Summary
Vi tilbyr en protokoll for neonatal hjertemakrofagsseparasjon og transplantasjon i et voksent musehjerte, noe som kan være en lovende måte å fremme hjertereparasjon på.
Abstract
I et skadet neonatalt myokardium letter makrofager kardiomyocyttproliferasjon og angiogenese og fremmer hjerteregenerering. Den nåværende studien avslører at transplantasjon av neonatale hjertemakrofager rekruttert av skade fremmer voksen hjerteregenerering etter hjerteinfarkt med forbedring av hjertefunksjon og kardiomyocyttproliferasjon. Resultatene indikerer at neonatal hjertemakrofagtransplantasjon kan være en lovende strategi for hjerteskadebehandling. Her gir vi de tekniske detaljene, inkludert isolering av neonatale hjertemakrofager fra apikale reseksjonsskadede neonatale musehjerter, transplantasjon av makrofager i myokardinfarktede voksne mus, og estimering av hjerteregenerering etter en makrofagtransplantasjon.
Introduction
Hjerteregenerering er en lovende strategi for å gjenopprette hjertefunksjon etter hjerteskade og for å beskytte mot hjertesvikt1,2,3. Etter hjerteinfarktskader infiltrerer makrofager det skadede hjertet og har blitt utforsket som nøkkelfaktorene under neonatal hjerteregenerering4,5,6. Foruten å fjerne nekrotisk cellulært rusk og fremkalle betennelse, fremmer makrofager angiogenese5 og kardiomyocyttproliferasjon7 etter neonatal mus hjerteinfarkt.
Vår forrige studie illustrerer at transplantasjon av neonatale hjertemakrofager isolert fra skadet neonatal hjerte forbedrer voksen hjerteregenerering7, noe som indikerer at neonatal hjertemakrofagtransplantasjon kan være en lovende strategi for å behandle hjerteskade. Her gir vi de tekniske detaljene, inkludert isolering av neonatale hjertemakrofager fra apikale reseksjonsskadede neonatale musehjerter, transplantasjon av makrofager til myokardinfarktede voksne mus, og estimering av hjerteregenerering etter makrofaggraft (figur 1).
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med veiledningen for bruk og pleie av forsøksdyr. Alle dyreprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. Aseptisk teknikk er nødvendig gjennom hele prosedyren for å forhindre forurensning av operasjonsstedet.
1. Apical reseksjonsoperasjon i neonatal 1-dagers Cx3cr1 GFP / + mus (C57BL / 6 bakgrunn)
- Anestesi
- Ta alle musevalpene ut fra burene og legg dem i en ren tørr boks.
- Bygg inn hver mus i isen i ca. 2-3 minutter. Forsikre deg om at det er en tynn barriere som latex eller gasbind mellom isen og musevalpen for å forhindre frostskader.
- Identifiser tilstrekkelig anestesi ved å observere følgende tegn: blek hud, mangel på lembevegelse og mangel på pedalrefleks.
- Thoracotomy
- Forkjøl bronsedriftsplattformen over natten ved -20 °C for å opprettholde anestesi.
- Ta den bedøvede musen ut av isboksen og legg den på en bronse driftsplattform. Forankre musen på driftsplattformen i en liggende stilling ved hjelp av medisinsk tape.
- Sett driftsplattformen med musen på under et stereoskop.
- Desinfiser musekisten ved hjelp av en prep pad gjennomvåt med betadine og 70% alkohol eller som i samsvar med institusjonell politikk.
- Øk huden med et 1 cm kutt i det fjerde intercostalområdet i brysthulen og skill deretter intercostalmuskulaturen ved hjelp av mikrokirurgisk saks til hjertet er tilgjengelig.
- Trykk vekselvis brystet og magen ved hjelp av to tang til hjertet er eksteriørisert ut av brystet uten mekanisk skade.
- Sett ribbeina under og over det lille snittet som en naturlig fiksering for å immobilisere hjertet.
- Ventrikulær apex reseksjon
- Finn toppen av venstre ventrikel. Klipp en 1 mm diameter av ventrikulært apexvev ved hjelp av iridectomy saks under et stereoskop.
- Kontroller at venstre ventrikulære kammer er eksponert, og begynn å ose.
