Summary
Skeletmuskulatur regenerering er drevet af væv hjemmehørende muskel stamceller, som er svækket i mange muskelsygdomme såsom muskelsvind, og dette resulterer i manglende evne til muskel til at regenerere. Her beskriver vi en protokol, der gør det muligt at undersøge muskelgendannelse i zebrafiskmodeller af muskelsygdom.
Abstract
Skeletmuskulatur har en bemærkelsesværdig evne til at regenerere efter skade, som er drevet af obligate væv hjemmehørende muskel stamceller. Efter skade aktiveres muskelstamcellert og gennemgår cellespredning for at generere en pulje af myoblaster, som efterfølgende differentierer sig til at danne nye muskelfibre. I mange muskelsvind betingelser, herunder muskelsvind og aldring, denne proces er nedsat resulterer i manglende evne til muskel til at regenerere. Processen med muskel regenerering i zebrafisk er meget bevaret med pattedyr systemer giver et glimrende system til at studere muskel stamcellefunktion og regenerering, i muskelsvind betingelser såsom muskeldystrofi. Her præsenterer vi en metode til at undersøge muskel regenerering i zebrafisk modeller af muskelsygdom. Det første trin indebærer brug af en genotypingplatform, der gør det muligt at bestemme larvernes genotype, før der fremkaldes en skade. Efter at have bestemt genotypen kommer musklen til skade ved hjælp af et nålestik, hvorefter polariserende lysmikroskopi bruges til at bestemme omfanget af muskelgendannelse. Vi leverer derfor en høj gennemløbspipeline, der gør det muligt at undersøge muskelgendannelse i zebrafiskmodeller af muskelsygdom.
Introduction
Skeletmuskulatur tegner sig for 30-50% af den menneskelige kropsmasse og er ikke kun uundværlig for bevægelse, men det fungerer også som et kritisk metabolisk og opbevaringsorgan1. På trods af at være postmitotisk, skeletmuskulatur er meget dynamisk og bevarer en enorm regenerativ kapacitet efter skade. Dette tilskrives tilstedeværelsen af væv bosiddende stamceller (også kaldet satellitceller), placeret under basal lamina af myofibers og præget af transskription faktorer parret kasse protein 7 (pax7) og / eller parret kasse protein 3 (pax3), blandt andre2,3. Efter skade aktiveres satellitcellen og gennemgår cellespredning for at generere en pulje af myoblaster, som efterfølgende differentierer sig for at danne nye muskelfibre. Den stærkt bevarede kaskade af pro-regenerative signaler, der regulerer satellitcelleaktivering og robust muskelreparation, påvirkes under forskellige forhold såsom myopatier og homøostatiskaldring 4,5.
En så forskelligartet gruppe af myopatier er muskeldystrofi, karakteriseret ved progressiv muskelsvind og degeneration6. Disse sygdomme er konsekvensen af genetiske mutationer i nøgleproteiner, herunder dystrophin og laminin-α2 (LAMA2), der er ansvarlig for fastgørelse af muskelfibre til den ekstracellulære matrix7,8. I betragtning af at proteiner impliceret i muskeldystrofi spiller en så central rolle i opretholdelsen af muskelstruktur, troede man i mange år, at en fiasko i denne proces var den mekanisme, der var ansvarlig for sygdomspatogenese9. Nylige undersøgelser har imidlertid identificeret defekter i reguleringen af muskelstamceller og efterfølgende svækkelse i muskelgendannelse som et andet muligt grundlag for muskelpatologi observeret i muskeldystrofi10,11. Som sådan er der behov for yderligere undersøgelser for at undersøge, hvordan en svækkelse i muskelstamcellefunktion og tilknyttede nicheelementer bidrager til muskeldystrofi.
