Summary
El método presentado permite visualizar proteínas celulares etiquetadas fluorescentemente con microscopía de expansión que conduce a una resolución de 70 nm en un microscopio convencional.
Abstract
La interrupción del filtro glomerular compuesto por el endotelio glomerular, la membrana glomerular del sótano y los podocitos, resulta en albúmina. Los procesos del pie de podocito contienen haces de actina que se unen a proteínas adaptadoras citoesqueléticos como la podocina. Esas proteínas adaptadoras, como la podocina, unen la columna vertebral del diafragma de hendidura glomerular, como la nefrina, con el citoesqueleto actin. Estudiar la localización y la función de estas y otras proteínas podocíticas es esencial para la comprensión del papel del filtro glomerular en la salud y la enfermedad. El protocolo presentado permite al usuario visualizar actina, podocina y nefrina en células con imágenes de super resolución en un microscopio convencional. En primer lugar, las células se tiñen con una técnica convencional de inmunofluorescencia. Todas las proteínas dentro de la muestra se anclan covalentemente a un hidrogel hinchable. A través de la digestión con proteinasa K, las proteínas estructurales se cleaved permitiendo la hinchazón isotrópica del gel en el último paso. La diálisis de la muestra en agua da como resultado una expansión de 4-4,5 veces de la muestra y la muestra se puede imaginar a través de un microscopio de fluorescencia convencional, lo que representa una resolución potencial de 70 nm.
Introduction
Albuminuria es un parámetro sustituto del riesgo cardiovascular y resulta de la interrupción del filtro glomerular1. El filtro glomerular se compone del endotelio fenestrado, la membrana glomerular del sótano y el diafragma cortado formado por podocitos. Los procesos de pie primario y secundario de los podocitos se envuelven alrededor de la pared capilar del glomérulo2. La delicada estructura de los procesos de los pies se mantiene mediante haces corticales de actina que también sirven como anclajes para múltiples proteínas de diafragma de hendidura y otras proteínas adaptadoras2. La proteína de la columna vertebral del diafragma cortado se llama nefrina e interactúa de manera homofílica con moléculas de nefrina de podocitos opuestos. A través de diversas proteínas adaptadoras, la nefrina está vinculada al actin cytoskeleton2,3. Las mutaciones en el gen de codificación de nefrina NPHS1 conducen al síndrome nefrótico del tipofinlandés 4.
Una de las proteínas que interactúan con la nefrina es la podocina, una proteína similar a la horquilla de la familia de la estomatina3. Podocin recluta nefrina a balsas lipídicas y la vincula con el actin cytoskeleton5. La podocina está codificada por el gen NPHS2. Las mutaciones en NPHS2 conducen al síndrome nefrótico resistente a los esteroides6.
Para visualizar y co-localizar las proteínas adaptadoras de actina, se pueden utilizar técnicas de inmunofluorescencia. Desafortunadamente, la barrera de difracción de la luz limita la resolución de los microscopios de fluorescencia convencionales a 200-350 nm7. Las nuevas técnicas de microscopía, por ejemplo, el agotamiento estimulado de emisiones (STED)8,la microscopía de localización fotoactivada (PALM)9,la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM o dSTORM) o la microscopía de eliminación de estado de tierra seguida de retorno individual de moléculas (GSDIM)9,10,11,permiten una resolución de hasta aproximadamente 10 nm. Sin embargo, estas técnicas de súper resolución requieren microscopios altamente caros, personal bien capacitado y, por lo tanto, no están disponibles en muchos laboratorios.
La microscopía de expansión (ExM) es una técnica novedosa y sencilla que permite imágenes de súper resolución con microscopios convencionales y que potencialmente está disponible para una gran comunidad de investigación12. En la microscopía de expansión de retención de proteínas (proExM), la muestra de interés (células o tejidos) se fija y se tiñe con fluoróforos13. Las proteínas dentro de la muestra son entonces ancladas covalentemente por una molécula pequeña (6-((Accriloyl)amino)ácido hexanoico, éster de succinimidyl, AcX) en un hidrogel hinchable13. A través de la digestión enzimática con proteinasa K (ProK), las proteínas y fluoróforos mantienen su posición relativa dentro del gel después de la expansión13. Después de la hinchazón del gel, la muestra se expande hasta 4,5 veces (expansión volumétrica 90 veces) lo que conduce a una resolución lateral efectiva de aproximadamente 60-70 nm (300 nm/4,5). Las modificaciones de esta técnica pueden incluso permitir una expansión de 10 veces (expansión volumétrica de 1.000 veces), lo que representa una resolución de 20-30 nm en microscopios convencionales14,15,16.
