Summary
De gepresenteerde methode maakt visualisatie van fluorescerend gelabelde cellulaire eiwitten met expansiemicroscopie mogelijk, wat leidt tot een resolutie van 70 nm op een conventionele microscoop.
Abstract
Verstoring van het glomerulaire filter bestaande uit het glomerulaire endotheel, glomerulair keldermembraan en podocyten, resulteert in albuminurie. Podocyte voetprocessen bevatten actinebundels die zich binden aan cytoskeletadaptereiwitten zoals podocine. Deze adaptereiwitten, zoals podocine, verbinden de ruggengraat van het glomerulaire spleetdiafragma, zoals nefhrine, met het actinecytoskelet. Het bestuderen van de lokalisatie en functie van deze en andere podocytische eiwitten is essentieel voor het begrijpen van de rol van het glomerulaire filter bij gezondheid en ziekte. Het gepresenteerde protocol stelt de gebruiker in staat om actine, podocine en nefhrine te visualiseren in cellen met superresolutiebeeldvorming op een conventionele microscoop. Ten eerste worden cellen gekleurd met een conventionele immunofluorescentietechniek. Alle eiwitten in het monster worden vervolgens covalent verankerd aan een zwelbare hydrogel. Door de spijsvertering met proteïnase K worden structurele eiwitten gespleten waardoor isotropische zwelling van de gel in de laatste stap mogelijk is. Dialyse van het monster in water resulteert in een 4-4,5-voudige uitzetting van het monster en het monster kan worden bekeken via een conventionele fluorescentiemicroscoop, waardoor een potentiële resolutie van 70 nm ontstaat.
Introduction
Albuminurie is een surrogaatparameter van cardiovasculair risico en is het gevolg van verstoring van het glomerulaire filter1. Het glomerulaire filter bestaat uit het fenestrated endotheel, het glomerulaire keldermembraan en het spleetmembraan gevormd door podocyten. Primaire en secundaire voetprocessen van podocyten wikkelen zich rond de capillaire wand van het glomerulum2. De delicate structuur van voetprocessen wordt gehandhaafd door corticale actinebundels die ook dienen als ankers voor meerdere spleetmembraaneiwitten en andere adaptereiwitten2. Het ruggengraateiwit van het spleetmembraan wordt nefhrine genoemd en interageert op een homofiele manier met nefhrinemoleculen van tegengestelde podocyten. Via diverse adaptereiwitten is nefhrine gekoppeld aan het actinecytoskelet2,3. Mutaties in het nefrine-coderende gen NPHS1 leiden tot nefrotisch syndroom van het Finse type4.
Een van de interacterende eiwitten van nephrin is podocine, een haarspeldachtig eiwit van de stomatinefamilie3. Podocin rekruteert nephrine aan lipidenvlotten en koppelt het aan het actinecytoskelet5. Podocine is gecodeerd door het NPHS2 gen. Mutaties in NPHS2 leiden tot steroïde-resistent nefrotisch syndroom6.
Om actineadaptereiwitten te visualiseren en te co-lokaliseren, kunnen immunofluorescentietechnieken worden gebruikt. Helaas beperkt de diffractiebarrière van het licht de resolutie van conventionele fluorescentiemicroscopen tot 200-350 nm7. Nieuwe microscopietechnieken, bijv. gestimuleerde emissiedepletie (STED)8, fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM)9, stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM of dSTORM) of aardtoestandverwijderingsmicroscopie gevolgd door individuele molecuulretour (GSDIM)9,10,11, maken een resolutie tot ongeveer 10 nm mogelijk. Deze superresolutietechnieken vereisen echter zeer dure microscopen, goed opgeleid personeel en zijn daarom niet beschikbaar in veel laboratoria.
