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Biochemistry

एस्चेरिचिया कोलाई में जेनेटिक कोड विस्तार का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पुनर्गठन के लिए हिस्टोन्स की साइट विशिष्ट लाइसिन एसिटिलेशन

Published: December 26, 2020 doi: 10.3791/62113
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Texas A&M University

Summary

यहां हम आनुवंशिक कोड विस्तार का उपयोग करके एसिटिलेटेड हिस्टोन प्रोटीन को व्यक्त करने और विट्रो में पुनर्गठित न्यूक्लियोसोम को इकट्ठा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एसेरिचिया कोलाई में एक उत्परिवर्ती को एन्कोडिंग करने में एसीटायलेटेड हाइस्टोन प्रोटीन आसानी से व्यक्त किया जा सकता है, एनε-एसिटिल-लाइसिन (एक्क) - विशिष्ट मेथानोसिरिना माज़ी पाइरोलिन टर्ना-सिंथेटास (MmAcKRS1) और इसके कॉग्नेट टीआरएनए (टीआरएनएपिल)साइट विशिष्ट एसिटाइलेटेड हिस्टोन के साथ पुनर्गठित मोनोन्यूसोम को इकट्ठा करने के लिए। MmAcKRS1 और tRNAPyl एस्चेरिचिया कोलाईमें अनुवाद के दौरान पसंद के एमएनए में एक एंबर उत्परिवर्तन साइट पर AcK उद्धार । इस तकनीक का बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है H3 lysine साइटों पर AcK शामिल करने के लिए । साइट विशिष्ट प्रोटीन संशोधन या कार्यात्मकता के लिए अन्य गैर-कैनॉनिकल अमीनो एसिड (एनसीएए) को शामिल करने के लिए पाइरोलिसिल-टीआरएनए संश्लेषण (पीएलआर) को भी आसानी से विकसित किया जा सकता है। यहां हम एक विधि का विस्तार करते हैं जो MmAcKRS1 प्रणाली का उपयोग करते हुए हिस्टोन एच 3 में शामिल किया गया है और एसिटिलेटेड एच 3 प्रोटीन को पुनर्गठित मोनोन्यूक्लियोसोम्स में एकीकृत करता है। जैव रासायनिक और बाध्यकारी परख, संरचना निर्धारण, और अधिक में एसीस्टाइलेटेड पुनर्गठित मोनोन्यूकोसोम का उपयोग किया जा सकता है। नई बातचीत की खोज और एपिजेनेटिक्स को समझने से संबंधित प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए संशोधित मोनोन्यूक्लियोसोम प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।

Introduction

हमने साइट विशिष्ट एसिटिलेटेड हिस्टटोन के साथ पुनर्गठित मोनोन्यूकोसोम को संश्लेषित करने और इकट्ठा करने के लिएपिलआरएस और ट्रान पीआईएल का उपयोग किया है। PylRS एक आनुवंशिक कोड विस्तार उपकरण के रूप में अमूल्य साबित कर दिया है पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों (PTMs) के साथ प्रोटीन का उत्पादन और आनुवंशिक रूप से २०० विभिंन ncAAs के बारे में शामिल करने के लिए विकसित किया गया है । PylRS अनुवाद के दौरान अन्य अमीनो एसिड से प्रतिस्पर्धा को हटाने, एक एंबर स्टॉप कोडन में शामिल किया गया है। पिलआरएस को पहली बार मेथानोजेनिक आर्किया में खोजा गया था, और तब से रासायनिक जीव विज्ञान में उपयोग किया गया है ताकि उपन्यास प्रतिक्रियाशील रासायनिक समूहों को प्रोटीन1,2में शामिल किया जा सके।

एमएमएकक्रस 1 को मेथानोसेसिना माज़ी पिलआरएस से विकसित किया गया था और अक्सर हमारी प्रयोगशाला में एसिटिलेटेड प्रोटीन के संश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता था3,4,5,6. MmAcKRS1 एस्चेरिचिया कोलाईमें अनुवाद के दौरान पसंद के एमएनए में एक एंबर उत्परिवर्तन स्थल पर एक्यूसी बचाता है। इस तकनीक का उपयोग पहले के4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, और K79 हिस्टोन H3 lysine साइटों पर AcK को शामिल करने के लिए किया गया है सिरतुइन 1, 2, 6, और 7 की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एसीटीके पर एसीके को शामिल करने के लिए एसीटी4,5,6। यहां हम इस विधि का विस्तार करते हैं ताकि एसिटिलेटेड हिस्टटोन को व्यक्त किया जा सके और एसिटिलेटेड न्यूक्लियोसोम्स का पुनर्गठन किया जा सके।

