Summary
Nous fournissons un protocole pour la séparation et la transplantation de macrophages cardiaques néonatals dans un cœur de souris adulte, ce qui pourrait être un moyen prometteur de promouvoir la réparation cardiaque.
Abstract
Dans un myocarde néonatal blessé, les macrophages facilitent la prolifération des cardiomyocytes et l’angiogenèse et favorisent la régénération cardiaque. La présente étude révèle que la transplantation de macrophages cardiaques néonatals recrutés par blessure favorise la régénération cardiaque adulte après un infarctus du myocarde avec une amélioration de la fonction cardiaque et une prolifération cardiomyocytaire. Les résultats indiquent que la transplantation néonatale de macrophages cardiaques pourrait être une stratégie prometteuse pour le traitement des lésions cardiaques. Ici, nous fournissons les détails techniques, y compris l’isolement des macrophages cardiaques néonatals à partir de cœurs de souris néonatals blessés par résection apicale, la transplantation de macrophages chez des souris adultes infarctus du myocarde et l’estimation de la régénération cardiaque après une greffe de macrophages.
Introduction
La régénération cardiaque est une stratégie prometteuse pour récupérer la fonction cardiaque après une lésion cardiaque et pour se protéger contre l’insuffisance cardiaque1,2,3. Suite à une lésion myocardique, les macrophages s’infiltrent dans le cœur blessé et ont été explorés comme les facteurs clés lors de la régénération cardiaque néonatale4,5,6. En plus d’éliminer les débris cellulaires nécrotiques et d’induire une inflammation, les macrophages favorisent l’angiogenèse5 et la prolifération des cardiomyocytes7 après un infarctus du myocarde chez la souris néonatale.
Notre étude précédente illustre que la transplantation de macrophages cardiaques néonatals isolés du cœur néonatal blessé améliore la régénération cardiaque adulte7,ce qui indique que la transplantation de macrophages cardiaques néonatals pourrait être une stratégie prometteuse pour traiter les lésions cardiaques. Nous fournissons ici les détails techniques, y compris l’isolement des macrophages cardiaques néonatals à partir de cœurs de souris néonatales blessés par résection apicale, la transplantation de macrophages chez des souris adultes infarctus du myocarde et l’estimation de la régénération cardiaque après greffe de macrophages (Figure 1).
Protocol
Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide d’utilisation et de soins des animaux de laboratoire. Tous les protocoles animaliers ont été approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. Une technique aseptique est nécessaire tout au long de la procédure pour prévenir la contamination du site chirurgical.
1. Opération de résection apicale chez une souris néonatale Cx3cr1 GFP/+ de 1 jour (arrière-planC57BL/6)
- Anesthésie
- Sortez tous les chiots de souris des cages et mettez-les dans une boîte propre et sèche.
- Intégrez chaque souris dans la glace pendant environ 2-3 minutes. Assurez-vous qu’il y a une fine barrière comme du latex ou de la gaze entre la glace et le chiot de la souris pour prévenir les engelures.
- Identifiez une anesthésie suffisante en observant les signes suivants: peau pâle, manque de mouvement des membres et manque de réflexe de pédale.
- Thoracotomie
- Prérefroidir la plate-forme de fonctionnement en bronze pendant la nuit à -20 ° C pour aider à maintenir l’anesthésie.
- Sortez la souris anesthésiée de la glacière et placez-la sur une plate-forme d’exploitation en bronze. Ancrez la souris sur la plate-forme d’exploitation en position couchée à l’aide de ruban adhésif médical.
- Placez la plate-forme d’exploitation avec la souris dessus sous un stéréoscope.
- Désinfectez la poitrine de la souris à l’aide d’un tampon de préparation imbibé de bétadine et d’alcool à 70% ou conformément à la politique institutionnelle.
- Inciser la peau avec une coupe de 1 cm à la quatrième zone intercostale de la cavité thoracique, puis séparer les muscles intercostaux à l’aide de ciseaux microchirurgicaux jusqu’à ce que le cœur soit accessible.
- Appuyez alternativement sur la poitrine et l’abdomen à l’aide de deux pinces jusqu’à ce que le cœur soit extériorisé hors de la poitrine sans aucun dommage mécanique.