I løbet af det seneste årti har zebrafisk (Danio rerio) vist sig som en vigtig hvirveldyr model for sygdom modellering12. Dette tilskrives den hurtige eksterne udvikling af zebrafiskembryoet kombineret med dets optiske klarhed, som muliggør direkte visualisering af muskeldannelse, vækst og funktion. Derudover er ikke kun udviklingen og strukturen af muskler stærkt bevaret i zebrafisk, de viser også en stærkt bevaret proces med muskelgendannelse13. Derfor repræsenterer zebrafisk et fremragende system til at studere patobiologien af muskelsygdomme og undersøge, hvordan muskelgendannelse påvirkes i det. Til dette formål har vi udviklet en metode, der muliggør rettidig undersøgelse af skeletmuskulatur regenerering i zebrafisk modeller af muskelsygdom. Denne høj gennemstrømningsrørledning involverer en metode til genotype levende embryoner14, hvorefter der udføres en nålestikskade, og omfanget af muskelgendannelse afbildes ved hjælp af polariserende lysmikroskopi. Anvendelsen af denne teknik vil derfor afsløre den regenerative kapacitet af muskler i zebrafisk modeller af muskelsygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafisk vedligeholdelse blev udført i henhold til standard driftsprocedurer godkendt af Monash University Animal Ethics Committee under avl koloni licens ERM14481.
1. Bestemmelse af genotypen af levende embryoner ved hjælp af en embryongenotypingplatform.
- Bedøve 3 dage efter befrugtning (dpf) zebrafisk embryoner ved at tilføje tricain metansulfonat til en endelig koncentration på 0,016% (v / v) i embryo medium (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 i vand). Vent i 10 minutter for at sikre, at fisken er helt bedøvet, tydeligt, når fisken holder op med at svømme.
- Forbered 24 kammer DNA-ekstraktionschippen ved at skrælle den klare beskyttelsesfilm fra chippens øverste overflade (Figur 1A).
- Skær spidsen af en 20 μL filterspids for at udvide åbningen. Ved hjælp af dette skal du vælge et enkelt embryon i et 13 μL volumen embryomedium og indlæse i det første kammer af chippen. Gentag denne proces, indtil embryoner er blevet udleveret i hvert kammer.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres i et område med minimale lufttræk, da høj luftstrøm kan forårsage overdreven fordampning af væsken, hvilket efterfølgende resulterer i nedsat genotypfølsomhed og overlevelse af embryonerne. - Når det ønskede antal embryoner er blevet lastet på DNA-ekstraktionschippen, skal du lægge det på zebrafiskembryo genotypingplatformen. Dette opnås bedst ved at placere i den ene side først, efterfulgt af resten af det.
BEMÆRK: Undgå at lægge for meget tryk på platformen, da dette kan overbelaste og beskadige de underliggende fjedre. - Fastgør det magnetiske platformslåg over chippen, hvilket forhindrer fordampning af embryomedier under DNA-ekstraktionsprotokollen og lukker platformslåget.
- Indstil basisenheden til 2,4 volt, 0,051 A og 0,12 W, og start DNA-udtrækningsprotokollen ved at trykke på knappen "TIL/FRA". Platformen skal begynde at vibrere, hvilket kan vurderes ved forsigtigt at røre ved låget. Protokollen skal køres i 8 minutter.
BEMÆRK: De kraftige vibrationer resulterer i afgivelse af epidermale celler, hvorfra genomisk DNA udvindes. - Mens programmet kører, forberede en 24 godt plade ved at tilføje 1 mL embryo medium til hver brønd, som er nødvendig for at adskille de enkelte embryoner, mens downstream genotyping assays bliver udført.
- Derudover, passende etiket 8 godt strimler rør, som vil blive brugt til indsamling af DNA-materiale fra hvert foster.
- Når protokollen på 8 minutter er afsluttet, skal du trykke på ON/OFF-knappen for at stoppe platformens vibrationer.
- Åbn låget på platformen, og fjern forsigtigt det magnetiske låg, der sikrer, at der påføres minimalt tryk på platformen.
- Fjern forsigtigt DNA-udsugningschippen fra platformen og læg den på en flad overflade.
