Summary
La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.
Abstract
Le muscle squelettique a une capacité remarquable à se régénérer après une blessure, qui est entraînée par des cellules souches musculaires résidentes dans les tissus obligatoires. Après une blessure, la cellule souche musculaire est activée et subit une prolifération cellulaire pour générer un pool de myoblastes, qui se différencient ensuite pour former de nouvelles fibres musculaires. Dans de nombreuses conditions d’atrophie musculaire, y compris la dystrophie musculaire et le vieillissement, ce processus est altéré, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Le processus de régénération musculaire chez le poisson-zèbre est hautement conservé avec des systèmes mammifères fournissant un excellent système pour étudier la fonction et la régénération des cellules souches musculaires, dans des conditions d’atrophie musculaire telles que la dystrophie musculaire. Ici, nous présentons une méthode pour examiner la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire. La première étape consiste à utiliser une plateforme de génotypage qui permet de déterminer le génotype des larves avant de provoquer une blessure. Après avoir déterminé le génotype, le muscle est blessé à l’aide d’un coup de couteau à aiguille, après quoi la microscopie à lumière polarisante est utilisée pour déterminer l’étendue de la régénération musculaire. Nous fournissons donc un pipeline à haut débit qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.
Introduction
Le muscle squelettique représente 30 à 50% de la masse corporelle humaine et est non seulement indispensable à la locomotion, mais il sert également d’organe métabolique et de stockage critique1. Bien qu’il soit postmitotique, le muscle squelettique est très dynamique et conserve une énorme capacité de régénération après une blessure. Ceci est attribué à la présence de cellules souches résidentes tissulaires (également appelées cellules satellites), situées sous la lame basale des myofibres et marquées par les facteurs de transcription appariés boîte protéine 7 (pax7) et / ou protéine boîte appariée 3 (pax3), entre autres2,3. Après une blessure, la cellule satellite est activée et subit une prolifération cellulaire pour générer un pool de myoblastes, qui se différencient ensuite pour former de nouvelles fibres musculaires. La cascade hautement conservée de signaux pro-régénératifs régulant l’activation des cellules satellites et la réparation musculaire robuste est affectée dans diverses conditions telles que les myopathies et le vieillissement homéostatique4,5.
L’un de ces groupes diversifiés de myopathies est la dystrophie musculaire, caractérisée par une atrophie musculaire progressive et une dégénérescence6. Ces maladies sont la conséquence de mutations génétiques dans des protéines clés, dont la dystrophine et la laminine-α2 (LAMA2), responsables de la fixation des fibres musculaires à la matrice extracellulaire7,8. Étant donné que les protéines impliquées dans la dystrophie musculaire jouent un rôle central dans le maintien de la structure musculaire, on a cru pendant de nombreuses années qu’un échec de ce processus était le mécanisme responsable de la pathogenèse de la maladie9. Cependant, des études récentes ont identifié des défauts dans la régulation des cellules souches musculaires et une altération ultérieure de la régénération musculaire comme deuxième base possible pour la pathologie musculaire observée dans la dystrophie musculaire10,11. En tant que tel, d’autres études sont nécessaires pour étudier comment une altération de la fonction des cellules souches musculaires et des éléments de niche associés contribue à la dystrophie musculaire.
Au cours de la dernière décennie, le poisson-zèbre(Danio rerio)est devenu un modèle important de vertébrés pour la modélisation des maladies12. Ceci est attribué au développement externe rapide de l’embryon de poisson zèbre, associé à sa clarté optique, qui permet la visualisation directe de la formation, de la croissance et de la fonction musculaires. De plus, non seulement le développement et la structure des muscles sont hautement conservés chez le poisson-zèbre, mais ils présentent également un processus de régénération musculaire hautement conservé13. Par conséquent, le poisson-zèbre représente un excellent système pour étudier la pathobiologie des maladies musculaires et explorer comment la régénération musculaire y est affectée. À cette fin, nous avons développé une méthode qui permet l’étude opportune de la régénération musculaire squelettique dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre. Ce pipeline à haut débit implique une méthode de génotype d’embryons vivants14, à la suite de laquelle une blessure à l’aiguille est effectuée et l’étendue de la régénération musculaire est imagée à l’aide de la microscopie à lumière polarisante. L’utilisation de cette technique révélera donc la capacité de régénération du muscle dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.
