer är lämpliga för 0,25 g pollen. Använd därför denna mängd pollen i mikrocentrifugrören som ska användas vid acetolys. Detta protokoll bör ge rikligt, färgat pollen för identifiering av växtkällor nedströms med ljusmikroskopi. Om en annan mängd pollen används vid acetolys bör reagensvolymen och bearbetningstiderna justeras i enlighet med detta. - Placera återstående pollen från varje färggrupp i enskilda plastpåsar (en påse per färg) märkta med färggruppens namn. Förvara dessa påsar tillsammans med övriga delar av lämpligt originalprov i förvaring vid -20 °C.
- Blanda pollen noggrant i röret med en ren trä tandpetare i 10 till 15 s.
3. Förberedelse för acetolys
- Innan du påbörjar någon del av acetolysen för första gången, kontakta den utsedda institutionens avdelning för miljöhälsa och säkerhet (EHS) för instruktioner om hur acetolysrelaterade reagenser och avfall ska hanteras.
- Skaffa stamlösningar av följande reagenser och placera dem i dragskåpet i enlighet med EHS-riktlinjer för kemisk lagring: 95% etanol; destillerat vatten; isättika, vattenfri; koncentrerad svavelsyra; Glycerin; och klart nagellack.
- Bered stamlösningar av följande reagenser och placera dem i dragskåpet i enlighet med EHS-riktlinjer för kemisk lagring: mättat natriumbikarbonat (8% w / v lösning i destillerat vatten); och safranin O (1% w/v lösning i 50% etanol).
4. Acetolys
- Utför pre-acetolysproceduren för isättikatisk syratvätt. Utför följande steg i dragskåpet med labbrock, ögonskydd och nitrilhandskar.
- Vrid ett värmeblock till 80 °C.
OBS: Se till att en klämflaska mättat natriumbikarbonat är lättillgänglig. Detta kan användas för att neutralisera syraspill i dragskåpet om de uppstår. - Märk en glasbägare för surt avfall, en för etanolavfall och en för acetolysblandning.
- Använd tidigare beredda stamlösningar, skapa fungerande alikvoter av följande reagenser i märkta glasbägare av lämplig storlek: ~ 23,0 ml isättika; ~ 33,0 ml destillerat vatten; ~ 23,0 ml 95% etanol; ~ 25,0 ml natriumbikarbonat (för syraförorenat fast avfall).
OBS: Dessa är de volymer som krävs för att slutföra följande acetolysprocedurer på totalt 10 färggruppsprover (10 mikrocentrifugrör). - Tillsätt långsamt 500 μl isättika till varje mikrocentrifugrör innehållande 0,25 g färggruppspollen. När du visuellt inspekterar röret, rör om pollen med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att rörets innehåll blandas noggrant. Placera den använda tandpetaren i natriumbikarbonatavfallsbägaren efter användning; Upprepa denna process för varje rör.
OBS: Använd en ren, ny tandpetare för varje rör. Se till att varje rörs lock är ordentligt stängt. - Centrifugera proverna i 3 min vid 1,100 × g. Dekantera supernatanten från rören till syraavfallsbägaren. Rör sedan mjukt och kort rörets öppna mun med en ren pappershandduk för att ta bort kvarvarande isättika runt rörets kant.
OBS: Var försiktig så att du inte tappar pollenpelleten när du dekanterar supernatanter.
- Vrid ett värmeblock till 80 °C.
- Utför acetolysproceduren.
OBS: Utför följande steg i dragskåpet med labbrock, ögonskydd och butylvinylhandskar.- Förbered acetolysblandningen (9:1 isättika: svavelsyra) genom att först tillsätta 10,8 ml isättika (från den fungerande alikvoten) till bägaren märkt acetolysblandning. Tillsätt sedan långsamt 1200 μl (1,2 ml) koncentrerad svavelsyra från stamlösningen till acetolysblandningsbägaren innehållande isättika med en pipett på 1000 μl som är försedd med 1250 μl filtrerade pipettspetsar. Kassera den använda pipettspetsen i bägaren av natriumbikarbonat.
OBS: Acetolysblandningens bägare kan bli varm vid beröring och blandningen kan bli gul. Det finns två möjligheter som gör att blandningen får en mörk färg: (a) reagenserna kan vara förbi sina utgångsdatum, eller (b) för mycket svavelsyra kan ha tillsatts. I vilket fall som helst, om blandningen blir mörk, kassera den i syraavfallsbägaren och förbered en ny acetolysblandning. - Rör försiktigt om acetolysblandningen med en glasstav eller trärör för att säkerställa att den är homogeniserad. Placera den använda staven/pinnen i bägaren av natriumbikarbonat.
- Använd en 1000 μL pipett med 1250 μL filtrerade pipettspetsar, tillsätt långsamt 1000 μL acetolysblandning från bägaren till varje rör. När du visuellt inspekterar röret, rör om med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant. Placera den använda tandpetaren i natriumbikarbonatavfallsbägaren efter användning.
OBS: Använd en ren, ny tandpetare för varje prov. - Placera proverna på det förvärmda (80 °C) värmeblocket. Inkubera rören i 5 minuter och rör om varje rör noggrant med en ren tandpetare halvvägs genom inkubationen. Placera varje använd tandpetare i bägaren av natriumbikarbonat efter användning.
OBS: Lämna inte tandpetare i proverna; syran kommer att lösa upp dem.
