Summary
يحرك تجديد العضلات الهيكلية الخلايا الجذعية العضلية المقيمة في الأنسجة، والتي تضعف في العديد من أمراض العضلات مثل ضمور العضلات، وهذا يؤدي إلى عدم قدرة العضلات على التجدد. هنا، ونحن نصف بروتوكول يسمح بفحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات.
Abstract
العضلات الهيكل العظمي لديه قدرة ملحوظة على تجديد بعد الإصابة, التي تحركها الخلايا الجذعية العضلات المقيمة ملزمة. بعد الإصابة ، يتم تنشيط الخلايا الجذعية العضلية وتخضع لانتشار الخلايا لتوليد مجموعة من الخلايا العضلية ، والتي تفرق لاحقا لتشكيل ألياف عضلية جديدة. في العديد من حالات إهدار العضلات، بما في ذلك ضمور العضلات والشيخوخة، تضعف هذه العملية مما يؤدي إلى عدم قدرة العضلات على التجدد. يتم الحفاظ على عملية تجديد العضلات في حمار وحشي للغاية مع أنظمة الثدييات توفير نظام ممتاز لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية العضلية وتجديدها، في ظروف الهزال العضلي مثل ضمور العضلات. هنا، نقدم طريقة لفحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات. تتضمن الخطوة الأولى استخدام منصة جينية تسمح بتحديد النمط الجيني لليرقات قبل الإصابة. بعد تحديد النمط الجيني ، يتم إصابة العضلات باستخدام طعنة إبرة ، وبعد ذلك يتم استخدام المجهر الخفيف المستقطب لتحديد مدى تجديد العضلات. ولذلك نحن نقدم خط أنابيب الإنتاجية العالية التي تسمح بفحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات.
Introduction
العضلات الهيكل العظمي تمثل 30-50٪ من كتلة جسم الإنسان، وليس فقط لا غنى عنه للحركة، ولكن أيضا بمثابة جهاز الأيض والتخزين الحرجة1. على الرغم من كونها ما بعد العضلات، والهيكل العظمي ديناميكية للغاية ويحتفظ قدرة تجديدية هائلة بعد الإصابة. ويعزى ذلك إلى وجود الخلايا الجذعية المقيمة في الأنسجة (وتسمى أيضا خلايا القمر الصناعي) ، وتقع تحت الصفيحة القاعدية من الألياف العضلية وتتميز بعوامل النسخ المقترنة بروتين مربع 7 (pax7) و / أو يقترن مربع البروتين 3 (pax3) ، من بين أمور أخرى2،3. بعد الإصابة ، يتم تنشيط الخلية الفضائية وتخضع لانتشار الخلايا لتوليد مجموعة من الخلايا العضلية ، والتي تفرق في وقت لاحق لتشكيل ألياف عضلية جديدة. وتتأثر سلسلة محافظة للغاية من الإشارات المؤيدة للتجدد تنظيم تنشيط الخلايا الفضائية وإصلاح العضلات قوية في ظروف مختلفة مثل اعتلالات عضلية والشيخوخة الهواستاتيكي4،5.
واحدة من هذه المجموعة المتنوعة من اعتلال عضلي هو ضمور العضلات، وتتميز الهزال التدريجي العضلات وانحطاط6. هذه الأمراض هي نتيجة للطفرات الوراثية في البروتينات الرئيسية، بما في ذلك الديستروفين واللامين-α2 (LAMA2)، المسؤولة عن تعلق ألياف العضلات إلى مصفوفة خارج الخلية7،8. وبالنظر إلى أن البروتينات المتورطة في ضمور العضلات تلعب مثل هذا الدور المركزي في الحفاظ على بنية العضلات، لسنوات عديدة كان يعتقد أن الفشل في هذه العملية هو الآلية المسؤولة عن مرض الأمراض المسببة للأمراض9. ومع ذلك ، فقد حددت الدراسات الحديثة عيوبا في تنظيم الخلايا الجذعية العضلية وضعفا لاحقا في تجديد العضلات كأساس ثان ممكن لعلم أمراض العضلات الملاحظ في ضمور العضلات10،11. على هذا النحو، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات للتحقيق في كيفية ضعف في وظيفة الخلايا الجذعية في العضلات والعناصر المتخصصة المرتبطة بها يساهم في ضمور العضلات.