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Protocol

1. प्लाज्मिड निर्माण

  1. यह तय करके शुरू करें कि कौन सा हिस्टोन प्रोटीन एसिटिलेटेड होगा और किस lysine साइट पर। साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस का उपयोग करके साइट को एंबर स्टॉप कोडन (टैग) में म्यूटेट करें।
    नोट: हिस्टोन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए पहले से डिजाइन किए गए चार प्लाज्मिड हैं। सभी चार हिस्टोन प्रोटीन को एन-टर्मिनल हिस्टिडीन टैग के साथ pETDuet-1 वेक्टर में क्लोन किया गया था । हिस्टोन एच 4 में एक सूमो टैग भी शामिल है, प्रतिकृति कोलई1 की उत्पत्ति लगभग 40, एम्पिसिलिन प्रतिरोधी और T7 प्रमोटर की एक प्रति संख्या के साथ।
    1. डिजाइन फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर जिसमें वांछित साइट पर एक टैग उत्परिवर्तन होता है (एम्बर स्टॉप कोडन के साथ मौजूदा lysine codon की जगह) चार हिस्टोन प्रोटीन प्लाज्मिड्स में से एक में।
    2. प्लाज्मिड युक्त टैग को बढ़ाने के लिए पूरे प्लाज्मिड पीसीआर का उपयोग करें। प्राइमर के लिए एक उपयुक्त एनीलिंग तापमान निर्धारित करें। सामान्य तौर पर प्राइमर माइनस 5 डिग्री सेल्सियस का पिघलने का तापमान (टीएम)पर्याप्त होगा। यदि पीसीआर उत्पाद प्राप्त करने में कठिनाई का अनुभव किया जाता है, तो टीएम - 5 डिग्री सेल्सियस के आसपास तापमान ढाल का उपयोग प्रवर्धन के लिए एनीलिंग तापमान को अनुकूलित करने के लिए किया जा सकता है।
      नोट: इस प्रयोग में निम्नलिखित शर्तों के साथ 30 चक्रों के लिए एक इन-हाउस व्यक्त PFU पॉलीमरेज का उपयोग किया गया था: 30 एस (डेनैचेशन) के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए एनीलिंग तापमान, और 6 मिनट (या 1 मिनट प्रति किलोबेस-जोड़े) के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। इस प्रकार की पीसीआर विधि के बारे में अधिक जानकारी के लिए लियू और नायमिथ7देखें ।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके पीसीआर साफ किट के साथ पीसीआर उत्पाद को साफ करें। एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और बाद में एथिडियम ब्रोमाइड धुंधला द्वारा पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण करें।
    4. 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर T4 ligase के साथ इनक्यूबेटिंग द्वारा प्लाज्मिड लिगेट।
  2. सबसे पहले प्लाज्मिड (AmpR)वाले टैग को रासायनिक रूप से सक्षम एस्चेरिचिया कोलाईमें बदलें . परिवर्तन से कम से कम 4 कॉलोनियों को चुनें और प्लाज्मिड को शुद्ध करें। मानक विधियों का उपयोग करके ग्लाइसरोल के साथ प्रत्येक का सेल स्टॉक बनाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वांछित टैग उत्परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए अनुक्रमण के लिए भेजें।
  3. एक बार अनुक्रम की पुष्टि हो जाने के बाद, टैग युक्त प्लाज्मिड (Ampआर)को पीईओएलओवी-एकेआरएस (सीएचएलआर)के साथ रासायनिक रूप से सक्षम कोब्ब (ई. कोलाईमें जाना जाने वाला एकमात्र हिस्टोन lysine deacetylase)) हीट शॉक विधि का उपयोग करके BL21 कोशिकाओं को हटाने में सह-रूपांतरित करें। pEVOL कम कॉपी-नंबर p15A मूल के लिए एक मध्य कॉपी-नंबर के साथ एक प्लाज्मिड है।
    नोट: प्लाज्मिड्स की pEVOL श्रृंखला पिछले अध्ययनों के आधार पर बनाई गई थी जिसमें ऑर्थोगोनल एएआरएस/टीआरएनएटायर जोड़ी की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति प्रोटीन ट्रंकेशन को कम करने और उत्परिवर्ती प्रोटीन8की समग्र पैदावार बढ़ाने में प्रभावी थी । यदि कोब हटाने कोशिकाओं सुलभ नहीं हैं, रासायनिक सक्षम BL21 कोशिकाओं के साथ आगे बढ़ें । कोब एक सिरतुइन की तरह हिस्टोन लिसाइन डेसिटाइल्स है और निकोटिनामाइड को एक वैकल्पिक दृष्टिकोण 9 के रूप में सिल को बाधित करने के लिए हिस्टोन प्रोटीन अभिव्यक्ति के दौरान5एमएम अंतिम एकाग्रता में जोड़ा जा सकता है।
