Summary
Vi tillhandahåller ett protokoll för neonatal hjärt makrofag separation och transplantation i en vuxen mus hjärta, som kan vara ett lovande sätt att främja hjärt reparation.
Abstract
I ett skadat neonatalt hjärtmuskelium underlättar makrofager kardiomyocytproliferation och angiogenes och främjar hjärtregenerering. Den aktuella studien visar att transplantation av neonatal hjärt makrofager rekryteras av skada främjar vuxna hjärtat regenerering efter hjärtinfarkt med förbättring av hjärt funktion och kardiomyocyt spridning. Resultaten tyder på att neonatal hjärt makrofag transplantation kan vara en lovande strategi för hjärt skada behandling. Här ger vi de tekniska detaljerna, inklusive isolering av neonatal hjärt makrofager från apical samband-skadade neonatal mus hjärtan, transplantation av makrofager i skador-infarcted vuxna möss och uppskattningen av hjärtat regenerering efter en makrofag moderplantor.
Introduction
Hjärtregenerering är en lovande strategi för att återställa hjärtfunktionen efter hjärtskada och för att skydda mot hjärtsvikt1,2,3. Efter skador på hjärtinfarkt infiltrerar makrofager det skadade hjärtat och har utforskats som de viktigaste faktorerna under neonatal hjärtregenerering4,5,6. Förutom att rensa nekrotiskt cellulärt skräp och inducera inflammation, makrofager främja angiogenesis5 och kardiomyocyt spridning7 efter neonatala möss hjärtinfarkt.
Vår tidigare studie visar att transplantation av neonatal hjärt makrofager isolerade från skadade neonatal hjärtat förbättrar vuxna hjärtat regenerering7, vilket indikerar att neonatal hjärt makrofag transplantation kan vara en lovande strategi för att behandla hjärt skada. Här ger vi de tekniska detaljerna, inklusive isolering av neonatal hjärt makrofager från apical samband-skadade neonatal mus hjärtan, transplantation av makrofager i till skador-infarcted vuxna möss och uppskattningen av hjärtat regenerering efter makrofag moderplantor (Figur 1).
Protocol
Alla försök utfördes i enlighet med vägledningen för användning och skötsel av försöksdjur. Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. Aseptisk teknik krävs under hela proceduren för att förhindra förorening av operationsstället.
1. Apical samband drift i neonatal 1-dagars gammal Cx3cr1 GFP/+ mus(C57BL/6 bakgrund)
- Anestesi
- Ta ut alla musvalpar från burarna och lägg dem i en ren torr låda.
- Bädda in varje mus i isen i ca 2-3 minuter. Se till att det finns en tunn barriär som latex eller gasväv mellan isen och muspuppen för att förhindra köldskador.
- Identifiera tillräcklig anestesi genom att observera för följande tecken: blek hud, brist på lemrörelse och brist på pedalreflex.
- Thoracotomy (thoracotomi)
- Förkyl bronsplattformen över natten vid -20 °C för att hjälpa till att upprätthålla anestesi.
- Ta ut den bedövade musen ur islådan och lägg den på en bronsplattform. Förankra musen på operationsplattformen i ett supin läge med medicinsk tejp.
- Sätt arbetsplattformen med musen på under ett stereoskop.
- Desinficera muskistan med en prep pad blöt med betadin och 70% alkohol eller som överensstämmer med institutionell politik.
- Incise huden med en 1 cm skärsår vid det fjärde interkostala området i brösthålan och separera sedan interkostala musklerna med hjälp av mikrokirurgisk sax tills hjärtat nås.
- Tryck växelvis bröstet och buken med hjälp av två tångar tills hjärtat är utvändigt ut ur bröstet utan mekanisk skada.
- Ställ revbenen under och ovanför det lilla snittet som en naturlig fixering för att immobilisera hjärtat.
- Ventrikulärt apex samband
- Leta reda på toppen av den vänstra ventrikeln. Kapa en 1 mm diameter ventrikulär spetsvävnad med hjälp av iridektomisax under ett stereoskop.
- Kontrollera att den vänstra ventrikulära kammaren är exponerad och börja sippra ut.