- Placez les côtes en dessous et au-dessus de la petite incision comme une fixation naturelle pour immobiliser le cœur.
- Résection ventriculaire de l’apex
- Localisez l’apex du ventricule gauche. Couper un tissu ventriculaire de l’apex de 1 mm de diamètre à l’aide de ciseaux d’iridectomye sous un stéréoscope.
- Confirmez que la chambre ventriculaire gauche est exposée et commencez à suinter.
- Appuyez doucement le cœur vers la cavité thoracique à l’aide d’un coton-tige.
- Suturez les muscles, les côtes et la peau en utilisant 8-0 Sutures de prolène.
- Nettoyez soigneusement la souris après l’opération.
- Soins post-opération
- Transférez la souris de la plate-forme d’exploitation à une couverture chauffante à 37 °C pour réchauffer le corps immédiatement après l’opération.
- Confirmez l’anabiose de la souris en observant les signes suivants: restauration spontanée de la respiration, changement de couleur de la peau de pâle à rose et mouvement des membres.
- Ramenez la souris opérée à sa mère une fois qu’elle a récupéré.
- Mélangez la souris opérée avec le matériel de nidification de sa mère si nécessaire.
REMARQUE: Il est important de retirer tous les chiots de 1 jour de la mère à la fois, puis de les retourner tous en même temps après que tous les chiots sont récupérés.
2. Préparation de la suspension de macrophages cardiaques néonatals
REMARQUE: Toutes ces procédures expérimentales doivent être effectuées dans un endroit sombre et dans des conditions stériles.
- Récoltez le cœur d’une souris néonatale Cx3cr1GFP/+ 1 jour après la résection apicale
- Euthanasier la souris Cx3cr1GFP/+ un jour après la résection apicale. Utilisez un excès de dioxyde de carbone et décapitez la souris séquentiellement pour appliquer l’euthanasie.
- Sortez le cœur de la poitrine et plongez-le dans un plat de 10 cm avec du PBS.
- Coupez les vaisseaux et le tissu conjonctif restant loin des ventricules. Coupez l’appendice auriculaire et le tractus d’écoulement loin du cœur.
- Une fois que le cœur cesse de battre, coupez le cœur en 1-2 mm3 morceaux dans un tampon PBS à l’aide de ciseaux microchirurgicaux (Figure 2A).
- Dissociation néonatale du cœur de souris
- Transférer le tissu cardiaque récolté dans un tube contenant 2,5 mL de mélange d’enzymes préchauffé(Table des matériaux)et fermer hermétiquement le tube.
- Inversez le tube et placez-le avec le capuchon vers le bas (Figure 2B).
- Exécutez le programme de dissociation cardiaque néonatale (Table des matériaux).
- Détachez le tube du dissociateur une fois le programme terminé.
- Ajouter 7,5 mL de 1x DMEM avec 10% fbS au tube.
- Filtrer et transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 mL(Figure 2C). Centrifuger la suspension de la cellule à 300 x g pendant 5 minutes.
- Resuspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de solution de lyse des cellules sanguines et incubez pendant 2 minutes à température ambiante.
- Ajouter 5 à 10 mL de tampon PBS à la suspension et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
- Resuspendez la pastille de cellule dans 1 mL de DMEM avec 10% de FBS.
- Isolement des macrophages cardiaques néonatals
- Trier GFP+ macrophages cardiaques néonatals par FACS. Recevez les macrophages triés dans un tube stérile contenant 500 μL de DMEM avec 10% de FBS.
- Comptez les macrophages GFP+ (Figure 2D). Resuspendez le macrophage dans le DMEM avec 10% de FBS à la concentration de 1 x 106 macrophages pour 200 μL de DMEM pour une injection ultérieure.
REMARQUE: Le nombre de macrophages GFP+ est faible chez un nouveau-né (environ 1 x 105); par conséquent, au moins 10 nouveau-nés doivent être utilisés pour obtenir suffisamment de macrophages pour chaque injection de souris adulte.
3. Transplantation néonatale de macrophages cardiaques
- Effectuer une opération d’infarctus du myocarde sur une souris C57BL/6 mâle adulte (6-8 semaines) par ligature de l’artère coronaire antérieure gauche8.