  4. एक सेल स्टॉक बनाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एसीटाइलेटेड हिस्टोन प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. संस्कृति फ्लास्क में ऑटोक्लेवेड 2YT मीडिया (या पसंद की मात्रा) के 1 एल तैयार करें।
  2. सह-रूपांतरित सेल स्टॉक के साथ उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं वाले 2YT मीडिया के 20 एमएल को टीका लगाते हैं जिसमें टैग युक्त प्लाज्मिड (AmpR)और पीईओवीएल-एकेआरएस (सीएचएलआर)होते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस से ओडी = 0.6 (4-6 एच) तक बढ़ते हैं।
  3. ऑटोक्लेवेड 2YT मीडिया के 1 एल में उपयुक्त एंटीबायोटिक्स जोड़ें और 20 एमएल स्टार्टर संस्कृति के साथ टीका लगाएं। ओडी = 0.6-0.8 (2-3 घंटे) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें।
  4. आईपीटीजी 1 MM, 0.2% अरबिनोज़, और AcK 5 mM की अंतिम सांद्रता में उत्प्रेरण एजेंटों और एसिटिल्लीसिन (AcK) जोड़ें।
  5. 6-8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बढ़ें।
  6. 15 मिनट के लिए 2,700 x ग्राम पर गोली कोशिकाएं।
  7. सेल पेलेट को रात -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. इस कदम के बाद से हर समय बर्फ पर नमूना रखें। संस्कृति के प्रति 1 एल हिस्टोन लाइसिस बफर के 50 एमएल में सेल पेलेट को भंग करें।
  9. निम्नलिखित चक्र के अनुसार Sonicate: 1 एस पर, 1 एस बंद, समय पर कुल: 60% आयाम पर 3 मिनट।
  10. 45 मिनट के लिए 41,600 x ग्राम पर गोली शामिल शरीर।
  11. सुपरनैंट को त्यागें और हिस्टोन लाइसिस बफर के 30 एमएल में समावेशन निकायों को फिर से रीसस्ट करें। 30 मिनट के लिए 41,600 x ग्राम पर गोली शामिल करना अच्छा है।
  12. पैलेट और रिसिपेंड इन्क्लूजन बॉडी को पैलेट वॉश बफर के 30 एमएल में छोड़ दें। 30 मिनट के लिए 41,600 x ग्राम पर गोली शामिल शरीर।
  13. सुपरनेट को त्यागें और 6 एम ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड (गुएचसीएल) बफर के 25 एमएल में समावेश निकायों को भंग करें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ इनक्यूबेट।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो समावेशन निकायों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आंदोलन के साथ इनक्यूबेटेड किया जा सकता है।
  14. 45 मिनट के लिए 41,600 x ग्राम पर पैलेट इन्ल्लूजन का संकेत है। नी-एनटीए राल के 1 एमसीएल के साथ सुपरनेट को 2 घंटे के लिए 6 एम गुएचसीएल बफर के साथ बराबर कर दिया गया है।
  15. विकृत परिस्थितियों में नी-एनटीए शुद्धिकरण के साथ आगे बढ़ें। कॉलम वॉश बफर के 3 कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम को धोएं। एल्यूट एसीटिलेटेड हिस्टोन प्रोटीन जिसमें 10 एमएल एल्यूशन बफर होता है।
    नोट: यहां प्रोटीन को केंद्रित करने का प्रयास करना एक विकल्प है लेकिन एसिटिलेटेड हिकटोन बहुत अप्रत्याशित हैं और आसानी से तेज़ कर सकते हैं। कुल मात्रा में पिछले 2 एमएल को केंद्रित करने की सिफारिश नहीं की जाती है।
  16. लवण को हटाने के लिए 5% एसिटिक एसिड बफर के खिलाफ एसिटिलेटेड हाइस्टोन प्रोटीन को बड़े पैमाने पर अलग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक समय में 3 घंटे के लिए डायलाइज़, ताजा बफर के लिए न्यूनतम 6 गुना का आदान-प्रदान।
    नोट: बेहतर प्रोटीन शुद्धता के लिए, शुद्ध पानी के खिलाफ डायलाइज़ करने का विकल्प है। हालांकि, यह महत्वपूर्ण वर्षा और उपज में कमी का कारण बनता है जो कम उपज वाले एसिटिलेटेड हिस्टोन प्रोटीन के लिए अवांछनीय हो सकता है।
  17. एलिकोट और लियोफिलिज़ प्रोटीन, और अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। जंगली प्रकार के हिस्टोन प्रोटीन आम तौर पर 10-50 मिलीग्राम/एल उपज जबकि एसीटायलेटेड हिस्टोन प्रोटीन विशिष्ट lysine साइट के आधार पर 10 मिलीग्राम/एल से कम उपज । उदाहरण के लिए, H3K79Ac औसत 5 मिलीग्राम/L ।