- Tryck försiktigt hjärtat tillbaka till brösthålan med en bomullspinne.
- Suturera muskler, revben och hud med 8-0 Prolene suturer.
- Rengör musen noggrant efter operationen.
- Vård efter operationen
- Överför musen från manöverplattformen till en 37 °C värmefilt för att värma upp kroppen omedelbart efter operationen.
- Bekräfta musens anabios genom att observera för följande tecken: spontan andning restaurering, hudfärg förändring från blek till rosa och rörelse av lemmar.
- Ta den opererade musen tillbaka till sin mamma när den har återhämtat sig.
- Mingla den opererade musen med moderns häckningsmaterial om det behövs.
OBS: Det är viktigt att ta bort alla 1-dagars gamla valpar från mamman på en gång och sedan returnera dem alla på en gång efter att alla valpar har återfunnits.
2. Förberedelse av neonatal hjärtmakrofadupphängning
OBS: Alla dessa experimentella procedurer bör utföras på en mörk plats och under sterila förhållanden.
- Skörda hjärtat av en neonatal Cx3cr1GFP/ + mus 1-dag efter apisk samband
- Avliva Cx3cr1GFP/+ musen en dag efter den apatiska sambandet. Använd ett överskott av koldioxid och halshugg musen sekventiellt för att applicera dödshjälp.
- Ta hjärtat ur bröstet och sänk ner det i en 10 cm skål med PBS.
- Skär kärlen och återstående bindväv bort från ventriklarna. Skär den auricular tillägget och utflödeskanalen bort från hjärtat.
- När hjärtat har upphört att slå, skär hjärtat i 1-2 mm3 stycken i PBS-buffert med mikrokirurgisk sax (Figur 2A).
- Neonatal mus hjärta dissociation
- Överför den skördade hjärtvävnaden till ett rör som innehåller 2,5 ml förvärmd enzymblandning (Table of Materials) och stäng röret ordentligt.
- Vänd röret och placera det med locket nedåt (Bild 2B).
- Kör neonatal hjärta dissociation program (Table of Materials).
- Lossa röret från dissociatorn när programmet är klart.
- Tillsätt 7,5 ml 1x DMEM med 10% FBS till röret.
- Filtrera och överför fjädringen till ett 15 ml centrifugeringsrör(figur 2C). Centrifugera cellupphängningen vid 300 x g i 5 minuter.
- Återanvänd cellpelleten i 1 ml lyslösning i blodkroppar och inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 5-10 ml PBS-buffert till suspensionen och centrifugen vid 300 x g i 5 minuter.
- Återanvänd cellpelleten i 1 ml DMEM med 10% FBS.
- Neonatal hjärt makrofag isolering
- Sortera GFP+ neonatal hjärtmakrofager av FACS. Ta emot de sorterade makrofagerna i ett sterilt rör som innehåller 500 μL DMEM med 10 % FBS.
- Räkna GFP+ makrofager (figur 2D). Återanvänd makrofagen i DMEM med 10% FBS vid koncentrationen 1 x 106 makrofager per 200 μL DMEM för senare injektion.
OBS: Antalet GFP+ makrofager är litet i en hos (ca 1 x 105); Därför bör minst 10 nyfödda användas för att erhålla tillräckligt med makrofager för varje vuxen musinjektion.
3. Neonatal hjärt makrofag transplantation
- Utför en hjärtinfarkt operation på en vuxen (6-8 veckor gammal) manliga C57BL/6 mus genom ligatur av den vänstra främre födansgatan 8.
- Sätt den opererade musen på en 37 °C uppvärmd filt tills den återhämtar sig.
- Intravenöst injicera 200 μL DMEM med 1 x 106 GFP+ neonatal hjärtmakrofager i den infarkterade vuxna musen efter operationen (ungefär 6 timmar senare) via svansvenen.
- Skicka tillbaka musen till en ren bur.
4. Resultatutvärdering
- Validering av injektionseffektivitet
- Bedöva den opererade musen och skörda hjärtat 7 dagar efter hjärtinfarkten.
- Sänk ner hjärtat i den förkylda PBS-bufferten.