- Placez la souris opérée sur une couverture chauffante à 37 °C jusqu’à ce qu’elle se rétablisse.
- Injecter par voie intraveineuse 200 μL de DMEM avec 1 x 106 GFP+ macrophages cardiaques néonatals à la souris adulte infarctus après l’opération (environ 6 heures plus tard) via la veine caudale.
- Renvoyez la souris dans une cage propre.
4. Évaluation des résultats
- Validation de l’efficacité d’injection
- Anesthésier la souris opérée et prélever le cœur 7 jours après l’opération d’infarctus du myocarde.
- Plongez le cœur dans le tampon PBS pré-refroidi.
- Fixez le tissu cardiaque avec 4% de polyformaldéhyde pendant 72 heures à température ambiante en secouant.
- Déshydrater le tissu cardiaque en diméthylbenzène et en éthanol.
- Incorporer le tissu cardiaque dans de la paraffine et le découper en sections d’une épaisseur de 5 μm.
- Effectuer le protocole standard de coloration par immunofluorescence1. Utilisez α-actinine pour marquer les cardiomyocytes.
- Détecter les macrophages GFP+ dans le cœur recevant la transplantation.
- Effectuer le protocole standard de coloration par immunofluorescence1. Utiliser α-actinine et pH3 pour marquer respectivement les cardiomyocytes et la prolifération cellulaire(Figure 3A).
- Évaluation de la réparation cardiaque après la transplantation
- Utilisez l’échocardiographie sur la souris opérée un mois après l’opération1.
- Analyser la fonction cardiaque en comparant la fraction d’éjection ventriculaire gauche et le raccourcissement fractionnaire dans différents groupes (Figure 3B).
- Anesthésiez la souris opérée et récoltez le cœur.
- Répétez les étapes 4.1.2 à 4.1.5.
- Effectuez un protocole de coloration de Masson.
- Analyser la zone infarctus après injection de macrophages (Figure 3C).
Representative Results
Le protocole décrit ici est résumé dans un organigramme (Figure 1). Nous avons effectué une opération de résection apicale sur une souris Cx3cr1GFP/+ âgée de 1 jour. Comme le montre la figure 2A,la souris néonatale Cx3cr1GFP/+ a été ancrée sur la plate-forme opératoire sous le stéréoscope après anesthésie. Nous avons appliqué une pression alternative sur la poitrine et l’abdomen de la souris à l’aide de deux pinces, qui peuvent être mises en place comme un tractus pour guider le cœur sortant de la poitrine. Tout dommage mécanique supplémentaire au cœur qui peut affecter la régénération cardiaque doit être évité. Le cœur a été immobilisé par les tissus thoraciques environnants, ce qui a facilité l’opération sur le myocarde. Nous avons constaté que couper moins de 1 mm de diamètre du tissu apex réséqué par des ciseaux d’iridectomie était approprié lorsque la chambre ventriculaire gauche commençait à suinter. L’induction réussie du modèle de résection apicale est nécessaire pour la transplantation de macrophages8,9.
Nous avons trié les macrophages GFP+ strictement en suivant un protocole de dissociation cardiaque néonatale1 (Figure 2).
Des macrophages cardiaques néonatals ont été injectés dans le cœur de souris adulte infarctus du myocarde peu de temps après l’isolement. Afin de confirmer l’efficacité de la transplantation de macrophages, nous avons effectué une coloration par immunofluorescence 7 jours après l’injection. Les résultats ont montré que des macrophages GFP+ pouvaient être trouvés dans le cœur de souris myocardique infarctus adulte, indiquant la transplantation réussie de macrophages cardiaques néonatals. Nous avons utilisé la co-immunocoloration du pH3 avec la α-actinine. La colocalisation a été considérée comme une prolifération cardiomyocytaire. Les résultats ont montré que le nombre de cardiomyocytes prolifératifs était régulé à la hausse dans le groupe injecté de macrophages, ce qui indique que la capacité de prolifération des cardiomyocytes adultes a été améliorée après la transplantation (Figure 3).