Expansion microscopy (ExM) is een nieuwe en eenvoudige techniek die superresolutiebeeldvorming met conventionele microscopen mogelijk maakt en mogelijk beschikbaar is voor een grote onderzoeksgemeenschap12. Bij eiwitretentie-expansiemicroscopie (proExM) wordt het interessemonster (cellen of weefsel) gefixeerd en gekleurd met fluoroforen13. Eiwitten in het monster worden vervolgens covalent verankerd door een klein molecuul (6-((Acryloyl)amino)hexaanzuur, succinimidylester, AcX) in een opzwepbare hydrogel13. Door enzymatische vertering met proteïnase K (ProK) behouden eiwitten en fluoroforen hun relatieve positie in de gel na expansie13. Na zwelling van de gel breidt het monster zich uit tot 4,5-voudig (90-voudige volumetrische expansie) wat leidt tot een effectieve laterale resolutie van ongeveer 60-70 nm (300 nm/4,5). Aanpassingen van deze techniek kunnen zelfs een 10-voudige uitbreiding (1.000-voudige volumetrische expansie) mogelijk maken, waardoor een resolutie van 20-30 nm op conventionele microscopen14,15,16wordt weergegeven.
Glomerulaire structuren van muis en menselijke nieren zijn gevisualiseerd via ExM17. In dit artikel presenteren we een gedetailleerd proExM-protocol om superresolutiebeelden van F-actine en de actineadapter eiwitpodocine in cellen te visualiseren met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Splitsen en zaaien van cellen
- Warm steriel Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) op, inclusief 10% foetale kalfsserum (FCS), steriele Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en steriele trypsine tot 37 °C. Activeer de schone bank.
- Bereid een 6-put plaat voor door één steriele glazen afdekplaat (10 mm) aan elke put toe te voegen met behulp van steriele tang.
- Leg een celkweekschaal van 10 cm met Cos7 cellen onder de schone bank. Zuig onder de schone bank het medium van de cellen aan met behulp van een vacuümapparaat.
- Houd de geanguleerde celkweekschaal in één hand en voeg 10 ml steriel PBS toe aan de zijkant van de celkweekschaal om te voorkomen dat cellen worden afspoeld. Leg de celkweekschaal neer zodat PBS de complete celkweekschaal spoelt.
- Verwijder de PBS en voeg 1 ml trypsine toe aan het midden van de celkweekschaal en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Stop de trypsinisatiereactie door 10 ml DMEM toe te voegen, inclusief 10% FCS en pipetteer de celoplossing op en neer met een pipettor om de cellen handmatig te scheiden.
- Analyseer het celnummer per milliliter met behulp van een telkamer.
- Zaai 68.000 cellen in 2 ml medium per put op de glazen afdekplaten in de 6-putplaat. Verdeel de cellen binnen de 6-put plaat door de plaat voorzichtig horizontaal en verticaal te schudden.
OPMERKING: Cellen moeten verspreid liggen. - Incubeer de cellen 's nachts in een incubator van 37 °C met 5% CO2.
2. Transfectie van cellen
- Bereid twee steriele buizen van 1,5 ml (één voor verdund DNA (A) en één voor verdund reagens voor kationische lipidetransfectie (B)). Pipet 0,75 μg nefhrine en 0,75 μg podocine cDNA expressie plasmide per put in één buis van 1,5 ml en verdun het tot 100 μL gereduceerd serummedium per put. Voeg 3 μL kationisch lipidetransfectiereagens per put toe aan de tweede buis van 1,5 ml en verdun met 100 μL gereduceerd serummedium. Incubeer beide reacties gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Combineer beide reacties (A en B) op een DNA-lipidencomplex en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg voorzichtig 200 μL van het DNA-lipidencomplex toe aan elke put.
- Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur zonder het medium te veranderen.
3. Immunolabeling van cellulaire structuren
- Bereid een fixatieoplossing (4% (m/v) paraformaldehyde in PBS, 1 ml/put), de permeabilisatieoplossing (0,5% (m/v) Triton X-100 in PBS, 1 ml/put) en een blokkerende oplossing (5% (v/v) runderserumalbumine in PBS, 1 ml/put).
- Verwijder het medium met een vacuümapparaat. Voeg 2 ml PBS toe aan elke put om extra medium te verwijderen. Aspireer de PBS volledig.
OPMERKING: Om te voorkomen dat cellen met PBS worden wegspoelen, moet u PBS niet direct op de glazen afdekstrip gieten. - Fix cellen met 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) opgelost in PBS gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Als alternatief kunt u cellen fixeren in 3% (v/v) glyoxal-ethanol18. - Gooi PFA weg en was de cellen tweemaal in PBS (elk 2 ml) door directe pipetten op de glazen afdekstrips te vermijden. Permeabiliseer de vaste cellen met Triton X-100 0,5% (w/v) in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de permeabilisatieoplossing en was tweemaal met PBS zoals aangegeven in stap 3.2.