على مدى العقد الماضي، ظهر حمار وحشي(دانيو ريو)كنموذج الفقاريات الهامة للنمذجة المرض12. ويعزى ذلك إلى التطور الخارجي السريع لجنين الحمار الوحشي ، إلى جانب وضوحه البصري ، والذي يسمح بالتصور المباشر لتشكيل العضلات والنمو والوظيفة. بالإضافة إلى ذلك، ليس فقط هو تطوير وهيكل العضلات الحفاظ عليها للغاية في حمار وحشي، كما أنها تعرض عملية الحفاظ عليها للغاية من تجديد العضلات13. وبالتالي، تمثل سمك الحمار الوحشي نظاما ممتازا لدراسة علم الأحياء المرضية لأمراض العضلات، واستكشاف كيفية تأثر تجديد العضلات فيه. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير طريقة تمكن من الدراسة في الوقت المناسب لتجديد العضلات الهيكل العظمي في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات. يتضمن خط أنابيب الإنتاجية العالي هذا طريقة للنمط الجيني للأجنة الحية14، وبعد ذلك يتم إجراء إصابة طعنة إبرة ويتم تصوير مدى تجديد العضلات باستخدام المجهر الخفيف المستقطب. وبالتالي فإن استخدام هذه التقنية تكشف عن القدرة على تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ صيانة سمك الحمار الوحشي وفقا لإجراءات التشغيل القياسية التي وافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة موناش بموجب ترخيص مستعمرة التربية ERM14481.
1. تحديد النمط الجيني للأجنة الحية باستخدام منصة جينوتيبينج الجنين.
- تخدير 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) أجنة حمار وحشي بإضافة الميثان ثلاثي الكيناتين إلى تركيز نهائي قدره 0.016٪ (v/v) في متوسط الجنين (5 mM NaCl، 0.17m KCl، 0.33 mM CaCl2، 0.33 mM MgSO4 في الماء). انتظر لمدة 10 دقائق لضمان تخدير الأسماك بالكامل ، وهو أمر واضح عندما تتوقف الأسماك عن السباحة.
- إعداد 24 غرفة رقاقة استخراج الحمض النووي عن طريق تقشير فيلم واقية واضحة من السطح العلوي للرقاقة(الشكل 1A).
- قطع غيض من طرف مرشح 20 ميكرولتر لتوسيع الفتحة. باستخدام هذا، اختر جنين واحد في حجم 13 ميكرولتر من متوسط الجنين وتحميله في الغرفة الأولى من الشريحة. كرر هذه العملية حتى يتم الاستغناء عن الأجنة في كل غرفة.
ملاحظة: ينبغي تنفيذ هذه الخطوة في منطقة ذات الحد الأدنى من مسودات الهواء، حيث أن تدفق الهواء العالي قد يسبب تبخرا مفرطا للسائل مما يؤدي في وقت لاحق إلى انخفاض حساسية الجينوتيبينج وبقاء الأجنة. - بمجرد تحميل العدد المطلوب من الأجنة على رقاقة استخراج الحمض النووي ، قم بتحميلها على منصة جينوتيبينج جنين حمار وحشي. ويتحقق ذلك على أفضل وجه بوضعه في جانب واحد أولا، يليه بقية الجانب.
ملاحظة: تجنب إضافة الكثير من الضغط على المنصة لأن هذا قد overstress والأضرار الينابيع الأساسية. - لصق غطاء المنصة المغناطيسية على الشريحة ، والتي ستمنع تبخر وسائط الجنين أثناء بروتوكول استخراج الحمض النووي ، وإغلاق غطاء المنصة.
- تعيين الوحدة الأساسية إلى 2.4 فولت و0.051 A و 0.12 W وبدء بروتوكول استخراج الحمض النووي عن طريق الضغط على زر "تشغيل/إيقاف التشغيل". يجب أن تبدأ المنصة في الاهتزاز ، والتي يمكن تقييمها عن طريق لمس الغطاء بلطف. يجب تشغيل البروتوكول لمدة 8 دقائق.
ملاحظة: ينتج الاهتزاز القوي في ذرف خلايا البشرة ، والتي يتم استخراج الحمض النووي الجينومي منها. - أثناء تشغيل البرنامج ، قم بإعداد لوحة بئر 24 عن طريق إضافة 1 مل من متوسط الجنين إلى كل بئر ، وهو أمر ضروري لفصل الأجنة الفردية أثناء إجراء فحوصات الجينوتيبينج في المصب.
- بالإضافة إلى ذلك، تسمية بشكل مناسب 8 أنابيب قطاع البئر، والتي سيتم استخدامها لجمع مواد الحمض النووي من كل جنين.
- عند الانتهاء من البروتوكول لمدة 8 دقائق، اضغط على زر ON/OFF لإيقاف اهتزاز المنصة.
- افتح غطاء المنصة، وأزل الغطاء المغناطيسي برفق لضمان الحد الأدنى من الضغط على المنصة.
- إزالة بعناية رقاقة استخراج الحمض النووي من المنصة ووضعها على سطح مستو.