- Förbered acetolysblandningen (9:1 isättika: svavelsyra) genom att först tillsätta 10,8 ml isättika (från den fungerande alikvoten) till bägaren märkt acetolysblandning. Tillsätt sedan långsamt 1200 μl (1,2 ml) koncentrerad svavelsyra från stamlösningen till acetolysblandningsbägaren innehållande isättika med en pipett på 1000 μl som är försedd med 1250 μl filtrerade pipettspetsar. Kassera den använda pipettspetsen i bägaren av natriumbikarbonat.
- Utför tvättproceduren efter acetolys isättika.
OBS: Utför följande steg i dragskåpet med labbrock, ögonskydd och butylvinylhandskar.- Tillsätt långsamt 500 μl isättika till varje rör. När du visuellt inspekterar röret, rör om med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant. Placera den använda tandpetaren i bägaren av natriumbikarbonat efter användning.
OBS: Använd en ren, ny tandpetare för varje prov. Se till att varje rörs lock är ordentligt stängt. - Centrifugera proverna i 3 min vid 1,100 × g. Dekantera supernatanten från varje rör i syraavfallsbägaren. Rör sedan mjukt och kort rörets öppna mun med en ren pappershandduk för att ta bort kvarvarande syra runt rörets kant.
- Skölj butylvinylhandskarna noggrant under rinnande vatten i minst 30 s, ta bort dem och låt dem torka.
OBS: Följ tillverkarens riktlinjer för återanvändning av butylvinylhandskar.
- Tillsätt långsamt 500 μl isättika till varje rör. När du visuellt inspekterar röret, rör om med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant. Placera den använda tandpetaren i bägaren av natriumbikarbonat efter användning.
- Utför tre vattensköljningar för varje prov. Utför följande steg i dragskåpet med labbrock, ögonskydd och nitrilhandskar.
- Tillsätt 1000 μl destillerat vatten från den destillerade vattenbägaren till varje rör. När du visuellt inspekterar röret, rör om med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant. Placera tandpetaren i natriumbikarbonatavfallsbägaren efter användning.
OBS: Använd en ren, ny tandpetare för varje prov. Se till att varje rörs lock är ordentligt stängt. - Centrifugera proverna i 3 min vid 1,100 × g. Dekantera supernatanten från rören till bägaren av natriumbikarbonat. Rör sedan mjukt vid rörets öppna mun med en ren pappershandduk för att ta bort kvarvarande vatten runt rörets kant.
- Upprepa steg 4.4.1–4.4.2 ytterligare två gånger för totalt tre vattensköljningar.
- Tillsätt 1000 μl destillerat vatten från den destillerade vattenbägaren till varje rör. När du visuellt inspekterar röret, rör om med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant. Placera tandpetaren i natriumbikarbonatavfallsbägaren efter användning.
- Utför etanolsköljningen för varje prov.
OBS: Utför följande steg i dragskåpet med labbrock, ögonskydd och nitrilhandskar.- Använd en 1000 μL pipett med 1250 μL filtrerade pipettspetsar, tillsätt 1000 μL 95% etanol från etanolbägaren till varje rör. Kasta pipettspetsen i icke-farligt avfall. När du visuellt inspekterar röret, rör om med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant.
OBS: Placera tandpetaren i natriumbikarbonatavfallsbägaren efter användning. Använd en ren, ny tandpetare för varje prov. Se till att varje rörs lock är ordentligt stängt. - Centrifugera proverna i 3 min vid 1,100 × g. Dekantera supernatanten från rören i etanolavfallsbägaren och rör mjukt vid rörets öppna mun med en ren pappershandduk för att ta bort kvarvarande etanol från röret.
- Använd en 1000 μL pipett med 1250 μL filtrerade pipettspetsar, tillsätt 1000 μL 95% etanol från etanolbägaren till varje rör. Kasta pipettspetsen i icke-farligt avfall. När du visuellt inspekterar röret, rör om med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant.
- Använd labbrock, ögonskydd och nitrilhandskar för att färga prover. Blanda Safranin O-fläcklösningen med skonsam inversion.
- Använd en engångspipett av plastöverföring och tillsätt 5-10 droppar Safranin O-fläck till varje rör. När du visuellt inspekterar röret, rör om med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant. Lämna tandpetaren i röret.
- Använd en 1000 μL pipett med 1250 μL filtrerade pipettspetsar, tillsätt 1000 μL 95% etanol från etanolbägaren till varje rör. Kasta pipettspetsen i icke-farligt avfall. När du visuellt inspekterar röret, rör om med tandpetaren i 10-15 s och se till att innehållet i röret blandas noggrant. Placera den använda tandpetaren i det icke-farliga avfallet efter användning.
- Se till att varje rörs lock är ordentligt stängt. Centrifugera i 3 min vid 1 100 × g. Dekantera supernatanten i etanolavfallsbägaren.
OBS: Rör inte rörets mun med en pappershandduk den här gången. - Tillsätt 10-15 droppar glycerin till varje rör med en engångsöverföringspipett av plast. När du visuellt inspekterar röret, rör om rörets innehåll med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att rörets innehåll blandas noggrant.
OBS: Placera den använda tandpetaren i det icke-farliga avfallet efter användning. Använd en ren, ny tandpetare för varje prov. Se till att alla röretiketter är läsbara.
- Låt rören vara öppna i dragskåpet för att avdunsta etanolen i minst 2 timmar vid rumstemperatur. Kontrollera proverna för etanollukt: om det är detekterbart är proverna inte klara och bör lämnas för att torka tills etanollukten försvinner.
- Rengör allt material och kassera avfall. Stäng av både centrifugen och värmeblocket. Kassera allt fast och flytande avfall i enlighet med den utsedda institutionens riktlinjer för miljöhälsa och säkerhet.