3. जंगली प्रकार हिस्टोन प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. पूर्ण न्यूक्लियोसोम को इकट्ठा करने के लिए, सभी 4 हिस्टोन प्रोटीन व्यक्त करें। जंगली प्रकार के हिटोन को व्यक्त और शुद्ध करते समय प्रोटोकॉल निम्नलिखित को छोड़कर एसिटिलेटेड हिकटोन के समान है:
    1. सह-परिवर्तन न करें। जंगली प्रकार के हिस्टोन अभिव्यक्ति के लिए pEVOL-AcKRS का उपयोग न करें। तदनुसार एंटीबायोटिक दवाओं को समायोजित करें।
    2. सिलब विलोपन सेल लाइन का उपयोग न करें या सेलुलर अभिव्यक्ति के प्रेरण के दौरान निकोटिनामाइड, एक्यूसी या अरबिनोज़ न जोड़ें।

4. 601 डीएनए की तैयारी

नोट: उच्च दक्षता के साथ मोनोन्यूकोसोम का उत्पादन करने के लिए सीधे न्यूक्लियोसोम पोजिशनिंग के लिए पहले से डिजाइन किया गया अनुकूलित डीएनए अनुक्रम हिस्टोन ऑक्टामर्स के साथ इकट्ठा किया जाता है। इस सीक्वेंस को 601 डीएनए या विडोम सीक्वेंस के रूप में जाना जाता है। यह अनुक्रम क्रोमेटिन रिमॉडलिंग परख से एकल अणु मापन10तक नाभिकों के इन विट्रो अध्ययनों के लिए मानक डीएनए अनुक्रम बन गया है ।

  1. न्यूक्लियोसोम असेंबली के लिए 601 डीएनए की महत्वपूर्ण मात्रा तैयार करने के लिए, पीजीईएम-3जेड/601 को शीर्ष 10 कोशिकाओं में रूपांतरित करें और प्लाज्मिड प्रवर्धन और निष्कर्षण के लिए संस्कृति के 10 एमएल बढ़ाएं। प्लाज्मिड एक्सट्रैकटी किट का उपयोग करें और निर्माता की सिफारिश का पालन करें।
  2. इस प्रवर्धन प्रोटोकॉल के लिए इन-हाउस व्यक्त PFU पॉलीमरेज (अधिक कुशल) का उपयोग करें। एक पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें: 250 माइक्रोल प्रतिक्रिया के लिए, 207.5 माइक्रोन ऑटोक्लेवेड एमक्यू एच2ओ, 25 माइक्रोन 10x पीफ्यू बफर, 5 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर: ctggagaatcccggtgccgg, 5 μL रिवर्स प्राइमर: अकागगटटाक्टैक्सीजी, 5 माइक्रोएल डीएनटीटीपी मिक्स, 2.5 माइक्रोन पीफ्यू एमफ्यू एंजाइम का उपयोग करें। हम आम तौर पर एक बार में ६० प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए पर्याप्त डीएनए को इकट्ठा करने के लिए मिलता है ।
  3. 30 एस के लिए 52 डिग्री सेल्सियस के एनीलिंग तापमान और यदि पीएलएफयू पॉलीमरेज का उपयोग करके 30 एस का विस्तार समय है तो इसका उपयोग करें। अन्यथा निर्माताओं की सिफारिश की शर्तों का पालन करें।
  4. एक बार पीसीआर हो जाने के बाद पीसीआर प्रोडक्ट को शुद्ध करने के लिए पसंद की पीसीआर क्लीन अप किट का इस्तेमाल करें।

