Summary
Vi leverer en protokol for neonatal hjerte makrofag adskillelse og transplantation i en voksen mus hjerte, som kunne være en lovende måde at fremme hjerte reparation.
Abstract
I en såret neonatal myokardie, makrofager lette kardiomyocyt spredning og angiogenese og fremme hjerte regenerering. Den foreliggende undersøgelse viser, at transplantation af neonatale hjertemakrofager rekrutteret ved skade fremmer voksen hjerte regenerering efter myokardieinfarkt med forbedring af hjertefunktion og kardiomyocyt spredning. Resultaterne tyder på, at neonatal hjerte makrofag transplantation kunne være en lovende strategi for hjerteskade behandling. Her giver vi de tekniske detaljer, herunder isolering af neonatale hjertemakrofager fra apikale resektionsskadede neonatale musehjerter, transplantation af makrofager i myokardieinfarerede voksne mus og vurdering af hjerteregenerering efter en makrofagsgraft.
Introduction
Hjerte regenerering er en lovende strategi for at genvinde hjertefunktion efter hjerteskade og for at beskytte mod hjertesvigt1,2,3. Efter myokardieskader infiltrerer makrofager det skadede hjerte og er blevet undersøgt som nøglefaktorer under neonatal hjerteregenerering4,5,6. Udover clearing nekrotiske cellulære vragrester og fremkalde betændelse, makrofager fremme angiogenese5 og kardiomyocyt spredning7 efter neonatale mus myokardieinfarkt.
Vores tidligere undersøgelse illustrerer, at transplantation af neonatale hjertemakrofager isoleret fra skadet neonatalt hjerte forbedrer voksen hjerteregenerering7, hvilket indikerer, at neonatal hjertemakrofagstransplantation kan være en lovende strategi til behandling af hjerteskader. Her giver vi de tekniske detaljer, herunder isolering af neonatale hjertemakrofager fra apikale resektionsskadede neonatale musehjerter, transplantation af makrofager i myokardieinfarerede voksne mus og vurdering af hjerteregenerering efter makrofagtransplantation (Figur 1).
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen til brug og pleje af laboratoriedyr. Alle dyreprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. Aseptisk teknik er påkrævet under hele proceduren for at forhindre forurening af det kirurgiske sted.
1. Apical resektion operation i neonatal 1-dag gamle Cx3cr1 GFP / + mus(C57BL/6 baggrund)
- Anæstesi
- Tag alle museungerne ud af burene og læg dem i en ren tør kasse.
- Integrer hver mus i isen i ca. 2-3 minutter. Sørg for, at der er en tynd barriere såsom latex eller gaze mellem isen og museungen for at forhindre forfrysninger.
- Identificer tilstrækkelig anæstesi ved at observere for følgende tegn: bleg hud, manglende lemmer bevægelse, og mangel på pedal refleks.
- Thoracotomi
- Precool bronze driftsplatform natten over ved -20 °C for at hjælpe med at opretholde anæstesi.
- Tag den bedøvede mus ud af iskassen og læg den på en bronze driftsplatform. Forankre musen på driftsplatformen i en liggende position ved hjælp af medicinsk tape.
- Sæt betjeningsplatformen med musen på den under et stereoskop.
- Desinficer musekisten ved hjælp af en prep pad gennemblødt med betadin og 70% alkohol eller i overensstemmelse med den institutionelle politik.
- Incise huden med en 1 cm skåret på den fjerde intercostal område af brysthulen og derefter adskille intercostal muskler ved hjælp af mikrokirurgisk saks, indtil hjertet er tilgængelig.
- Tryk skiftevis på brystet og maven ved hjælp af to sammenkrulninger, indtil hjertet er udvendigt ud af brystet uden mekanisk skade.
- Sæt ribbenene under og over det lille snit som en naturlig fiksering for at immobilisere hjertet.
- Ventrikulær apex resektion
- Find toppen af venstre ventrikel. Skær en 1 mm diameter af ventrikulær spidsvæv ved hjælp af iridektomi saks under et stereoskop.
- Bekræft, at venstre ventrikulære kammer er udsat, og begynde oser.
