Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Wide-Field, Real-Time Imaging af lokale og systemiske sårsignaler i Arabidopsis

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

Ekstracellulær glutamat-udløst systemisk calcium signalering er afgørende for induktion af planteforsvar svar på mekaniske sår og planteædende angreb i planter. Denne artikel beskriver en metode til at visualisere den rumlige og tidsmæssige dynamik i begge disse faktorer ved hjælp af Arabidopsis thaliana planter udtrykke calcium- og glutamat-følsomme fluorescerende biosensorer.

Abstract

Planter reagerer på mekaniske belastninger såsom sår og planteædende ved at fremkalde forsvarsresponser både i de beskadigede og i de distale ubeskadigede dele. Ved såning af et blad sker der en stigning i cytosolic calciumionkoncentration (Ca2+ signal) på såret. Dette signal sendes hurtigt til ubeskadigede blade, hvor forsvarsresponser aktiveres. Vores seneste forskning viste, at glutamat lækker fra de sårede celler i bladet i apoplast omkring dem tjener som et sår signal. Dette glutamat aktiverer glutamat receptor-lignende Ca2 + gennemtrængelige kanaler, som derefter fører til langdistance Ca2 + signal formering i hele planten. Disse hændelsers rumlige og tidsmæssige karakteristika kan indfanges med realtidsbilleddannelse af levende planter, der udtrykker genetisk kodede fluorescerende biosensorer. Her introducerer vi en billeddannelsesmetode i hele fabrikken til at overvåge dynamikken i både Ca2+-signalerne og ændringer i apoplastisk glutamat, der opstår som reaktion på sår. Denne fremgangsmåde bruger et bredfelts fluorescensmikroskop og transgene Arabidopsis-planter, der udtrykker grønne fluorescerende protein (GFP)-baserede Ca2+ og glutamatbiosensorer. Derudover præsenterer vi metode til let at fremkalde sår-induceret, glutamat-udløst hurtig og langdistance Ca2 + signal formering. Denne protokol kan også anvendes på undersøgelser af andre anlæg understreger at hjælpe med at undersøge, hvordan anlægget systemiske signalering kan være involveret i deres signalering og respons netværk.

Introduction

Planter kan ikke undslippe fra biotiske belastninger, f.eks. insekter, der fodrer dem, så de har udviklet sofistikerede stresssensorer og signaltransduktionssystemer til at opdage og derefter beskytte sig mod udfordringer som planteæder1. Ved sår eller planteædende angreb indleder planter hurtige forsvarsresponser, herunder akkumulering af phytohormone jasmonsyre (JA) ikke kun på det sårede sted, men også i ubeskadigede distale organer2. Denne JA så både udløser forsvar svar i direkte beskadigede væv og forebyggende inducerer forsvar i ubeskadigede dele af planten. I Arabidopsisblev akkumulering af JA induceret af sår opdaget i distale, intakte blade inden for få minutter efter skader andre steder i planten, hvilket tyder på, at et hurtigt og langdistancesignal overføres fra det sårede blad3. Flere kandidater, såsom Ca2 +, reaktiv ilt arter (ROS), og elektriske signaler, er blevet foreslået at tjene som disse langdistance sår signaler i anlæg4,5.

Ca2+ er et af de mest alsidige og allestedsnærværende andet budbringerelementer i eukaryote organismer. I planter forårsager larve tygge og mekanisk sår drastiske stigninger i den cytosolske Ca2 + koncentration ([Ca2 +]cyt) både i det sårede blad og i uhelede fjerne blade6,7. Dette systemiske Ca2+ signal modtages af intracellulære Ca2+-sensing proteiner, som fører til aktivering af downstream forsvarssignalveje, herunder JA biosyntese8,9. På trods af talrige sådanne rapporter, der støtter betydningen af Ca2+-signaler i skudsårsresponser, er oplysninger om de rumlige og tidsmæssige karakteristika ved Ca2+-signaler fremkaldt af sår begrænset.