- Blokkeer de cellen door 1 ml 5% (v/v) BSA toe te voegen in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer de cellen met 200 μL van het primaire antilichaam (anti-podocine-antilichaam 1:200 in 1% (v/v) BSA in PBS) 's nachts bij 4 °C.
OPMERKING: U kunt het primaire antilichaam ook gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen. - Verwijder het primaire antilichaam en was driemaal met PBS zoals in stap 3.2. Voeg het secundaire antilichaam (geitenanti-konijn Alexa 488 1:1000 in 1% (v/v) BSA in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur toe. Houd de cellen in het donker met behulp van een doos.
- Gooi het secundaire antilichaam weg en was drie keer met PBS.
- Verwijder PBS en incubeer de cellen met 200 μL anti-nefronantilichaam 1:100 in 1% (v/v) BSA in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Drie keer wassen met PBS. Houd de cellen in het donker met behulp van een doos.
- Verwijder PBS en incubeer met het secundaire antilichaam ezel anti-cavia 633, 1:200, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Drie keer wassen met PBS. Houd de cellen in het donker met behulp van een doos.
4. Expansiemicroscopie
- Voorbereiding
- Om de afstandhouders voor de gelatiekamer te vormen, schuift de glazen afdekking #1,0 en #1,5 in strepen van 5 mm (elk vier per glasschuif) met behulp van een diamantmes. Plaats de #1,5 mm afdekstrips zo dat ze een vierkant van 2,5 cm lengte vormen op een glazen glijbaan en plaats ze in een kleurkamer (Afbeelding 2A1-C1). Pipetteer een druppel ddH2O in de hoeken van het vierkant om de schuifstrepen van de glazen afdekking aan elkaar en aan de glazen schuif te hechten (Afbeelding 2A2-C2).
OPMERKING: Vermijd het volledig drogen van ddH2O, omdat de hechtkracht verloren gaat. Breng indien nodig meer druppels ddH2O aan. Wacht ongeveer 20 minuten, zodat #1,5 mm afdekstroken stabiel worden bevestigd voordat u begint met stap 4.1.2. - Plaats vier #1,0 glazen afdekstrips per afdekstrip op de #1,5 mm afdekstrips. Hecht de strepen door op elke #1,5 mm afdekstrip een druppel te pipetten (afbeelding 2A3-C3).
OPMERKING: De dikte van de gel moet ten minste 0,15 mm zijn om de hantering in de voortgang van het protocol te vergemakkelijken. Om echter overmatige gel bovenop de cellen te voorkomen, houdt u de hoogte van de afstandhouders dicht bij het celsubstraat. Door #1,5 en #1,0 afdekstrips als afstandhouders te gebruiken, wordt de hoogte van de afstandhouders ongeveer 0,3 mm. De cellen hechten zich aan het afdekglas (hoogte 0,12 mm). Daarom zal de gel dik genoeg zijn om te hanteren, maar overmatige gel bovenop de cellen wordt vermeden met behulp van #1.0 en #1,5 bedekken glazen strepen als afstandhouders. - Wikkel voor het deksel van de gelatiekamer een afdekglas (#1,5) in met paraffinefilm. Vermijd plooien of vuil op de paraffinefilm(afbeelding 2A5-C5).
- Om de afstandhouders voor de gelatiekamer te vormen, schuift de glazen afdekking #1,0 en #1,5 in strepen van 5 mm (elk vier per glasschuif) met behulp van een diamantmes. Plaats de #1,5 mm afdekstrips zo dat ze een vierkant van 2,5 cm lengte vormen op een glazen glijbaan en plaats ze in een kleurkamer (Afbeelding 2A1-C1). Pipetteer een druppel ddH2O in de hoeken van het vierkant om de schuifstrepen van de glazen afdekking aan elkaar en aan de glazen schuif te hechten (Afbeelding 2A2-C2).
- Verankering en polymerisatie (gelatie)
- Bereid de verankeringsbuffer voor (zie tabel 1). Vervang PBS voor de verankeringsbehandeling door 250 μL verankeringsbuffer per put direct op de glazen afdekslip en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Houd het substraat in het donker met behulp van een doos.