- Fixera hjärtvävnaden med 4% polyformaldehyd i 72 timmar vid rumstemperatur med skakningar.
- Torka ut hjärtvävnaden i dimetylbensen och etanol.
- Bädda in hjärtvävnaden i paraffin och skär den i sektioner med en tjocklek av 5 μm.
- Utför standard immunofluorescens färgningsprotokoll1. Använd α-aktinin för att markera kardiomyocyter.
- Upptäck GFP+ makrofager i hjärtat som får transplantation.
- Utför standard immunofluorescens färgningsprotokoll1. Använd α-aktinin och pH3 för att markera kardiomyocyter respektive cellproliferation (figur 3A).
- Utvärdering av hjärtreparation efter transplantationen
- Använd ekokardiografi på den manövrerade musen en månad efter operationen1.
- Analysera hjärtfunktionen genom att jämföra den vänstra ventrikulära utmatningsfraktionen och den fraktionerade förkortningen i olika grupper (figur 3B).
- Bedöva den opererade musen och skörda hjärtat.
- Upprepa steg 4.1.2-4.1.5.
- Utför en Massons färgningsprotokoll.
- Analysera det infarkterade området efter makrofadinjektion (figur 3C).
Representative Results
Protokollet som beskrivs här sammanfattas i ett flödesschema (bild 1). Vi utförde apical samband drift på 1-dagars gamla Cx3cr1GFP/+ mus. Som visas i figur 2Aförankrades neonatal Cx3cr1GFP/+ musen på operationsplattformen under stereoskopet efter anestesi. Vi applicerade tryck växelvis på muskistan och buken med hjälp av två tångar, som kan ställas in som ett område för att styra hjärtat som poppar ut ur bröstet. Eventuella extra mekaniska skador på hjärtat som kan påverka hjärtregenerering bör undvikas. Hjärtat immobiliserades av de omgivande bröstvävnaderna, vilket underlättade operationen på hjärtmuskeln. Vi fann att skära av mindre än en 1 mm diameter av den resected apex vävnad av iridectomy sax var lämpligt när den vänstra Ventrikulärt kammaren började sippra. Framgångsrik induktion av apical samband modell är nödvändigt för makrofag transplantation8,9.
Vi sorterade GFP+ makrofager strikt efter ett neonatalt hjärta dissociation protokoll1 (Figur 2).
Neonatal hjärt makrofager injicerades i hjärtinfarkt infarcted vuxna mus hjärtat kort efter isoleringen. För att bekräfta effektiviteten av makrofag transplantation, utförde vi immunofluorescens färgning 7 dagar efter injektionen. Resultaten visade att GFP+ makrofager kunde hittas i vuxna hjärtinfarkt infarcted mus hjärta, vilket indikerar framgångsrik transplantation av neonatal hjärt makrofag. Vi använde co-immunostaining av pH3 α-aktin. Samlokalisering ansågs vara kardiomyocyt spridning. Resultaten visade att antalet proliferativa kardiomyocyter var uppreglerade i den makrofag-injicerade gruppen, vilket indikerar att vuxna kardiomyocyt spridning förmåga förbättrades efter transplantation (Figur 3).
Vuxna mus hjärtat regenerering utvärderades 1 månad efter transplantation. Vi utförde echocardiogram på den vuxna musen och fann att makrofag injektion kan förbättra hjärt funktionen efter hjärtinfarkt. Massons färgning utfördes, och resultaten illustrerade att infarcted området minskade anmärkningsvärt efter neonatal hjärt makrofag transplantation (Figur 3). Alla dessa resultat visat att neonatal hjärt makrofag transplantation främjar vuxna mus hjärtat regenerering och kardiomyocyt spridning.