Realtidsbilleddannelse ved hjælp af genetisk kodede Ca2+-indikatorer er et effektivt værktøj til at overvåge og kvantificere den rumlige og tidsmæssige dynamik i Ca2+-signaler. Til dato er der udviklet versioner af sådanne sensorer, der muliggør visualisering af Ca2 + signaler på niveau med en enkelt celle, til væv, organer og endda hele planter10. Den første genetisk kodede biosensor for Ca2+, der blev anvendt i planter, var det bioluminescerende protein aequorin, der stammer fra vandmændene Aequorea victoria11. Selv om dette chemiluminescent protein er blevet brugt til at opdage Ca2 + ændringer som reaktion på forskellige belastninger i planter12,13,14,15,16,17,18, det er ikke velegnet til real-time billeddannelse på grund af den ekstremt lave selvlysende signal, den producerer. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserede Ca2+ indikatorer, såsom de gule cameleoner, er også blevet anvendt med succes til at undersøge dynamikken i en række Ca2+ signalhændelser i anlæg19,20,21,22,23,24. Disse sensorer er kompatible med billeddannelse tilgange og oftest er sammensat af Ca2 + bindende protein calmodulin (CaM) og en CaM-bindende peptid (M13) fra en myosin lyskæde kinase, alle smeltet mellem to fluorophore proteiner, generelt en Cyan Fluorescerende Protein (CFP) og en gul fluorescerende Protein variant (YFP)10. Ca2+ binding til CaM fremmer samspillet mellem CaM og M13, hvilket fører til en kropsbygningsændring af sensoren. Denne ændring fremmer energioverførsel mellem den fælles fiskeripolitik og YFP, hvilket øger YFP'ens fluorescensintensitet, samtidig med at fluorescensemissionen mindskes fra den fælles fiskeripolitik. Overvågning af dette skift fra den fælles fiskeripolitik til YFP-fluorescens giver derefter et mål for stigningen i Ca2+-niveau. Ud over disse FRET sensorer, enkelt fluorescerende protein (FP)-baserede Ca2 + biosensorer, såsom GCaMP og R-GECO, er også kompatible med plante billeddannelse tilgange og er meget udbredt til at studere [Ca2 +]cyt ændringer på grund af deres høje følsomhed og brugervenlighed25,26,27,28,29,30. GCaMPs indeholder en enkelt cirkulært permuteret (cp) GFP, igen smeltet til CaM og M13 peptid. Ca2+-afhængig interaktion mellem CaM og M13 forårsager en kropsbygningsændring i sensoren, der fremmer et skift i protonationstilstanden af cpGFP, hvilket øger dets fluorescerende signal. Således, som Ca2 + niveauer stiger, cpGFP signalet stiger.

For at undersøge dynamikken i Ca2 + signaler genereret som reaktion på mekanisk sår eller planteæder fodring, har vi brugt transgene Arabidopsis thaliana planter udtrykke en GCaMP variant, GCaMP3, og en bred felt fluorescens mikroskop6. Denne tilgang har formået at visualisere hurtig transmission af et langdistance Ca2 + signal fra sårstedet på et blad til hele planten. Således blev en stigning i [Ca2 +]cyt straks opdaget på sårstedet, men dette Ca2 + signal blev derefter overført til de nærliggende blade gennem vaskulaturen inden for få minutter efter sår. Desuden fandt vi, at overførslen af dette hurtige systemiske sårsignal afskaffes i Arabidopsis-planter med mutationer i to glutamatreceptorlignende gener, Glutamat receptor som (GLR), GLR3.3 og GLR3.66. Den GLRs synes at fungere som amino-syre gated Ca2 + kanaler involveret i forskellige fysiologiske processer, herunder sårrespons3, pollen rør vækst31, rod udvikling32, koldrespons 33, og medfødte immunitet34. På trods af denne velkendte, brede fysiologiske funktion af GLR'erne er oplysninger om deres funktionelle egenskaber, såsom deres ligand specificitet, ion selektivitet og subcellulær lokalisering, begrænset35. Nylige undersøgelser rapporterede imidlertid, at GLR3.3 og GLR3.6 er lokaliseret i henholdsvis phloem og xylem. Plant GLRs har ligheder med ionotrope glutamatreceptorer (iGluRs)36 hos pattedyr, som aktiveres af aminosyrer, såsom glutamat, glycin og D-serin i pattedyrsnervesystemet37. Faktisk har vi vist, at anvendelsen af 100 mM glutamat, men ikke andre aminosyrer, på sårstedet fremkalder et hurtigt, langdistance Ca2 + signal i Arabidopsis, hvilket indikerer, at ekstracellulær glutamat sandsynligvis fungerer som et sårsignal i planter6. Dette svar er afskaffet i glr3.3/glr3.6 mutant tyder på, at glutamat kan virke gennem en eller begge af disse receptor-lignende kanaler og ja, AtGLR3.6 blev for nylig vist sig at være gated af disse niveauer af glutamat38.