OPMERKING: U kunt ook 's nachts op kamertemperatuur incuberen. Bereid voor elk experiment een nieuwe verankeringsbuffer voor en wacht 10-15 minuten totdat deze goed is opgelost. 6-(Acryloyl)amino)hexaanzuur, succinimidylester (AcX) moet elke 4-5 maanden worden vervangen om voldoende verankering te garanderen. - Verwijder de verankeringsbuffer en was eenmaal met 1,5 ml PBS per put.
- Om actinevezels te beitsen, ontdooit u een ExM-compatibele falloïdineoplossing en incubeert u de phalloïdine (5 μL phalloïdine verdund in 195 μL van 1% (v/v) BSA in PBS/well) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar monsters in het donker met behulp van een doos.
- Los ondertussen natriumacrylaat op in ddH2O met behulp van een roerapparaat. Bereid op ijs de monomeeroplossing voor (zie tabel 1).
OPMERKING: Opgelost natriumacrylaat moet een heldere en kleurloze oplossing zijn. Als de oplossing geel is, vervang dan door nieuw natriumacrylaat. - Bereid de geleeroplossing op ijs (zie tabel 1). Pipet ammoniumperoxidsulfaat (APS) in de geleeroplossing vlak voordat de geleeroplossing op de gelatiekamer wordt aangebracht.
- Verwijder phalloïdine uit de cellen en was tweemaal met 1,5 ml PBS op kamertemperatuur. Laat 1,5 ml PBS in de put om het verwijderen van het monster op de glazen afdekslip te vergemakkelijken.
- Plaats de cellen op het afdekglas in de geleerkamer met behulp van een tang en een canule om de glazen slip van de 6-putplaat op te tillen.
OPMERKING: De cellen moeten zich op de bovenkant van de glazen afdekstrip zitten. De glazen afdekstrip mag de afstandhouders niet raken. - Voeg binnenkort APS toe aan de geleeroplossing en vortex. Pipet 200 μL geleeroplossing op het monster (figuur 2A4-C4). Sluit voorzichtig de gelatiekamer door luchtbellen in de gel te vermijden(afbeelding 2A5-C5).
- Incubeer de geleerkamer gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C om de gel in de natte kleurkamer te polymeriseren.
- Bereid de verankeringsbuffer voor (zie tabel 1). Vervang PBS voor de verankeringsbehandeling door 250 μL verankeringsbuffer per put direct op de glazen afdekslip en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Houd het substraat in het donker met behulp van een doos.
- Homogenisatie (spijsvertering)
- Haal de kleurkamer uit de couveuse. Om het deksel van de gelatiekamer te openen, introduceert u een scheermesje tussen het deksel en de afstandhouders. Verwijder het deksel voorzichtig. Verwijder de afstandhouders met het scheermesje en elimineer alle extra gel door het met het scheermesje te snijden.
- Doe de glijbaan met de gel en dek glas af in een schaal gevuld met PBS. Door zachtjes te schudden, verwijdert u het losgemaakte afdekglas uit de gel. Om de gel gemakkelijk uit de schaal te verwijderen, plaatst u de glijbaan onder de gel om de gel aan de glijbaan te bevestigen.
- Verdeel de gel met de gel op de glijbaan in kleine stukjes (een kwart van de gel is verdeeld in twee tot drie stukken) met behulp van het scheermesje. Duw voorzichtig een stuk gel in een put van een 6-well plaat met glazen bodem en vouw het in een penseel. Houd de gel gehydrateerd met een beetje PBS met behulp van de kwast om uitdroging van de gel te voorkomen.
OPMERKING: De cellen kijken naar beneden. - Maak met behulp van een omgekeerde microscoop overzichtsfoto's met een laag numeriek diafragma om de expansiefactor na uitbreiding te bepalen.
- Bereid de spijsverteringsbuffer voor (zie tabel 1). Verdun Proteinase K tot 4 U/ml in de spijsverteringsbuffer om de spijsverteringsoplossing te ontvangen.
OPMERKING: De spijsverteringsbuffer zonder Proteinase K kan 1-2 weken bij 4 °C worden bewaard. - Voeg 500 μL van de vergistingsoplossing toe aan elke put en dompel de gel onder in de oplossing. Laat het 's nachts verteren bij kamertemperatuur en sluit het deksel om de monsters in het donker te houden.
OPMERKING: U kunt het ook 1 uur laten verteren bij 37 °C.