- Förbered mikroskopglas för pollenidentifiering; märk dem läsligt. Märk en ren glasmikroskopbild på lämpligt sätt för varje färggrupp / prov som ska monteras. När du visuellt inspekterar röret, rör om provet med en ren tandpetare i 10-15 s och se till att rörets innehåll blandas noggrant.
OBS: Bildförberedelser kan göras vid labbbänken. Kassera tandpetaren i icke-farligt avfall. Använd en ren, ny tandpetare för varje prov.- Använd en ren engångsplastöverföringspipett, ta bort 1 droppe pollenrester från ett rör och placera den i mitten av dess märkta mikroskopglas. Låt droppen sprida sig något. Placera en ren täckglas över droppen på bilden.
- När bilden har torkat, försegla täckglaset till bilden med klart nagellack. Placera en liten droppe polermedel på varje hörn av täckglaset och måla en kant av polermedel runt täckglasets omkrets där den möter bilden. Låt nagellacket torka helt och måla ett andra lager polermedel runt täckglasets omkrets.
Representative Results
En tidigare studie rapporterade bedömningen av mångfalden av pollen som samlats in av honungsbin i följande jordbruksgrödor: mandel, körsbär, highbush blåbär, hybrid morot och ängsskum14. Med hjälp av de beskrivna metoderna samlades korbikulär pollen, sorterad efter färg, och växtkällorna för varje pelletsfärggrupp identifierades för att bedöma pollendiversiteten. Bottenmonterade pollenfällor installerades på kolonier på flera platser för varje gröda (figur 1A). Mängden pollen som samlades in från varje plats var tillräcklig för att uppfylla provviktskraven för färgsorterings- och acetolysanalysmetoderna. Varje pollenuppsamlingsprov hade flera urskiljbara färggrupper (figur 2 och figur 3). I vissa prover innehöll pollenfärggrupper så få som 4-5 pellets; de flesta grupper hade dock betydligt mer än så och fungerade därmed som sin egen märkta färggrupp för acetolys (figur 4 och figur 5). Efter acetolys (figur 6) användes ljusfältsljusmikroskopi för att effektivt identifiera varje färggrupp till lägsta möjliga taxonomiska rang genom att bekräfta de morfologiska egenskaperna med de hos kupongprover som samlats in från området kring varje studieplats (figur 7).
Figur 1: Pollenfällor installerade på en honungsbikoloni för att samla korbikulär pollen . (A) Bottenmonterade fällor placerade ovanför bikupans bottenbräda och direkt ovanför den lägsta bikupan. Andra pollenfällor inkluderar (B) frontfäste och (C) skruvhålsfästfällor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fångstmekanism och uppsamlingsbricka av pollenfälla. Återvändande pollenförädlare måste pressa igenom nätfångstmekanismen innan de når sin bikupa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Uppsamlingsbricka med pollenfälla. Korbikulär pollen skrapas av benen på återvändande pollenförädlare av pollenfällan och faller i uppsamlingsbrickan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Sortera ett prov av korbikulär pollen i färggrupper. Korbikulär pollen kan torkas och vägas efter att den har sorterats i färggrupper för att rapportera proportioner av olika färgpellets som samlats in. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fyra grupper av pollenpellets sorterade efter färg med hjälp av Pantone-färgguiden. Färggrupperna är märkta som (A) grå, Pantone 5855C, (B) brun, Pantone 7557C, (C) gul, Pantone 458C och (D) ljusbrun, Pantone 3547C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Inställning av acetolysutrustning inuti dragskåpet. Värmeblocket, reagenser, lösningsmedelsavfall och syraavfallsbehållare, märkta bägare, pipett, pipettspetsar, omrörningspinnar och mikrocentrifugrör som ligger inuti dragskåpet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Mikrograf av färgade, acetolyserade pollenkorn. Många fasetter av acetolyserad senap (Brassicaceae) pollenkorn med 40x förstoring. Skalstreck = 50,398 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Pollen som samlades in från mandelgrödor hade relativt lägre pollendiversitet än pollen som samlats in från andra grödor, med i genomsnitt 3,0 ± 0,5 pelletsfärger och 3,2 ± 1,2 växttaxa per plats (tabell 2)14. De återstående fyra odlingssystemen hade högre pollendiversitetsnivåer med i genomsnitt 6,0 ± 2,0 pelletsfärger och 8,0 ± 1,5 växttaxa per plats i körsbär, 8,8 ± 1,4 pelletsfärger och 13,5 ± 2,0 växttaxa per plats i highbush blåbär, 7,0 ± 1,0 pelletsfärger och 11,0 ± 0,0 växttaxa per plats i hybrid morot och 10,0 ± 0,0 pelletsfärger och 13,0 ± 1,5 växttaxa per plats i ängsskum14.
| Gröda | Genomsnittligt antal pollenpelletsfärger/plats (SE) | Genomsnittligt antal växttaxa/växtområden (SE) | Totalt antal identifierade taxa | ||
| Familj | Släkte | Art | |||
| Mandel | 3.0 (0.5) | 3.2 (1.2) | 4 | 3 | 4 |
| Blåbär | 8.8 (1.4) | 13.5 (2.0) | 5 | 10 | 13 |
| Morot | 7.0 (1.0) | 11.0 (0.0) | 3 | 5 | 6 |
| Körsbär | 6.0 (2.0) | 8.0 (1.5) | 4 | 7 | 5 |
| Ängsskum | 10.0 (0.0) | 13.0 (1.5) | 5 | 4 | 14 |
Tabell 2: Mångfald av korbikulärt pollen som samlats in från honungsbin i fem odlingssystem. Mångfaldsmått inkluderar genomsnittligt antal pelletsfärger (± SE), genomsnittligt antal växttaxa (± SE) och totala taxa identifierade. Denna tabell har ändrats från14. Förkortning: SE = standardfel.