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Protocol
L’entretien du poisson-zèbre a été effectué conformément aux procédures d’exploitation normalisées approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université Monash en vertu de la licence de colonie de reproduction ERM14481.
1. Détermination du génotype d’embryons vivants à l’aide d’une plateforme de génotypage d’embryons.
- Anesthésier 3 jours après la fécondation (dpf) des embryons de poisson zèbre en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à une concentration finale de 0,016 % (v/v) dans un milieu embryonnaire (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4 dans l’eau). Attendez 10 minutes pour vous assurer que les poissons sont complètement anesthésésés, ce qui est évident lorsque les poissons cessent de nager.
- Préparez la puce d’extraction d’ADN à 24 chambres en pelant le film protecteur transparent de la surface supérieure de la puce (Figure 1A).
- Coupez l’extrémité d’une pointe de filtre de 20 μL pour élargir l’ouverture. En utilisant cela, choisissez un seul embryon dans un volume de 13 μL de milieu embryonnaire et chargez-le dans la première chambre de la puce. Répétez ce processus jusqu’à ce que les embryons aient été distribués dans chaque chambre.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans une zone avec des courants d’air minimaux, car un débit d’air élevé peut provoquer une évaporation excessive du fluide entraînant par la suite une réduction de la sensibilité au génotypage et de la survie des embryons. - Une fois que le nombre souhaité d’embryons a été chargé sur la puce d’extraction d’ADN, chargez-la sur la plate-forme de génotypage d’embryons de poisson zèbre. Ceci est mieux réalisé en plaçant d’abord d’un côté, suivi du reste.
REMARQUE: Évitez d’ajouter trop de pression sur la plate-forme, car cela pourrait troptrer et endommager les ressorts sous-jacents. - Apposez le couvercle de la plate-forme magnétique sur la puce, ce qui empêchera l’évaporation des milieux embryonnaires pendant le protocole d’extraction de l’ADN, et fermez le couvercle de la plate-forme.
- Réglez l’unité de base sur 2,4 volts, 0,051 A et 0,12 W et démarrez le protocole d’extraction d’ADN en appuyant sur le bouton « ON / OFF ». La plate-forme doit commencer à vibrer, ce qui peut être évalué en touchant doucement le couvercle. Le protocole doit être exécuté pendant 8 minutes.
REMARQUE: La vibration vigoureuse entraîne l’excrétion des cellules épidermiques, à partir desquelles l’ADN génomique est extrait. - Pendant que le programme est en cours, préparez une plaque de 24 puits en ajoutant 1 mL de milieu embryonnaire à chaque puits, ce qui est nécessaire pour séparer les embryons individuels pendant que des tests de génotypage en aval sont effectués.
- De plus, étiquetez de manière appropriée 8 tubes à bande de puits, qui seront utilisés pour la collecte de matériel ADN de chaque embryon.
- À la fin du protocole de 8 minutes, appuyez sur le bouton ON/OFF pour arrêter les vibrations de la plate-forme.
- Ouvrez le couvercle de la plate-forme et retirez doucement le couvercle magnétique en veillant à ce qu’une pression minimale soit appliquée à la plate-forme.
- Retirez soigneusement la puce d’extraction d’ADN de la plate-forme et placez-la sur une surface plane.
- De la première chambre, retirez 10 μL de milieux embryonnaires entourant l’embryon et placez-le dans le puits approprié du tube à bande de 8 puits. Le milieu contient le matériel génétique de cet embryon, qui sera utilisé pour les essais en aval.
REMARQUE: Évitez de toucher l’embryon avec la pointe de la pipette pendant la collecte du média, car cela pourrait endommager l’embryon. - À l’aide d’une pipette en plastique, ajoutez immédiatement deux gouttes de milieu embryonnaire frais dans la même chambre. Recueillez l’embryon et déplacez-le vers le premier puits d’une plaque de 24 puits.