I planter er glutamat ud over sin rolle som strukturel aminosyre også blevet foreslået som en vigtig udviklingsregulator39; dens rumlige og tidsmæssige dynamik er imidlertid dårligt forstået. Ligesom for Ca2+er der udviklet flere genetisk kodede indikatorer for glutamat til at overvåge dynamikken i denne aminosyre i levende celler40,41. iGluSnFR er en GFP-baseret enkelt-FP glutamat biosensor bestående af cpGFP og et glutamat bindende protein (GltI) fra Escherichia coli42,43. Den kropsbygningsændring af iGluSnFR, der er forårsaget af glutamatbinding til GltI, resulterer i en forbedret GFP-fluorescensemission. For at undersøge, om ekstracellulær glutamat fungerer som et signalmolekyle i plantens sårrespons, forbandt vi iGluSnFR-sekvensen med den grundlæggende chitinase signal peptidsekretionssekvens (CHIB-iGluSnFR) for at lokalisere denne biosensor i det apoplastiske rum6. Denne fremgangsmåde muliggjorde billeddannelse af eventuelle ændringer i koncentrationen af apoplastisk glutamat ([Glu]apo) ved hjælp af transgene Arabidopsis-planter, der udtrykker denne sensor. Vi opdagede hurtige stigninger i iGluSnFR-signalet på det sårende sted. Disse data understøtter tanken om, at glutamat lækker ud af de beskadigede celler / væv til apoplast ved sår og fungerer som et skadesignal, der aktiverer GLR'erne og fører til langdistance Ca2 + signal i planter6.

Her beskriver vi en plantedækkende realtidsbilleddannelsesmetode ved hjælp af genetisk kodede biosensorer til at overvåge og analysere dynamikken i langdistance Ca2+ og ekstracellulære glutamatsignaler som reaktion på sårende6. Tilgængeligheden af bredfelts fluorescensmikroskopi og transgene planter, der udtrykker genetisk kodede biosensorer, giver en kraftfuld, men let implementeret tilgang til at detektere hurtigt transmitterede langdistancesignaler, såsom Ca2+ bølger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af plantemateriale

  1. I et 1,5 mL mikrorør steriliseres frøene af Arabidopsis thaliana (Kol-0 tiltrædelse) anlæg, der udtrykker enten GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR ved at ryste med 20% (v/ v) NaClO i 3 minutter og derefter vaske 5 gange med sterilt destilleret vand.
    BEMÆRK: De transgene linjer i Arabidopsis, der udtrykker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR, er tidligere beskrevet6.
  2. I en steril hætte, så 13 overflade-steriliserede frø på en 10 cm firkantet plast Petri parabol fyldt med 30 mL steril (autoklaveret) Murashige og Skoog (MS) medium [1x MS salte, 1% (w/v) saccharose, 0,01% (w/v) myoinositol, 0,05% (w/v) MES og 0,5% (w/v) gellangummi; pH 5,7 justeret med 1N KOH]. Udskift låget og pak det ind med kirurgisk tape.
  3. Efter inkubation i mørke ved 4 °C i 2 dage anbringes pladerne vandret ved 22 °C i et vækstkammer under kontinuerligt lys (90-100 μmol m-2 s-1) i ca. 2 uger før brug. Efter 2 uger tælles antallet af Arabidopsis blade fra ældste til yngste44 (Figur 1). Sårrespons bevæger sig fortrinsvis fra det beskadigede blad (n) til blade nummereret n ± 3 og n ± 56.
    BEMÆRK: I denne protokol åbnes petriskålen for billeddannelse af såret og glutamateffekterne under et fluorescensmikroskop. Derfor bør efterfølgende trin i dette eksperiment udføres under temperatur- og fugtighedskontrollerede rumforhold. Dette skyldes, at Ca2+ signaler også fremkaldes af ændringer i disse miljøforhold. Det er også kendt, at det blå lys, der udsendes fra mikroskopet under registreringen til excitation af biosensorproteinets fluorescens, kan fremkalde en stigning i cytosol Ca2+ koncentration45, og derfor bør planten akklimatiseres til blåt lys bestråling i flere minutter, før forsøget påbegyndes.

2. Kemisk præparat

  1. L-glutamat opløses i et flydende vækstmedium [1/2x MS-salte, 1% (w/v) saccharose og 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 justeret med 1N KOH] for at fremstille en 100 mM arbejdsopløsning.
    BEMÆRK: Undgå brug af salte af glutamat såsom natriumglutamat for at forhindre potentielle kation-relaterede virkninger på Ca2 + dynamik.

