Summary
Proporcionamos un protocolo para la separación y el trasplante de macrófagos cardíacos neonatales en un corazón de ratón adulto, que podría ser una forma prometedora de promover la reparación cardíaca.
Abstract
En un miocardio neonatal lesionado, los macrófagos facilitan la proliferación de cardiomiocitos y la angiogénesis y promueven la regeneración cardíaca. El presente estudio revela que el trasplante de macrófagos cardíacos neonatales reclutados por lesión promueve la regeneración cardíaca adulta después del infarto de miocardio con mejora de la función cardíaca y proliferación de cardiomiocitos. Los resultados indican que el trasplante neonatal de macrófagos cardíacos podría ser una estrategia prometedora para el tratamiento de lesiones cardíacas. Aquí, proporcionamos los detalles técnicos, incluido el aislamiento de macrófagos cardíacos neonatales de corazones de ratones neonatales lesionados por resección apical, el trasplante de macrófagos en ratones adultos con infarto de miocardio y la estimación de la regeneración cardíaca después de un injerto de macrófagos.
Introduction
La regeneración cardíaca es una estrategia prometedora para recuperar la función cardíaca después de una lesión cardíaca y para proteger contra la insuficiencia cardíaca1,2,3. Después de la lesión miocárdica, los macrófagos se infiltran en el corazón lesionado y se han explorado como los factores clave durante la regeneración cardíaca neonatal4,5,6. Además de eliminar los desechos celulares necróticos e inducir la inflamación, los macrófagos promueven la angiogénesis5 y la proliferación de cardiomiocitos7 después del infarto de miocardio neonatal en ratones.
Nuestro estudio anterior ilustra que el trasplante de macrófagos cardíacos neonatales aislados del corazón neonatal lesionado mejora la regeneración cardíaca adulta7,lo que indica que el trasplante de macrófagos cardíacos neonatales podría ser una estrategia prometedora para tratar la lesión cardíaca. Aquí proporcionamos los detalles técnicos, incluido el aislamiento de macrófagos cardíacos neonatales de corazones de ratón neonatales lesionados por resección apical, el trasplante de macrófagos en ratones adultos con infarto de miocardio y la estimación de la regeneración cardíaca después del injerto de macrófagos(Figura 1).
Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), El Hospital Fuwai, la Academia China de Ciencias Médicas. Se requiere una técnica aséptica durante todo el procedimiento para evitar la contaminación del sitio quirúrgico.
1. Operación de resección apical en ratón Cx3cr1 GFP/+ neonatal de 1 día de edad (fondoC57BL/6)
- Anestesia
- Saque a todos los cachorros de ratón de las jaulas y póngalos en una caja limpia y seca.
- Inserte cada ratón en el hielo durante unos 2-3 minutos. Asegúrese de que haya una barrera delgada como látex o gasa entre el hielo y el cachorro de ratón para evitar la congelación.
- Identifique suficiente anestesia observando los siguientes signos: piel pálida, falta de movimiento de las extremidades y falta de reflejo del pedaleo.
- Toracotomía
- Preenfriar la plataforma de operación de bronce durante la noche a -20 ° C para ayudar a mantener la anestesia.
- Saque el ratón anestesiado de la caja de hielo y colóelo en una plataforma operativa de bronce. Anclar el ratón en la plataforma operativa en posición supina con cinta adhesiva médica.
- Coloque la plataforma operativa con el mouse debajo de un estereoscopio.
- Desinfecte el pecho del ratón con una almohadilla de preparación empapada con betadina y alcohol al 70% o según sea consistente con la política institucional.
- Incise la piel con un corte de 1 cm en la cuarta área intercostal de la cavidad torácica y luego separe los músculos intercostales usando tijeras microquirúrgicas hasta acceder al corazón.
- Presione alternativamente el pecho y el abdomen con la ayuda de dos forrceps hasta que el corazón se exteriorice fuera del pecho sin ningún daño mecánico.
- Coloca las costillas por debajo y por encima de la pequeña incisión como una fijación natural para inmovilizar el corazón.