Discussion
Olika pollenfällstilar har sina egna fördelar och konsekvenser. Fördelarna och begränsningarna med fyra vanliga fällstilar, (1) frontmontering, (2) bottenfäste, (3) skruvhål och (4) toppmonterade pollenfällor diskuteras nedan. Fällor med frontmontering är den mest mångsidiga stilen (figur 1B). Installationen är snabb och enkel; det kan göras utan att lyfta bikupalådor, och dessa fällor kan passa på alla Langstroth-stilar av bikupautrustning. Eftersom uppsamlingsbrickan sitter framför kolonin samlar den minimalt med skräp från kolonin. Uppsamlingsbrickan är dock också mer utsatt för yttre element - fukt från fältbevattning, regnigt eller fuktigt väder, eller dagg kan komma i kontakt med pollen genom uppsamlingsbrickan, vilket potentiellt gör pollen oanvändbar om pellets blir för mättade för att separera. Risken för pollenmättnad kan minskas genom att undvika fångst under prognostiserade händelser med regn eller hög luftfuktighet. Att placera en gummimatta under fällan och extra täckmaterial (t.ex. takpapp) ovanpå pollenfällan kan också skydda uppsamlingsbrickan från väder.
Bottenmonterade fällor användes för att samla in pollen för data i detta dokument (figur 1A). De är inte lika praktiska att installera eftersom de måste placeras under kolonins yngelbo. Installationen är tidskrävande och resulterar i att en stor mängd skräp faller i fällan från kolonin, såsom bidelar och små vaxbitar. Golvet i uppsamlingsbrickan för de flesta tillverkade bottenmonterade fällor är gjord av fint nät, vilket möjliggör korrekt ventilation för att skydda det uppsamlade pollenet från fukt. Pollenfällor med skruvhål hjälper till att minimera desorientering av födosökare om de främst använder skruvhål som bikupaingångar istället för ingången från bikupans bottenplatta (figur 1C). Eftersom uppsamlingsbrickan för pollenfällor med skruvhål är mycket liten måste den tömmas ofta för att undvika att uppsamlingsbrickan svämmar över. Med tanke på dess övre placering på en bikupa är den toppmonterade pollenfällan den enklaste fällstilen att installera och ta bort, och det uppsamlade pollenprovet är fritt från bikupeskräp. Denna fällstil är dock extra känslig för skadad bikupautrustning eftersom uppsamlingsbrickan skulle utsättas för fukt om locket, innerlocket och den övre bikupan inte är ordentligt förseglade tillsammans.
De protokoll som beskrivs häri uppmanar till att välja kolonier med stora vuxna och larvpopulationer (steg 1.2). Denna urvalsmetod är avsedd att producera mycket stora mängder fångat pollen från dessa kolonier. Kolonier med betydande födosökspopulationer kan uppleva stor trängsel vid ingången vid fällinstallation. Att välja en stor bikupaingång kommer att lindra trängsel. Stora födosökspopulationer kan också samla in mycket stora mängder pollen som kan överskrida gränserna för uppsamlingsbrickan. Använd omfattande uppsamlingsbrickor, som ses med de flesta botten- eller toppmonterade fällstilar, och töm brickor ofta för att rymma stora mängder fångad pollen. Om det önskade forskningsmålet är att bedöma pollenmängder som samlas in av kolonier i en bigård, välj representativa kolonier istället för att optimera vuxna och larvpopulationer för urval. Alla stilar av pollenfällor blockerar bikupans ingång och skapar en ny ingång som skiljer sig rumsligt från den ursprungliga ingången16. Pollenfällor misslyckas vanligtvis med att samla pollen när födosökare inte kan omorientera till pollenfällans nya ingång vid installationen. Dessa födosökare driver lätt till närliggande nässelfeber, vilket kan korsförorena andra pollenuppsamlingsprover om de går in i en annan bikupa med en pollenfälla. Därför bör födosökare ges minst 24 timmar för att acklimatisera sig till den nya ingången genom att hålla fångstmekanismen urkopplad efter installationen. Att välja kolonier med få eller inga ytterligare ingångar till bikupor minskar också förvirringen när man orienterar sig mot den nya pollenfällans ingång.
Ytterligare ingångar till bikupor (t.ex. hål och skeva lock) bör förseglas, men risken för att födosökare driver till närliggande bikupor kommer att öka med dessa ingångar närvarande i början av fällinstallationen. Foragers kommer också lätt att driva in i andra bikupaingångar om en pollenfälla endast installeras på en enda bikupa i ett kluster av palleterade bikupor. Foragers är mindre benägna att driva om alla nässelfeber som vetter mot samma riktning på pallen har fällor installerade. Toppmonterade pollenfällor kan utgöra en högre risk för bidrift på grund av det stora avståndet mellan pollenfällans ingång och bikupans ursprungliga ingång. För denna studie installerades pollenfällor på flera honungsbikolonier på varje experimentell plats för att ta hänsyn till variationen i pollenkvantitet och taxasammansättning mellan varje honungsbikoloni. Således bör pollenfällor installeras på flera kolonier för att uppnå robusta pollensamlingar från landskapet eftersom pollensamlingen kan variera mycket mellan kolonier baserat på växtartstyp och total insamlad mängd12,13. Varje pollenprov hade en 7-dagars insamlingsperiod. I framtida studier kommer insamling av pollen i två eller tre på varandra följande 72 h-intervall att öka noggrannheten i pollenfoderuppskattning40.
