Summary
نحن نقدم بروتوكولا لفصل الضامة القلبية الوليدية وزرعها في قلب فأر بالغ ، والتي يمكن أن تكون طريقة واعدة لتعزيز إصلاح القلب.
Abstract
في عضلة القلب الوليدية المصابة، تسهل الضامة انتشار خلايا القلب وتولد الأوعية الدموية وتعزز تجديد القلب. تكشف هذه الدراسة أن زرع الضامة القلبية الوليدية التي تم تجنيدها عن طريق الإصابة يعزز تجديد القلب للبالغين بعد احتشاء عضلة القلب مع تحسين وظيفة القلب وانتشار خلايا القلب. تشير النتائج إلى أن زرع الضامة القلبية الوليدية يمكن أن يكون استراتيجية واعدة لعلاج إصابات القلب. هنا، نقدم التفاصيل التقنية، بما في ذلك عزل الضامة القلبية الوليدية من قلوب الفئران الوليدية المصابة باستئصال الخلايا، وزرع الضامة في الفئران البالغة التي تتشاء عضلة القلب، وتقدير تجديد القلب بعد الكسب غير المشروع الضام.
Introduction
تجديد القلب هو استراتيجية واعدة لاستعادة وظيفة القلب بعد إصابة القلب والحماية من قصور القلب1،2،3. بعد إصابة عضلة القلب، تتسلل الضامة إلى القلب المصاب وتم استكشافها كعوامل رئيسية أثناء تجديد قلب حديثي الولادة4و5و6. إلى جانب إزالة الحطام الخلوي النخري وتحفيز الالتهاب ، تعزز الضامة تولد الأوعية5 وانتشار خلايا القلب7 بعد احتشاء عضلة القلب للفئران الوليدية.
توضح دراستنا السابقة أن زرع الضامة القلبية الوليدية المعزولة عن قلب حديثي الولادة المصاب يعزز تجديد القلب البالغ7، مما يشير إلى أن زرع الضامة القلبية الوليدية يمكن أن يكون استراتيجية واعدة لعلاج إصابات القلب. هنا نقدم التفاصيل التقنية، بما في ذلك عزل الضامة القلبية الوليدية من قلوب الفئران الوليدية المصابة باستئصال الخلايا، وزرع الضامة في الفئران البالغة التي تتشاء عضلة القلب، وتقدير تجديد القلب بعد الكسب غير المشروع الضامة(الشكل 1).
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب وفقا لدليل استخدام الحيوانات المختبرية ورعايتها. وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه على جميع بروتوكولات الحيوان، ومستشفى فوي، والأكاديمية الصينية للعلوم الطبية. مطلوب تقنية العقيم في جميع أنحاء الإجراء لمنع تلوث موقع الجراحة.
1. عملية استئصال Apical في الوليدي 1 يوم من العمر Cx3cr1 GFP / + الماوس (C57BL / 6 الخلفية)
- تخدير
- تأخذ كل الجراء الماوس من الأقفاص ووضعها في مربع جاف نظيفة.
- تضمين كل فأر في الجليد لمدة 2-3 دقائق. تأكد من وجود حاجز رفيع مثل اللاتكس أو الشاش بين الجليد وجر الجرو الماوس لمنع قضمة الصقيع.
- تحديد التخدير الكافي من خلال مراقبة العلامات التالية: بشرة شاحبة، وعدم وجود حركة الأطراف، وعدم وجود منعكس دواسة.
- استئصال الصدر
- Precool البرونزية منصة التشغيل بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية للمساعدة في الحفاظ على التخدير.
- أخرج الفأر المخدر من صندوق الثلج وضعه على منصة تشغيل برونزية. مرساة الماوس على منصة التشغيل في موقف supine باستخدام شريط لاصق الطبية.
- وضع منصة التشغيل مع الماوس على ذلك تحت مجسمة.
- تطهير الصدر الماوس باستخدام لوحة الإعدادية غارقة مع بيتادين والكحول 70٪ أو بما يتفق مع السياسة المؤسسية.
- قطع الجلد مع 1 سم في المنطقة الوربي الرابعة من تجويف الصدر ومن ثم فصل العضلات الوربي باستخدام مقص الجراحة الدقيقة حتى يتم الوصول إلى القلب.
- اضغط بالتناوب على الصدر والبطن بمساعدة اثنين من ملقط حتى يتم إخراج القلب من الصدر دون أي ضرر ميكانيكي.
- تعيين الأضلاع تحت وفوق شق صغير تثبيت الطبيعية لشل حركة القلب.
- استئصال قمة البطين
- حدد قمة البطين الأيسر. قطع قطر 1 مم من الأنسجة قمة البطين باستخدام مقص استئصال الدهون تحت مجسمة.