- Répétez les étapes 1.12 et 1.13 pour toutes les chambres restantes. À la fin de cette opération, la plaque de 24 puits contenant des embryons vivants peut être déplacée vers un incubateur à 28 °C.
- Effectuer des tests de génotypage en aval appropriés pour déterminer le génotype des embryons.
REMARQUE: L’ADN obtenu à partir de la plate-forme de génotypage embryonnaire peut être amplifié avec succès par PCR et peut être utilisé pour une analyse ultérieure, y compris le séquençage, l’électrophorèse sur gel ou l’analyse de fusion à haute résolution14. Pour génotyper la souche lama2 décrite dans les résultats représentatifs, la PCR, la digestion de restriction et l’électrophorèse sur gel ont été utilisées. Étant donné que la concentration d’ADN obtenue à partir de chaque embryon est faible, il est suggéré d’utiliser la plupart, sinon la totalité, du matériel génétique obtenu pour le test en aval. - Une fois que le génotype de chaque larve a été identifié, transférez-les dans des boîtes de Petri de 90 mm, en plaçant chaque génotype dans un plat différent. Remplissez le plat avec 25 mL de milieu embryonnaire et conservez-le dans l’incubateur à 28 °C.
2. Effectuer une blessure musculaire à l’aide d’un coup de couteau à l’aiguille
- Une fois que les larves ont 4 dpf, anesthésiez-les en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à une concentration finale de 0,016% (v / v) dans le milieu embryonnaire. Attendez 10 minutes pour vous assurer que les poissons sont complètement anesthésésés, ce qui est évident lorsque les poissons cessent de nager.
REMARQUE: Pour éviter tout biais, l’identité du génotype doit être aveuglée par l’investigateur effectuant les coups de couteau et les analyses en aval. - Pendant ce temps, préparez 24 plaques de puits en remplissant chaque puits avec 1 mL de milieu embryonnaire frais et installez le stéréomicroscope avec un fond noir et une lumière de haute puissance, pour faciliter la visualisation des bordures de somite.
- À l’aide d’une pipette en plastique, transférez une larve anesthésiée dans une nouvelle boîte de Pétri.
- Retirez soigneusement l’excès de milieu embryonnaire à l’avec une pipette et, sous un microscope à dissection, orientez le poisson de manière à ce que la tête soit à gauche, la queue à droite, la région dorsale vers le haut et la région ventrale vers le bas(Figure 1B).
- En travaillant sous un microscope à dissection, utilisez une aiguille de calibre 30 pour effectuer un coup de couteau rapide mais précis dans le muscle époxyde situé au-dessus du myoseptum horizontal. Pour assurer la cohérence en position antérieure-postérieure, visez 1-2 somites situés au-dessus du pore anal (Figure 1B).
REMARQUE: Évitez de poignarder le tube neural et la notochorde, et travaillez rapidement pour éviter le séchage du poisson pendant le processus. - À l’aide d’une pipette en plastique, versez une goutte de milieu embryonnaire sur le poisson-zèbre poignardé et transférez-la soigneusement dans un puits de la plaque de 24 puits.
- Répétez les étapes 2.3 à 2.6. jusqu’à ce que tous les poissons aient été poignardés.
REMARQUE: Plusieurs larves peuvent être poignardées ensemble en fonction de la vitesse de traitement et des compétences de l’enquêteur, tant que les poissons ne sèchent pas pendant le processus. - Une fois que toutes les larves ont été poignardées, placez la plaque de 24 puits dans l’incubateur à 28 °C jusqu’à ce que l’imagerie ultérieure soit effectuée.
3. Imagerie de la blessure musculaire et récupération
- 1 jour après la blessure (1 dpi), anesthésier les larves poignardées en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à une concentration finale de 0,016 % (v/v) dans le milieu embryonnaire. Attendez 10 minutes pour vous assurer que les poissons sont complètement anesthésésés, ce qui est évident lorsque les poissons cessent de nager.