Eftersom det finns en hög grad av tidsmässig fluktuation i pollenuppsamlingen kan pollenuppskattningsnoggrannheten ökas genom att upprepa pollenuppsamlingsprocessen under tidiga, topp- och senblomningsperioder i de riktade odlingssystemen24,27,39. Pollen bör samlas in från flera platser, om än samma odlingssystem eller landskapstyp, på grund av förväntad variation i kvantitet och växtartstyp mellan bigårdsplatser 14,27,33,43. Långvarig pollenfångst kan vara skadlig för honungsbikolonier. Potentiella effekter inkluderar minskad uppfödning av yngel, förkortning av larvtillväxtperioden och kannibalism av ägg och unga larver i bikuporna 19,44,45,46. Längre perioder av pollenfångst, såsom hela växtsäsongen, kan förvärra de skadliga effekterna på uppfödning av yngel i kolonier. Pollenfångst kan också orsaka en minskning av honungsproduktionen och en ökning av fuktnivån hos lagrad honung13. Roterande pollenfällor mellan kolonier i en bigård vid kontinuerlig övervakning av ett landskap eller odlingssystem kan mildra skador på kolonier som används för pollenfångst. Att engagera pollenfällor varannan vecka kommer att minska skadliga effekter, särskilt förlust av honungsproduktion, om man fångar pollen på samma kolonier under en tidsperiod13.
Dessutom placeras pollenfällorna företrädesvis på starka kolonier. Ibland kan pollenfällorna engagera sig oavsiktligt. Detta skulle kunna undvikas genom att låsa pollenfällemekanismen när insamling av pollenfällor inte är önskvärd. Pollenfällor tar inte bort all korbikulär pollen från honungsbi-födosökare. Fångsteffektiviteten beror på fälltyp, pollenpelletsstorlek, bikroppsstorlek, tid på dagen och väderförhållanden. Därför är insamling av korbikulärt pollen inte konsekvent när man använder pollenfällor för olika växtarter och insamlingsperioder25,26. Mindre pollenpellets från växter som Eucalyptus spp. och Tamarix spp. Noterbart är att ingen highbush blåbär (Vaccinium corymbosum L.) pollen hittades från highbush blåbärsuppsamlingsplatserna i denna studie, vilket stöder tidigare bevis för att highbush blåbärspollenpellets är för små för pollenfällsamling47. Däremot hittades pollen från maskros (Taraxacum officinale F.H. Wigg) i varje odlingssystem i denna studie. Pollenpellets av vissa växtarter kan också vara mycket större än andra, såsom Taraxacum spp., och kan möjligen vara överrepresenterade i analysen av pollensamlingar från pollenfällor27. Att fånga enskilda pollenförädlare och manuellt ta bort deras korbikulära pollen kommer att öka noggrannheten i en pollenkällbedömning, men det är mycket tids- och resurskrävande jämfört med att använda pollenfällor (tabell 1). Att sortera pollenpellets i färggrupper är relativt enkelt, även om det är tidskrävande. Om det inte finns ett specifikt forskningsmål eller mål bör mängden pollenpellets begränsas till 10 g eller mindre (för ett visst prov) för sortering i färggrupper. Att sortera hela prover som innehåller större mängder än denna mängd kommer drastiskt att öka den tid som krävs för att slutföra analysen. Det är dock avgörande att ett pollenprov blandas mycket väl innan ett delprov för färgsortering tas från det. Om det ursprungliga provet inte blandas kan det leda till ett delprov som inte är representativt för helheten, vilket bör undvikas.
Om den ursprungliga provbehållaren inte innehåller tillräckligt med ledigt utrymme för att möjliggöra noggrann blandning av pollenpellets, bör det räcka med att placera hela provet i en stor plastpåse eller en liten papperspåse, även för stora prover. Hårdplast, lockbehållare fungerar också. Blandning av provet bör göras försiktigt, så att pollenpellets inte krossas eller på annat sätt förstörs. Oavsiktlig partiskhet kan omedvetet övertala en att skopa ut "de vackra lila pelletsen", till exempel när man tar bort ett delprov från helheten. Därför bör provets färgkomposition döljas från vyn när man skopar ut ett delprov. På detta sätt är det mer troligt att få ett delprov som verkligen är representativt för helheten. Denna subsamplingsmetod kan dock misslyckas med att välja pollenpellets som finns i låg förekomst i provet. Därför, om det är ett forskningsmål att identifiera varje enskild växttaxon som representeras i provet, kommer det inte att vara lämpligt att samla in ett delprov. Hela provet måste analyseras. Därför bör pellets sorteras i en petriskål i glas. När sorteringen är klar kan lämpliga sidor i Pantone-färgguiden placeras under skålen för att underlätta färgmatchning mellan guiden och det sorterade pollenet. Ett exempel på detta illustreras i figur 5.
Vid fångst av pollen från honungsbikolonier placerade i grödor för pollinering bör inte mer än tio totala färggrupper användas: nio enskilda färger och en "diverse" färggrupp bestående av minoritetsfärgerna i provet. Att sätta en rimlig gräns för det maximala antalet färggrupper som ett prov kan delas in i förhindrar att forskaren fastnar genom att oändligt separera pellets i ständigt ökande antal extremt specifika grupper, som, när sorteringen är klar, kanske inte individuellt innehåller tillräckliga mängder för acetolys. Om fångst från kolonier som sannolikt födosöker från ett mycket varierat sortiment av växtarter kan fler färggrupper vara nödvändiga, och protokollen bör optimeras för att återspegla det kravet. Den aktuella studien fokuserade på pollenproverna som samlats in från honungsbikolonier som pollinerade grödor, och flera taxa hittades vanligtvis i en färggrupp, liknande tidigare studier 29,30,31.