- Uitbreiding
- Verwijder de vergistingsoplossing met een pipet en gooi deze weg. Voeg 1 ml ddH2O toe. Incubeer de ondergedompelde gel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het water en voeg 1 ml verse ddH2O toe. Wacht 10 minuten en blijf elke 10 minuten water uitwisselen totdat een plateau van expansie is bereikt.
OPMERKING: Monsteruitbreiding tot 4,5-voudig is haalbaar. De gel wordt optisch helder.
- Imaging
- Haal het water uit de gel en start direct met de microscopie. Gebruik met behulp van een omgekeerde microscoop voornamelijk een luchtdoelstelling (lage vergroting) om afgebeelde cellen in de pre-expansietoestand te vinden (stap 4.3.4).
- Schakel over naar een 40x (olie/water) en 63x objectief voor een betere resolutie. Prikkel met de golflengte van belang en neem het beeld via de camera.
- Validatie
- Maak een overzichtsafbeelding van het voorbeeld. Zoek en match dezelfde structuren in het voorbeeld die zijn afgebeeld in stap 4.3.4. Gebruik het kanaal met de beste signaal-ruisverhouding voor validatie (figuur 3 A-B).
OPMERKING: Pas de beeldparameters aan om een vergelijkbare helderheid te bereiken als in het beeld dat is verkregen in de niet-uitgebreide toestand (stap 4.3.4). - Overlay pre- en post-uitbreiding beelden door ze te roteren en te verschuiven met ImageJ. Gebruik het afstandsmeetinstrument in ImageJ om de afstanden tussen duidelijk identificeerbare structuren te meten. Meet ten minste 10 verschillende structuren.
OPMERKING: U kunt ook een Python-script gebruiken om afstanden te meten zoals beschreven in14. - Bereken de expansiefactor door post-/pre-expansiemetingen te delen.
- Om vervormingen te bepalen, maak je foto's met een hoger numeriek diafragma (figuur 4A-B). Overlay deze afbeeldingen en analyseer ze met ImageJ of zoals beschreven in15.
OPMERKING: De bepaling van vervormingen moet routinematig worden uitgevoerd, maar niet noodzakelijkerwijs op elk monster.
- Maak een overzichtsafbeelding van het voorbeeld. Zoek en match dezelfde structuren in het voorbeeld die zijn afgebeeld in stap 4.3.4. Gebruik het kanaal met de beste signaal-ruisverhouding voor validatie (figuur 3 A-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het concept en de timing van dit proExM-protocol zijn weergegeven in figuur 1. Op dag 5 worden getransfecteerde cellen gefixeerd en gekleurd met fluorescerende antilichamen die gericht zijn op het eiwit van belang (figuur 1A,B). Op dag 6 leidt behandeling met AcX tot vorming van aminegroepen op alle eiwitten (inclusief fluoroforen) (Figuur 1A,B)12. Bij polymerisatie van de hydrogel binden deze aminegroepen zich covalent aan de hydrogel (dag 6). Na polymerisatie van de gel wordt homogenisatie (spijsvertering) uitgevoerd met proteïnase K, wat resulteert in de vernietiging van structurele eiwitten van de cel (dag 6, figuur 1A,B). Fluorescerend gelabelde antilichamen blijven grotendeels behouden na de spijsvertering. Door de verstoring van structurele eiwitten resulteert waterdialyse van de hydrogel in isotrope uitzetting van de cel in de hydrogel op dag 7 (figuur 1A,B). Beeldvorming van het monster wordt uitgevoerd met een conventionele fluorescentiemicroscoop (figuur 1A). Gegevensvalidatie om de expansiefactor te bepalen en vervormingen uit te sluiten dient te worden uitgevoerd (figuur 1A).
Om de cel isotropisch uit te breiden, is de gelatiestap essentieel. Figuur 2 toont het zij- en bovenaanzicht van een gelatiekamer. Glazen afdekstrips bouwen de afstandhouders van de gelatiekamer (Figuur 2A1-3/C1-3). Het afdekglas met de vaste en gebrandschilderde cellen wordt met de cellen omhoog op een glazen dia geplaatst (figuur 2A4-C4). Het deksel van de gelatiekamer is omwikkeld met parafilm en is bubbelvrij gesloten (figuur 2A5-C5).