5. हिस्टोन ऑक्टामर की विधानसभा

  1. हिस्टोन प्रोटीन छर्रों H2A, H2B, H3, और H4 के aliquots भंग इतना है कि वहां १०० μL की कुल मात्रा के साथ GuHCl बफर में प्रत्येक हिस्टोन प्रोटीन का एक अलग स्टॉक है ।
  2. ए280 अवशोषण को मापने के द्वारा प्रत्येक हिस्टोन प्रोटीन की एकाग्रता की गणना करें।
  3. यदि किसी भी प्रोटीन के लिए अवशोषण 1 से अधिक है, तो अधिक सटीक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए गुएचसीएल बफर के साथ पतला करें।
  4. H2A और H2B प्रोटीन को 1:1 मोलर अनुपात में मिलाएं और 4 μg/μL की कुल प्रोटीन एकाग्रता को पतला करें । H3 और H4 के लिए दोहराएं ।
  5. रात भर 2 एम ते बफर के मुकाबले 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलाइज़, 2 घंटे के लिए 1 एम टीई बफर और 5 घंटे के लिए 0.5 मीटर टीई बफर।
    नोट: डायलिसिस के दूसरे और तीसरे चरण में प्रोटीन की अस्थिर संरचनाएं बाहर निकलने का कारण बनती हैं । इन कदमों पर भारी वर्षा देखने की उम्मीद है ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा उपजी निकालें।
  7. फिर, एक२८० अवशोषण को मापने के लिए हिस्टोन डिमर (H2A/H2B मिश्रण) और टेट्रामर्स (H3/H4 मिश्रण) की एकाग्रता की गणना करें ।
  8. 1:1 मोलर अनुपात में डाइमर्स और टेट्रामर्स को मिलाएं और ठोस एनएसीएल के अलावा एनएसीएल को 2 एम में समायोजित करें।
  9. हिस्टोन ऑक्टामर को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और डिमर्स और टेट्रामर्स की तुलना में अधिक स्थिर है। कभी भी हिस्टोन ऑक्टामर को फ्रीज न करें क्योंकि इससे अलग-अलग हो सकता है।
  10. यदि एसिटिलेटेड हस्टन के साथ कोडांतरण करते हैं, तो बस प्रक्रिया में एसिटिलेटेड प्रोटीन के साथ जंगली प्रकार के प्रोटीन को बदलें।

6. न्यूक्लियोसोम असेंबली

  1. 2M TE बफर के लिए 601 डीएनए समायोजित करने के लिए 100x TE बफर और ठोस NaCl का उपयोग करें। 0.85:1 से 0.90:1 के मोलर अनुपात में हिस्टोन ऑक्टामर के लिए 2M TE बफर में 601 डीएनए जोड़ें। यदि जेल शिफ्ट विश्लेषण में मुफ्त डीएनए मौजूद है तो डीएनए का एक कम अनुपात जोड़ा जा सकता है।
  2. डीएनए-हिस्टोन मिश्रण को एक डायलिसिस बैग स्थानांतरित करें और 2एम ते बफर (या अधिक यदि कई नमूनों को इकट्ठा करते हैं) के लगभग 200 एमएल में रखें और बहुत धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर हलचल करें।
  3. कोई नमक ते बफर में धीरे-धीरे ड्रिप करने के लिए शुद्ध करने के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप सेट करें। जब मात्रा लगभग दोगुनी हो गई है, तो आधी मात्रा डालें। ऐसा कुल में कम से कम 4 बार करें। एक पंप के साथ यह शुरुआती मात्रा के आधार पर 4-8 घंटे ले सकता है। जब नमक एकाग्रता 150 mm (लवणता मीटर द्वारा मापा जाता है) तक कम हो जाती है तो न्यूकोसोम बनते हैं।
  4. नमक एकाग्रता 150 mM करने के लिए कम हो जाता है के बाद, एक 20 mM TE बफर रातोंरात के खिलाफ डायलाइज़।
  5. अपकेंद्री द्वारा उपजी निकालें और एक प्लेट रीडर का उपयोग करके260 पढ़ने से न्यूकोसोम्स की एकाग्रता को मापें।
  6. सभी हिस्टिडीन टैग को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपने-तेव प्रोटीज (TEV: न्यूकोसोम 1:30, w:w) और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़ें। नी-एनटीए राल द्वारा न्यूक्लियोसोम समाधान से हिस्टिडीन टैग अशुद्धियों को हटा दें।
  7. न्यूक्लियोसोम को स्थिति में रखने और नमूने को समरूप बनाने के लिए, 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: विशेष रूप से अस्थिर साइटों के लिए, यह कदम उचित नहीं हो सकता है।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर शॉर्ट टर्म (कुछ हफ्तों) के लिए न्यूकोसोम्स स्टोर करें।
  9. दीर्घकालिक भंडारण के लिए, भंडारण बफर के खिलाफ न्यूक्लियोसोम को डायलाइज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