- من الغرفة الأولى، قم بإزالة 10 ميكرولتر من وسائط الأجنة المحيطة بالجنين ووضعه في البئر المناسب للأنبوب الشريطي ذي 8 آبار. وسائل الإعلام تحتوي على المواد الوراثية من هذا الجنين، والتي سيتم استخدامها لإجراء فحوصات المصب.
ملاحظة: تجنب لمس الجنين مع طرف ماصة أثناء جمع الوسائط، لأن هذا يمكن أن يضر الجنين. - باستخدام ماصة بلاستيكية، إضافة على الفور قطرتين من المتوسط الجنين الطازج إلى نفس الغرفة. جمع الجنين ونقله إلى البئر الأول من لوحة بئر 24.
- كرر الخطوتين 1.12 و1.13 لجميع الغرف المتبقية. وعند الانتهاء من ذلك، يمكن نقل لوحة البئر ال 24 التي تحتوي على أجنة حية إلى حاضنة تبلغ درجة حرارتها 28 درجة مئوية.
- إجراء المقايسات الجينية المصب المناسبة لتحديد النمط الجيني للأجنة.
ملاحظة: الحمض النووي التي تم الحصول عليها من منصة الأجنة genotyping يمكن تضخيمها بنجاح عن طريق PCR ويمكن استخدامها للتحليل اللاحق بما في ذلك التسلسل، هلام electrophoresis، أو عالية الدقة ذوبان التحليل14. إلى النمط الجيني سلالة lama2 وصفها في النتائج التمثيلية، استخدمت PCR، تقييد الهضم وهلام الكهربائي. وبالنظر إلى أن تركيز الحمض النووي الذي يتم الحصول عليه من كل جنين منخفض، يقترح الاستفادة من معظم، إن لم يكن كل، المواد الوراثية التي تم الحصول عليها لإجراء الفحص النهائي. - بمجرد تحديد النمط الجيني لكل يرقات ، قم بنقلها إلى أطباق بيتري عيار 90 مم ، ووضع كل نمط جيني في طبق مختلف. ملء الطبق مع 25 مل الجنين المتوسطة والاحتفاظ بها في حاضنة 28 درجة مئوية.
2. أداء إصابة العضلات باستخدام طعنة إبرة
- بمجرد أن تبلغ اليرقات 4 ديسيبل ، التخدير لهم عن طريق إضافة الميثان ثلاثية كبريتونات إلى تركيز نهائي قدره 0.016 ٪ (v / v) في المتوسط الجنين. انتظر لمدة 10 دقائق لضمان تخدير الأسماك بالكامل ، وهو أمر واضح عندما تتوقف الأسماك عن السباحة.
ملاحظة: لتجنب التحيز، ينبغي أن تعمى هوية النمط الجيني عن المحقق الذي يقوم بالطعنات وتحليلات المصب. - خلال هذا الوقت، وإعداد 24 لوحات بئر عن طريق ملء كل بئر مع 1 مل من المتوسط الجنين الطازج، وإعداد مجسم مع خلفية سوداء وضوء عالي الطاقة، لتسهيل التصور من الحدود سوميت.
- باستخدام ماصة بلاستيكية ، قم بنقل يرقة مخدرة واحدة إلى طبق بيتري جديد.
- إزالة بعناية المتوسطة الجنين الزائد مع ماصة، وتحت المجهر تشريح، وتوجيه الأسماك بحيث الرأس على اليسار، الذيل على اليمين، منطقة الظهرية صعودا ومنطقة البطن إلى أسفل(الشكل 1B).
- العمل تحت المجهر تشريح، واستخدام إبرة قياس 30 لإجراء طعنة سريعة ولكن دقيقة في العضلات epaxial تقع فوق الميوزبتوم الأفقي. لضمان الاتساق في الموقف الأمامي الخلفي، وتهدف إلى 1-2 somites تقع فوق المسام الشرجية(الشكل 1B).
ملاحظة: تجنب طعن الأنبوب العصبي و notochord، والعمل بسرعة لتجنب تجفيف الأسماك أثناء العملية. - باستخدام ماصة بلاستيكية، صب قطرة من المتوسط الجنين على حمار وحشي طعن ونقلها بعناية إلى بئر من لوحة البئر 24.
- كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.6. حتى يتم طعن كل الأسماك.
ملاحظة: يمكن طعن العديد من اليرقات معا اعتمادا على سرعة المعالجة وكفاءة المحقق ، طالما أن الأسماك لا تجف أثناء العملية. - بمجرد طعن جميع اليرقات ، ضع لوحة البئر ال 24 في حاضنة 28 درجة مئوية حتى يتم إجراء التصوير اللاحق.