Acetolys löser upp lipider, proteiner och organiskt skräp från ytan av pollenkorn och avslöjar exinens särskiljande karaktärer, så att kornen lättare kan färgas och identifieras. Det är en gammal och vanlig metod som används i många typer av pollenforskning37. De allmänna stegen är standardiserade; de varierar lite från protokoll till protokoll. Specifikationerna för centrifugeringshastigheter och -tider, inkubationstemperatur och varaktighet, pollenmängdsdrivna reagensvolymer och till och med supernatantavlägsnande metod (dekantering vs pipettering) kan dock behöva optimeras experimentellt enligt forskningsmål och i viss utsträckning de typer av pollen som sannolikt kommer att påträffas48. Faktum är att acetolys kan ta bort viktiga diagnostiska tecken hos pollen från vissa taxa som Malvaceae och Orchidaceae38. Därför är inte allt pollen mottagligt för standardmetoder för acetolys. Som nämnts ovan optimerades dessa metoder i denna studie i syfte att identifiera dominerande växttaxonkällor för pollen som samlats in av grödbestämande honungsbin. Detaljer som ska övervägas om exakt kvantifiering av pollenkorn är en del av studien har inte tagits upp i detta dokument.
Användningen av lösningsmedel och syror kräver noggrann planering, korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) och ansvarsfull avfallshantering (figur 6). Det är viktigt att forskare bestämmer rätt sätt att lagra reagenser och bortskaffa avfall innan de påbörjar någon del av acetolys. I detta laboratorium används butylhandskar under någon del av processen som involverar svavelsyra och till och med isättika eftersom de har mycket bättre nedbrytnings- och permeationsvärden för båda syrorna än nitrilhandskar, samtidigt som de inte äventyrar fingerfärdighet49. Det vore klokt att konsultera respektive institutions säkerhetsriktlinjer för rekommendationer om lämpliga handskar och annan personlig skyddsutrustning49. Tillsats av isättika före acetolyssteget hjälper till att avlägsna eventuell restfuktighet i provet och förbereder det för den viktiga acetolysreaktionen. Isättika-svavelsyrablandningen i acetolyssteget kan reagera våldsamt med vatten, varför det är viktigt att alla glasvaror och förnödenheter är helt torra och att all fukt avlägsnas från provet före acetolys. Tillsatsen av isättika efter acetolys späds ut och neutraliserar acetolysblandningen.
I synnerhet etanol och isättika kan lösa upp bläcket på mikrocentrifugrörsetiketter, om dessa reagenser droppar på utsidan av röret, även med lösningsmedelsbeständiga pennor. Kontrollera röretiketterna ofta under hela processen för att vara säker på att de fortfarande är läsbara. Om det är logistiskt möjligt kan du överväga att använda LaserJet-tryckta etiketter som ett skydd mot denna möjlighet. Det sätt på vilket supernatanter dekanteras kommer att påverka om reagenser dribblar ner utsidan av mikrocentrifugrören. Det är viktigt att dekantera supernatanten med en säker, slät hand, som kommer med övning. Försiktighet bör iakttas för att undvika förlust av pollenprover från centrifugröret under dekantering. Dekantering för snabbt riskerar att förlora en del eller hela pollenresten; Dekantering för långsamt kan resultera i att supernatanten rinner ner i röret. Även om en inkubationstemperatur på 100 °C vanligtvis rekommenderas, kan pollen lätt bli "överkokt" vid den temperaturen i de mängder som används i denna studie (0,25 g), särskilt om det inkuberas under något längre varaktigheter29. Faktum är att även vid 80 ° C kan pollenkorn brista eller på annat sätt skadas om de lämnas i acetolysblandningen för länge. Inkubationstemperatur och inkubationstid skall bestämmas noggrant för att undvika att pollenkornen i provet förstörs.
Färgning av pollen ökar definitionen och kontrasten av exine-funktionerna, vilket gör det lättare att fotografera och identifiera (figur 7). Fem droppar (från en plastöverföringspipett) av 1% Safranin O färgade effektivt 0,25 g pollen. Men olika pollen fläckar annorlunda. Om pollenkorn färgas för lätt eller för tungt kan identifiering vara svår. När så är möjligt bör den volym fläcklösning som behövs för att på lämpligt sätt fläcka de pollenarter som förväntas finnas i studien valideras innan bearbetningen av försöksproverna påbörjas. Icke desto mindre, om ett av de experimentella proverna inte är ordentligt färgat, kan det korrigeras. För att lätta ett pollenprov som färgas för kraftigt, skölj provet med vatten och sedan etanol. Om pollen inte är färgad tillräckligt bra för att se särdrag kan några ytterligare droppar fläck tillsättas. Fläcken av dessa prover bör kontrolleras innan glycerin tillsätts. På samma sätt kan vissa försök och fel behövas för att bestämma den ideala volymen glycerin för pollenresterna. Femton droppar glycerin skyddade på lämpligt sätt proverna i denna studie från att torka ut, samtidigt som pollenresterna späddes ut till en koncentration som är idealisk för nedströms identifiering via ljusmikroskopi. Andra mängder pollenrester kan kräva mer eller mindre glycerin för att förhindra uttorkning och underlätta montering.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) för att ha hjälpt till med färgsortering och acetolysanalys. Denna forskning stöddes av forskningsmedel som gavs till R.R.S. av Oregon State Beekeepers Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #8 hardware cloth | 2.7 mm aperture | ||