REMARQUE: À 0 dpi, le site de la plaie contient une grande quantité de débris cellulaires, ce qui rend difficile la quantification de l’étendue de la lésion musculaire (Figure supplémentaire 1A-B). Il faut environ 18 à 20 heures pour que ces débris soient éliminés du site de la plaie et, en tant que tels, il est plus fiable d’imager les larves à 1 dpi, plutôt qu’à 0 dpi, pour déterminer l’étendue des blessures provoquées. - Placez un fond en verre propre et vide sur la scène du microscope polarisant et réglez l’arrière-plan à l’aide du logiciel intégré.
REMARQUE: N’utilisez pas de boîtes de Petri en plastique pour imager la biréfringence, car elles ne transmettent pas correctement la lumière réfractée. Selon le microscope polarisé utilisé, des réglages supplémentaires peuvent être nécessaires conformément aux directives du fabricant. - Après avoir réglé l’arrière-plan, retirez le plat à base de fond de verre de l’étage du microscope et, à l’aide d’une pipette en verre, transférez le poisson anesthésié et poignardé sur le plat à fond en verre.
- Retirez soigneusement l’excès de milieu embryonnaire à l’aide d’une pipette et orientez le poisson selon 2,5 - la tête est à gauche, la queue à droite, la région dorsale vers le haut et la région ventrale vers le bas.
REMARQUE: Assurez-vous que les larves sont montées aussi plates que possible, car un montage inégal entraîne différentes intensités de biréfringence entre différentes somites. - Placez le plat à fond de verre avec les larves anesthésiées sur la scène du microscope et imagez le muscle à l’aide d’une lumière polarisée(figures 1C et 1D).
REMARQUE: Selon le type de microscope / lentille polarisée utilisé, l’orientation du poisson sur son axe antérieur-postérieur peut affecter la biréfringence globale15. Assurez-vous d’inclure au moins 5 somites de chaque côté du site de la blessure lors de l’imagerie. - À l’aide d’une pipette en plastique, versez une goutte de milieu embryonnaire pour réhydrater le poisson et placez le poisson dans un puits d’une plaque de 24 puits remplie de milieu embryonnaire.
REMARQUE: Il est important d’effectuer l’imagerie le plus rapidement possible pour empêcher le poisson de sécher. - Répétez les étapes 3.3. à 3.6. jusqu’à ce que tous les poissons aient été imagés.
- Lorsque toutes les images ont été acquises, enregistrez-les dans .tiff format pour des analyses ultérieures.
- Remettre le poisson dans l’incubateur à 28 °C jusqu’à ce qu’il effectue une imagerie ultérieure à 3 dpi (7 dpf).
- Lorsque les poissons ont 3 dpi, imaginez le poisson selon 3,3 à 3,8.
- Une fois que tous les poissons ont été imagés, euthanasiez-les en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à une concentration finale de 0,2 % (v/v) dans le milieu embryonnaire. Attendez au moins 10 minutes pour vous assurer que les poissons sont euthanasiés, comme en témoignent la perte de capacité de nage, le pompage des couvertures branchiales et l’absence de réponse de vol après le toucher.
4. Quantification de la régénération musculaire
- Ouvrez une image de 1 dpi sur un logiciel d’analyse d’imagerie tel que le logiciel Image J disponible gratuitement.
- À l’aide de l’outil polygone, dessinez autour du site de la plaie et mesurez l’aire et l’intensité moyenne de biréfringence de cette région(figures 1C et 1D). Copiez ces valeurs dans les cellules D3 et E3 du modèle fourni (Tableau supplémentaire 1).
- Dessinez deux régions supplémentaires, chacune couvrant 1 à 2 somites non blessées, et mesurez la superficie et les intensités moyennes de biréfringence de chacune de ces régions (Figures 1C & 1D). Copiez ces valeurs dans les cellules D4-D5 et E4-E5 du modèle fourni (Tableau supplémentaire 1).