Las estructuras glomerulares del ratón y los riñones humanos se han visualizado a través de ExM17. Dentro de este artículo, presentamos un protocolo proExM detallado para visualizar imágenes de súper resolución de F-actin y la podocina proteica actin-adaptador dentro de las células utilizando un microscopio de fluorescencia convencional.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. División y siembra de células
- Caliente el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco estéril, incluyendo un 10% de suero de pantorrilla fetal (FCS), solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y trippsina estéril a 37 °C. Active el banco limpio.
- Prepare una placa de 6 pozos añadiendo un resbalón estéril de cubierta de vidrio (10 mm) a cada pozo utilizando fórceps estériles.
- Ponga un plato de cultivo celular de 10 cm con células Cos7 bajo el banco limpio. Bajo el banco limpio, aspirar el medio de las celdas usando un dispositivo de vacío.
- Sostenga el plato de cultivo celularngulado en una mano y agregue 10 ml de PBS estéril al lado del plato de cultivo celular para evitar el enjuague de las células. Ponga el plato de cultivo celular para que PBS enjuague el plato de cultivo celular completo.
- Retire el PBS y agregue 1 ml de trypsin al centro del plato de cultivo celular e incuba durante 5 minutos a 37 °C.
- Detenga la reacción de trippsinización añadiendo 10 ml de DMEM incluyendo 10% FCS y pipetear la solución celular arriba y abajo con un pipeteador para separar manualmente las celdas.
- Analice el número de celda por mililitro utilizando una cámara de recuento.
- Semillas 68.000 células en medio de 2 ml por pozo en la cubierta de vidrio se desliza en la placa de 6 pozos. Distribuya las celdas dentro de la placa de 6 pozos agitando cautelosamente la placa horizontal y verticalmente.
NOTA: Las células deben estar dispersas. - Incubar las células durante la noche en una incubadora de 37 °C con un 5% de CO2.
2. Transfección de células
- Prepare dos tubos estériles de 1,5 ml (uno para ADN diluido (A) y otro para reactivo diluido para transfección lipídica catiónica (B)). Pipeta 0,75 μg de nefrina y 0,75 μg de plásmido de expresión de podocina cDNA por pozo en un tubo de 1,5 ml y diluirlo en 100 μL de medio sérico reducido por pozo. Añadir 3 μL de reactivo de transfección lipídica catiónica por pozo al segundo tubo de 1,5 ml y diluir con 100 μL de medio sérico reducido. Incuba ambas reacciones durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Combine ambas reacciones (A y B) con un complejo de lípidos de ADN e incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Agregue con precaución 200 μL del complejo DE lípidos de ADN a cada pozo.
- Incubar las células transfectadas a 37 °C con un 5% de CO2 durante 48 h sin cambiar el medio.
3. Inmunoetiquetado de estructuras celulares
- Prepare una solución de fijación (4% (w/v) paraformaldehído en PBS, 1 mL/pozo), la solución de permeabilización (0,5% (w/v) Triton X-100 en PBS, 1 mL/pozo) y una solución de bloqueo (5% (v/v) de albúmina sérica bovina en PBS, 1 mL/pozo).
- Retire el medio con un dispositivo de vacío. Añadir 2 ml de PBS a cada pozo para eliminar el medio adicional. Aspirar el PBS por completo.
NOTA: Para evitar lavar las células con PBS, asegúrese de pipetear PBS no en la tapa de vidrio resbalar directamente. - Fijar celdas con 4% (w/v) paraformaldehído (PFA) disuelto en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Alternativamente, fije las células en 3% (v/v) glyoxal-etanol18. - Deseche la PFA y lave las células dos veces en PBS (2 ml cada una) evitando el pipeteo directo en los resbalones de la cubierta de vidrio. Permeabilizar las células fijas con Tritón X-100 0.5% (w/v) en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
- Retire la solución de permeabilización y lave dos veces con PBS como se indica en el paso 3.2.