3. تصوير إصابة العضلات والانتعاش
- في يوم واحد بعد الإصابة (1 نقطة في البوصة) ، تخدير اليرقات المطعونة عن طريق إضافة الميثان ثلاثي الكبريتات إلى تركيز نهائي قدره 0.016٪ (v /v) في وسط الجنين. انتظر لمدة 10 دقائق لضمان تخدير الأسماك بالكامل ، وهو أمر واضح عندما تتوقف الأسماك عن السباحة.
ملاحظة: عند 0 نقطة في البوصة، يحتوي موقع الجرح على كمية كبيرة من الحطام الخلوي، مما يجعل من الصعب تحديد مدى إصابة العضلات(الشكل التكميلي 1A-B). يستغرق إزالة هذا الحطام من موقع الجرح ما يقرب من 18-20 ساعة ، وعلى هذا النحو ، فمن الأكثر موثوقية تصوير اليرقات عند نقطة واحدة في البوصة ، بدلا من 0 نقطة في البوصة ، لتحديد مدى الإصابة التي تم الحصول عليها. - ضع طبق زجاجي نظيف وفارغ على أساس مرحلة المجهر المستقطب وحدد الخلفية باستخدام البرنامج المتكامل.
ملاحظة: لا تستخدم أطباق بيتري البلاستيكية لتصوير birefringence، لأنها لا تنقل بشكل مناسب الضوء المنكسر. اعتمادا على المجهر المستقطب المستخدم، قد تكون هناك حاجة إلى إعدادات إضافية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. - بعد تعيين الخلفية، وإزالة طبق الزجاج أسفل القائم من مرحلة المجهر، واستخدام ماصة زجاجية، ونقل التخدير، طعن الأسماك على طبق الزجاج أسفل القائم.
- إزالة بعناية فائض الجنين المتوسط باستخدام ماصة، وتوجيه الأسماك وفقا ل2.5 - الرأس على اليسار، الذيل على اليمين، منطقة الظهرية صعودا ومنطقة البطن إلى أسفل.
ملاحظة: تأكد من تركيب اليرقات مسطحة قدر الإمكان ، حيث يؤدي تصاعد غير متساو إلى شدة ثنائيةefringence مختلفة عبر السخامات المختلفة. - ضع طبق الزجاج السفلي القائم على اليرقات المخدرة على مرحلة المجهر وصورة العضلات باستخدام الضوء المستقطب(الأشكال 1C و 1D).
ملاحظة: اعتمادا على نوع المجهر / عدسة المستقطبة المستخدمة، واتجاه السمك على محورها الأمامي الخلفي يمكن أن تؤثر على birefringence العام15. تأكد من تضمين ما لا يقل عن 5 سومتات على جانبي موقع الإصابة عند التصوير. - باستخدام ماصة بلاستيكية، صب قطرة من الجنين المتوسطة لترطيب الأسماك ووضع الأسماك في بئر من لوحة بئر 24 مليئة المتوسطة الجنين.
ملاحظة: من المهم إجراء التصوير في أسرع وقت ممكن لمنع الأسماك من التجفيف. - كرر الخطوات 3.3. إلى 3.6. حتى يتم تصوير كل الأسماك.
- عند الحصول على جميع الصور، احفظها في شكل .tiff للتحليلات اللاحقة.
- ضع السمكة مرة أخرى في حاضنة 28 درجة مئوية حتى إجراء التصوير اللاحق عند 3 نقطة في البوصة (7 ديسيبل).
- عندما تكون السمكة 3 نقطة في البوصة، تصور السمك وفقا ل3.3 إلى 3.8.
- بمجرد تصوير جميع الأسماك، يمكنك قتلها عن طريق إضافة الميثان ثلاثي الكينايل إلى تركيز نهائي قدره 0.2٪ (v/v) في وسط الجنين. انتظر لمدة 10 دقائق على الأقل لضمان قتل الأسماك، ويتضح ذلك من فقدان القدرة على السباحة، وضخ أغطية الخيشوم، وعدم وجود استجابة الطيران بعد اللمس.
4. تحديد كمي لتجديد العضلات
- افتح صورة 1 نقطة في البوصة على برنامج تحليل التصوير مثل برنامج Image J المتوفر بحرية.
- باستخدام أداة المضلع ، رسم حول موقع الجرح ، وقياس المنطقة ومتوسط كثافة birefringence من هذه المنطقة(الأرقام 1C و 1D). نسخ هذه القيم إلى الخلايا D3 و E3 في القالب المتوفر(الجدول التكميلي 1).
- رسم منطقتين إضافيتين، كل تمتد 1-2 somites غير مصاب، وقياس المنطقة ويعني كثافة birefringence من كل من هذه المناطق (الأرقام 1C و 1D). نسخ هذه القيم إلى الخلايا D4-D5 و E4-E5 في القالب المقدم(الجدول التكميلي 1).