- Fra det første kammer fjernes 10 μL embryomedier omkring embryoet og placeres i den passende brønd i 8-brøndsbåndsrøret. Medierne indeholder det genetiske materiale fra dette embryo, som vil blive brugt til downstream-assays.
BEMÆRK: Undgå at røre embryoet med pipettespidsen under medieindsamlingen, da dette kan beskadige embryoet. - Ved hjælp af en plastikpipette tilsættes straks to dråber frisk embryo medium til samme kammer. Saml embryoet og flyt det til den første brønd af en 24 brøndplade.
- Gentag trin 1.12 og 1.13 for alle de resterende kamre. Ved afslutningen af dette kan 24-brøndpladen, der indeholder levende embryoner, flyttes til en 28 °C inkubator.
- Udfør passende downstream genotyping assays for at bestemme genotypen af embryonerne.
BEMÆRK: DNA'et fra embryogenotypingplatformen kan med succes forstærkes af PCR og kan bruges til efterfølgende analyse, herunder sekventering, gelelektroforese eller smelteanalyse med høj opløsning14. For at genotype lama2-stammen, der er beskrevet i de repræsentative resultater, blev der anvendt PCR, begrænsnings fordøjelse og gelelektroforese. Da koncentrationen af DNA fra hvert embryon er lav, foreslås det at anvende størstedelen, hvis ikke alle, af det genetiske materiale, der er opnået til den nedstrømsanalyse. - Når genotypen for hver larver er blevet identificeret, overføres de til 90 mm petriskåle, og hver genotype placeres i en anden skål. Skålen fyldes med et embryonmedium på 25 mL og opbevares i inkubatoren på 28 °C.
2. Udførelse af muskelskade ved hjælp af et nålestik
- Når larverne er 4 dpf, bedøve dem ved at tilføje tricain metansulfonat til en endelig koncentration på 0,016% (v / v) i embryo medium. Vent i 10 minutter for at sikre, at fisken er helt bedøvet, tydeligt, når fisken holder op med at svømme.
BEMÆRK: For at undgå bias bør genotypens identitet blændes af den efterforsker, der udfører stik og downstream-analyser. - I løbet af denne tid skal du forberede 24 brøndplader ved at fylde hver brønd med 1 mL frisk embryomedium og oprette stereomikroskopet med en sort baggrund og højeffektlys for at lette visualiseringen af de somite grænser.
- Ved hjælp af en plastikpipette overføres en bedøvet larve til en ny petriskål.
- Fjern forsigtigt overskydende embryo medium med en pipette, og under et dissekerende mikroskop, orientere fisken sådan, at hovedet er til venstre, hale til højre, dorsal region op og ventral region ned (Figur 1B).
- Arbejde under en dissekere mikroskop, skal du bruge en 30-gauge nål til at udføre en hurtig, men præcis stab i epaxial muskel placeret over den vandrette myoseptum. For at sikre konsistens i forreste-bageste position, mål for 1-2 somites placeret over anal pore (Figur 1B).
BEMÆRK: Undgå at stikke nerverøret og notochord, og arbejd hurtigt for at undgå tørring af fisken under processen. - Brug en plastikpipette, hæld en dråbe embryo medium på den stukket zebrafisk og overfør den forsigtigt til en brønd af 24 brøndpladen.
- Gentag trin 2.3 til 2.6. indtil alle fiskene er blevet stukket ned.
BEMÆRK: Flere larver kan stikkes sammen afhængigt af investigatorens behandlingshastighed og færdigheder, så længe fisken ikke tørrer ud under processen. - Når alle larverne er blevet stukket ned, anbringes 24-brøndpladen i inkubatoren på 28 °C, indtil der foretages efterfølgende billeddannelse.
3. Billeddannelse af muskelskader og genopretning
- Ved 1 dag efter skaden (1 dpi) bedøves de dolkede larver ved at tilsætte tricainmetansulfonat til en endelig koncentration på 0,016% (v/v) i embryo medium. Vent i 10 minutter for at sikre, at fisken er helt bedøvet, tydeligt, når fisken holder op med at svømme.