- تأكد من تعرض غرفة البطين الأيسر، وابدأ في النضح.
- اضغط بلطف القلب مرة أخرى إلى تجويف الصدر باستخدام مسحة القطن.
- خياطة العضلات والأضلاع والجلد باستخدام 8-0 غرز البرولين.
- تنظيف الماوس جيدا بعد العملية.
- الرعاية بعد العملية
- نقل الماوس من منصة التشغيل إلى بطانية التدفئة 37 درجة مئوية لتسخين الجسم مباشرة بعد العملية.
- تأكد من أنابيوسيس الفأر من خلال مراقبة العلامات التالية: استعادة التنفس التلقائي، وتغيير لون البشرة من شاحب إلى وردي، وحركة الأطراف.
- خذ الماوس الذي تم تشغيله مرة أخرى إلى والدته بمجرد تعافيه.
- الاختلاط الماوس تعمل مع مواد التعشيش والدتها إذا لزم الأمر.
ملاحظة: من المهم إزالة جميع الجراء البالغة من العمر يوما واحدا من الأم في وقت واحد ثم إعادتها جميعا في وقت واحد بعد استرداد جميع الجراء.
2. إعداد تعليق الضامة القلبية الوليدية
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع هذه الإجراءات التجريبية في مكان مظلم وفي ظل ظروف معقمة.
- حصاد قلب الوليد Cx3cr1GFP / + الماوس 1 يوم بعد استئصال apical
- القتل الرحيم Cx3cr1GFP / + الماوس بعد يوم واحد من استئصال apical. استخدام فائض من ثاني أكسيد الكربون وقطع رأس الماوس بالتسلسل لتطبيق القتل الرحيم.
- أخرج القلب من الصدر وانغمس فيه في طبق 10 سم مع برنامج تلفزيوني.
- قطع الأوعية والأنسجة الضامة المتبقية بعيدا عن البطينين. قطع الزائدة الدودية المسالك من القلب.
- بعد توقف القلب عن النبض، وقطع القلب إلى 1-2 ملم3 قطع في مخزن تلفزيوني باستخدام مقص الجراحية الدقيقة(الشكل 2A).
- فصافر قلب فأر حديثي الولادة
- نقل أنسجة القلب حصادها إلى أنبوب يحتوي على 2.5 مل من مزيج انزيم مسخن(جدول المواد)،وإغلاق بإحكام الأنبوب.
- عكس الأنبوب ووضعه مع الغطاء إلى أسفل(الشكل 2B).
- تشغيل برنامج فصافر القلب الوليدي (جدول المواد).
- فصل الأنبوب من المفكك بعد اكتمال البرنامج.
- إضافة 7.5 مل من 1x DMEM مع 10٪ FBS إلى الأنبوب.
- تصفية ونقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل (الشكل 2C). الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
- Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أضف 5-10 مل من حاجز PBS إلى نظام التعليق والطرد المركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقائق.
- Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS.
- عزل الضامة القلبية الوليدية
- فرز GFP+ الضامة القلبية الوليدية بواسطة FACS. تلقي الضامة فرزها في أنبوب معقم يحتوي على 500 ميكرولتر من DMEM مع 10٪ FBS.
- عد GFP+ الضامة (الشكل 2D). إعادة ضغط الضامة في DMEM مع 10٪ FBS بتركيز 1 × 106 الضامة لكل 200 ميكرولتر من DMEM للحقن في وقت لاحق.
ملاحظة: عدد GFP+ الضامة صغير في حديثي الولادة واحد (1 × 105تقريبا)؛ لذلك، يجب استخدام ما لا يقل عن 10 حديثي الولادة للحصول على ما يكفي من الضامة لكل حقنة فأرة بالغة.
3. زرع الضامة القلبية الوليدية
- إجراء عملية احتشاء عضلة القلب على الكبار (6-8 أسابيع من العمر) الذكور C57BL/6 الماوس عن طريق ربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر8.
- ضع الماوس الذي تم تشغيله على بطانية ساخنة 37 درجة مئوية حتى يتعافى.
- حقن عن طريق الوريد 200 ميكرولتر من DMEM مع 1 × 106 GFP+ الضامة القلبية حديثي الولادة في الماوس الكبار المتشترئ بعد العملية (حوالي 6 ساعات في وقت لاحق) عن طريق الوريد الذيل.
- أرسل الفأرة إلى قفص نظيف
4. تقييم النتائج
- التحقق من كفاءة الحقن
- تخدير الماوس الذي يتم تشغيله وحصاد القلب بعد 7 أيام من عملية احتشاء عضلة القلب.
- تزج القلب في المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا.
- إصلاح أنسجة القلب مع 4٪ بوليفورمالديهايد لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز.