- Resección del ápice ventricular
- Localice el ápice del ventrículo izquierdo. Cortar un diámetro de 1 mm de tejido del ápice ventricular usando tijeras de iridectomía debajo de un estereoscopio.
- Confirme que la cámara ventricular izquierda está expuesta y comience a supurar.
- Presione suavemente el corazón hacia atrás a la cavidad torácica con un hisopo de algodón.
- Sutura los músculos, las costillas y la piel con 8-0 Suturas de proleno.
- Limpie el mouse a fondo después de la operación.
- Cuidados post-operación
- Transfiera el ratón de la plataforma de operación a una manta calefactora de 37 °C para calentar el cuerpo inmediatamente después de la operación.
- Confirme la anabiosis del ratón observando los siguientes signos: restauración espontánea de la respiración, cambio de color de la piel de pálido a rosa y movimiento de las extremidades.
- Lleve el ratón operado de vuelta a su madre una vez que se haya recuperado.
- Mezcle el ratón operado con los materiales de anidación de su madre si es necesario.
NOTA: Es importante quitar todos los cachorros de 1 día de edad de la madre a la vez y luego devolverlos todos a la vez después de que todos los cachorros se recuperen.
2. Preparación de la suspensión de macrófagos cardíacos neonatales
NOTA: Todos estos procedimientos experimentales deben llevarse a cabo en un lugar oscuro y en condiciones estériles.
- Cosechar el corazón de un ratón cx3cr1GFP/+ neonatal 1 día después de la resección apical
- Sacrificar el ratón Cx3cr1GFP/+ un día después de la resección apical. Use un exceso de dióxido de carbono y decapite al ratón secuencialmente para aplicar la eutanasia.
- Saca el corazón del pecho y sumérgelo en un plato de 10 cm con PBS.
- Corte los vasos y el tejido conectivo restante lejos de los ventrículos. Cortar el apéndice auricular y el tracto de salida lejos del corazón.
- Después de que el corazón deje de latir, corte el corazón en1-2 mm 3 piezas en tampón PBS usando tijeras microquirúrgicas(Figura 2A).
- Disociación cardíaca neonatal del ratón
- Transfiera el tejido cardíaco cosechado a un tubo que contenga 2,5 ml de mezcla de enzimas precalentadas(Tabla de materiales)y cierre herméticamente el tubo.
- Invierta el tubo y colóquelo con la tapa hacia abajo (Figura 2B).
- Ejecutar el programa de disociación cardíaca neonatal(Tabla de Materiales).
- Separe el tubo del disociador después de que se complete el programa.
- Agregue 7.5 ml de 1x DMEM con 10% fbS al tubo.
- Filtre y transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 15 ml(Figura 2C). Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspend el pellet celular en 1 ml de solución de lisis de células sanguíneas e incube durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Agregue 5-10 ml de tampón PBS a la suspensión y centrífuga a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspend el pellet celular en 1 mL de DMEM con 10% fbs.
- Aislamiento de macrófagos cardíacos neonatales
- Clasificación GFP+ macrófagos cardíacos neonatales por FACS. Recibir los macrófagos clasificados en un tubo estéril que contenga 500 μL de DMEM con 10% de FBS.
- Contar la GFP+ macrófagos (Figura 2D). Resuspend el macrófago en DMEM con 10% fbS a la concentración de 1 x 106 macrófagos por 200 μL de DMEM para su posterior inyección.
NOTA: El número de GFP+ macrófagos es pequeño en un neonato (aproximadamente 1 x 105); por lo tanto, se deben usar al menos 10 neonatos para obtener suficientes macrófagos para cada inyección de ratón adulto.
3. Trasplante de macrófagos cardíacos neonatales
- Realizar una operación de infarto de miocardio en un ratón C57BL/6 macho adulto (6-8 semanas de edad) mediante ligadura de la arteria coronaria anterior izquierda8.
- Coloque el ratón operado sobre una manta calentada a 37 °C hasta que se recupere.
- Inyecte por vía intravenosa 200 μL de DMEM con 1 x 106 GFP+ macrófagos cardíacos neonatales en el ratón adulto infarto después de la operación (aproximadamente 6 horas después) a través de la vena de la cola.