| 10 mL graduated cylinder | |||
| 1000 uL micropipette tips | |||
| 1250 mL filter micropipette tips | |||
| 15 x 75 mm glass slides | Thickness: 0.93 mm - 1.05 mm | ||
| 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| 250 mL graduated Borosilicate glass beakers (x3) | VWR | 10754-952 | |
| 50 mL graduated Borosilicate glass beakers (x6) | VWR | 10754-946 | |
| 95% EtOH | Pharmco AAPER | 111000200DM55 | ACS/USP/Kosher grade |
| Butyl vinyl gloves | |||
| Centrifuge | 1060 x g maximum speed; horizontal swing preferred | ||
| Chemical safety goggles | |||
| Color guide | Pantone | SKU: GP1601A | Solid coated |
| Coverslip of 1 or 1.5 | Thickness: 0.13 mm - 0.19 mm | ||
| Distilled water | |||
| Forceps | |||
| Fume hood | |||
| Glacial acetic acid | BDH Chemicals | BDH3092 | ACS grade |
| Glass funnel | |||
| Glycerin | Humco | 103196001_1 | USP grade, 99.5%, anhydrous |
| Hazardous waste containers | |||
| Hive tool | |||
| Hot block | Must reach 80 degree C | ||
| Lab coat with long sleeves | |||
| Latex or polyurethane foam | |||
| Microscope | |||
| Nailpolish, clear | |||
| Nitrile gloves | |||
| P1000 pipette | VWR | ||
| Petri dish | |||
| Plastic spoon | |||
| Safranin | Ward's Science | 470302-322 | Lab grade |
| Smoker | For pollen trap installation | ||
| Sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | ACS grade, powder |
| Squirt bottles (x2) | |||
| Sulfuric acid | EMD Millipore | SX1244 | ACS grade |
| Sundance Bottom Mount Pollen Trap | Betterbee Beekeeping Supply | PTRAPB | |
| Tape | |||
| Wooden stir sticks | |||
| Wooden tooth picks |
References
- Klein, A. M., Vaissière, B. E., Cane, J. H., Steffan-Dewenter, I., Cunningham, S. A., Kremen, C., Tscharntke, T. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 274 (1608), 303-313 (2007).
- vanEngelsdorp, D., Hayes, J., Underwood, R. M., Pettis, J. S. A survey of honey bee colony losses in the United States, fall 2008 to spring 2009. Journal of Apicultural Research. 49 (1), 7-14 (2010).
- vanEngelsdorp, D., Hayes, J., Underwood, R. M., Caron, D., Pettis, J. S. A survey of managed honey bee colony losses in the USA, fall 2009 to winter 2010. Journal of Apicultural Research. 50 (1), 1-10 (2011).
- vanEngelsdorp, D., et al. A national survey of managed honey bee 2010-11 winter colony losses in the USA: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 51 (1), 115-124 (2012).
- Spleen, A. M., et al. A national survey of managed honey bee 2011-12 winter colony losses in the United States: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 52 (2), 44-53 (2013).
- Steinhauer, N. A., et al. A national survey of managed honey bees 2012-2013 annual colony losses in the USA: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 1-18 (2014).
- Lee, K. V., et al. A national survey of managed honey bee 2013-2014 annual colony losses in the USA. Apidologie. 46 (3), 292-305 (2015).
- Seitz, N., et al. A national survey of managed honey bee 2014-2015 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 54 (4), 1-12 (2016).
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Steinhauer, N., et al.
- Smart, M. D., Pettis, J. S., Euliss, N., Spivak, M. S. Land use in the Northern Great Plains region of the U.S. influences the survival and productivity of honey bee colonies. Agriculture, Ecosystems & Environment. 230, 139-149 (2016).
- Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PloS One. 8 (7), 70182 (2013).
- Hoover, S. E., Ovinge, L. P. Pollen collection, honey production, and pollination services: managing honey bees in an agricultural setting. Journal of Economic Entomology. 111 (4), 1509-1516 (2018).
- Topitzhofer, E., Lucas, H., Chakrabarti, P., Breece, C., Bryant, V., Sagili, R. R. Assessment of pollen diversity available to honey bees (Hymenoptera: Apidae) in major cropping systems during pollination in the western United States. Journal of Economic Entomology. 112 (5), 2040-2048 (2019).
- Judd, H. J., Huntzinger, C., Ramirez, R., Strange, J. P. A 3D printed pollen trap for bumble bee (Bombus) hive entrances. Journal of Visualized Experiments. (161), e61500 (2020).
- Delaplane, K. S., Dag, A., Danka, R. G., Freitas, B. M., Garibaldi, L. A., Goodwin, R. M., Hormaza, J. I. Standard methods for pollination research with Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-28 (2013).
- Barker, R. J. The influence of food inside the hive on pollen collection by a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 10 (1), 23-26 (1971).
- Levin, M. D., Loper, G. M. Factors affecting pollen trap efficiency. American Bee Journal. 124 (10), 721-723 (1984).
- Webster, T. C., Thorp, R. W., Briggs, D., Skinner, J., Parisian, T. Effects of pollen traps on honey bee (Hymenoptera: Apidae) foraging and brood rearing during almond and prune pollination. Environmental Entomology. 14 (6), 683-686 (1985).
- Gemeda, T. K., Li, J., Luo, S., Yang, H., Jin, T., Huang, J., Wu, J., Nascimento, F. S. Pollen trapping and sugar syrup feeding of honey bee (Hymenoptera: Apidae) enhance pollen collection of less preferred flowers. PLoS One. 13 (9), 0203648 (2018).
- Hellmich, R. L., Rothenbuhler, W. C. Relationship between different amounts of brood and the collection and use of pollen by the honey bee (Apis mellifera). Apidologie. 17 (1), 13-20 (1986).