- Bloquee las celdas añadiendo 1 ml de BSA del 5% (v/v) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Incubar las células con 200 μL del anticuerpo primario (anticuerpo anti-podocina 1:200 en 1% (v/v) BSA en PBS) durante la noche a 4 °C.
NOTA: Alternativamente, incuba el anticuerpo primario durante 1 h a temperatura ambiente. - Retire el anticuerpo primario y lave tres veces con PBS como en el paso 3.2. Agregue el anticuerpo secundario (el anticongelado de cabra Alexa 488 1:1000 en 1% (v/v) BSA en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Mantenga las celdas en la oscuridad usando una caja.
- Deseche el anticuerpo secundario y lávelo con PBS tres veces.
- Retire PBS e incuba las células con 200 μL de anticuerpo anti-nefrina 1:100 en 1% (v/v) BSA en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Lávese con PBS tres veces. Mantenga las celdas en la oscuridad usando una caja.
- Retire PBS e incuba con el anticuerpo secundario burros anti-conejillo de indias 633, 1:200, durante 1 h a temperatura ambiente. Lávese con PBS tres veces. Mantenga las celdas en la oscuridad usando una caja.
4. Microscopía de expansión
- preparación
- Para formar los espaciadores de la cámara de gelación, corte los resbalones de la cubierta de vidrio #1.0 y #1.5 en rayas de 5 mm (cuatro cada una por tobogán de vidrio) usando un cuchillo de diamante. Coloque las rayas deslizantes de la cubierta #1,5 mm de modo que formen un cuadrado de 2,5 cm de longitud en un tobogán de vidrio y colóquelas en una cámara de tinción(Figura 2A1-C1). Pipeta una gota de ddH2O en las esquinas del cuadrado para adherir las rayas deslizantes de la cubierta de vidrio entre sí y a la diapositiva de vidrio (Figura 2A2-C2).
NOTA: Evite el secado completo de ddH2O a medida que se pierda la fuerza de adherencia. Si es necesario, aplique más gotas de ddH2O. Espere aproximadamente 20 minutos para que los resbalones de la cubierta de #1,5 mm estén firmemente unidos antes de comenzar con el paso 4.1.2. - Coloque cuatro tiras deslizantes de cubierta de vidrio #1.0 por deslizamiento de cubierta en los #1,5 mm de los resbalones de la cubierta. Adhiera las rayas pipeteando una gota en cada franja deslizante de la cubierta de #1,5 mm(Figura 2A3-C3).
NOTA: El espesor del gel debe ser de al menos 0,15 mm para facilitar el manejo en el progreso del protocolo. Sin embargo, para evitar el gel excesivo en la parte superior de las células, mantenga la altura de los espaciadores cerca del sustrato celular. Mediante el uso de #1.5 y #1.0 rayas deslizantes de la cubierta como espaciadores, la altura de los espaciadores será de aproximadamente 0,3 mm. Las células se adhieren al vidrio de la cubierta (altura 0,12 mm). Por lo tanto, el gel será lo suficientemente grueso como para manejar, pero se evita el gel excesivo en la parte superior de las células usando #1.0 y #1.5 cubren las rayas de vidrio como espaciadores. - Para la tapa de la cámara de gelificación, envuelva un vaso de cubierta (#1.5) con película de parafina. Evite cualquier pliegue o suciedad en la película de parafina(Figura 2A5-C5).
- Para formar los espaciadores de la cámara de gelación, corte los resbalones de la cubierta de vidrio #1.0 y #1.5 en rayas de 5 mm (cuatro cada una por tobogán de vidrio) usando un cuchillo de diamante. Coloque las rayas deslizantes de la cubierta #1,5 mm de modo que formen un cuadrado de 2,5 cm de longitud en un tobogán de vidrio y colóquelas en una cámara de tinción(Figura 2A1-C1). Pipeta una gota de ddH2O en las esquinas del cuadrado para adherir las rayas deslizantes de la cubierta de vidrio entre sí y a la diapositiva de vidrio (Figura 2A2-C2).