Dit ExM-protocol maakt uitbreiding tot viervoudig mogelijk. Om de expansiefactor te bepalen, is het essentieel om cellen voor en na de expansie in beeld te brengen (figuur 3A + B). Onvoldoende verankering en homogenisatie kan leiden tot vervormingen en scheuren van cellen. Figuur 4A + B toont representatieve voorbeelden van gescheurde cellen in verschillende vergrotingsafbeeldingen.
Deze methode kan worden gebruikt om de colokalisatie van F-actine- en actineadaptereiwitten te onderzoeken, bijvoorbeeld podocine en nefhrine (figuur 5). Podocin wordt in het groen afgebeeld, terwijl actine in blauw is geëtiketteerd (figuur 5). Nephrin is groen gemarkeerd. Witte gebieden duiden op colokalisatie.
Figuur 1: Concept en timing van dit ExM-protocol. (A) In de kolom "protocol" wordt elke stap van het protocol beschreven. (A + B) Na het zaaien en transfecteren van cellen wordt immunofluorescente etikettering uitgevoerd (Immunolabeling). (A + B) Het kleine molecuul AcX (rode stip) bindt zich aan alle eiwitten en verankert ze aan de hydrogel (Verankering). (A + B) Via polymerisatie worden alle eiwitten inclusief fluoroforen via AcX covalent gebonden aan de hydrogel (Polymerisatie). (A + B) Homogenisatie leidt tot de vertering van structurele matrixeiwitten. (A + B) Uitbreiding wordt bereikt door dialyse in water. (A) Beeldvorming en validatie van beeldvorming rondt het experiment af. (A) Het hele protocol vereist 7 dagen (kolom "dag") met veel incubatiestappen (totale tijd per dag kolom "totale tijd"), maar de werkelijke benchtijd is veel minder zoals aangegeven in de betreffende kolom "bench time". Gewijzigd van14. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Bouwen van de gelatiekamer. Zijaanzicht (A1) en bovenaanzicht (B1 + C1) van een glazen glijbaan met vier #1,5 afdekstrepen. Door een druppel water tussen de glazen glijbaan en de afdekstrips toe te voegen, hechten de strepen zich aan de glazen glijbaan(zijaanzicht A2, bovenaanzicht B2, C2). Druppels water op de #1,5 afdekstrepen leiden tot hechting van #1,0 afdekstrepen bovenop de #1,5 afdekstrepen(zijaanzicht A3, bovenaanzicht B3, C3). Het monster op de afdekstrook wordt met een tang in het midden van de rechthoek geplaatst. De gel is pipetted op de top(zijaanzicht A4, bovenaanzicht B4, C4). (A5) Zijaanzicht en bovenaanzicht (B5 en C5) van de geassembleerde gelatiekamer inclusief het gesloten deksel dat is opgebouwd uit een in parafilm gewikkelde hoes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Cellen voor en na expansie. (A) Cellen vóór expansie gekleurd voor actine. Het vak geeft aan in welk gebied de geëxpandeerde cellen in figuur 3B liggen. (B) Cellen na expansie gekleurd voor actine in rood en podocine in groen. Podocine lokaliseert samen met actine in de celrand. Schaalbalk = 5 μm, expansiefactor = 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Vervormingen en breuken van cellen. ( A+ B) Representatieve microscopische beelden van cos7-cellen die immuunbevlekt zijn voor actine (rood). Cellen werden gefixeerd, gekleurd, verankerd, verteerd en uitgevouwen. (A) Breuken van cellen. Pijlen wezen op gescheurde gebieden. Schaalbalk = 5 μm, expansiefactor = 4. (B) Breuken en vervorming van cellen. Witte pijlen wezen op gescheurde gebieden. Schaalbalk = 5 μm, expansiefactor = 4. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Podocine lokaliseert samen met nefhrine en actine. Cos7 cellen immunofluorescently gelabeld voor podocine, actine, en nefrline. (A) Cos7 cellen gekleurd voor podocine (groen), actine (blauw) en nefron (rood) met ExM. Podocin lokaliseert samen met actine en nefhrine. Schaalbalk = 200 nm, expansiefactor = 4. (B) Vergroting van het aangegeven gebied in (A), Schaalbalk = 40 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Verankeringsbuffer | eindconcentratie | ||