- Weidenmüller, A., Tautz, J. In-hive behavior of pollen foragers (Apis mellifera) in honey bee colonies under conditions of high and low pollen need. Ethology. 108 (3), 205-221 (2002).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. The influence of pollen quality on foraging behavior in honeybees (Apis mellifera L.). Behavioral Ecology and Sociobiology. 51 (1), 53-68 (2001).
- Couvillon, M. J., et al. Honey bee foraging distance depends on month and forage type. Apidologie. 46, 61-70 (2015).
- Percival, M. Pollen collection by Apis mellifera. New Phytologist. 46, 142-165 (1947).
- Synge, A. D. Pollen collection by honey bees (Apis mellifera). Journal of Animal Ecology. 16, 122-138 (1947).
- O'Neal, R. J., Waller, G. D. On the pollen harvest by the honey bee (Apis mellifera L.) near Tucson, Arizona (1976-1981). Desert Plants. 6, 81-109 (1984).
- Eckert, C. D., Winston, M. L., Ydenberg, R. C. The relationship between population size, amount of brood, and individual foraging behaviour in the honey bee, Apis mellifera. Oecologia. 97 (2), 248-255 (1994).
- Free, J. B. The flower constancy of honey bees. Journal of Animal Ecology. 32 (1), 119-132 (1963).
- van der Moezel, P. G., Delfs, J. C., Pate, J. S., Loneragan, W. A., Bell, D. T. Pollen selection by honeybees in shrublands of the Northern Sandplains of Western Australia. Journal of Apicultural Research. 26 (4), 224-232 (1987).
- Hill, P. S., Wells, P. H., Wells, H. Spontaneous flower constancy and learning in honey bees as a function of color. Animal Behaviour. 54 (3), 615-627 (1997).
- Barth, O., Munhoz, M., Luz, C. Botanical origin of Apis pollen loads using colour, weight and pollen morphology data. Acta Alimentaria. 38, 133-139 (2009).
- Colwell, M. J., Williams, G. R., Evans, R. C., Shutler, D. Honey bee-collected pollen in agro-ecosystems reveals diet diversity, diet quality, and pesticide exposure. Ecology and Evolution. 7 (18), 7243-7253 (2017).
- Stoner, K. A., Cowles, R. S., Nurse, A., Eitzer, B. D. Tracking pesticide residues to a plant genus using palynology in pollen trapped from honey bees (Hymenoptera: Apidae) at ornamental plant nurseries. Environmental Entomology. 48 (2), 351-362 (2019).
- Almeida-Muradian, L., Pamplona, L. C., Coimbra, S. I., Barth, O. M. Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets. Journal of Food Composition and Analysis. 18 (1), 105-111 (2005).
- Lau, P., Bryant, V., Rangel, J. Determining the minimum number of pollen grains needed for accurate honey bee (Apis mellifera) colony pollen pellet analysis. Palynology. 42 (1), 36-42 (2018).
- Erdtman, G. Handbook of palynology: morphology, taxonomy, ecology: an introduction to the study of pollen grains and spores. , Munksgaard, Copenhagen, DK. (1969).
- Jones, G. D. Pollen analyses for pollination research, acetolysis. Journal of Pollination Ecology. 13 (21), 203-217 (2014).
- Richardson, R. T., Lin, C. H., Sponsler, D. B., Quijia, J. O., Goodell, K., Johnson, R. M. Application of ITS2 metabarcoding to determine the provenance of pollen collected by honey bees in an agroecosystem. Applied Plant Science. 3 (1), 1-6 (2015).
- Dimou, M., Thrasyvoulou, A., Tsirakoglou, V. Efficient use of pollen traps to determine the pollen flora used by honey bees. Journal of Apicultural Research. 45 (1), 42-46 (2005).
- Szczesna, T., Rybak-Chmielewska, H., Chmielewski, W. Effect of infestation of pollen loads with acarid mites on amino acid content and organoleptic characteristics of the product. Pszczelnicze Zeszyty Naukowe. 43 (1), 235-245 (1999).
- Stoner, K. A., Eitzer, B. D. Using a hazard quotient to evaluate pesticide residues detected in pollen trapped from honey bees (Apis mellifera) in Connecticut. PLoS One. 8 (10), 77550 (2013).
- Garbuzov, M., Couvillon, M. J., Schürch, R., Ratnieks, F. L. Honey bee dance decoding and pollen-load analysis show limited foraging on spring-flowering oilseed rape, a potential source of neonicotinoid contamination. Agriculture, Ecosystems & Environment. 203, 62-68 (2015).
- Moeller, F. E. Managing colonies for pollen production. Proceedings of 26th International Agricultural Congress. , Adelaide, SA. 232-239 (1977).
- Dustmann, J. H., Ohe, W. V. D. Einfluss von Kälteeinbrüchen auf die Frühjahresentwicklung von Bienenvölkern (Apis mellifera L). Apidologie. 19 (3), 245-254 (1988).
- Schmickl, T., Crailsheim, K. J. Cannibalism and early capping: strategy of honeybee colonies in times of experimental pollen shortages. Journal of Comparative Physiology A. 187 (7), 541-547 (2001).
- Hodges, D. The pollen loads of the honeybee: a guide to their identification by colour and form. , London Hill House. Chalfont St Peter, UK. (1974).
- Jones, G. D.
- Ansell, Chemical resistance guide. Permeation and degradation data. 8th Ed. , Available from: https://ehs.unc.edu/files/2015/09/Ansell_8thEditionChemicalResistanceGuide.pdf (2020).