- Anclaje y polimerización (gelación)
- Prepare el búfer de anclaje (véase la Tabla 1). Para el tratamiento de anclaje, reemplace PBS por 250 μL de amortiguador de anclaje por pozo directamente en el resbalón de la cubierta de vidrio e incubar durante 3 h a temperatura ambiente. Mantenga el sustrato en la oscuridad con una caja.
NOTA: Alternativamente, incuba durante la noche a temperatura ambiente. Prepare un nuevo búfer de anclaje para cada experimento y espere 10-15 minutos hasta que se disuelva correctamente. 6-(Acrililo)amino)ácido hexanoico, éster de succinimidyl (AcX) debe ser reemplazado cada 4-5 meses para asegurar un anclaje adecuado. - Retire el búfer de anclaje y lave una vez con PBS de 1,5 ml por pozo.
- Para manchar las fibras de actina, descongelar una solución de fhalloidina compatible con ExM e incubar la fhalloidina (5 μL de fhalloidina diluida en 195 μL de 1% (v/v) BSA en PBS/pozo) durante 45 min a temperatura ambiente. Mantenga las muestras en la oscuridad con una caja.
- Mientras tanto, disolver el acrilato de sodio en ddH2O usando un dispositivo de agitación. Sobre hielo, prepare la solución del monómero (véase la Tabla 1).
NOTA: El acrilato de sodio disuelto debe ser una solución transparente e incolora. Si la solución es amarilla, sustitúyala por un nuevo acrilato de sodio. - Preparar la solución de gelificante sobre hielo (ver Tabla 1). Pipeta ammoniumperoxidsulfato (APS) en la solución de gelling justo antes de que la solución de gelling se aplique a la cámara de gelación.
- Retire la faloidina de las células y lave con 1,5 ml de PBS dos veces a temperatura ambiente. Deje 1,5 mL PBS dentro del pozo para facilitar la eliminación de la muestra en el resbalón de la cubierta de vidrio.
- Coloque las celdas en el vaso de la cubierta en la cámara de gelificante con fórceps y una cánula para levantar el resbalón de vidrio de la cubierta de la placa de 6 pozos.
NOTA: Las celdas deben estar en la parte superior del resbalón de la cubierta de vidrio. El resbalón de la cubierta de vidrio no debe tocar los espaciadores. - Agregue APS a la solución de gelling y vórtice en breve. Pipeta 200 μL de solución de gelificante en la muestra (Figura 2A4-C4). Cierre con precaución la cámara de gelación evitando burbujas de aire dentro del gel(Figura 2A5-C5).
- Incubar la cámara de gelificante durante al menos 1 h a 37 °C para polimerizar el gel en la cámara de tinción húmeda.
- Prepare el búfer de anclaje (véase la Tabla 1). Para el tratamiento de anclaje, reemplace PBS por 250 μL de amortiguador de anclaje por pozo directamente en el resbalón de la cubierta de vidrio e incubar durante 3 h a temperatura ambiente. Mantenga el sustrato en la oscuridad con una caja.
- Homogeneización (digestión)
- Saca la cámara de manchas de la incubadora. Para abrir la tapa de la cámara de gelificación, introduzca una cuchilla de afeitar entre la tapa y el espaciador. Retire la tapa con precaución. Retire los espaciadores con la cuchilla de afeitar y elimine todo el gel adicional cortándolo con la cuchilla de afeitar.
- Coloque el tobogán con el gel y cubra el vidrio en un plato lleno de PBS. Agitando suavemente, retire el vaso de la cubierta desprendida del gel. Para quitar el gel del plato fácilmente, coloque la diapositiva debajo del gel para fijar el gel a la diapositiva.
- Con el gel en la diapositiva, divida el gel en trozos pequeños (la cuarta parte del gel se divide en dos o tres piezas) usando la hoja de afeitar. Empuje suavemente un trozo de gel en un pozo de una placa de 6 pozos con fondo de vidrio y envolvéguelo por un pincel. Mantenga el gel hidratado con una pequeña cantidad de PBS usando el pincel para evitar la deshidratación del gel.