- Trykk forsiktig hjertet tilbake til brysthulen ved hjelp av en bomullspinne.
- Sutur muskler, ribber og hud ved hjelp av 8-0 Prolene suturer.
- Rengjør musen grundig etter operasjonen.
- Pleie etter drift
- Overfør musen fra driftsplattformen til et 37 °C varmeteppe for å varme opp kroppen umiddelbart etter operasjonen.
- Bekreft musens anabioser ved å observere følgende tegn: spontan respirasjonsrestaurering, hudfargeendring fra blek til rosa og bevegelse av lemmer.
- Ta den opererte musen tilbake til sin mor når den har gjenopprettet.
- Mingle den opererte musen med morens hekkematerialer om nødvendig.
MERK: Det er viktig å fjerne alle de 1-dagers valpene fra moren samtidig og deretter returnere dem alle samtidig etter at alle valpene er gjenopprettet.
2. Fremstilling av neonatal hjertemakrofag suspensjon
MERK: Alle disse eksperimentelle prosedyrene skal utføres på et mørkt sted og under sterile forhold.
- Høst hjertet av en neonatal Cx3cr1GFP /+ mus 1 dag etter apikal reseksjon
- Euthanize Cx3cr1GFP/+ musen en dag etter den apikale reseksjonen. Bruk et overskudd av karbondioksid og halshugge musen sekvensielt for å bruke eutanasi.
- Ta hjertet ut av brystet og senk det ned i en 10 cm tallerken med PBS.
- Klipp karene og gjenværende bindevev vekk fra ventriklene. Klipp det aurikulære tillegget og utstrømningskanalen bort fra hjertet.
- Når hjertet slutter å slå, skjærer du hjertet i 1-2 mm3 stykker i PBS-buffer ved hjelp av mikrokirurgisk saks (figur 2A).
- Neonatal mus hjerte dissosiasjon
- Overfør det høstede hjertevevet til et rør som inneholder 2,5 ml forvarmet enzymblanding (Materialbord), og lukk røret tett.
- Snu røret og plasser det med hetten nede (Figur 2B).
- Kjør neonatal hjerte dissosiasjonsprogram (Tabell over materialer).
- Koble røret fra dissosiatoren etter at programmet er fullført.
- Tilsett 7,5 ml 1x DMEM med 10% FBS i røret.
- Filtrer og overfør suspensjonen til et sentrifugerør på 15 ml (figur 2C). Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 x g i 5 minutter.
- Resuspend cellepellet i 1 ml blodcelle lysis løsning og inkubere i 2 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 5-10 ml PBS-buffer til suspensjonen og sentrifugen ved 300 x g i 5 minutter.
- Resuspend cellepellet i 1 ml DMEM med 10% FBS.
- Neonatal hjertemakrofagisolasjon
- Sorter GFP+ neonatal hjertemakrofager etter FACS. Motta de sorterte makrofagene i et sterilt rør som inneholder 500 μL DMEM med 10% FBS.
- Telle GFP+ makrofager (Figur 2D). Resuspend makrofagen i DMEM med 10% FBS i konsentrasjonen av 1 x 106 makrofager per 200 μL DMEM for senere injeksjon.
MERK: Antall GFP+ makrofager er lite i en neonat (omtrent 1 x 105); Derfor bør minst 10 nyfødte brukes til å oppnå nok makrofager for hver voksne museinjeksjon.
3. Neonatal hjertemakrofagtransplantasjon
- Utfør en hjerteinfarktoperasjon på en voksen (6-8 uker gammel) mannlig C57BL / 6 mus ved ligasjon av venstre fremre koronararterie8.
- Sett den opererte musen på et oppvarmet teppe på 37 °C til den kommer seg.
- Injiser intravenøst 200 μL DMEM med 1 x 106 GFP+ neonatal hjertemakrofager i den infarkterte voksne musen etter operasjonen (omtrent 6 timer senere) via halevenen.
- Send musen tilbake til et rent bur.
4. Resultatevaluering
- Validering av injeksjonseffektivitet
- Bedøv den opererte musen og høst hjertet 7 dager etter hjerteinfarktoperasjonen.
- Senk hjertet ned i den forhåndskjølte PBS-bufferen.