ملاحظة: في حين أنه من الأفضل تحديد نفس السخامات غير المصابة في صور 1 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة ، فإن انفصال ألياف العضلات المتقطع وما يلي ذلك من انخفاض في ثنائية التجويف في المسوخ قد يجعل هذا مستحيلا. لذلك، في حالة لا يمكن اختيار نفس السخامات في 1 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة بسبب انخفاض سلامة العضلات في المسوخ، حدد منطقتين مختلفتين ولكن لم تتأثر في كل نقطة من النقاط الزمنية. - حساب birefringence تطبيع لكل منطقة بقسمة متوسط شدة ثنائيةefringence من تلك المنطقة على المنطقة - المعروضة في العمود F في القالب المقدم(الجدول التكميلي 1).
- كرر الخطوات 4.1-4.4 لجميع الصور 1 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة.
ملاحظة: عند استخدام القالب المتوفر(الجدول التكميلي 1)،يجب إدراج مساحة 1 نقطة في البوصة وقيم كثافة ثنائية التدرين المتوسطة في العمودين D وE على التوالي، وينبغي إدراج مساحة 3 نقطة في البوصة وقيم كثافة ثنائية التدوين المتوسطة في العمودين J وK على التوالي. - لكل نقطة زمنية، حساب متوسط birefringence تطبيع المنطقتين غير المصابين. توفر هذه القيمة نقطة مرجعية للعضلات غير المصابة.
ملاحظة: في القالب المتوفر(الجدول التكميلي 1)،يتم حساب هذه القيمة في العمودين G وM، لصور 1 نقطة في البوصة و3 نقطة في البوصة على التوالي. - بعد ذلك ، حدد مدى إصابة العضلات عند نقطة واحدة في البوصة ، عن طريق تقسيم birefringence تطبيع منطقة الإصابة على متوسط birefringence تطبيع المناطق غير المصابة (محسوبة في 4.6).
ملاحظة: باستخدام إجراء طعن الإبرة المفصل أعلاه ، تظهر يرقات النوع البري عادة ثنائية حقن طبيعية تبلغ 48.5 ± 14.3٪ في موقع الجرح عند نقطة واحدة في البوصة ، مما يشير إلى أن الإمدوين قد انخفض بنسبة 50٪ تقريبا بالمقارنة مع السخام غير المصاب. عند استخدام القالب (الجدول التكميلي 1)، يتم حساب هذه القيمة كنسبة مئوية في العمود H. - لتحديد مدى تجديد العضلات، تقسيم birefringence تطبيع المنطقة إصابة في صورة 3 نقطة في البوصة، من خلال متوسط كثافة تطبيع المناطق غير المصابة في هذه المرحلة.
ملاحظة: عند 3 نقطة في البوصة، تظهر يرقات النوع البري عادة ثنائيةefringence طبيعية من 60 ± 15.3٪ في موقع الجرح. وبالنظر إلى أن birefringence تطبيع داخل موقع الجرح في 1 نقطة في البوصة كان 48.5 ± 14.3٪ (الخطوة 4.7)، والزيادة في birefringence في 3 نقطة في البوصة إلى 60 ± 15.3٪ يشير إلى انتعاش ما يقرب من 11.5٪. عند استخدام القالب (الجدول التكميلي 1)، يتم حساب هذه القيمة كنسبة مئوية في العمود N. - حفظ الأسماك داخل كل نمط جيني منفصل، إجراء اختبار t مقترن مقارنة birefringence تطبيع موقع الجرح في 3 نقطة في البوصة (الخطوة 4.8) مع أن من 1 نقطة في البوصة (الخطوة 4.7). وهذا سوف يكشف عن مسار تجديد العضلات التي تعرضها كل الأسماك في كل نمط وراثي، وتسليط الضوء على ما إذا كان مدى تجديد العضلات التي أظهرها كل النمط الجيني قد تغير بشكل كبير.
- وأخيرا، حساب مؤشر التجديد عن طريق تقسيم القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.8، وهو مدى تجديد العضلات في 3 نقطة في البوصة، على القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.7، وهو مدى إصابة العضلات في 1 نقطة في البوصة. يشير مؤشر تجديدي من 1 إلى أن الإصابة عند نقطة في البوصة واحدة قابلة للمقارنة مع 3 نقطة في البوصة وأن تجديد العضلات لم يحدث؛ قيمة فوق 1 يشير إلى أن في 3 نقطة في البوصة قد تشكلت العضلات الجديدة في موقع الجرح تسليط الضوء على أن العضلات قد تجددت; ومؤشر تجديدي أقل من 1 يسلط الضوء على أن الجرح في 3 نقطة في البوصة هو أسوأ من 1 نقطة في البوصة، وأن تجديد العضلات في ضعف. يمكن إجراء اختبار t أو ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة مدى تجديد العضلات إحصائيا بين الأنماط الجينية المختلفة. عند استخدام القالب المقدم(الجدول التكميلي 1)،يتم حساب هذه القيمة في العمود O.