La régénération cardiaque de la souris adulte a été évaluée 1 mois après la transplantation. Nous avons effectué un échocardiogramme sur la souris adulte et avons constaté que l’injection de macrophages pouvait améliorer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde. La coloration de Masson a été effectuée, et les résultats ont montré que la zone infarctus a été remarquablement réduite après la transplantation de macrophages cardiaques néonatals (Figure 3). Tous ces résultats ont démontré que la transplantation de macrophages cardiaques néonatals favorise la régénération cardiaque de la souris adulte et la prolifération des cardiomyocytes.
Figure 1: Représentation schématique de la transplantation néonatale de macrophages cardiaques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Images de l’isolement des macrophages. R)Les cœurs sont coupés en petits morceaux. B)Les cœurs de souris sont dissociés. C)La suspension est filtrée et transférée dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. D) Le nombre de macrophages cardiaques néonatals est calculé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: La transplantation de macrophages cardiaques néonatals favorise la régénération cardiaque adulte. A) (à gauche) Les images d’immunofluorescence montrent les cardiomyocytes prolifératifs (flèche, pH3 vert, rouge α-actinine). (À droite) L’analyse statistique montre que la prolifération des cardiomyocytes augmente après la transplantation de macrophages. B) (à gauche) Les images d’échocardiogramme montrent la fonction cardiaque chez la souris adulte 1 mois après l’infarctus du myocarde. (À droite) L’analyse statistique montre que la fonction cardiaque est améliorée après une transplantation de macrophages. C)La coloration de Masson montre la zone infarctus chez la souris adulte 1 mois après l’infarctus du myocarde. (À droite) L’analyse statistique montre que la zone infarctuse est réduite après Mφ, transplantation de macrophages. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ici, nous fournissons une approche efficace pour préparer, acquérir et transplanter des macrophages cardiaques néonatals afin de favoriser la régénération cardiaque de la souris adulte.
La résection apicale est une opération simple et efficace pour stimuler la régénération cardiaque. Nous avons optimisé les détails de la résection apicale pour assurer le taux de survie maximal des animaux impliqués dans l’opération10. Le temps d’anesthésie ne doit pas dépasser 3 minutes, ce qui entraîne la mort induite par l’hypothermie, ou moins de 2 minutes, ce qui provoquerait des saignements excessifs pendant l’opération. La résection apicale standard était censée amputer environ 1,5 mm de diamètre du tissu apex. Cependant, le but de l’opération ici était de stimuler une infiltration abondante de macrophages pendant le processus de régénération cardiaque. La résection de moins de 1,5 mm de diamètre était acceptable car elle pouvait garantir un taux de survie maximal et un recrutement efficace de macrophages en même temps. Seule l’habileté de l’opérateur a influencé le taux de survie et les souris opérées n’ont pas pu survivre à la durée prolongée de l’opération. L’opérateur doit terminer toute la procédure dans les 5 minutes.
Dans notre étude antérieure, nous avons constaté que l’inflammation aiguë favorisait la régénération cardiaque néonatale. La microinjection intramyocardique de particules immunogènes de zymosan A dans le cœur néonatal de souris pourrait favoriser la prolifération des cardiomyocytes6. Récemment, Molkentin et al. ont affirmé que l’infiltration de macrophages qui est stimulée par l’injection intracardiaque de zymosan A, de débris cellulaires et de cellules tuées par le gel / dégel peut favoriser la réparation cardiaque, confirmant que l’inflammation aiguë et les macrophages sont essentiels à la réparation cardiaque plutôt que les cellules souches se différenciant en cardiomyocytes11. Sadek et al.5 ont rapporté que les macrophages pourraient favoriser la régénération cardiaque néonatale via l’angiogenèse. Notre étude récente a révélé que l’injection néonatale de macrophages cardiaques pourrait favoriser la régénération cardiaque adulte et augmenter la capacité de prolifération des cardiomyocytes adultes1,7. La transplantation de macrophages cardiaques néonatals pourrait être une stratégie prometteuse pour favoriser la régénération cardiaque de souris adultes. Nous présentons ici les protocoles pour aider plus de chercheurs sur le développement d’applications régénératives et explorer les mécanismes de régénération cardiaque.
Disclosures
Pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Fonds d’innovation en sciences médicales de l’Académie chinoise des sciences médicales (CIFMS, 2016-I2M-1-015), le National Key Research and Development Project of China (2019YFA0801500), la National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81970243, 81770308), Beijing Natural Science Foundation (7172183, 7182140).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
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