BEMÆRK: Ved 0 dpi indeholder sårstedet en stor mængde celleaffald, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere omfanget af muskelskader (Supplerende figur 1A-B). Det tager cirka 18-20 timer for dette affald, der skal ryddes fra såret stedet, og som sådan er det mere pålideligt at billedet larver på 1 dpi, snarere end 0 dpi, at bestemme omfanget af skade fremkaldt. - Placer en ren og tom glasbund baseret parabol på scenen af polariserende mikroskop og sæt baggrund ved hjælp af den integrerede software.
BEMÆRK: Brug ikke petriskåle af plast til at afbilde birefringence, da de ikke overfører brudt lys korrekt. Afhængigt af det polariserede mikroskop, der anvendes, kan der kræves yderligere indstillinger i henhold til producentens retningslinjer. - Efter at have indstillet baggrunden, skal du fjerne glasbundsbaseret skål fra mikroskopstadiet og bruge en glaspipette overføre den bedøvede, dolkede fisk på glasbundsbaseret skål.
- Fjern forsigtigt overskuddet af embryomedie ved hjælp af en pipette, og orientere fisken pr. 2,5 - hovedet er til venstre, halen til højre, dorsalområdet op og ventralområdet ned.
BEMÆRK: Sørg for, at larverne er monteret så fladt som muligt, da ujævn montering resulterer i forskellige birefringence intensiteter på tværs af forskellige somites. - Placer glasbundsbaseret skål med de bedøvede larver på mikroskopstadiet og billede musklen ved hjælp af polariseret lys (Figur 1C & 1D).
BEMÆRK: Afhængigt af den anvendte type mikroskop/polariseret linse kan fiskeretningen på dens forreste bageste akse påvirke den samlede birefringence15. Sørg for at medtage mindst 5 somites på hver side af skadestedet, når du billedbehandling. - Brug en plastikpipette, hæld en dråbe embryo medium for at rehydrere fisken og læg fisken i en brønd på en 24 brøndplade fyldt op med embryo medium.
BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre billeddannelsen så hurtigt som muligt for at forhindre fisken i at tørre. - Gentag trin 3.3. til 3.6. indtil alle fiskene er blevet afbildet.
- Når alle billeder er anskaffet, skal du gemme dem i .tiff format til efterfølgende analyser.
- Fisken sættes tilbage i 28 °C-inkubatoren, indtil den efterfølgende billeddannelse udføres ved 3 dpi (7 dpf).
- Når fisken er 3 dpi, billede fisken pr 3,3 til 3,8.
- Når alle fisk er blevet afbildet, aflive dem ved at tilføje tricain metansulfonat til en endelig koncentration på 0,2% (v / v) i embryo medium. Vent i mindst 10 minutter for at sikre, at fiskene aflives, tydeligt ved tab af svømmeevne, pumpning af gællebetræk og mangel på et flyverespons efter berøring.
4. Kvantificering af muskelgendannelse
- Åbn et 1 dpi-billede på en billedanalysesoftware, f.eks.
- Brug polygonværktøjet til at tegne rundt om sårstedet, og mål området og den gennemsnitlige birefringenceintensitet i denne region (Figur 1C & 1D). Kopier disse værdier til cellerne D3 og E3 i den angivne skabelon (Supplerende tabel 1).
- Tegne yderligere to regioner, der hver strækker sig over 1-2 uskadte somites, og måle området og den gennemsnitlige birefringence intensiteter i hver af disse regioner (Figur 1C &1D). Kopier disse værdier til cellerne D4-D5 og E4-E5 i den angivne skabelon (Supplerende tabel 1).