ملاحظة: يوصى بإجراء التجربة بأكملها في ثلاثية الليكات، مع الأسماك من كل تجربة تم الحصول عليها من الآباء البيولوجيين المختلفين، وكل تجربة أجريت في أيام مختلفة، لتجنب أي تحيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
القدرة على قياس birefringence من العضلات الهيكل العظمي يوفر طريقة غير الغازية ولكن استنساخها للغاية لفحص ومقارنة مستويات تلف العضلات, ودراسة تجديد العضلات في الجسم الحي. نتائج Birefringence من حيود الضوء المستقطب من خلال مجموعة زائفة بلورية من ساركوميرس العضلات15، وبعد إصابة أو تلف في العضلات ، وانخفاض في birefringence واضح. وبالمثل، يؤدي تنشيط الخلايا الجذعية وتمايزها إلى تكوين ألياف عضلية جديدة داخل موقع الإصابة، مما يزيد من كثافة ثنائية الدماغ داخل هذه المنطقة. باستخدام هذا النظام، قمنا بفحص تجديد العضلات في نموذج حمار وحشي من نوع ضمور العضلات الخلقي 1A (MDC1A)، الناجم عن نقص في Lama216. تم جمع مخلب من الأجنة من صليب بين اثنين من lama2+/- حمار وحشي، وعند 3 dpf، تم نقل الأجنة إلى رقاقة استخراج الحمض النووي(الشكل 1A)وجنوتية في وقت لاحق باستخدام تكنولوجيا جينوتيبينج الجنين. بعد تحديد النمط الجيني ، أصيب lama2-/- larvae ، الذي نموذج MDC1A16، والأشقاء lama2+/+ باستخدام طعنة إبرة وفقا للرسم 1B، وتم تصويرها على مجهر مستقطب عند 1 نقطة في البوصة ، و 3 نقطة في البوصة ، وتم قياس كثافة ثنائية التجويف كميا. في حين أن إصابة العضلات تؤدي إلى انخفاض في كثافة ثنائية الاسترداد عند 1 نقطة في البوصة(الشكل 1Ci و Di)،فإن التجديد الناجح للعضلات يؤدي إلى زيادة ثنائية التخسيس في نفس المنطقة ( الشكل1Cii و Dii). ومن الجدير بالذكر أيضا أنه في حين أن يرقات lama2+/+ تظهر كثافة ثنائيةefringence موحدة (الشكل 1C)، بسبب أنماط العضلات الطبيعية ، فإن كثافة الإماء في عضلة lama2-/- كانت متفاوتة ومتفرقة للغاية(الشكل 1D)، ويعزى ذلك إلى انخفاض سلامة العضلات.
باستخدام هذا النهج ، نكشف أن كلا من يرقات النمط البري (lama2+/ +؛ الشكل 2A)، واليرقات ناقصة في lama2 (lama2-/-; الشكل 2B)، تظهر زيادة كبيرة في كثافة birefringence في موقع الجرح في 3 نقطة في البوصة مقارنة مع 1 نقطة فيالبوصة (الشكل 2C)،مما يدل على أن العضلات قد تجددت. لمقارنة الإمكانات التجديدية لليرقات في كل نمط جيني ، تم تحديد المؤشر التجديدي ، ونكشف عن أن lama2-/- اليرقات أظهرت زيادة مذهلة في تجديد العضلات مقارنة بيرقات lama2+/+ (الشكل 2D؛ المتوسط في lama2-/- = 1.30 ± - 0.251 ؛ المتوسط في lama2-/- = 1.83 ± 0.439). لمزيد من التحقق من صحة تحسين التجديد في lama2-/- اليرقات، ونحن ملطخة العضلات مع الأجسام المضادة ضد F-Actin ( الشكلالتكميلي 1B-D). في حين أن هذه النتائج تؤكد أن lama2-/- لا تتجدد في الواقع، ويتضح من وجود ألياف العضلات المتمايزة داخل موقع الجرح، وعدم القدرة على فحص نفس الأسماك في 1 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة يحد من القدرة على قياس ومقارنة الاستجابة التجديدية بين lama2+/+ و lama2-/- الأسماك. على الرغم من أن الأساس الميكانيكي لهذا القدرة المحسنة على التجديد في lama2-/- اليرقات لا يزال بعيد المنال ، نعتقد أن فقدان lama2 يزيد من عدد الخلايا الجذعية المنشطة ، مما يؤدي لاحقا إلى تحسين تجديد العضلات. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد ذلك. بشكل جماعي، تسلط هذه النتائج الضوء على قدرة التقنية الموصوفة على تحديد التغيرات في تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي لأمراض العضلات.