- تجفيف أنسجة القلب في ثنائي ميثيل بنزيني والإيثانول.
- تضمين أنسجة القلب في البارافين وشريحة إلى أقسام مع سمك 5 ميكرومتر.
- تنفيذ معيار immunofluorescence تلطيخ البروتوكول1. استخدام α-أكتينين للاحتفال خلايا القلب.
- الكشف عن GFP+ الضامة في القلب تلقي زرع.
- تنفيذ معيار immunofluorescence تلطيخ البروتوكول1. استخدام α-أكتينين وpH3 للاحتفال cardiomyocytes وانتشار الخلايا, على التوالي (الشكل 3A).
- تقييم إصلاح القلب بعد عملية الزرع
- استخدام تخطيط صدى القلب على الماوس تعمل بعد شهر واحد من العملية1.
- تحليل وظيفة القلب عن طريق مقارنة كسر طرد البطين الأيسر وتقصير كسور في مجموعات مختلفة(الشكل 3B).
- تخدير الماوس تعمل وحصاد القلب.
- كرر الخطوات 4.1.2-4.1.5.
- نفذ بروتوكول تلطيخ (ماسون)
- تحليل المنطقة المتشتة بعد حقن الضامة (الشكل 3C).
Representative Results
يتم تلخيص البروتوكول الموضح هنا في مخطط تدفق(الشكل 1). قمنا بعملية استئصال apical على 1 يوم من العمر Cx3cr1GFP / + الماوس. كما هو مبين في الشكل 2A، تم تثبيت الماوس Cx3cr1GFP / + الوليدي على منصة التشغيل تحت المجسمة بعد التخدير. قمنا بتطبيق الضغط بالتناوب على صدر الفأر والبطن بمساعدة اثنين من ملقط ، والتي يمكن إعدادها كجهاز لتوجيه القلب ظهرت من الصدر. يجب تجنب أي ضرر ميكانيكي إضافي للقلب قد يؤثر على تجديد القلب. تم شل حركة القلب بسبب أنسجة الصدر المحيطة به ، مما سهل العملية على عضلة القلب. وجدنا أن قطع أقل من قطر 1 ملم من الأنسجة قمة استئصالها عن طريق مقص استئصال قزحية كان من المناسب عندما بدأت غرفة البطين الأيسر ناز. الاستقراء الناجح لنموذج استئصال apical ضروري لزرع الضامة8،9.
قمنا بفرز الضامة GFP+ بدقة بعد بروتوكول فصابة قلب حديثي الولادة1 (الشكل 2).
تم حقن الضامة القلبية الوليدية في قلب فأر البالغين المتشترئ عضلة القلب بعد فترة وجيزة من العزلة. من أجل تأكيد كفاءة زرع الضامة ، قمنا بإجراء تلطيخ immunofluorescence في 7 أيام بعد الحقن. وأظهرت النتائج أنه يمكن العثور على GFP+ الضامة في قلب الماوس المتشحش عضلة القلب الكبار، مما يشير إلى نجاح زرع الضامة القلبية الوليدية. لقد قمنا بتوظيف التثبط المناعي المشترك لpH3 مع α-أكتينين. واعتبر التوطين المشترك أن انتشار خلايا القلب. وأوضحت النتائج أن عدد خلايا القلب التكاثرية تم تنظيمه في المجموعة التي تحقن الماكروفاج، مما يشير إلى أن قدرة الكبار على انتشار خلايا القلب تعززت بعد الزرع(الشكل 3).
تم تقييم تجديد قلب الفأر البالغ بعد شهر واحد من عملية الزرع. قمنا بإجراء تخطيط صدى القلب على فأر البالغين ووجدنا أن حقن الضامة يمكن أن يعزز وظيفة القلب بعد احتشاء عضلة القلب. تم إجراء تلطيخ ماسون ، وأظهرت النتائج أن المنطقة المتشتة انخفضت بشكل ملحوظ بعد زرع الضامة القلبية الوليدية(الشكل 3). أظهرت كل هذه النتائج أن زرع الضامة القلبية الوليدية يعزز تجديد قلب الفأر البالغ وانتشار خلايا القلب.
الشكل 1:التمثيل التخطيطي لزراعة الضامة القلبية الوليدية.