Bild 1: Schematisk representation av neonatal hjärtmakrofagtransplantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Bilder av makrofagisolering. A) Hjärtana är skuren i små bitar. B) Mushjärtana är dissocierade. C) Fjädringen filtreras och överförs till ett 15 ml centrifugeringsrör. D) Antalet neonatal hjärtmakrofager beräknas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Neonatal hjärtmakrofagtransplantation främjar hjärtregenerering hos vuxna. A) (vänster) Immunofluorescens bilder visar proliferative kardiomyocyter (pil, pH3 grön, α-aktinin röd). (Höger) Statistisk analys visar att kardiomyocyt spridning ökar efter makrofag transplantation. B) (vänster) Ekokardiogram bilder visar hjärtfunktionen i vuxna musen 1 månad efter hjärtinfarkt. (Höger) Statistisk analys visar att hjärtfunktionen förbättras efter makrofagtransplantation. C) Massons färgning visar det infarcted området i vuxna mus 1 månad efter hjärtinfarkt. (Höger) Statistisk analys visar att infarcted område minskas efter Mφ, makrofag transplantation. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Här ger vi ett effektivt tillvägagångssätt för att förbereda, förvärva och transplantera neonatala hjärtmakrofager för att främja vuxna mushjärtaregenerering.
Apical samband är en enkel och effektiv operation för att stimulera hjärtregenerering. Vi har optimerat detaljerna i apical samband för att säkerställa maximal överlevnadsgrad för de djur som är involverade i operationen10. Anestesitiden bör inte vara längre än 3 minuter, vilket leder till hypotermiinducerad död, eller kortare än 2 minuter, vilket skulle orsaka överdriven blödning under operationen. Standard apical samband var tänkt att amputera ca 1,5 mm diameter av apex vävnaden. Syftet med operationen här var dock att stimulera riklig makrofag infiltration under hjärtat regenereringsprocessen. Samband med mindre än 1,5 mm diameter var acceptabelt eftersom det kunde garantera en maximal överlevnadsgrad och effektiv makrofagrekrytering samtidigt. Endast operatörens skicklighet påverkade överlevnadsgraden, och de opererade mössen kunde inte överleva den långvariga driftstiden. Operatören bör slutföra hela proceduren inom 5 minuter.
I vår tidigare studie fann vi att akut inflammation främjade neonatal hjärtregenerering. Intramyocardial microinjection av immunogenic zymosan A partiklar i neonatal mus hjärta kan främja kardiomyocyt spridning6. Nyligen hävdade Molkentin et al. att makrofag infiltration som stimuleras av intracardiac injektion av zymosan A, cell skräp och frysa / tina dödade celler kan främja hjärt reparation, bekräftar att akut inflammation och makrofager är avgörande i hjärt reparation snarare än stamceller differentiering till kardiomyocyter11. Sadek et al.5 rapporterade att makrofager kan främja neonatal hjärtat regenerering via angiogenes. Vår senaste studie visade att neonatal hjärt makrofag injektion kan främja vuxna hjärtat regenerering och öka förmågan hos vuxna kardiomyocyt spridning1,7. Neonatal hjärt makrofag transplantation kan vara en lovande strategi för att främja vuxna mus hjärtat regenerering. Här presenterar vi protokollen för att hjälpa fler forskare om den regenerativa applikationsutvecklingen och utforska hjärtregenereringsmekanismer.
Disclosures
Inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS, 2016-I2M-1-015), Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprojekt (2019YFA0801500), National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81970243, 81770308), Beijing Natural Science Foundation (7172183, 7182140).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
- Li, Y., et al. gp130 Controls Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Circulation. 142 (10), 967-982 (2020).
- Pei, J., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration via ROS Scavenging. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 1412696 (2020).
- Wang, Y., et al. Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics. 10 (20), 9100-9112 (2020).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Han, C., et al. Acute inflammation stimulates a regenerative response in the neonatal mouse heart. Cell Research. 25 (10), 1137-1151 (2015).
- Li, Y., et al. Transplantation of murine neonatal cardiac macrophage improves adult cardiac repair. Cellular & Molecular Immunology. , (2020).
- Yue, Z., et al. PDGFR-β Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Reports. 28 (4), 966-978 (2019).
- Wang, J., et al. A long noncoding RNA NR_045363 controls cardiomyocyte proliferation and cardiac repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 105-114 (2019).
- Li, Y., et al. Achieving stable myocardial regeneration after apical resection in neonatal mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (11), 6500-6504 (2020).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577 (7790), 405-409 (2020).