الشكل 1:نظرة عامة على بروتوكول جينوتيبينج وتجديد العضلات. (أ) صورة لرقاقة استخراج الحمض النووي التي تحتوي على 24، 3 يرقات حمار وحشي dpf. (ب) تخطيطي للتوجه الذي يجب وضع يرقات 4 dpf لإجراء طعنة الإبرة ، مع الرأس على اليسار ، والذيل على اليمين ، والمنطقة الظهرية صعودا ومنطقة البطن لأسفل. يجب إجراء طعنة الإبرة باستخدام إبرة قياس 30 ، تستهدف 1-2 سومت من العضلات epaxial. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. (C-D) صور من birefringence في lama2+/+ و lama2-/- اليرقات في 1 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة. تعكس المناطق الموضحة بالأبيض والأحمر المناطق المستخدمة لقياس ثنائية التجويف في موقع الجرح والسخام غير المصاب على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد كمي لتجديد العضلات في يرقات حمار وحشي لاما2 ناقصة. صور ثنائية الefringence في lama2+/+ (A)، و lama2-/- (B) اليرقات في 1 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة. الجرح في 3 نقطة في البوصة في كل من، lama2+/+ و lama2-/- تمتلئ اليرقات مع العضلات الجديدة. (ج) رسم بياني للاستخلاص الطبيعي لكل يرقة عند نقطة في البوصة و3 نقطة في البوصة. يتم زيادة birefringence تطبيع في موقع الجرح في lama2+/+ و lama2-/- اليرقات بشكل ملحوظ في 3dpi، كما تم تحديدها باستخدام اختبار تي الاقتران. (د) مؤشر التجديد في lama2+/+، و lama2-/- مع هذا الأخير تظهر زيادة تجديد العضلات، كما هو محدد باستخدام اختبار تي. تمثل أشرطة الخطأ SEM مع اليرقات من ثلاث تجارب مستقلة (lama2+/+n =28، و lama2-/- n=16). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: فحص تجديد العضلات في يرقات lama2 الناقصة. صور ثنائية التجويف في lama2+/+ (Ai)، ويرقات lama2-/- (Aii) عند 0 نقطة في البوصة مما يدل على وجود حطام خلوي داخل موقع الجرح. أقصى صور كونفوجال إسقاط من ميوتومي اليرقات الملطخة لF-أكتين في 0 نقطة في البوصة (B)، 1 نقطة في البوصة (C) و 3 نقطة في البوصة (D). في 3 نقطة في البوصة ، يتميز موقع الجرح في lama2+/+ و lama2-/- اليرقات بظهور ألياف العضلات المسماة F-actin. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: نموذج للقياس الكمي لتجديد العضلات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحرك تجديد العضلات الهيكلية الخلايا الجذعية العضلية المقيمة في الأنسجة الملزمة ، والتي يتم تغيير وظيفتها في العديد من أمراض العضلات مثل ضمور العضلات ، مما يعوق في وقت لاحق عملية تجديد العضلات. هنا، ونحن نصف بروتوكول الإنتاجية العالية لفحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي حية من أمراض العضلات. تستخدم الخطوة الأولى من خط الأنابيب منصة جينوتيبينج الجنين14، وهي طريقة سهلة الاستخدام ودقيقة لتحديد النمط الجيني لليرقات الحية ، قبل إجراء فحص تجديد المصب. ومن الفوائد المباشرة لذلك أنه يسمح باختيار الأنماط الجينية التي لا تهم إلا، و/أو عدد مماثل من الأسماك داخل كل مجموعة من مجموعات النمط الجيني، مما يقلل إلى حد كبير من عدد الأسماك التي تحتاج إلى معالجة من خلال بقية البروتوكول. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن كمية الحمض النووي الجينومي التي تم الحصول عليها من جهاز جينوتيبينج الجنين منخفضة نسبيا ، مما قد يعرض مقايسات الجينوتيبينج في المصب للخطر. ولذلك فمن المهم أن يتم اختبار جميع المقايسات genotyping والأمثل قبل استخدامه للتجربة الرئيسية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مصدر الحمض النووي هو في المقام الأول البشرة ، وعلى هذا النحو ، لا يمكن استخدام نظام جينوتيبينج الجنين بنجاح ليرقات النمط الجيني التي تعرض طفرات محددة في الأنسجة.