डिमर्स, टेट्रामर्स और ऑक्टैमर्स का आकलन 12% एसडीएस पेज जेल(चित्रा 1 और चित्रा 2)चलाकर किया जा सकता है । यहां आप देख सकते हैं कि कुछ एसिटिलेटेटेड टेट्रामर्स में दूसरों की तुलना में कम उपज होती है(चित्रा 1)। वास्तव में, कोर क्षेत्र के करीब, उपज कम देखी गई। यह सबसे अधिक संभावना है कि टेट्रामर के कोडांतरण के साथ हस्तक्षेप करने वाले एसीटिलेशन के कारण आप कोर क्षेत्रों में पहुंच जाते हैं। ऑक्टामर्स(चित्रा 2)को इकट्ठा करने के बाद इसी तरह का प्रभाव देखा जाता है। 601 डीएनए अनुक्रम के साथ ऑक्टैमर कोडांतरण के बाद, न्यूकोसोम का मूल्यांकन 5% 1x TBE देशी पेज जेल का उपयोग करके किया जा सकता है जिसके बाद एथिडियम ब्रोमाइड(चित्रा 3)के साथ धुंधला हो जाता है। TEV पाचन से पहले न्यूकोसोम बैंड 10k बेस जोड़ी मार्क के पास मनाया जाता है। TEV पाचन के बाद नाभिक बैंड सीढ़ी के सापेक्ष नीचे बदलाव । थर्मल पोजिशनिंग से पहले, मनाया न्यूक्लियोसोम बैंड बहुत व्यापक हो जाएगा, और संभवतः लकीर(चित्रा 4)।

Figure 1
चित्रा 1:हिस्टोन डाइमर्स और टेट्रामर्स। प्रतिनिधि 12% एसडीएस पेज जेल ऑफ वाइल्ड टाइप हिस्टोन डाइमर (लेन 2) और एच 3 एसीटालेटेड टेट्रामर्स (लेन 3-9)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:हिस्टोन ऑक्टामर्स। प्रतिनिधि 12% SDS पेज जेल के H3 एसीटिलेटेड हाइस्टोन ऑक्टामर्स (लेन 2-11)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:अपने टैग H3K64Ac न्यूक्लियोसोम परिसर इकट्ठे हुए । प्रतिनिधि 1x TBE देशी पृष्ठ जेल H3K64Ac न्यूक्लियोसोम कॉम्प्लेक्स (लेन 2) की तुलना में मुक्त ६०१ डीएनए (लेन 4) ethidium ब्रोमाइड द्वारा कल्पना की । लेन 3 एक घंटे के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद H3K64Ac नाभिक से पता चलता है । लेन 3 में यह देखा गया है कि सभी न्यूकोसोम अलग हो गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:इकट्ठे TEV पचा नाभिक जटिल। प्रतिनिधि 1x TBE देशी पृष्ठ जेल जंगली प्रकार TEV पचा नाभिक परिसर, और मुक्त ६०१ डीएनए । न्यूक्लियोसोम थर्मल पोजिशनिंग से पहले और बाद की तुलना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