REMARQUE: Bien qu’il soit préférable de sélectionner les mêmes somites non blessées dans les images de 1 dpi et 3 dpi, le détachement sporadique des fibres musculaires et la réduction subséquente de la biréfringence chez les mutants peuvent rendre cela impossible. Par conséquent, dans le cas où les mêmes somites ne peuvent pas être sélectionnées à 1 dpi et 3 dpi en raison de la réduction de l’intégrité musculaire chez les mutants, sélectionnez deux zones différentes mais non affectées à chacun des points temporels. - Calculer la biréfringence normalisée pour chaque région en divisant l’intensité moyenne de biréfringence de cette région par la zone - affichée dans la colonne F du modèle fourni (Tableau supplémentaire 1).
- Répétez les étapes 4.1 à 4.4 pour toutes les images 1 dpi et 3 dpi.
REMARQUE: Lors de l’utilisation du modèle fourni (Tableau supplémentaire 1), les valeurs d’intensité de biréfringence moyenne et de surface de biréfringence moyenne de 1 dpi doivent être insérées dans les colonnes D et E respectivement, et les valeurs d’intensité de biréfringence moyenne de 3 dpi et d’intensité de biréfringence moyenne doivent être insérées dans les colonnes J et K respectivement. - Pour chaque point temporel, calculez la biréfringence normalisée moyenne des deux régions non blessées. Cette valeur fournit un point de référence pour un muscle non blessé.
REMARQUE: Dans le modèle fourni (Tableau supplémentaire 1), cette valeur est calculée dans les colonnes G et M, pour les images 1 dpi et 3 dpi respectivement. - Ensuite, déterminez l’étendue de la lésion musculaire à 1 dpi, en divisant la biréfringence normalisée de la région de la blessure par la biréfringence normalisée moyenne des régions non blessées (calculée en 4,6).
REMARQUE: En utilisant la procédure détaillée de poignard à l’aiguille ci-dessus, les larves de type sauvage présentent généralement une biréfringence normalisée de 48,5 ± 14,3% au site de la plaie à 1 dpi, ce qui indique que la biréfringence a diminué d’environ 50% par rapport aux somites non blessées. Lors de l’utilisation du modèle (Tableau supplémentaire 1), cette valeur est calculée en pourcentage dans la colonne H. - Pour déterminer l’étendue de la régénération musculaire, divisez la biréfringence normalisée de la région de la blessure dans l’image de 3 dpi, par l’intensité normalisée moyenne des régions non blessées à ce stade.
REMARQUE: À 3 dpi, les larves de type sauvage présentent généralement une biréfringence normalisée de 60 ± 15,3% au site de la plaie. Étant donné que la biréfringence normalisée à l’intérieur du site de la plaie à 1 dpi était de 48,5 ± 14,3 % (étape 4,7), l’augmentation de la biréfringence à 3 dpi à 60 ± 15,3 % indique une récupération d’environ 11,5 %. Lors de l’utilisation du modèle (Tableau supplémentaire 1), cette valeur est calculée en pourcentage dans la colonne N. - En gardant les poissons dans chaque génotype séparés, effectuez un test t apparié comparant la biréfringence normalisée du site de la plaie à 3 dpi (étape 4.8) avec celle de 1 dpi (étape 4.7). Cela révélera la trajectoire de régénération musculaire affichée par chaque poisson dans chaque génotype, et mettra en évidence si l’étendue de la régénération musculaire affichée par chaque génotype a considérablement changé.
- Enfin, calculez l’indice de régénération en divisant la valeur obtenue à l’étape 4.8, qui est l’étendue de la régénération musculaire à 3 dpi, par la valeur obtenue à l’étape 4.7, qui est l’étendue de la lésion musculaire à 1 dpi. Un indice de régénération de 1 indique que la blessure à 1 dpi est comparable à 3 dpi et que la régénération musculaire ne s’est pas produite; une valeur supérieure à 1 indique qu’à 3 dpi, un nouveau muscle s’est formé dans le site de la plaie, ce qui souligne que le muscle s’est régénéré; et un indice de régénération inférieur à 1 met en évidence que la plaie à 3 dpi est pire que 1 dpi, et que la régénération musculaire est altérée. Un test t ou une ANOVA unidirectionnelle peut être effectué pour comparer statistiquement l’étendue de la régénération musculaire entre les différents génotypes. Lorsque vous utilisez le modèle fourni (Tableau supplémentaire 1), cette valeur est calculée dans la colonne O.
REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer toute l’expérience en trois exemplaires, avec des poissons de chaque expérience obtenus de parents biologiques différents, et chaque expérience réalisée à des jours différents, pour éviter tout biais.
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Representative Results
La capacité de quantifier la biréfringence du muscle squelettique fournit une méthode non invasive mais hautement reproductible pour examiner et comparer les niveaux de lésions musculaires, et examiner la régénération musculaire in vivo. La biréfringence résulte de la diffraction de la lumière polarisée à travers le réseau pseudo-cristallin des sarcomères musculaires15, et suite à une blessure ou à une lésion du muscle, une réduction de la biréfringence est évidente. De même, l’activation et la différenciation des cellules souches entraînent la formation de nouvelles fibres musculaires dans le site de la blessure, augmentant par la suite l’intensité de la biréfringence dans cette région. En utilisant ce système, nous avons examiné la régénération musculaire dans un modèle de poisson zèbre de dystrophie musculaire congénitale de type 1A (MDC1A), causée par une carence en Lama216. Une couvée d’embryons provenant d’un croisement entre deux poissons-zèbres lama2+/- a été collectée, et à 3 dpf, les embryons ont été transférés sur une puce d’extraction d’ADN(Figure 1A)puis génotypés à l’aide d’une technologie de génotypage d’embryons. Après avoir identifié le génotype, les larves de lama2-/- qui modélisent MDC1A16, et les frères et sœurs lama2+/+ ont été blessés à l’aide d’un coup de couteau à l’aiguille conformément à la figure 1B,et imagés sur un microscope polarisant à 1 dpi et 3 dpi, et les intensités de biréfringence ont été quantifiées. Alors que les lésions musculaires entraînent une réduction de l’intensité de la biréfringence à 1 dpi(Figure 1Ci et Di),la régénération réussie du muscle entraîne une augmentation de la biréfringence dans la même région(Figure 1Cii et Dii). Il convient également de noter que si les larves de lama2+/+ présentent une intensité de biréfringence uniforme(Figure 1C),en raison d’un schéma musculaire normal, l’intensité de biréfringence dans le muscle de lama2-/- était inégale et très sporadique(Figure 1D),attribuée à une intégrité musculaire réduite.
En utilisant cette approche, nous révélons que les deux larves de type sauvage (lama2+/+; Figure 2A), et larves déficientes en lama2 (lama2-/-; Figure 2B), montrent une augmentation significative de l’intensité de la biréfringence dans le site de la plaie à 3 dpi par rapport à 1 dpi (Figure 2C), indiquant que le muscle s’est régénéré. Pour comparer le potentiel de régénération des larves dans chaque génotype, l’indice de régénération a été déterminé, et nous révélons que les larves de lama2-/- présentaient une augmentation frappante de la régénération musculaire par rapport aux larves de lama2+/+ (Figure 2D; moyenne en lama2-/- = 1,30 ±- 0,251 ; moyenne en lama2-/- = 1,83 ± 0,439). Pour valider davantage l’amélioration de la régénération chez les larves de lama2-/-, nous avons coloré le muscle avec un anticorps contre la F-Actine ( Figuresupplémentaire 1B-D). Bien que ces résultats confirment que le lama2-/- se régénère effectivement, comme en témoigne la présence de fibres musculaires différenciées dans le site de la plaie, l’incapacité d’examiner le même poisson à 1 dpi et 3 dpi limite la capacité de quantifier et de comparer la réponse régénérative entre les poissons lama2+/+ et lama2-/-. Bien que la base mécaniste de cette capacité de régénération améliorée chez les larves de lama2-/- reste insaisissable, nous pensons que la perte de lama2 augmente le nombre de cellules souches activées, ce qui entraîne par la suite une amélioration de la régénération musculaire. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour déterminer cela. Collectivement, ces résultats mettent en évidence la capacité de la technique décrite à identifier les changements dans la régénération musculaire dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.