BEMÆRK: Selv om det er at foretrække at vælge de samme uskadte somites i 1 dpi og 3 dpi billeder, den sporadiske løsrivelse af muskelfibre og efterfølgende reduktion i birefringence i mutanter kan gøre dette umuligt. Derfor, i tilfælde af at de samme somites ikke kan vælges ved 1 dpi og 3 dpi på grund af reduktionen i muskelintegritet hos mutanter, skal du vælge to forskellige, men upåvirket områder på hvert af tidspunkterne. - Den normaliserede birefringence beregnes for hvert område ved at dividere regionens gennemsnitlige birefringenceintensitet med det område, der vises i kolonne F i den angivne skabelon (Supplerende tabel 1).
- Gentag trin 4.1-4.4 for alle 1 dpi- og 3 dpi-billeder.
BEMÆRK: Ved anvendelse af den medfølgende skabelon (supplerende tabel 1) indsættes intensitetsværdierne 1 dpi og middelbirefringence i henholdsvis kolonne D og E, og intensitetsværdierne på 3 dpi og middelbirefringence skal indsættes i henholdsvis kolonne J og K. - For hvert tidspunkt beregnes den gennemsnitlige normaliserede birefringence af de to ikke-skadede regioner. Denne værdi giver et referencepunkt for ikke-skadede muskler.
BEMÆRK: I den angivne skabelon (Supplerende tabel 1) beregnes denne værdi i kolonne G og M for henholdsvis 1 dpi- og 3 dpi-billederne. - Dernæst bestemme omfanget af muskelskade ved 1 dpi ved at dividere den normaliserede birefringence af skade region med den gennemsnitlige normaliserede birefringence af de uskadte regioner (beregnet i 4,6).
BEMÆRK: Ved hjælp af ovenstående detaljerede nålestikprocedure viser vilde typelarver typisk en normaliseret birefringence på 48,5 ± 14,3% på sårstedet ved 1 dpi, hvilket indikerer, at biringenrefce er reduceret med ca. 50% sammenlignet med uskadte somitter. Når skabelonen (Supplerende tabel 1) bruges denne værdi som en procentdel i kolonne H. - For at bestemme omfanget af muskel regenerering, dividere den normaliserede birefringence af skaden regionen i 3 dpi billedet, med den gennemsnitlige normaliserede intensitet af de uskadte regioner på dette tidspunkt.
BEMÆRK: Ved 3 dpi viser vilde larver typisk en normaliseret birefringence på 60 ± 15,3% på såret. Da den normaliserede birefringence på sårstedet ved 1 dpi var 48,5 ± 14,3% (trin 4,7), indikerer stigningen i birefringence ved 3 dpi til 60 ± 15,3% en genopretning på ca. 11,5%. Når skabelonen (Supplerende tabel 1) bruges denne værdi som en procentdel i kolonne N. - Hold fisk inden for hver genotype adskilt, udfør en parret t-test, der sammenligner den normaliserede birefringence af sårstedet ved 3 dpi (trin 4.8) med den på 1 dpi (trin 4.7). Dette vil afsløre bane muskel regenerering vises af hver fisk i hver genotype, og fremhæve, hvis omfanget af muskel regenerering vises af hver genotype har ændret sig betydeligt.
- Endelig beregnes det regenerative indeks ved at dividere den værdi, der opnås i trin 4.8, som er omfanget af muskelgendannelse ved 3 dpi, med den værdi, der opnås i trin 4.7, som er omfanget af muskelskade ved 1 dpi. Et regenerativt indeks på 1 angiver, at skaden ved 1 dpi kan sammenlignes med 3 dpi, og at muskelgendannelse ikke har fundet sted; en værdi over 1 angiver, at der ved 3 dpi er dannet nye muskler på sårstedet, der fremhæver, at musklen er regenereret; og et regenerativt indeks på mindre end 1 fremhæver, at såret ved 3 dpi er værre end 1 dpi, og at muskel regenerering i nedsat. En t-test eller en envejs ANOVA kan udføres for statistisk at sammenligne omfanget af muskel regenerering mellem de forskellige genotyper. Når du bruger den angivne skabelon (Supplerende tabel 1), beregnes denne værdi i kolonne O.