किसी प्रयोग के दौरान हर विस्तार से इस प्रोटोकॉल का पालन करना आवश्यक है। न्यूक्लियोसोम बहुत स्थिर नहीं हैं और इस प्रोटोकॉल का निर्धारण करने में बहुत अधिक परीक्षण और त्रुटि हो गई है। हर कदम (या जब भी मनाया जाता है) पर उपजी को हटाना महत्वपूर्ण है क्योंकि कण आसानी से कोडांतरण प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप कर सकते हैं। बर्फ पर हमेशा हिस्टोन के नमूने रखें। यदि न्यूकोसोम्स को बहुत लंबे समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, तो वे अनायास ही अलग हो सकते हैं। किसी भी प्रयोग में उपयोग से पहले 2 सप्ताह से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर देशी पेज द्वारा किसी भी नमूने की जांच करना सुनिश्चित करें। भंवर ऑक्टामर्स और न्यूक्लियोसोम्स से बचें क्योंकि इससे उन्हें अलग भी किया जा सकता है। यदि मुद्दों को कोडांतरण डिमर, टेट्रामर्स, या ऑक्टामर्स का सामना करना पड़ता है तो यह आमतौर पर खराब प्रोटीन गुणवत्ता का संकेत होता है। प्रोटीन की गुणवत्ता 15% SDS-पेज द्वारा जांचें। एक विकल्प यदि प्रोटीन शुद्धता कम है तो शुद्ध पानी के खिलाफ प्रोटीन को डायलाइज करना है। यह भारी वर्षा का कारण बनेगा और प्रोटीन उपज को बहुत कम करेगा, लेकिन एक शुद्ध नमूना पैदा करेगा। प्रत्येक हिस्टोन एसिटिलेशन साइट की निगमन और नाभिक स्थिरता व्यापक रूप से भिन्न होती है। सामान्य तौर पर, साइट एन-टर्मिनल डोमेन के करीब है, हिस्टोन प्रोटीन अभिव्यक्ति के दौरान उपज कम होगी। न्यूक्लियोसोम स्थिरता के लिए, एसिटिलेशन साइट न्यूक्लियोसोम कोर या डीएनए बाध्यकारी साइटों के करीब है, इकट्ठे नाभिक को कम स्थिर करना। यदि स्थिरता के मुद्दों का सामना करना पड़ता है, तो हमेशा बर्फ पर नाभिक नमूना रखना महत्वपूर्ण है। न्यूक्लियोसोम पोजिशनिंग चरण को 60 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ना आवश्यक हो सकता है क्योंकि इससे अलग या वर्षा हो सकती है। एसिटिलेटेड न्यूक्लियोसोम्स की एक बड़ी सीमा उनकी अस्थिरता है। न्यूकोसोमल वर्षा के कारण बिना 37 डिग्री सेल्सियस जैसे उच्च तापमान पर परख को प्रीफॉर्म करना असंभव हो सकता है। यदि प्रायोगिक प्रक्रियाएं अनुमति देती हैं, तो उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन करें ताकि एसिटिलेटेड न्यूक्लियोसोम की वर्षा को रोका जा सके।

नाभिक के उत्पादन की यह विधि बाध्यकारी प्रयोगों और संरचना निर्धारण के लिए संशोधित नाभिकों के उत्पादन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यह विधि उच्च शुद्धता और एक ज्ञात न्यूकोसोमल डीएनए अनुक्रम के साथ न्यूकोसोम पैदा करती है, जो जटिल चर को समाप्त करती है जिसके परिणामस्वरूप बेहतर नियंत्रित प्रयोग और उच्च संकल्प छवियां होती हैं। यह संरचना निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है कि न्यूकोसोम नमूना एक ज्ञात डीएनए अनुक्रम के साथ समरूप है, अन्यथा उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करना असंभव होगा।

इस विधि के संभावित अनुप्रयोगों की बहुतायत है। विशेष रूप से, एपिजेनेटिक्स के क्षेत्र में। संशोधित प्रोटीन प्राप्त करना अविश्वसनीय रूप से मुश्किल हो सकता है। संशोधित प्रोटीन प्राप्त करना कई एपिजेनेटिक रास्तों में लेखकों, पाठकों और इरेज़र की संरचना और कार्य की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है जो खराब समझ रहे हैं। हमने पहले इस तकनीक का उपयोग एच 3 एसिटिलेशन साइटों K18, K36 और K56 में Pst1 पाचन के लिए नाभिक डीएनए की पहुंच की जांच करने के लिए किया है, जो प्रत्येक उत्परिवर्ती ऑक्टामर को संशोधित 601 डीएनए अनुक्रम के साथ कोडांतरण करके है जिसमें पीएसटी 1 पाचन साइट शामिल है। इस तकनीक को एकेके के अलावा अन्य एनसीएए को शामिल करने के लिए और संशोधित किया जा सकता है। PylRS को अन्य एनसीएए के एक मेजबान को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। हमने कई एसिटिलेशन साइटों परSIRT7 की हिस्टोन डेसिलेशन गतिविधि की जांच करने के लिए कई AzHeK-युक्त हिस्टोन एच 3 प्रोटीन की पुनर्संयोजन अभिव्यक्ति के लिए एस्चेरिचिया कोलाई में एम्बर कोडन द्वारा एन ε -(7-azidoheptanoyl)-एल-lysine (AzHeK) को भी शामिल किया है। इस दृष्टिकोण से पता चला है कि SIRT7 H3K36 के deacylation की दिशा में उच्च गतिविधि है और यह भी उत्प्रेरक H3K37 deacylate करने के लिए सक्रिय है । H3K36 deacylation आगे नाभिक निर्भर होना दिखाया गया था और काफी एकिल-न्यूक्लियोसोम सब्सट्रेट है कि देशी गुणक6में नाभिक के बीच ब्रिजिंग डीएनए की नकल करने के लिए एक छोटे डबल फंसे डीएनए जोड़कर बढ़ाया जा सकता है ।