- Tryk forsigtigt hjertet tilbage til brysthulen ved hjælp af en vatpind.
- Sutur muskler, ribben, og hud ved hjælp af 8-0 Prolene suturer.
- Rengør musen grundigt efter operationen.
- Pleje efter operationen
- Overfør musen fra driftsplatformen til et 37 °C varmetæppe for at varme kroppen op umiddelbart efter operationen.
- Bekræft musens anabiose ved at observere for følgende tegn: spontan respiration restaurering, hudfarveændring fra bleg til pink og bevægelse af lemmer.
- Tag den opererede mus tilbage til sin mor, når den er kommet sig.
- Bland den opererede mus med moderens redematerialer, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne alle de 1-dages gamle hvalpe fra moderen på én gang og derefter returnere dem alle på én gang, når alle hvalpene er kommet sig.
2. Forberedelse af neonatal hjerte makrofag suspension
BEMÆRK: Alle disse forsøgsprocedurer skal udføres på et mørkt sted og under sterile forhold.
- Høst hjertet af en neonatal Cx3cr1GFP/+ mus 1-dag efter apikal resektion
- Aflive Cx3cr1GFP/+ musen en dag efter den apikale resektion. Brug et overskud af kuldioxid og halshugge musen sekventielt at anvende aktiv dødshjælp.
- Tag hjertet ud af brystet og sænk det i en 10 cm skål med PBS.
- Skær karrene og resterende bindevæv væk fra hjertekamrene. Skær auricular tillæg og udstrømning tarmkanalen væk fra hjertet.
- Når hjertet holder op med at slå, skæres hjertet i 1-2 mm3 stykker i PBS buffer ved hjælp af mikrokirurgisk saks (Figur 2A).
- Neonatal mus hjerte dissociation
- Det høstede hjertevæv overføres til et rør, der indeholder 2,5 mL forvarmet enzymblanding (Materialetabel), og røret lukkes tæt.
- Vend røret og læg det med hætten ned (Figur 2B).
- Kør neonatal hjerte dissociation program (Tabel over materialer).
- Tag røret ud af dissociatoren, når programmet er afsluttet.
- Tilsæt 7,5 mL 1x DMEM med 10% FBS til røret.
- Filtrer og overfør suspensionen til et 15 mL centrifugerør (Figur 2C). Centrifuge celleaffjedringen ved 300 x g i 5 minutter.
- Brug cellepillen igen i 1 mL blodcelle lysisopløsning og inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 5-10 mL PBS-buffer til affjedringen og centrifugen ved 300 x g i 5 minutter.
- Resuspend celle pellet i 1 mL af DMEM med 10% FBS.
- Neonatal hjerte makrofag isolation
- Sorter GFP+ neonatale hjertemakrofager efter FACS. De sorterede makrofager modtages i et sterilt rør, der indeholder 500 μL DMEM med 10% FBS.
- Tæl GFP+ makrofager (Figur 2D). Resuspend makrofaget i DMEM med 10% FBS i koncentration af 1 x 106 makrofager pr. 200 μL DMEM til senere injektion.
BEMÆRK: Antallet af GFP+ makrofager er lille i ét neonat (ca. 1 x 105); derfor bør der anvendes mindst 10 nyfødte til at opnå nok makrofager til hver voksen museindsprøjtning.
3. Neonatal transplantation af hjertemakrofag
- Udfør en myokardieinfarkt operation på en voksen (6-8-uger gammel) mandligE C57BL/6 mus ved ligation af venstre forreste kranspulsåre8.
- Sæt den opererede mus på et 37 °C opvarmet tæppe, indtil det kommer sig.
- Intravenøst injicere 200 μL AF DMEM med 1 x 106 GFP+ neonatale hjertemakrofager i den infarkterede voksne mus efter operationen (ca. 6 timer senere) via halevenen.
- Send musen tilbage til et rent bur.
4. Resultatevaluering
- Validering af injektionseffektivitet
- Bedøve den opererede mus og høste hjertet 7 dage efter myokardieinfarkt operation.
- Fordyb hjertet i den forkølede PBS-buffer.