BEMÆRK: Det anbefales at udføre hele forsøget i tre eksemplarer, med fisk fra hvert forsøg fra forskellige biologiske forældre, og hvert forsøg udføres på forskellige dage for at undgå bias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til at kvantificere birefringence af skeletmuskulatur giver en ikke-invasiv, men meget reproducerbar metode til at undersøge og sammenligne niveauer af muskelskader og undersøge muskelgendannelse in vivo. Birefringence skyldes diffraktion af polariseret lys gennem pseudo-krystallinsk array af muskel sarkomenter15, og efter skade eller skade på musklen, en reduktion i birefringence er indlysende. På samme måde resulterer aktivering og differentiering af stamceller i dannelsen af nye muskelfibre på skadesstedet, hvilket efterfølgende øger birefringenceintensiteten i denne region. Ved hjælp af dette system har vi undersøgt muskelgendannelse i en zebrafiskmodel af medfødt muskeldystrofi type 1A (MDC1A), forårsaget af en mangel i Lama216. Der blev indsamlet en kobling af embryoner fra en krydsning mellem to lama2+/- zebrafisk, og ved 3 dpf blev embryonerne overført til en DNA-ekstraktionschip (figur 1A) og efterfølgende genotypet ved hjælp af en embryongenotypingteknologi. Efter at have identificeret genotype, lama2-/- larver, som model MDC1A16, og lama2+/+ søskende blev såret ved hjælp af en nål stab som pr Figur 1B, og afbildet på en polariserende mikroskop på 1 dpi, og 3 dpi, og birefringence intensiteter blev kvantificeret. Mens muskelskade resulterer i en reduktion i birefringence intensitet ved 1 dpi (Figur 1Ci og Di), den vellykkede regenerering af muskel resulterer i øget birefringence i samme region(Figur 1Cii og Dii). Det er også bemærkelsesværdigt, at mens lama2+/+ larver viser ensartet birefringence intensitet (Figur 1C), på grund af normal muskel mønstre, birefringence intensitet i musklen af lama2-/- var ujævn og meget sporadisk (Figur 1D), tilskrives reduceret muskel integritet.
Ved hjælp af denne tilgang afslører vi, at både wildtype larver (lama2+/+; Figur 2A) og larver, der mangler lama2 (lama2-/-; Figur 2B) viser signifikant øget birefringenceintensitet på sårstedet ved 3 dpi sammenlignet med 1 dpi (Figur 2C), hvilket indikerer, at musklen er regenereret. For at sammenligne larvernes regenerative potentiale i hver genotype blev det regenerative indeks bestemt, og vi afslører, at lama2-/- larver viste en slående stigning i muskelgendannelse sammenlignet med lama2+/+ larver (Figur 2D; gennemsnit i lama2-/- = 1,30 ± - 0,251; gennemsnit i lama2-/- = 1,83 ± 0,439). For yderligere at validere den forbedrede regenerering i lama2-/- larver farvede vi musklen med et antistof mod F-Actin (Supplerende figur 1B-D). Mens disse resultater bekræfter, at lama2-/- faktisk regenererer, fremgår det af tilstedeværelsen af differentierede muskelfibre i såret stedet, den manglende evne til at undersøge de samme fisk på 1 dpi og 3 dpi begrænser evnen til at kvantificere og sammenligne regenerative respons mellem lama2+/+ og lama2-/- fisk. Selv om det mekanistiske grundlag for denne forbedrede regenereringskapacitet i lama2-/- larver fortsat er flygtigt, mener vi, at tabet af lama2 øger antallet af aktiverede stamceller, hvilket efterfølgende resulterer i forbedret muskelgendannelse. Der er dog behov for yderligere undersøgelser for at afgøre dette. Kollektivt, disse resultater fremhæve, at evnen til den beskrevne teknik til at identificere ændringer i muskel regenerering i zebrafisk modeller af muskelsygdom.