3. Mikroskop indstilling og gennemføre real-time imaging

  1. Tænd det motoriserede fluorescenssterroskop, der er udstyret med en 1x objektiv linse (NA = 0,156) og et sCMOS-kamera (figur 2), og konfigurer enhedens indstillinger til at bestråle med et 470/40 nm excitationslys og få et emissionslys, der passerer gennem et 535/50 nm filter.
    BEMÆRK: Ethvert GFP-følsomt fluorescensmikroskop kan bruges til at registrere GCaMP3- og iGluSnFR-signaler i realtid, men en objektiv linse med lav effekt og et meget følsomt kamera med en bred SCMOS-chip anbefales at erhverve signaler fra hele anlægget. Den lave effekt mål giver mulighed for billeddannelse af en hel Arabidopsis anlæggets reaktion og brug af et meget følsomt kamera tillader hurtig dataindsamling er nødvendig for at fange den hurtige tid for sår-udløst Ca2 + bølge. For det fluorescensmikroskop, der anvendes i denne undersøgelse, er maksimumsværdierne for synsfeltet og tidsopløsningen henholdsvis 3 cm x 3 cm og 30 billeder i sekundet (fps).
  2. Fjern låget og læg skålen under den objektive linse.
  3. Kontroller lysstofsignalet fra anlægget, og vent derefter ca. 30 minutter i mørke, indtil planterne er tilpasset de nye miljøforhold. Dette tilpasningstrin er påkrævet, fordi ændringer i fugtighed fremkalder [Ca2+]cythøjde i planter, der kan forstyrre eventuelle sårrelaterede hændelser.
  4. Juster fokus og forstørrelse for at se hele planten i synsfeltet. I den aktuelle protokol blev der anvendt en forstørrelse på 0,63x.
  5. Før du starter realtidsbilleddannelse, skal du konfigurere anskaffelsesparametrene til at registrere fluorescenssignalerne ved hjælp af mikroskopbilledsoftware. Indstillingerne for billedbehandling i den aktuelle protokol er: eksponerings- og intervaltider indstillet til henholdsvis 1,8 s og 2 s (dvs. 0,5 fps). Indstil optagetid til 11 min.
  6. Billede i 5 minutter, før du starter eksperimentet for at akklimatisere anlægget til det blå lys bestråling fra mikroskopet, og derefter begynde at optage ved at klikke på Kør nu, eller den tilsvarende kommando i mikroskop software, der anvendes. For at bestemme den gennemsnitlige baseline fluorescens skal du registrere mindst 10 rammer (dvs. mindst 20 s i den aktuelle protokol), før du sårer eller glutamatapplikation (se afsnit 4).
    1. For real-time billeddannelse af sår-induceret [Ca2 +]cyt og [Glu]apo ændringer, skære petiole eller den midterste region af blade L1 med en saks(Figur 3 og Figur 4).
    2. For real-time billeddannelse af glutamat-udløst [Ca2 +]cyt ændringer, skære kanten (ca. 1 mm fra spidsen) af blad 1 på tværs af de vigtigste vene med en saks. Efter mindst 20 minutters genfindingsperiode påføres 10 μL på 100 mM glutamat på bladets afskårne overflade (figur 5).
      BEMÆRK: Denne forskæring var nødvendig for at give glutamat adgang til bladapoplasten for at udløse reaktioner. Desuden viste det sig, at det var afgørende at påføre en dråbe destilleret vand på den afskårne overflade af blad L1 for at forhindre, at prøverne udtørrede under genvindingen, før der påføres glutamat.
  7. Når du er færdig med 11 minutters optagelse, skal du gemme dataene.