Figure 1: Vue d’ensemble du protocole de génotypage et de régénération musculaire. (A) Image d’une puce d’extraction d’ADN contenant 24, 3 dpf larves de poisson zèbre. (B) Schéma de l’orientation dans laquelle les 4 larves de dpf doivent être placées pour effectuer le coup de couteau à l’aiguille, avec la tête à gauche, la queue à droite, la région dorsale vers le haut et la région ventrale vers le bas. Le coup de poignard à l’aiguille doit être effectué à l’aide d’une aiguille de calibre 30, ciblant 1-2 somites de muscle époxyde. Créé avec BioRender.com. (C-D) Images de biréfringence chez une larve de lama2+/+ et de lama2-/- à 1 dpi et 3 dpi. Les régions indiquées en blanc et en rouge reflètent les zones utilisées pour quantifier la biréfringence dans le site de la plaie et les somites non blessées respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Quantification de la régénération musculaire chez les larves de poisson zèbre déficientes en lama2. Images de biréfringence chez les larves de lama2+/+ (A) et de lama2-/- (B) à 1 dpi et 3 dpi. La plaie à 3 dpi dans les larves de lama2+/+ et de lama2-/- est remplie de nouveau muscle. (C) Graphique de la biréfringence normalisée de chaque larve à 1 dpi et 3 dpi. La biréfringence normalisée dans le site de la plaie chez les larves de lama2+/+ et de lama2-/- est significativement augmentée à 3 dpi, comme déterminé à l’aide d’un test t apparié. (D) Indice de régénération dans le lama2+/+et le lama2-/- ce dernier montrant une régénération musculaire accrue, déterminée à l’aide d’un test t. Les barres d’erreur représentent le SEM avec des larves de trois expériences indépendantes (lama2+/+n=28 et lama2-/- n=16). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1: Examen de la régénération musculaire chez les larves déficientes en lama2. Images de biréfringence chez les larves de lama2+/+ (Ai) et de lama2-/- (Aii) à 0 dpi démontrant la présence de débris cellulaires dans le site de la plaie. Images confocales de projection maximale du myotome larvaire coloré pour la F-actine à 0 dpi (B), 1 dpi (C) et 3 dpi (D). À 3 dpi, le site de la plaie des larves de lama2+/+ et de lama2-/- est caractérisé par l’apparition de fibres musculaires marquées F-actine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Modèle pour la quantification de la régénération musculaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La régénération des muscles squelettiques est entraînée par des cellules souches musculaires résidentes des tissus obligatoires, dont la fonction est altérée dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, entravant par la suite le processus de régénération musculaire. Ici, nous décrivons un protocole à haut débit pour examiner la régénération musculaire dans des modèles vivants de poisson zèbre de maladie musculaire. La première étape du pipeline utilise une plate-forme de génotypage d’embryons14, qui est une méthode conviviale et précise pour déterminer le génotype des larves vivantes, avant d’effectuer le test de régénération en aval. Un avantage direct de ceci est qu’il permet la sélection de génotypes qui ne sont d’intérêt que, et / ou un nombre comparable de poissons dans chaque groupe de génotypes, réduisant ainsi considérablement le nombre de poissons qui doivent être traités dans le reste du protocole. Cependant, il convient de noter que la quantité d’ADN génomique obtenue à partir du dispositif de génotypage embryonnaire est relativement faible, ce qui peut compromettre les essais de génotypage en aval. Il est donc important que tous les tests de génotypage soient testés et optimisés avant de les utiliser pour l’expérience principale. De plus, la source de l’ADN est principalement épidermique et, en tant que tel, le système de génotypage embryonnaire ne peut pas être utilisé avec succès pour génotyper des larves présentant des mutations spécifiques aux tissus.