- Fest hjertevevet med 4% polyformaldehyd i 72 timer ved romtemperatur med risting.
- Dehydrer hjertevevet i dimetylbenzen og etanol.
- Legg inn hjertevevet i parafin og skjær det i seksjoner med en tykkelse på 5 μm.
- Utfør standard immunfluorescensfargingsprotokoll1. Bruk α-aktinin for å markere kardiomyocytter.
- Oppdag GFP+ makrofager i hjertet mottar transplantasjon.
- Utfør standard immunfluorescensfargingsprotokoll1. Bruk α-aktinin og pH3 til å markere henholdsvis kardiomyocytter og celleproliferasjon (figur 3A).
- Evaluering av hjertereparasjon etter transplantasjonen
- Bruk ekkokardiografi på den opererte musen én måned etter operasjonen1.
- Analyser hjertefunksjonen ved å sammenligne venstre ventrikulær ejeksjonsfraksjon og brøkforkortelse i forskjellige grupper (figur 3B).
- Bedøv den opererte musen og høst hjertet.
- Gjenta trinn 4.1.2-4.1.5.
- Utfør en Massons fargingsprotokoll.
- Analyser det infarkterte området etter makrofaginjeksjon (figur 3C).
Representative Results
Protokollen som beskrives her, er oppsummert i et flytskjema (figur 1). Vi utførte apikal reseksjonsoperasjon på 1 dag gamle Cx3cr1GFP / + mus. Som vist i figur 2Able neonatal Cx3cr1GFP/+-musen forankret på driftsplattformen under stereoskopet etter anestesi. Vi påførte trykk vekselvis på musekisten og magen ved hjelp av to tang, som kan settes opp som en kanal for å lede hjertet som spretter ut av brystet. Eventuelle ekstra mekaniske skader på hjertet som kan påvirke hjerteregenerering bør unngås. Hjertet ble immobilisert av det omkringliggende brystvevet, noe som forenklet operasjonen på myokardiet. Vi fant ut at kutting av mindre enn en 1 mm diameter av det resekterte apexvevet ved iridectomy saks var hensiktsmessig da venstre ventrikulære kammer begynte å ose. Vellykket induksjon av apikal reseksjonsmodell er nødvendig for makrofagtransplantasjon8,9.
Vi sorterte GFP+ makrofager strengt etter en neonatal hjertedissosiasjonsprotokoll1 (figur 2).
Neonatale hjertemakrofager ble injisert i det hjerteinfarktte voksne musehjertet kort tid etter isolasjonen. For å bekrefte effektiviteten av makrofagtransplantasjonen utførte vi immunfluorescensfarging 7 dager etter injeksjonen. Resultatene viste at GFP+ makrofager kunne bli funnet i det voksne myokardinfarktede musehjertet, noe som indikerer vellykket transplantasjon av neonatal hjertemakrofag. Vi brukte samtidig immunisering av pH3 med α-aktinin. Samlokaliseringen ble ansett å være kardiomyocyttproliferasjon. Resultatene illustrerte at antall proliferative kardiomyocytter ble oppregulert i den makrofaginnsprøytede gruppen, noe som indikerer at voksen kardiomyocyttproliferasjonsevne ble forbedret etter transplantasjonen (figur 3).
Voksen mus hjerte regenerering ble evaluert 1 måned etter transplantasjonen. Vi utførte ekkokardiogram på den voksne musen og fant ut at makrofag injeksjon kunne forbedre hjertefunksjonen etter hjerteinfarkt. Massons farging ble utført, og resultatene illustrerte at infarktet område ble bemerkelsesverdig redusert etter neonatal hjertemakrofagtransplantasjon (figur 3). Alle disse resultatene viste at neonatal hjertemakrofagtransplantasjon fremmer voksenmus hjerteregenerering og kardiomyocyttproliferasjon.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av neonatal hjertemakrofagtransplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilder av makrofagisolasjon. A) Hjertene er kuttet i små biter. B) Musehjertene er dissosierte. C) Suspensjonen filtreres og overføres til et 15 ml sentrifugerør. D) Antall neonatale hjertemakrofager beregnes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Neonatal hjertemakrofagtransplantasjon fremmer voksen hjerteregenerering. A) (Venstre) Immunfluorescence bilder viser proliferative kardiomyocytter (pil, pH3 grønn, α-aktinin rød). (Høyre) Statistisk analyse viser at kardiomyocyttproliferasjon øker etter makrofagtransplantasjon. B) (Venstre) Ekkokardiogrambilder viser hjertefunksjonen i voksenmus 1 måned etter hjerteinfarkt. (Høyre) Statistisk analyse viser at hjertefunksjonen forbedres etter makrofagtransplantasjon. C) Massons farging viser det infarkterte området i voksenmus 1 måned etter hjerteinfarkt. (Høyre) Statistisk analyse viser at infarktert område reduseres etter Mφ, makrofagtransplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Her gir vi en effektiv tilnærming til å forberede, skaffe og transplantere neonatale hjertemakrofager for å fremme voksen mus hjerteregenerering.