इस विधि को जंगली प्रकार के न्यूकोसोम्स का उत्पादन करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है जिसमें कोई संशोधन नहीं किया जा सकता है जो विभिन्न परिदृश्यों में उपयोगी हो सकता है। हमारे समूह ने हाल ही में डॉ पिंगवेई ली के समूह के सहयोग से एक संरचना प्रकाशित की है जो चक्रीय जीएमपी-AMP सिंथेस (सीजीएएस) के तंग बाध्यकारी को हिस्टोन एच2ए और एच2बी द्वारा अपनी दूसरी डीएनए बाध्यकारी साइट11के माध्यम से गठित नकारात्मक आवेशित अम्लीय पैच को दिखा रही है । सीजीएएसए एक डीएसडीएनए सेंसर है जो चक्रीय डायकोलॉटाइड सीजीएएमपी के संश्लेषण को उत्प्रेरित करता है, जो स्टिंग-टीबीके 1-आईआरएफ3 सिग्नलिंगएक्सिस12, 13,14,15,16के माध्यम से प्रकार के प्रेरण में मध्यस्थता करता है।

पूरी तरह से इकट्ठे न्यूक्लियोसोम का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह किसी भी प्रकार के एपिजेनेटिक-संबंधित प्रोटीन की गतिविधियों या बाध्यकारी क्षमताओं की जांच करने के लिए एक बेहतर मॉडल के रूप में सेवारत न्यूकोसोम्स की मूल स्थिति जैसा दिखता है। नग्न डीएनए या हिस्टोन पेप्टाइड सब्सट्रेट्स की ओर सीमित या पूरी तरह से अनुपस्थित एंजाइम गतिविधि के कई उदाहरण हैं जो न्यूकोसोम सब्सट्रेट्स के साथ जांच करने पर परिणामों में काफी परिवर्तन करते हैं। ऊपर उल्लिखित उदाहरण के साथ, एसआईआरटी7 के लिए एक न्यूक्लियोसोम सब्सट्रेट का उपयोग करके एक उपन्यास डीसाइलेशन साइट की खोज की गई थी जो अन्यथा अज्ञात होती। इस प्रकार की प्रणालियों की जांच करते समय देशी सब्सट्रेट्स का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इस तकनीक का उपयोग किसी भी संशोधन की गतिविधि या बाध्यकारी क्षमता को पढ़ने, लिखने और मिटाने की जांच करने के लिए किया जा सकता है जिसे पाइरोलिसाइन जेनेटिक कोड विस्तार तकनीक द्वारा शामिल किया जा सकता है। पाइरोलिसिल-टीआरएनए संश्लेषण पहले से ही मूल रूप से संकीर्ण है और प्राथमिक सीमित कारक शोधकर्ता की रचनात्मकता बनाने वाले सिस्टम की संख्या में इस तकनीक का उपयोग करने के लिए पहले से ही दरवाजा खोलने वाले अन्य सब्सट्रेट्स के एक मेजबान के लिए इंजीनियर किया गया है।

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Disclosures

किसी भी लेखक द्वारा घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल और उनकी बहुमूल्य सदस्यता की बुनियाद रखने के लिए डॉ वेस्ले वांग को धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (अनुदान R01GM127575 और R01GM121584) और वेल्च फाउंडेशन (ग्रांट ए-1715) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M TE Buffer NA NA 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
1 M TE Buffer NA NA 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
100x TE Buffer NA NA
2 M TE Buffer NA NA 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
20 mM TE Buffer NA NA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8
6 M GuHCl 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0
Acetyllysine
Column Wash Buffer NA NA 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8
Elution Buffer NA NA
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump Fischer Scientific 15-077-67
His-TEV protease
Histone Lysis Buffer NA NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resin 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8
PCR Clean-Up Kit Epoch Life Sicences 2360050
Pellet Wash Buffer NA NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS Addgene 137976
pGEM-3z/601 Addgene 26656
Storage Buffer NA NA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8
Thermocycler

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 166 न्यूक्लियोसोम एसिटिलेशन पायरोलिसिन जेनेटिक कोड विस्तार पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन प्रोटीन संशोधन हिस्टीटोन
<em>एस्चेरिचिया कोलाई</em> में जेनेटिक कोड विस्तार का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पुनर्गठन के लिए हिस्टोन्स की साइट विशिष्ट लाइसिन एसिटिलेशन
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Rowlett, C. M., Liu, W. R. Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (166), e62113, doi:10.3791/62113 (2020).

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