الجزء الثاني من البروتوكول يوضح استخدام إصابة طعن الإبرة ، وهي تقنية فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية التي لا تؤدي فقط إلى حجم إصابة قابلة للاستنساخ للغاية ، ولكنها كافية أيضا لتحفيز تنشيط الخلايا الجذعية العضلية مما يؤدي إلى تجديد العضلات. نهج بديل لتحفيز إصابة العضلات الهيكل العظمي في حمار وحشي هو استخدام الليزر بوساطة استئصال الخلية13،17،18 . في حين أن هذا يوفر القدرة على التركيز على طائرات محددة س، ص و z واستهداف خلايا العضلات واحدة في وقت لاحق، وحجم الجرح صغيرة للغاية الناجمة يحد من كمية دقيقة من تجديد العضلات، وخاصة في نماذج أمراض العضلات حيث يتم بالفعل اختراق سلامة العضلات. ولذلك نحن نفضل استخدام إصابات طعن الإبر عند فحص تجديد العضلات في نماذج مرض عضلة حمار وحشي.
لتحديد مدى تجديد العضلات بدقة، نستفيد من الطبيعة الثنائية للعضلات الهيكلية، والتي يمكن تصويرها بسهولة باستخدام مجهر الاستقطاب القياسي. وهناك نقطتان حاسمتان ينبغي النظر فيهما عند استخدام هذا النهج. أولا ، اعتمادا على نوع المجهر و / أو عدسة الاستقطاب المستخدمة ، قد يؤثر اتجاه السمك في محوره الأمامي الخلفي على كثافة ثنائية الدورانالشاملة 15، وهذا يحتاج إلى النظر فيه أثناء التصوير. وأخيرا، على الرغم من أن تجديد العضلات لم يكتمل بالكامل بمقدار 3 نقطة في البوصة، إلا أن مدى التعافي كاف لتمكين تمييز قدرات التجديد في سلالات مختلفة13 (الشكل 1). وقد أثبت عملنا السابق أنه باستخدام البروتوكول الذي حددناه ، تتجدد يرقات النوع البري بالكامل بعد 14 نقطة في البوصة19، وبالتالي ، لتحديد ما إذا كان لا يمكن للإجهاد أن يتجدد أو إذا تأخر تجديد العضلات ، فقد يكون من الضروري فحص شدة ثنائية الدوران التي تتجاوز 3 نقطة في البوصة.
تجدر الإشارة إلى أنه في الأسماك التليوست ، يحدث نمو العضلات طوال حياة الحيوان20، وعلى هذا النحو ، من المهم جدا تطبيع كثافة ثنائية التخبير في موقع الجرح ، مع أن من السخام غير المصاب داخل نفس السمكة. توفر هذه الخطوة رقابة داخلية وتزيل التحيز في التحليلات بسبب الاختلافات في كمية العضلات في النقاط الزمنية المختلفة، أو الاختلافات في معلمات التصوير خلال جلسات مختلفة. هذه الخطوة تطبيع أمر حتمي أيضا لتحديد بدقة تجديد العضلات في نماذج من أمراض العضلات, التي قد خفضت بطبيعتها الميوفيبريلات و / أو عرض سلامة العضلات للخطر, خفض في وقت لاحق كثافة ثنائية التأييد الشاملة. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن هذا البروتوكول يمكن أن تكشف بشكل فعال عن تغييرات في القدرة التجديدية للعضلات، فمن الممكن أن تكون نتيجة لآثار غير مباشرة على وظيفة الخلايا الجذعية. تجديد العضلات هو عملية معقدة تنطوي على إشارات من أنواع الخلايا المتعددة بما في ذلك خلايا العضلات، الضامة، السلف الليفيةadepogenic، والخلايا الخلالية. فمن الممكن أن القدرة المتغيرة للعضلات لتجديد ربما يفسرها التغيرات في بيولوجيا أي من هذه الأنواع الأخرى من الخلايا التي تؤثر في وقت لاحق وظيفة الخلايا الجذعية العضلات والعملية التجديدية. لذلك، في حين أن هذا البروتوكول يمكن تحديد التعديلات في تجديد العضلات في نماذج من أمراض العضلات، والتحليلات الخلوية والجزيئية المصب تحتاج إلى إجراء لتحديد الآلية (ق) المسؤولة عن التغييرات التي لوحظت.
في الختام، القدرة التجديدية للعضلات في أمراض العضلات المختلفة غير مفهومة تماما، وظهور تقنيات جديدة لفحص تجديد العضلات في الجسم الحي يوفر منصة لمعالجة مثل هذه الأسئلة. ويمكن استخدام هذه الطريقة كأساس لاستكشاف الإشارات الخلوية والجزيئية التي تنظم تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور أليكس فولتشر، وموناش مايكرو إيماجينج للمساعدة في صيانة المجهر والإعداد. 129- ويساند المعهد الأسترالي للطب التجديدي منح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة مشروع جمعية ضمور العضلات (USA) إلى P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