Figur 1: Oversigt over genotyping- og muskelgendannelsesprotokollen. (A) Billede af en DNA-ekstraktionschip indeholdende 24, 3 dpf zebrafisklarver. (B) Skematisk over den retning, hvori de 4 dpf larver skal placeres til at udføre nålen stikket, med hovedet til venstre, hale til højre, dorsal region op og ventral region ned. Nålestikket skal udføres ved hjælp af en 30-gauge nål, rettet mod 1-2 somites af epaxial muskel. Oprettet med BioRender.com. (C-D) Billeder af birefringence i en lama2+/+ og lama2-/- larver ved 1 dpi og 3 dpi. Regioner, der er vist i hvid og rød, afspejler de områder, der anvendes til at kvantificere birefringence på sårstedet og ikke-skadede somitter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvantificering af muskelgendannelse i lama2 mangelfulde zebrafisklarver. Billeder af birefringence i lama2+/+ (A) og lama2-/- (B) larver ved 1 dpi og 3 dpi. Såret ved 3 dpi i begge, lama2+/+ og lama2-/- larver er fyldt med nye muskler. (C) Graf over den normaliserede birefringence af hver larver ved 1 dpi og 3 dpi. Den normaliserede birefringence på sårstedet i lama2+/+ og lama2-/- larver øges betydeligt ved 3 dpi, som bestemt ved hjælp af en parret t-test. (D) Regenerativt indeks i lama2+/+og lama2-/- med sidstnævnte viser øget muskelgendannelse, som bestemt ved hjælp af en t-test. Fejllinjer repræsenterer SEM med larver fra tre uafhængige eksperimenter (lama2+/+n=28 og lama2-/- n=16). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Undersøgelse af muskelgendannelse i lama2 mangelfulde larver. Billeder af birefringence i lama2+/+ (Ai) og lama2-/- (Aii) larver ved 0 dpi, der demonstrerer tilstedeværelsen af cellulært affald på sårstedet. Maksimale projektionskonfokale billeder af larve-myotomet, der er farvet til F-actin ved 0 dpi (B), 1 dpi (C) og 3 dpi (D). Ved 3 dpi er såret af lama2+/+ og lama2-/- larver kendetegnet ved udseendet af F-actin mærkede muskelfibre. Klik her for at hente denne fil.
Supplerende tabel 1: Skabelon til kvantificering af muskelgendannelse. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skeletmuskulatur regenerering er drevet af obligate væv hjemmehørende muskel stamceller, hvis funktion er ændret i mange muskelsygdomme såsom muskelsvind, efterfølgende hæmmer processen med muskel regenerering. Her beskriver vi en høj gennemløbsprotokol til at undersøge muskelgendannelse i levende zebrafiskmodeller af muskelsygdom. Det første trin i rørledningen bruger en embryogenotyping platform14, som er en brugervenlig og præcis metode til at bestemme genotypen af levende larver, før du udfører downstream-regenereringsanalysen. En direkte fordel ved dette er, at det giver mulighed for at vælge genotyper, der kun er af interesse, og/eller et sammenligneligt antal fisk inden for hver genotypegruppe, hvilket reducerer antallet af fisk, der skal forarbejdes gennem resten af protokollen, betydeligt. Det er dog bemærkelsesværdigt, at mængden af genomisk DNA fra embryogenotypingapparatet er relativt lav, hvilket kan kompromittere downstream-genotypinganalyser. Det er derfor vigtigt, at alle genotyping assays testes og optimeres, før du bruger det til hovedeksperimentet. Derudover er kilden til DNA primært epidermal, og som sådan kan embryogenotypingsystemet ikke med succes bruges til at genotype larver, der viser vævsspecifikke mutationer.