NOTA: Las células se enfrentan hacia abajo. - Con un microscopio invertido, tome imágenes de visión general con baja apertura numérica para determinar el factor de expansión después de la expansión.
- Prepare el búfer de digestión (véase la Tabla 1). Diluir proteinasa K a 4 U/ml en búfer de digestión para recibir la solución de digestión.
NOTA: El búfer de digestión sin Proteinase K se puede almacenar a 4 °C durante 1-2 semanas. - Añadir 500 μL de la solución de digestión a cada pozo y sumergir el gel dentro de la solución. Deje que digiera durante la noche a temperatura ambiente y cierre la tapa manteniendo las muestras en la oscuridad.
NOTA: Alternativamente, deje que digiera a 37 °C durante 1 h.
- expansión
- Retire la solución de digestión con una pipeta y deséchela. Agregue 1 ml de ddH2O. Incubar el gel sumergido durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Retire el agua y agregue 1 ml de ddH fresco2O. Espere 10 minutos y continúe intercambiando agua cada 10 minutos hasta que se alcance una meseta de expansión.
NOTA: La expansión de la muestra hasta 4,5 veces es alcanzable. El gel se vuelve ópticamente transparente.
- imagenológico
- Retire el agua del gel e inicie directamente la microscopía. Utilizando un microscopio invertido, utilice principalmente un objetivo de aire (baja ampliación) para encontrar células con imágenes en el estado de pre-expansión (paso 4.3.4).
- Cambie a un objetivo de 40x (aceite/agua) y 63x para una mejor resolución. Excitar con la longitud de onda de interés y tomar la imagen a través de la cámara.
- validación
- Tome una imagen general de la muestra. Busque y haga coincidir las mismas estructuras dentro de la muestra que se imaginaron en el paso 4.3.4. Utilice el canal con la mejor relación señal-ruido para la validación (Figura 3 A-B).
NOTA: Ajuste los parámetros de imagen para lograr un brillo similar al de la imagen adquirida en estado no expandido (paso 4.3.4). - Superponga las imágenes previas y posteriores a la expansión girándolas y desplazándolas por ImageJ. Utilice la herramienta de medición de distancia en ImageJ para medir las distancias entre estructuras claramente identificables. Mida al menos 10 estructuras diferentes.
NOTA: Como alternativa, utilice una secuencia de comandos de Python para medir las distancias como se describe en14. - Calcule el factor de expansión dividiendo las mediciones posteriores/previas a la expansión.
- Para determinar distorsiones, tome imágenes con una apertura numérica más alta (Figura 4A-B). Superponga estas imágenes y analícelas con ImageJ o como se describe en15.
NOTA: La determinación de distorsiones debe realizarse de forma rutinaria, pero no necesariamente en cada muestra.
- Tome una imagen general de la muestra. Busque y haga coincidir las mismas estructuras dentro de la muestra que se imaginaron en el paso 4.3.4. Utilice el canal con la mejor relación señal-ruido para la validación (Figura 3 A-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El concepto y el tiempo de este protocolo proExM se representan en la Figura 1. El día 5, las células transfectadas se fijan y se tiñen con anticuerpos fluorescentes dirigidos a la proteína de interés(Figura 1A,B). El día 6, el tratamiento con AcX conduce a la formación de grupos de aminas en todas las proteínas (incluidos los fluoróforos) (Figura 1A,B)12. Tras la polimerización del hidrogel, estos grupos de aminas se unen covalentemente al hidrogel (día 6). Después de la polimerización del gel, la homogeneización (digestión) se realiza con proteinasa K resultando en la destrucción de proteínas estructurales de la célula (día 6, Figura 1A,B). Los anticuerpos etiquetados fluorescentemente permanecen preservados principalmente después de la digestión. Debido a la interrupción de las proteínas estructurales, diálisis de agua del hidrogel resulta en la expansión isotrópica de la célula dentro del hidrogel en el día 7 (Figura 1A,B). Las imágenes de la muestra se realizan con un microscopio de fluorescencia convencional(Figura 1A). Se debe realizar la validación de datos para determinar el factor de expansión y excluir distorsiones (Figura 1A).