- Fix hjertevævet med 4% polyformaldehyd i 72 timer ved stuetemperatur med rystelser.
- Dehydrere hjertevævet i dimethylbenzene og ethanol.
- Integrer hjertevævet i paraffin og skær det i sektioner med en tykkelse på 5 μm.
- Udfør standard immunofluorescence farvning protokol1. Brug α-actinin til at markere kardiomyocytter.
- Detekter GFP+ makrofager i hjertet, der modtager transplantation.
- Udfør standard immunofluorescence farvning protokol1. Brug α-actinin og pH3 til at markere henholdsvis kardiomyocytter og cellespredning (figur 3A).
- Hjertereparationsevaluering efter transplantationen
- Brug ekkokardiografi på den opererede mus en måned efter handlingen1.
- Analysere hjertefunktionen ved at sammenligne den venstre ventrikulære udslyngningsfraktion og fraktioneret afkortning i forskellige grupper (Figur 3B).
- Bedøve den opererede mus og høste hjertet.
- Gentag trin 4.1.2-4.1.5.
- Udfør en Massons farvningsprotokol.
- Analysere det infarkte område efter makrofagsindsprøjtning (Figur 3C).
Representative Results
Den protokol, der er beskrevet her, er opsummeret i et rutediagram (Figur 1). Vi udførte apikal resektionsoperation på 1 dag gamle Cx3cr1GFP / + mus. Som vist i figur 2Ablev den neonatale Cx3cr1GFP/+ mus forankret på driftsplatformen under stereoskopet efter anæstesi. Vi anvendte pres skiftevis på musekassen og maven ved hjælp af to sammenklik, som kan sættes op som en tarmkanal til at guide hjertet springer ud af brystet. Enhver ekstra mekanisk skade på hjertet, der kan påvirke hjerte regenerering bør undgås. Hjertet blev immobiliseret af de omkringliggende brystvæv, hvilket lettede operationen på myokardiet. Vi fandt, at afskære mindre end en 1 mm diameter af resected apex væv af iridectomy saks var passende, når venstre ventrikulær kammer begyndte oser. En vellykket induktion af den apikale resektionsmodel er nødvendig for makrofagstransplantation8,9.
Vi sorterede GFP+ makrofager strengt efter en neonatal hjerte dissociation protokol1 (Figur 2).
Neonatale hjertemakrofager blev sprøjtet ind i det myokardieinfarkterede voksne musehjerte kort efter isolationen. For at bekræfte effektiviteten af makrofagstransplantationen udførte vi immunofluorescence farvning farvning 7 dage efter injektionen. Resultaterne viste, at GFP+ makrofager kunne findes i det voksne myokardieinfarkterede musehjerte, hvilket indikerer en vellykket transplantation af neonatal hjertemakrofag. Vi anvendte co-immunstaining af pH3 med α-actinin. Co-lokalisering blev anset for at være kardiomyocyt spredning. Resultaterne viste, at antallet af proliferative kardiomyocytter blev opreguleret i den makrofagsindsprøjtningsgruppe, hvilket indikerer, at voksne kardiomyocytforsentationsevne blev forbedret efter transplantationen (Figur 3).
Voksen musehjerte regenerering blev evalueret 1 måned efter transplantationen. Vi udførte ekkokardiogram på den voksne mus og fandt ud af, at makrofagsindsprøjtning kunne forbedre hjertefunktionen efter myokardieinfarkt. Massons farvning blev udført, og resultaterne viste, at infarkt område blev bemærkelsesværdigt reduceret efter neonatal hjertemakrofagstransplantation (Figur 3). Alle disse resultater viste, at neonatal hjerte makrofag transplantation fremmer voksne mus hjerte regenerering og kardiomyocyt spredning.
Figur 1: Skematisk repræsentation af neonatal hjerte makrofag transplantation.