- Envíe el ratón de vuelta a una jaula limpia.
4. Evaluación de resultados
- Validación de la eficiencia de inyección
- Anestesiar al ratón operado y cosechar el corazón 7 días después de la operación de infarto de miocardio.
- Sumerja el corazón en el búfer PBS preenfriado.
- Fije el tejido cardíaco con poliformaldehído al 4% durante 72 horas a temperatura ambiente con agitación.
- Deshidratar el tejido cardíaco en dimetilbenceno y etanol.
- Incruste el tejido cardíaco en parafina y córnelo en secciones con un grosor de 5 μm.
- Realizar el protocolo estándar de tinción por inmunofluorescencia1. Use α-actinina para marcar los cardiomiocitos.
- Detectar la GFP+ macrófagos en el corazón que recibe el trasplante.
- Realizar el protocolo estándar de tinción por inmunofluorescencia1. Utilizar α-actinina y pH3 para marcar cardiomiocitos y proliferación celular, respectivamente (Figura 3A).
- Evaluación de la reparación cardíaca después del trasplante
- Utilizar la ecocardiografía en el ratón operado un mes después de la operación1.
- Analizar la función cardíaca comparando la fracción de eyección del ventrículo izquierdo y el acortamiento fraccional en diferentes grupos (Figura 3B).
- Anestesiar al ratón operado y cosechar el corazón.
- Repita los pasos 4.1.2-4.1.5.
- Realizar un protocolo de tinción de Masson.
- Analizar el área infartable después de la inyección de macrófagos(Figura 3C).
Representative Results
El protocolo descrito aquí se resume en un diagrama de flujo (Figura 1). Se realizó una operación de resección apical en un ratón Cx3cr1GFP/+ de 1 día de antigüedad. Como se muestra en la Figura 2A,el ratón cx3cr1GFP/+ neonatal se ancló en la plataforma operativa bajo el estereoscopio después de la anestesia. Aplicamos presión alternativamente sobre el pecho y el abdomen del ratón con la ayuda de dos bórceps, que se pueden configurar como un tracto para guiar el corazón que sale del pecho. Se debe evitar cualquier daño mecánico adicional al corazón que pueda afectar la regeneración del corazón. El corazón fue inmovilizado por los tejidos torácicos circundantes, lo que facilitó la operación en el miocardio. Encontramos que cortar menos de 1 mm de diámetro del tejido del ápice resecada mediante tijeras de iridectomía fue apropiado cuando la cámara ventricular izquierda comenzó a supurar. La inducción exitosa del modelo de resección apical es necesaria para el trasplante de macrófagos8,9.
Clasificamos la GFP+ macrófagos siguiendo estrictamente un protocolo de disociación cardíaca neonatal1 (Figura 2).
Los macrófagos cardíacos neonatales se inyectaron en el corazón de ratón adulto infarto de miocardio poco después del aislamiento. Para confirmar la eficacia del trasplante de macrófagos, se realizó la tinción por inmunofluorescencia a los 7 días de la inyección. Los resultados mostraron que GFP+ macrófagos se podían encontrar en el corazón de ratón infarto de miocardio adulto, lo que indica el trasplante exitoso de macrófagos cardíacos neonatales. Empleamos la coinmunotinción de pH3 con α-actinina. La colocalización se consideró una proliferación de cardiomiocitos. Los resultados ilustraron que el número de cardiomiocitos proliferativos fue regulado al alza en el grupo inyectado con macrófagos, lo que indica que la capacidad de proliferación de cardiomiocitos adultos mejoró después del trasplante (Figura 3).
La regeneración cardíaca del ratón adulto se evaluó 1 mes después del trasplante. Realizamos un ecocardiograma en el ratón adulto y encontramos que la inyección de macrófagos podría mejorar la función cardíaca después del infarto de miocardio. Se realizó la tinción de Masson, y los resultados ilustraron que el área infartada se redujo notablemente después del trasplante de macrófagos cardíacos neonatales (Figura 3). Todos estos resultados demostraron que el trasplante neonatal de macrófagos cardíacos promueve la regeneración cardíaca del ratón adulto y la proliferación de cardiomiocitos.