Apical reseksjon er en enkel og effektiv operasjon for å stimulere hjerteregenerering. Vi har optimalisert detaljene i apical reseksjon for å sikre maksimal overlevelsesrate for dyrene som er involvert i operasjonen10. Anestesitiden bør ikke være lengre enn 3 minutter, noe som fører til hypotermiindusert død, eller kortere enn 2 minutter, noe som vil føre til overdreven blødning under operasjonen. Standard apikal reseksjon skulle amputere ca 1,5 mm diameter av apexvevet. Hensikten med operasjonen her var imidlertid å stimulere til rikelig makrofaginfiltrasjon under hjerteregenereringsprosessen. Reseksjon på mindre enn 1,5 mm diameter var akseptabelt, da det kunne garantere maksimal overlevelsesrate og effektiv makrofagrekruttering samtidig. Bare dyktigheten til operatøren påvirket overlevelsesraten, og de opererte musene kunne ikke overleve den langvarige operasjonsvarigheten. Operatøren bør fullføre hele prosedyren innen 5 minutter.
I vår tidligere studie fant vi at akutt betennelse fremmet neonatal hjerteregenerering. Intramyokard mikroinjeksjon av immunogen zymosan A partikler i neonatal mus hjerte kan fremme kardiomyocyttproliferasjon6. Nylig hevdet Molkentin et al. at makrofaginfiltrasjon som stimuleres ved intrakarakuminjeksjon av zymosan A, celleavfall og fryse / tine drepte celler kan fremme hjertereparasjon, noe som bekrefter at akutt betennelse og makrofager er avgjørende i hjertereparasjon i stedet for stamceller som skiller seg fra kardiomyocytter11. Sadek et al.5 rapporterte at makrofager kunne fremme neonatal hjerteregenerering via angiogenese. Vår nylige studie viste at neonatal hjertemakrofaginjeksjon kunne fremme voksen hjerteregenerering og øke evnen til voksen kardiomyocyttproliferasjon1,7. Neonatal hjertemakrofagtransplantasjon kan være en lovende strategi for å fremme voksen mus hjerteregenerering. Her presenterer vi protokollene for å hjelpe flere forskere om regenerativ applikasjonsutvikling og utforskning av hjerteregenereringsmekanismer.
Disclosures
Ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS, 2016-I2M-1-015), National Key Research and Development Project of China (2019YFA0801500), National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81970243, 81770308), Beijing Natural Science Foundation (7172183, 7182140).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
- Li, Y., et al. gp130 Controls Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Circulation. 142 (10), 967-982 (2020).
- Pei, J., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration via ROS Scavenging. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 1412696 (2020).
- Wang, Y., et al. Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics. 10 (20), 9100-9112 (2020).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Han, C., et al. Acute inflammation stimulates a regenerative response in the neonatal mouse heart. Cell Research. 25 (10), 1137-1151 (2015).
- Li, Y., et al. Transplantation of murine neonatal cardiac macrophage improves adult cardiac repair. Cellular & Molecular Immunology. , (2020).
- Yue, Z., et al. PDGFR-β Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Reports. 28 (4), 966-978 (2019).
- Wang, J., et al. A long noncoding RNA NR_045363 controls cardiomyocyte proliferation and cardiac repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 105-114 (2019).
- Li, Y., et al. Achieving stable myocardial regeneration after apical resection in neonatal mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (11), 6500-6504 (2020).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577 (7790), 405-409 (2020).