Figur 2: Billeder af makrofagsisolation. A) Hjerterne er skåret i små stykker. B) Musen hjerter er adskilt. C) Suspensionen filtreres og overføres til et 15 mL centrifugerør. D) Antallet af neonatale hjertemakrofager beregnes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Neonatal hjerte makrofag transplantation fremmer voksne hjerte regenerering. A) (Venstre) Immunofluorescence billeder viser de proliferative kardiomyocytter (pil, pH3 grøn, α-actinin rød). (Højre) Statistisk analyse viser, at kardiomyocyt spredning stiger efter makrofag transplantation. B) (Venstre) Ekkokardiogram billeder viser hjertefunktion i voksen mus 1-måned efter myokardieinfarkt. (Højre) Statistisk analyse viser, at hjertefunktionen er forbedret efter makrofagstransplantation. C) Masson's farvning viser infarcted område i voksen mus 1-måned efter myokardieinfarkt. (Højre) Statistisk analyse viser, at infarcted område reduceres efter Mφ, makrofag transplantation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her giver vi en effektiv tilgang til at forberede, erhverve og transplantere neonatale hjertemakrofager for at fremme voksen musehjerteregenerering.
Apisk resektion er en enkel og effektiv operation for at stimulere hjerte regenerering. Vi har optimeret detaljerne i apikal resektion for at sikre den maksimale overlevelsesrate for de dyr, der er involveret i operationen10. Anæstesi tid bør ikke være længere end 3 minutter, hvilket fører til hypotermi-induceret død, eller kortere end 2 minutter, hvilket ville forårsage overdreven blødning under operationen. Standard apikale resektion skulle amputere omkring 1,5 mm diameter af apex væv. Men formålet med operationen her var at stimulere rigelige makrofag infiltration under hjerte regenerering proces. Resektion på mindre end 1,5 mm diameter var acceptabelt, da det kunne garantere en maksimal overlevelsesrate og effektiv makrofag rekruttering på samme tid. Kun operatørens dygtighed påvirkede overlevelsesraten, og de opererede mus kunne ikke overleve den langvarige driftsvarighed. Operatøren skal afslutte hele proceduren inden for 5 minutter.
I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at akut betændelse fremmes neonatal hjerte regenerering. Intramyokardiemikroinjektion af immunogen zymosan A-partikler i neonatalt musehjerte kan fremme spredning af kardiomyocyt6. For nylig hævdede Molkentin et al. at makrofaginfiltration, der stimuleres ved intracardiac injektion af zymosan A, cellerester og fryse / optø dræbte celler, kan fremme hjertereparation, hvilket bekræfter, at akut betændelse og makrofager er afgørende for hjertereparation snarere end stamceller, der differentierer sig til kardiomyocytter11. Sadek et al.5 rapporterede, at makrofager kunne fremme neonatal hjerte regenerering via angiogenese. Vores seneste undersøgelse viste, at neonatal hjerte makrofag injektion kunne fremme voksne hjerte regenerering og øge evnen til voksne kardiomyocyt spredning1,7. Neonatal hjerte makrofag transplantation kan være en lovende strategi for at fremme voksne mus hjerte regenerering. Her præsenterer vi protokollerne for at hjælpe flere forskere om den regenerative applikationsudvikling og udforske af hjerteregenereringsmekanismer.
Disclosures
Ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS, 2016-I2M-1-015), National Key Research and Development Project of China (2019YFA0801500), National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81970243, 81770308), Beijing Natural Science Foundation (7172183, 7182140).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
- Li, Y., et al. gp130 Controls Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Circulation. 142 (10), 967-982 (2020).
- Pei, J., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration via ROS Scavenging. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 1412696 (2020).
- Wang, Y., et al. Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics. 10 (20), 9100-9112 (2020).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Han, C., et al. Acute inflammation stimulates a regenerative response in the neonatal mouse heart. Cell Research. 25 (10), 1137-1151 (2015).
- Li, Y., et al. Transplantation of murine neonatal cardiac macrophage improves adult cardiac repair. Cellular & Molecular Immunology. , (2020).
- Yue, Z., et al. PDGFR-β Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Reports. 28 (4), 966-978 (2019).
- Wang, J., et al. A long noncoding RNA NR_045363 controls cardiomyocyte proliferation and cardiac repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 105-114 (2019).
- Li, Y., et al. Achieving stable myocardial regeneration after apical resection in neonatal mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (11), 6500-6504 (2020).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577 (7790), 405-409 (2020).