Para realizar la expansión de la célula isotrópicamente, el paso de gelación es esencial. La Figura 2 muestra la vista lateral y superior de una cámara de gelación. Los resbalones de la cubierta de vidrio construyen los espaciadores de la cámara de gelación (Figura 2A1-3/C1-3). El vidrio de la cubierta con las celdas fijas y manchadas se coloca con las células hacia arriba en un tobogán de vidrio(Figura 2A4-C4). La tapa de la cámara de gelificación está envuelta con parafilm y está cerrada sin burbujas(Figura 2A5-C5).
Este protocolo ExM permite la expansión de hasta cuatro veces. Para determinar el factor de expansión, es esencial para las celdas de imagen antes y después de la expansión (Figura 3A + B). El anclaje y la homogeneización insuficientes pueden conducir a distorsiones y rupturas de las células. La Figura 4A + B muestra ejemplos representativos de células rotas en diferentes imágenes de ampliación.
Este método se puede utilizar para investigar la co-localización de proteínas adaptadoras de F-actina y actina, por ejemplo, podocina y nefrina (Figura 5). La podocina se representa en verde mientras que actin está etiquetado en azul (Figura 5). La nefrina está marcada en verde. Las áreas blancas indican la co-localización.
Figura 1: Concepto y sincronización de este protocolo ExM. (A) En la columna "protocolo", se describe cada paso del protocolo. (A + B) Después de las células de siembra y transfectación, se realiza el etiquetado inmunofluorescente (Inmunoetiquetado). (A + B) La molécula pequeña AcX (punto rojo) se une a todas las proteínas y las ancla al hidrogel (Anclaje). (A + B) A través de la polimerización todas las proteínas, incluidos los fluoróforos, se unen covalentemente a través de AcX al hidrogel (polimerización). (A + B) La homogeneización conduce a la digestión de proteínas de matriz estructural. (A + B) La expansión se logra mediante diálisis en el agua. (A) Las imágenes y la validación de imágenes finalizan el experimento. (A) Todo el protocolo requiere 7 días (columna "día") con muchos pasos de incubación (tiempo total por día columna "tiempo total"), pero el tiempo real del banco es mucho menor como se indica en la columna respectiva "tiempo de banco". Modificado a partir de14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Construcción de la cámara de gelación. Vista lateral (A1) y vista superior (B1 + C1) de una diapositiva de vidrio con cuatro #1.5 rayas de cubierta. Al añadir una gota de agua entre la tobogán de vidrio y las rayas deslizantes de la cubierta, las rayas se adhieren a la diapositiva de vidrio(vista lateral A2, vista superior B2, C2). Gotas de agua en las rayas de cubierta #1.5 conducen a la adhesión de #1.0 rayas de cubierta colocadas en la parte superior de la #1.5 rayas de cubierta(vista lateral A3, vista superior B3, C3). La muestra en el resbalón de la cubierta se coloca en el centro del rectángulo usando fórceps. El gel está pipetado en la parte superior(vista lateral A4, vista superior B4, C4). (A5) Vista lateral y vista superior(B5 y C5)de la cámara de gelificación montada incluyendo la tapa cerrada que está construida a partir de un resbalón de cubierta envuelto en parafilm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Células antes y después de la expansión. (A) Células antes de la expansión manchadas para actin. El cuadro indica en qué área se encuentran las celdas expandidas de la Figura 3B. (B) Células después de la expansión manchadas de actina en rojo y podocina en verde. La podocina se localiza con actina en la periferia celular. Barra de escala = 5 μm, factor de expansión = 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Distorsiones y rupturas de células. (A + B) Imágenes microscópicas representativas de células cos7 inmunodeprimadas para actina (rojo). Las células fueron fijas, manchadas, ancladas, digeridas y expandidas. (A) Rupturas de células. Las flechas indicaban áreas rotas. Barra de escala = 5 μm, factor de expansión = 