| NaHCO3 | 150 mM | ||
| Acryloyl-X, SE (AcX) | 0,1 mg/ml | ||
| Monomeeroplossing | Stamoplossing concentratie g/100 ml | hoeveelheid (ml) | eindconcentratie (g/100 ml) |
| natriumacrylaat | 38 | 2.25 | 8.6 |
| Acrylamide | 50 | 0.5 | 2.5 |
| N,N'-Methyleenbisacrylamide | 2 | 0.75 | 0.15 |
| Natriumchloride | 29.2 | 4 | 11.7 |
| Pbs | 10x | 1 | 1x |
| Water | 0.75 | ||
| Totale | 9.4 | ||
| Geleeroplossing | Concentratie van stamoplossing | hoeveelheid (μl) | eindconcentratie (mg/ml) |
| monomeeroplossing | NA | 190 | NA |
| Aps | 10% | 4 | 0.1 |
| TEMED | >99% | 4 | 0.1 |
| Water | NA | 2 | NA |
| Totale | 200 | ||
| Spijsverteringsoplossing | eindconcentratie | ||
| Tris Cl, pH 8,0 | 1 M | ||
| EDTA pH 8,0 | 0,5 m | ||
| Triton X-100 | 0.005% | ||
| Guanidin HCL | 8 M | ||
| Water | |||
| proteïnase K | 4 U/ml |
Tabel 1: Oplossingen voor ExM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde methode stelt de onderzoeker in staat om cellulaire eiwitten te visualiseren, bijvoorbeeld podocine, nefhrine en cytoskeletcomponenten, bijvoorbeeld F-actine. Binnen dit protocol worden getransfecteerde cos7-cellen gebruikt als model om de interactie van spleetmembraaneiwitten met F-actine te bestuderen. Helaas drukken vereeuwigde podocytcellijnen onvoldoende endogene hoeveelheden spleetmembraaneiwitten uit19.
Met deze methode kunnen cellulaire eiwitten worden gevisualiseerd met nanoschaalresolutie met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop. De meest kritische stappen binnen het protocol zijn: 1) voldoende verankering van eiwitaminegroepen aan de hydrogel met AcX, 2) adequate polymerisatie van de hydrogel, 3) optimale timing voor de spijsvertering en 4) selectie van compatibele fluoroforen.
Verankering van cellulaire eiwitten aan de hydrogel is essentieel voor deze methode om de positie van het eiwit in de hydrogel tijdens de expansie te behouden. AcX is een klein molecuul dat zich bindt aan aminegroepen eiwitten in cellen en weefsels. AcX creëert een koolstof-koolstof dubbele band met eiwitten, waardoor de eiwitten in de hydrogel kunnen worden opgenomen in de polymerisatiestap20. AcX integreert ook antilichamen zodat etikettering met immunofluorescentieantistoffen kan worden uitgevoerd vóór acx-behandeling. Onvoldoende verankering kan leiden tot scheuren en vervormingen van cellen. Als gevolg van modificatie van aminegroepen door fixatieven, moet men het fixatief of het tijdstip van fixatie optimaliseren. Bovendien kunnen onvoldoende opslag- of niet-geoptimaliseerde verankeringsomstandigheden leiden tot scheuren en vervormingen. Op basis van onze ervaring verliest AcX zijn optimale effect bij gebruik gedurende meer dan 3-4 maanden.
Polymerisatie van de gel is temperatuurafhankelijk. We raden daarom aan om de polymerisatieoplossingen op ijs te houden voordat we deze in de gelatiekamer gieten. Bovendien moet de verwerkingstijd van de gelatiestap kort worden gehouden (minder dan 5 minuten) om voortijdige gelvorming te voorkomen. Een grondige menging van de polymerisatieoplossing voorkomt ongelijkmatige polymerisatie. Luchtbellen beïnvloeden het expansieproces bij het aanraken van het monster en kunnen worden voorkomen door meer polymerisatieoplossing toe te voegen.