الشكل 2: صور عزلة الضامة. أ)يتم قطع القلوب إلى قطع صغيرة. ب)يتم فصل قلوب الماوس. ج)تتم تصفية التعليق ونقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. د)يتم حساب عدد الضامة القلبية الوليدية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:زراعة الضامة القلبية الوليدية تعزز تجديد القلب لدى البالغين. أ)(يسار) صور immunofluorescence تظهر خلايا القلب التكاثرية (السهم، pH3 الأخضر، α-actinin الأحمر). (يمين) يظهر التحليل الإحصائي أن انتشار خلايا القلب يزداد بعد زرع الضامة. ب)(يسار) صور تخطيط صدى القلب تظهر وظيفة القلب في الماوس الكبار 1 أشهر بعد احتشاء عضلة القلب. (يمين) يظهر التحليل الإحصائي أن وظيفة القلب تتعزز بعد زرع الضامة. ج)تلطيخ ماسون يظهر المنطقة المتشتة في الماوس الكبار 1 أشهر بعد احتشاء عضلة القلب. (يمين) التحليل الإحصائي تبين أن يتم تقليل المنطقة المتشتة بعد Mφ، زرع الضامة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا، نقدم نهجا فعالا لإعداد، واكتساب، وزرع الضامة القلبية الوليدية لتعزيز تجديد قلب الفأر الكبار.
استئصال Apical هو عملية بسيطة وفعالة لتحفيز تجديد القلب. لقد قمنا بتحسين تفاصيل استئصال apical لضمان الحد الأقصى لمعدل البقاء على قيد الحياة للحيوانات المشاركة في العملية10. يجب ألا يزيد وقت التخدير عن 3 دقائق، مما يؤدي إلى الوفاة الناجمة عن انخفاض حرارة الجسم، أو أقصر من دقيقتين، مما قد يسبب نزيفا مفرطا أثناء العملية. كان من المفترض أن يبتر الاستئصال apical القياسي قطر 1.5 مم تقريبا من نسيج القمة. ومع ذلك ، كان الغرض من العملية هنا لتحفيز تسلل الضامة وفيرة أثناء عملية تجديد القلب. وكان استئصال قطره أقل من 1.5 ملم مقبولا لأنه يمكن أن يضمن معدل بقاء أقصى وتجنيدا فعالا للكوافر الكبيرة في نفس الوقت. فقط مهارة المشغل أثرت على معدل البقاء على قيد الحياة ، والفئران العاملة لا يمكن البقاء على قيد الحياة لمدة التشغيل المطولة. يجب على المشغل إكمال الإجراء بأكمله في غضون 5 دقائق.
في دراستنا السابقة، وجدنا أن الالتهاب الحاد يعزز تجديد قلب حديثي الولادة. يمكن أن يشجع التحزيم الدقيق داخل عضلة القلب لجسيمات الزيموسان المناعية A في قلب فأر حديثي الولادة على انتشار خلايا القلب6. في الآونة الأخيرة، ادعى مولكينتين وآخرون أن تسلل الضامة التي يتم تحفيزها عن طريق الحقن داخل القلب من zymosan A، وحطام الخلايا، وتجميد / إذابة الخلايا القاتلة يمكن أن تعزز إصلاح القلب، مما يؤكد أن الالتهاب الحاد وال الضامة ضرورية في إصلاح القلب بدلا من الخلايا الجذعية التي تختلف في خلايا القلب11. أفاد صادق وآخرون5 أن الضامة يمكن أن تعزز تجديد قلب الوليد عن طريق تولد الأوعية. كشفت دراستنا الأخيرة أن حقن الضامة القلبية الوليدية يمكن أن يعزز تجديد القلب للبالغين ويزيد من قدرة انتشار خلايا القلب البالغة1،7. قد تكون زراعة الضامة القلبية الوليدية استراتيجية واعدة لتعزيز تجديد قلب الفأر البالغ. هنا نقدم البروتوكولات لمساعدة المزيد من الباحثين على تطوير التطبيقات التجديدية واستكشاف آليات تجديد القلب.
Disclosures
لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل الصندوق الصيني للابتكار في العلوم الطبية التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CIFMS، 2016-I2M-1-015)، والمشروع الوطني للبحوث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0801500)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC: 81970243، 81770308)، ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7172183، 7182140).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
- Li, Y., et al. gp130 Controls Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Circulation. 142 (10), 967-982 (2020).
- Pei, J., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration via ROS Scavenging. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 1412696 (2020).
- Wang, Y., et al. Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics. 10 (20), 9100-9112 (2020).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Han, C., et al. Acute inflammation stimulates a regenerative response in the neonatal mouse heart. Cell Research. 25 (10), 1137-1151 (2015).
- Li, Y., et al. Transplantation of murine neonatal cardiac macrophage improves adult cardiac repair. Cellular & Molecular Immunology. , (2020).
- Yue, Z., et al. PDGFR-β Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Reports. 28 (4), 966-978 (2019).
- Wang, J., et al. A long noncoding RNA NR_045363 controls cardiomyocyte proliferation and cardiac repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 105-114 (2019).
- Li, Y., et al. Achieving stable myocardial regeneration after apical resection in neonatal mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (11), 6500-6504 (2020).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577 (7790), 405-409 (2020).