Den anden del af protokollen viser brugen af en nålestiksskade, som er en omkostningseffektiv og høj gennemløbsteknik, der ikke kun resulterer i en meget reproducerbar skadesstørrelse, men også er tilstrækkelig til at udløse aktivering af muskelstamceller, der resulterer i muskelgendannelse. En alternativ tilgang til at fremkalde skeletmuskulaturskade hos zebrafisk er at anvende lasermedieret celleabsation13,17,18 . Mens dette giver mulighed for at fokusere på specifikke x, y og z fly og efterfølgende målrette enkelt muskelceller, den ekstremt lille sårstørrelse induceret grænser nøjagtig kvantificering af muskel regenerering, især i muskelsygdom modeller, hvor integriteten af muskler er allerede kompromitteret. Vi går derfor ind for brugen af nålestikskader, når vi undersøger muskelgendannelse i zebrafisk muskelsygdomsmodeller.
For præcist at kvantificere omfanget af muskelgendannelse drager vi fordel af skeletmuskulaturens birefringerte natur, som let kan afbildes ved hjælp af et standard polariserende mikroskop. Der er to kritiske punkter, der skal tages i betragtning, når du bruger denne tilgang. For det første, afhængigt af hvilken type mikroskop og / eller polariseret linse, der anvendes, orienteringen af fisken i sin forreste-posterior akse kan påvirke den samlede birefringence intensitites15, og dette skal overvejes, mens billeddannelse. Selv om muskelgendannelsen ikke er helt afsluttet med 3 dpi, er genvindingens omfang tilstrækkeligt til at muliggøre sondringen mellem regenereringskapacitet i forskellige stammer13 (figur 1). Vores tidligere arbejde har vist, at ved hjælp af den protokol, vi har skitseret, regenererer wildtype larver fuldt ud efter 14 dpi19, og derfor for at afgøre, om en stamme ikke kan regenerere, eller hvis muskelgendannelse er forsinket, kan det være nødvendigt at undersøge birefringence intensiteter ud over 3 dpi.
Det skal bemærkes, at i teleostfisk forekommer muskelvækst i hele dyrets liv20, og som sådan er det meget vigtigt at normalisere de birefringence intensiteter af sårstedet med den af uskadte somites inden for samme fisk. Dette trin giver en intern kontrol og fjerner bias i analyserne på grund af forskelle i mængden af muskler på de forskellige tidspunkter eller forskelle i billeddannelsesparametre under forskellige sessioner. Dette normaliseringstrin er også afgørende for præcist at kvantificere muskelgendannelse i modeller af muskelsygdom, som i sagens natur kan have reduceret myofibriller og / eller vise kompromitteret muskelintegritet, hvilket efterfølgende reducerer den samlede birefringence intensitet. Derudover, mens denne protokol effektivt kan afsløre ændringer i muskels regenerative kapacitet, er det muligt, at de er som følge af indirekte virkninger på stamcellefunktionen. Muskel regenerering er en kompleks proces, der involverer signaler fra flere celletyper, herunder muskelceller, makrofager, fibro-adepogene forfædre, og interstitielle celler. Det er muligt, at den ændrede evne til muskel til at regenerere måske forklares ved ændringer i biologien af nogen af disse andre celletyper, som efterfølgende påvirker muskel stamcellefunktion og regenerative proces. Derfor, mens denne protokol kan identificere ændringer i muskel regenerering i modeller af muskelsygdom, downstream cellulære og molekylære analyser skal udføres for at identificere den eller de mekanismer, der er ansvarlige for de observerede ændringer.
Afslutningsvis forstås muskelens regenerative kapacitet i forskellige muskelsygdomme ikke fuldt ud, og fremkomsten af nye teknikker til at undersøge muskelgendannelse in vivo giver en platform til at tackle sådanne spørgsmål. Metoden kan bruges som grundlag for udforskning af cellulære og molekylære signaler, der regulerer muskel regenerering i zebrafisk modeller af muskelsygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Alex Fulcher, og Monash Micro Imaging for hjælp med mikroskop vedligeholdelse og opsætning. Den australske Regenerative Medicine Institute er støttet af tilskud fra staten regering Victoria og den australske regering. Dette arbejde blev finansieret af en muskelsvind Association (USA) projekt tilskud til P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