4. (B) Rupturas y distorsión de las células. Las flechas blancas indicaban áreas rotas. Barra de escala = 5 μm, factor de expansión = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La podocina se localiza con nefrina y actina. Células Cos7 inmunofluorescentes etiquetadas para podocina, actina y nefrina. (A) Células cos7 manchadas de podocina (verde), actina (azul) y nefrina (rojo) con ExM. La podocina se localiza con actina y nefrina. Barra de escala = 200 nm, factor de expansión = 4. (B) Ampliación del área indicada en (A), Barra de escala = 40 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búfer de anclaje | concentración final | ||
| NaHCO3 | 150 mM | ||
| Acrililo-X, SE (AcX) | 0,1 mg/ml | ||
| Solución monomer | Concentración de solución de stock g/100 ml | cantidad (ml) | concentración final (g/100 ml) |
| acrilato de sodio | 38 | 2.25 | 8.6 |
| acrilamida | 50 | 0.5 | 2.5 |
| N,N'-Metilebisacrilamida | 2 | 0.75 | 0.15 |
| cloruro de sodio | 29.2 | 4 | 11.7 |
| Pbs | 10x | 1 | 1x |
| Agua | 0.75 | ||
| total | 9.4 | ||
| Solución gelling | Concentración de soluciones de stock | cantidad (μl) | concentración final (mg/ml) |
| solución monómero | Na | 190 | Na |
| Aps | 10% | 4 | 0.1 |
| TEMED | >99% | 4 | 0.1 |
| Agua | Na | 2 | Na |
| total | 200 | ||
| Solución de digestión | concentración final | ||
| Tris Cl, pH 8.0 | 1 M | ||
| EDTA pH 8.0 | 0,5 M | ||
| Tritón X-100 | 0.005% | ||
| Guanidin HCL | 8 M | ||
| Agua | |||
| proteinasa K | 4 U/ml |
Tabla 1: Soluciones para ExM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método presentado permite al investigador visualizar proteínas celulares, por ejemplo, podocina, nefrina y componentes citoesqueléticos, por ejemplo, F-actin. Dentro de este protocolo, las células cos7 transfectadas se utilizan como modelo para estudiar la interacción de proteínas de diafragma cortadas con F-actin. Desafortunadamente, las líneas celulares de podocitos inmortalizadas no expresan suficientes cantidades endógenas de proteínas de diafragma cortadas19.
Con este método, las proteínas celulares se pueden visualizar con resolución a nanoescala utilizando un microscopio de fluorescencia convencional. Los pasos más críticos dentro del protocolo son: 1) anclaje suficiente de grupos de proteínas aminas al hidrogel con AcX, 2) polimerización adecuada del hidrogel, 3) sincronización óptima para la digestión y 4) selección de fluoróforos compatibles.
El anclaje de proteínas celulares al hidrogel es esencial para este método con el fin de preservar la posición de la proteína dentro del hidrogel durante la expansión. AcX es una molécula pequeña que se une a grupos de aminas de proteínas dentro de las células y tejidos. AcX crea una doble banda carbono-carbono con proteínas, permitiendo la incorporación de las proteínas en el hidrogel en el paso de polimerización20. AcX también integra anticuerpos para que el etiquetado con anticuerpos de inmunofluorescencia se pueda realizar antes del tratamiento con AcX. El anclaje insuficiente puede provocar rupturas y distorsiones de las células. Debido a la modificación de los grupos de aminas por fijación, uno necesita optimizar el fijador o el tiempo de fijación. Además, el almacenamiento insuficiente o las condiciones de anclaje no optimizadas pueden provocar rupturas y distorsiones. Basándose en nuestra experiencia, AcX pierde su efecto óptimo cuando se utiliza durante más de 3-4 meses.
La polimerización del gel depende de la temperatura. Por lo tanto, recomendamos mantener las soluciones de polimerización en el hielo antes de canalizarlo a la cámara de gelificador. Además, el tiempo de manipulación del paso de gelización debe mantenerse corto (menos de 5 min) para evitar la formación prematura de gel. La mezcla exhaustiva de la solución de polimerización evita la polimerización desigual. Las burbujas de aire afectarán al proceso de expansión al tocar la muestra y se pueden prevenir añadiendo más solución de polimerización.