Na opname van de cellulaire eiwitten in de hydrogel is de mechanische homogenisatiestap (of spijsvertering) nodig om uitbreiding te garanderen. Er bestaan verschillende methoden, bijvoorbeeld warmte en wasmiddel of enzymatische vergisting, die moeten worden aangepast aan het onderzochte monster12,14,20. Binnen dit protocol wordt het protease Proteinase K gebruikt voor enzymatische spijsvertering. Proteïnase K wordt toegepast in een dosering die voldoende is om structurele eiwitten te vernietigen met behoud van de meeste andere eiwitten, waaronder fluorescerende antilichamen12. Als de spijsvertering onvolledig is, is de monsteruitbreiding onvoldoende. Bovendien kan het monster scheuren tijdens het expansieproces (figuur 3). Als er onvoldoende monsteruitzetting heeft plaatsgevonden, wordt watervervanging aanbevolen. Als alternatief kan de tijd voor de enzymatische spijsvertering worden aangepast of een nieuwe aliquot van de Proteinase K worden geopend.
Als het monster te verteerd is, zullen fluorescentiesignalen afnemen. In dit geval moet de verteringstijd worden verkort. In ExM in het algemeen wordt de fluorescentiesignaalintensiteit per volume-eenheid verminderd als gevolg van de volumetrische expansie van het monster14. Daarom moeten langere blootstellingstijden tijdens beeldvorming worden overwogen.
Het is essentieel om ExM-compatibele fluoroforen te selecteren. Cyaankleurstoffen worden afgebroken tijdens de polymerisatiestap13. Fluorescentie-eiwitten op basis van bacteriofytochromen worden ook grotendeels vernietigd13. De meeste GFP-achtige eiwitten blijven echter behouden13. Bovendien, streptavidin kan ook worden toegepast pre-expansie, labeling post-translationele modificaties zoals S-nitrolysatie via een klein molecuul tag13.
Phalloidin, een klein etiketteermolecuul om het actinecytoskelet te targeten, is niet compatibel met ExM21. Om onvoldoende verankering van falloïdine te overwinnen, is trivalente verankering (TRITON) geïntroduceerd21. Deze aanpak biedt gelijktijdige targeting, etikettering en enting van biomoleculen21.
Deze methode kan worden aangepast om RNA-moleculen (ExFish)te beitsen 22. Bij iteratieve expansiemicroscopie (iExM) of X10-microscopie kan de resolutie van 60-70 nm worden verlengd tot ongeveer 25 nm door een tweede opzwepbare gel aan te brengen binnen de eerste geëxpandeerde hydrogel of een enkele expansiestap uit te voeren met behulp van een andere hydrogel15,16. Ultrastructure expansiemicroscopie (U-ExM) maakt een superresolutie van eiwitten mogelijk die hun toeschrijving aan een ultrastructureel element (bijv. mitochrondria, microtubuli)behouden 23. Een combinatie van ExFish (RNA en DNA) en proExM-methoden is eerderuitgevoerd,evenals22,24. Het gepresenteerde protocol gebruikt getransfecteerde cos7-cellen als model om spleetmembraaneiwitten te onderzoeken. We verwachten dat andere ingezeten gekweekte niercellen, bijvoorbeeld HEK293T-cellen, op dezelfde manier kunnen worden gebruikt voor dit protocol. Afhankelijk van de cellijn kunnen aanpassingen nodig zijn voor de verschillende cultiverings- en transfectieomstandigheden.
ExM verbetert de resolutie van immuno-bevlekte monsters met ongeveer 4-voudige bereiken van een laterale ruimtelijke resolutie van 70 nm13. In vergelijking met andere superresolutietechnieken wordt ExM uitgevoerd op een conventionele fluorescentiemicroscoop13,14. Daarom is er geen dure apparatuur of specifiek opgeleid personeel nodig om de ExM-methode uit te voeren14. Hoewel niet alle fluoroforen compatibel zijn met ExM, zijn er over het algemeen veel beschikbare antilichamen met geoptimaliseerde fluoroforen met fotofysische eigenschappen die nodig zijn voor microscopie met superresolutie14. Het grootste nadeel van deze methode is dat ExM onverenigbaar is met levende monsters12,14.
In de toekomst kan het verbeteren van de chemische samenstelling van de hydrogel leiden tot een nog hogere ruimtelijke resolutie12. De combinatie van verschillende protocollen kan ook visualisatie van eiwitten, RNA, DNA of lipiden in complexen binnen hetzelfde monster mogelijk maken met een dergelijke hoge resolutie12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen Blanka Duvnjak en Nikola Kuhr bedanken voor hun uitstekende technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al.
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