La deuxième partie du protocole démontre l’utilisation d’une blessure à l’aiguille, qui est une technique rentable et à haut débit qui non seulement entraîne une taille de blessure hautement reproductible, mais est également suffisante pour déclencher l’activation des cellules souches musculaires entraînant la régénération musculaire. Une autre approche pour induire une lésion musculaire squelettique chez le poisson-zèbre consiste à utiliser l’ablation cellulaire médiée par laser13,17,18 . Bien que cela permette de se concentrer sur des plans x, y et z spécifiques et de cibler ensuite des cellules musculaires uniques, la taille extrêmement petite de la plaie induite limite la quantification précise de la régénération musculaire, en particulier dans les modèles de maladies musculaires où l’intégrité du muscle est déjà compromise. Nous privilégions donc l’utilisation de blessures par coups de couteau à l’aiguille lors de l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de maladies musculaires du poisson-zèbre.
Pour quantifier avec précision l’étendue de la régénération musculaire, nous profitons de la nature biréfringente du muscle squelettique, qui peut facilement être imagé à l’aide d’un microscope polarisant standard. Deux points critiques doivent être pris en compte lors de l’utilisation de cette approche. Tout d’abord, selon le type de microscope et/ou de lentille polarisée utilisé, l’orientation du poisson dans son axe antérieur-postérieur peut affecter les intensités globales de biréfringence15, et cela doit être pris en compte lors de l’imagerie. Enfin, bien que la régénération musculaire ne soit pas complète de 3 dpi, l’étendue de la récupération est suffisante pour permettre la distinction des capacités de régénération dans différentes souches13 (Figure 1). Nos travaux antérieurs ont démontré qu’en utilisant le protocole que nous avons décrit, les larves de type sauvage se régénèrent complètement après 14 dpi19, et par conséquent, pour déterminer si une souche ne peut pas se régénérer ou si la régénération musculaire est retardée, il peut être nécessaire d’examiner les intensités de biréfringence au-delà de 3 dpi.
Il convient de noter que chez les poissons téléostéens, la croissance musculaire se produit tout au long de la vie de l’animal20, et en tant que tel, il est très important de normaliser les intensités de biréfringence du site de la plaie, avec celle des somites non blessées dans le même poisson. Cette étape fournit un contrôle interne et élimine les biais dans les analyses en raison des différences dans la quantité de muscle aux différents moments, ou des différences dans les paramètres d’imagerie au cours des différentes séances. Cette étape de normalisation est également impérative pour quantifier avec précision la régénération musculaire dans les modèles de maladie musculaire, qui peut intrinsèquement avoir réduit les myofibrilles et / ou présenter une intégrité musculaire compromise, réduisant par la suite les intensités globales de biréfringence. De plus, bien que ce protocole puisse révéler efficacement des changements dans la capacité de régénération du muscle, il est possible qu’ils soient le résultat d’effets indirects sur la fonction des cellules souches. La régénération musculaire est un processus complexe impliquant des signaux provenant de plusieurs types de cellules, y compris les cellules musculaires, les macrophages, les progéniteurs fibro-adépogéniques et les cellules interstitielles. Il est possible que l’altération de la capacité du muscle à se régénérer s’explique par des changements dans la biologie de l’un de ces autres types de cellules qui influencent par la suite la fonction des cellules souches musculaires et le processus de régénération. Par conséquent, bien que ce protocole puisse identifier des altérations de la régénération musculaire dans des modèles de maladies musculaires, des analyses cellulaires et moléculaires en aval doivent être effectuées pour identifier le ou les mécanismes responsables des changements observés.
En conclusion, la capacité de régénération des muscles dans diverses maladies musculaires n’est pas entièrement comprise, et l’émergence de nouvelles techniques pour examiner la régénération musculaire in vivo fournit une plate-forme pour aborder de telles questions. La méthode peut être utilisée comme base pour l’exploration des indices cellulaires et moléculaires qui régulent la régénération musculaire dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Alex Fulcher et Monash Micro Imaging pour leur aide à la maintenance et à la configuration du microscope. L’Australian Regenerative Medicine Institute est soutenu par des subventions du gouvernement de l’État de Victoria et du gouvernement australien. Ce travail a été financé par une subvention de projet de la Muscular Dystrophy Association (USA) à P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
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