Después de la incorporación de las proteínas celulares dentro del hidrogel, se necesita el paso de homogeneización mecánica (o digestión) para asegurar la expansión. Existen diferentes métodos, por ejemplo, calor y detergente o digestión enzimática, que deben personalizarse a la muestra investigada12,14,20. Dentro de este protocolo, la proteasa Proteinasa K se utiliza para la digestión enzimática. Proteinasa K se aplica en una dosis suficiente para destruir proteínas estructurales mientras se preservan la mayoría de las otras proteínas incluyendo anticuerpos fluorescentes12. Si la digestión está incompleta, la expansión de la muestra es insuficiente. Además, la muestra puede desgarrar durante el proceso de expansión (Figura 3). Si se ha producido una expansión inadecuada de la muestra, se recomienda el reemplazo de agua. Alternativamente, el tiempo para la digestión enzimática se puede ajustar o se abre una nueva alícuota de la Proteinase K.
Si la muestra es digerida en exceso, las señales de fluorescencia disminuirán. En este caso, se debe reducir el tiempo de digestión. En ExM en general, la intensidad de la señal de fluorescencia por unidad de volumen se reduce debido a la expansión volumétrica de la muestra14. Por lo tanto, es necesario tener en cuenta los tiempos de exposición más largos durante la toma de imágenes.
Es esencial seleccionar fluoróforos compatibles con ExM. Los tintes de cianina se degradan durante el paso de polimerización13. Las proteínas de fluorescencia basadas en bacteriofitocromos también se destruyen en gran medida13. Sin embargo, la mayoría de las proteínas similares a GFP se conservarán13. Además, streptavidin también se puede aplicar antes de la expansión, etiquetando modificaciones post-traslacionales como S-nitrolysation a través de una pequeña etiqueta de molécula13.
La faloidina, una pequeña molécula de etiquetado para dirigirse al citoesqueleto actin, no es compatible con ExM21. Para superar el anclaje insuficiente de la faloidina, se ha introducido el anclaje trivalente (TRITON)21. Este enfoque ofrece orientación simultánea, etiquetado e injerto de biomoléculas21.
Este método se puede modificar para manchar moléculas de ARN (ExFish)22. En microscopía de expansión iterativa (iExM) o microscopía X10, la resolución de 60-70 nm se puede ampliar a aproximadamente 25 nm mediante la aplicación de un segundo gel hinchable dentro del primer hidrogel expandido o la realización de un único paso de expansión utilizando un hidrogel diferente15,16. La microscopía de expansión de ultraestructuras (U-ExM) permite una super resolución de proteínas que preservan su atribución a un elemento ultraestructural (por ejemplo, mitocondrias, microtúbulos)23. Previamente se ha realizado una combinación de ExFish (ARN y ADN) y métodos proExM, así como22,24. El protocolo presentado utiliza células cos7 transfectadas como modelo para investigar las proteínas de diafragma cortadas. Esperamos que otras células renales cultivadas residentes, por ejemplo, células HEK293T, se puedan utilizar de manera similar para este protocolo. Dependiendo de la línea celular, es posible que deba realizarse ajustes para las diferentes condiciones de cultivo y transfección.
ExM mejora la resolución de muestras inmuno-manchadas al alcanzar aproximadamente 4 veces una resolución espacial lateral de 70 nm13. En comparación con otras técnicas de super-resolución, ExM se realiza en un microscopio de fluorescencia convencional13,14. Por lo tanto, no es necesario ningún equipo costoso o personal específicamente capacitado para llevar a cabo el método ExM14. Aunque no todos los fluoróforos son compatibles con ExM, generalmente hay muchos anticuerpos disponibles con fluoróforos optimizados con propiedades fotofísmicas necesarias para la microscopía de súper resolución14. La principal desventaja de este método es que ExM es incompatible con las muestras vivas12,14.
En el futuro, la mejora de la composición química del hidrogel puede conducir a una resolución espacial aún mayor12. La combinación de diferentes protocolos también puede permitir la visualización de proteínas, ARN, ADN o lípidos en complejos dentro de la misma muestra con tan alta resolución12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Blanka Duvnjak y Nikola Kuhr por su excelente asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al.
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