Figura 1: Representación esquemática del trasplante de macrófagos cardíacos neonatales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de aislamiento de macrófagos. A)Los corazones se cortan en pedazos pequeños. B)Los corazones de ratón están disociados. C)La suspensión se filtra y se transfiere a un tubo centrífugo de 15 ml. D)Se calcula el número de macrófagos cardíacos neonatales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El trasplante neonatal de macrófagos cardíacos promueve la regeneración cardíaca en adultos. A)(Izquierda) Las imágenes de inmunofluorescencia muestran los cardiomiocitos proliferativos (flecha, verde pH3, rojo α-actinina). (Derecha) El análisis estadístico muestra que la proliferación de cardiomiocitos aumenta después del trasplante de macrófagos. B)(Izquierda) Las imágenes del ecocardiograma muestran la función cardíaca en ratones adultos 1 mes después del infarto de miocardio. (Derecha) El análisis estadístico muestra que la función cardíaca se mejora después del trasplante de macrófagos. C)La tinción de Masson muestra el área infarta en ratones adultos 1 mes después del infarto de miocardio. (Derecha) El análisis estadístico muestra que el área infartable se reduce después de Mφ, trasplante de macrófagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aquí, proporcionamos un enfoque efectivo para preparar, adquirir y trasplantar macrófagos cardíacos neonatales para promover la regeneración cardíaca del ratón adulto.
La resección apical es una operación simple y efectiva para estimular la regeneración del corazón. Hemos optimizado los detalles de la resección apical para asegurar la máxima tasa de supervivencia de los animales implicados en la operación10. El tiempo de anestesia no debe ser superior a 3 minutos, que conducen a la muerte inducida por hipotermia, o inferior a 2 minutos, lo que causaría un sangrado excesivo durante la operación. Se suponía que la resección apical estándar amputaba aproximadamente 1,5 mm de diámetro del tejido del ápice. Sin embargo, el propósito de la operación aquí era estimular la infiltración abundante de macrófagos durante el proceso de regeneración cardíaca. La resección de menos de 1,5 mm de diámetro fue aceptable, ya que podía garantizar una tasa de supervivencia máxima y un reclutamiento efectivo de macrófagos al mismo tiempo. Solo la habilidad del operador influyó en la tasa de supervivencia, y los ratones operados no pudieron sobrevivir a la prolongada duración de la operación. El operador debe completar todo el procedimiento en 5 minutos.
En nuestro estudio anterior, encontramos que la inflamación aguda promovió la regeneración cardíaca neonatal. La microinyección intramiocárdica de partículas inmunogénicas de zymosan A en el corazón neonatal del ratón podría promover la proliferación de cardiomiocitos6. Recientemente, Molkentin et al. afirmaron que la infiltración de macrófagos que es estimulada por la inyección intracardíaca de zymosan A, los desechos celulares y las células muertas por congelación / descongelación pueden promover la reparación cardíaca, confirmando que la inflamación aguda y los macrófagos son esenciales en la reparación cardíaca en lugar de que las células madre se diferencien en cardiomiocitos11. Sadek et al.5 informaron que los macrófagos podrían promover la regeneración cardíaca neonatal a través de la angiogénesis. Nuestro estudio reciente reveló que la inyección neonatal de macrófagos cardíacos podría promover la regeneración cardíaca adulta y aumentar la capacidad de proliferación de cardiomiocitos enadultos 1,7. El trasplante neonatal de macrófagos cardíacos podría ser una estrategia prometedora para promover la regeneración cardíaca del ratón adulto. Aquí presentamos los protocolos para ayudar a más investigadores en el desarrollo de aplicaciones regenerativas y explorar los mecanismos de regeneración cardíaca.
Disclosures
Sin conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Innovación para Ciencias Médicas de la Academia China de Ciencias Médicas (CIFMS, 2016-I2M-1-015), el Proyecto Nacional clave de Investigación y Desarrollo de China (2019YFA0801500), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC: 81970243, 81770308), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7172183, 7182140).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
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