4. Dataanalyse

  1. For analyse af fluorescensintensitet over tid skal der defineres en interesseregion på det sted, hvor fluorescensintensiteten skal analyseres (figur 6 og figur 7). Til hastighedsberegningen af Ca2+-bølgen skal du definere 2 ROI'er (ROI1 og ROI2) til analyse. Klik på Time Measurement | Definer | Cirkel. Mål afstanden mellem ROI1 og ROI2 ved at klikke på Annotationer og Måling | Længde | Simpel linje (figur 6).
  2. Mål de rå fluorescensværdier (F) i hvert investeringsafkast over tid ved at klikke på Mål . Eksporter rå data til en regnearkssoftware for at konvertere fluorescenssignalet til tal på hvert tidspunkt ved at klikke på Alle til Excel | Eksporter.
  3. Basisværdien for fluorescens, der defineres som F0, bestemmes ved at beregne gennemsnittet af F over de første 10 rammer (dvs. før behandlingen) i de registrerede data.
  4. Normaliser F-dataene (ved at beregne ΔF/F) ved hjælp af ligningen ΔF/F = (F−F0)/F0, hvor ΔF er den tidsafhængige ændring i fluorescens.
  5. For Ca2+ bølgehastighedsbølgeanalyse skal du definere et signifikant signalstigningspunkt over de præstimulerede værdier som udtryk for detektion af en Ca2+-stigning i hvert investeringsafkast (t1 og t2) ved hjælp af kriteriet om en stigning til 2× den standardafvigelse (2x SD), der beregnes ud fra F0-dataene ved hjælp af statistisk software. 95% af F0-dataene falder inden for 2x SD fra gennemsnittet, hvilket indikerer, at en stigning i signalet over dette niveau ved en tilfældighed er ≤5%. Beregn tidsforskellen mellem ca2+ forøgelsen mellem ROI1 og ROI2 [t2- t1 tidsforskydning (Δt)] og mål afstanden mellem ROI1 og ROI2, og bestem derefter hastigheder for enhver Ca2+-bølge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Signaludbredelse af [Ca2+]cyt og [Glu]apo som reaktion på sår er præsenteret i figur 3, figur 4, Movie S1og Movie S2. Skæring af bladbladets petiole 1 i planter, der udtrykker GCaMP3 (ved 0 s), førte til en betydelig stigning i [Ca2+]cyt, der hurtigt blev induceret lokalt gennem vaskulaturen (ved 40 s) (Figur 3 og Movie S1). Efterfølgende blev signalet hurtigt forplantet til naboblade (blad 3 og 6) inden for få minutter (ved 80 s)(Figur 3 og Film S1).

Ved opskæring af blad 1 i planter, der udtrykker CHIB-iGluSnFR, blev der observeret en hurtig [Glu]apo-stigning omkring udskæringsområdet (ved 2 s). Dette signal blev forplantet gennem vaskulaturen lokalt inden for få minutter (ved 160 s), men blev ikke observeret i systemiske blade(Figur 4 og Film S2).

For realtidsbilleder af Ca2+ signaludbredelse udløst af anvendelsen af glutamat blev kanten (ca. 1 mm fra spidsen) af blad 1 i planter, der udtrykker GCaMP3, skåret som vist i figur 5A og Movie S3. At skære kanten af blad 1 forårsagede en lokal [Ca2+]cytforøgelse (ved 40 s), men dette signal forsvandt inden for få minutter (ved 124 s). Efter at have ventet i ca. 10 minutter på, at anlægget skulle komme sig, blev der anvendt 10 μL på 100 mM glutamat på bladudskæringen 1, hvilket forårsagede en hurtig, betydelig stigning på [Ca2+]cyt lokalt (ved 56 s) og signaludbredelse til distale blade (ved 104 s) (Figur 5B og Movie S4).

For at måle ændringerne i [Ca2+]cyt induceret ved sår i det systemiske blad blev der fastsat to ROI'er (ROI1 og ROI2) i basisområdet og spidsen af blad 6 i planter, der udtrykker GCaMP3 som vist i figur 6A. Tidsændringen af GCaMP3-signalintensiteten i ROI1 og ROI2 ved skæring af bladbladet 1 blev målt (Figur 6B). Der blev påvist en betydelig stigning på [Ca2+]cyt ved ROI1 tidligere end stigningen i investeringsafkastet2 (figur 6B). [Ca2+] cyt toppede ved ca. 100 s efter sår, varede i over 10 minutter og udviste to faser (figur 6B).

For at bestemme velocities af Ca2 + bølge ved mekanisk sår, tidspunktet for et betydeligt signal stige over de præ-stimulerede værdier i ROI1 og ROI2 blev bestemt (tidsforskydning; se afsnit 4) (Figur 6C). Da afstanden mellem ROI1 og ROI2 var 2,7 mm i dette tilfælde (Figur 6A), blev Ca2+-signalhastigheden i blad 6 beregnet som 0,15 mm/s. For at måle [Glu]apo-ændringerne som reaktion på den mekaniske skade blev ROI1 fastsat i nærheden af skærestedet for bladet markeret som L1 som vist i figur 7A. - Jeg har ikke brug for dig. apo signatur på ROI1 har udstillet en enkelt top på ca 100 s ved sår (Figur 7B).

Figure 1
Figur 1:Nummerering af Arabidopsis rosetblade. Arabidopsis blade er nummereret fra ældste til yngste (venstre panel). Et skematisk diagram over bladenes placering er angivet i højre panel. L: blad, C: cotyledons. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Et fluorescensmikroskop, der blev anvendt i denne undersøgelse. R: Fjernbetjening, O: 1x objektiv linse, C: sCMOS kamera, T: Trinocular vippe rør, S: Stage, P: Plantemateriale. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3:Sårinduceret langdistance Ca2+-signaltransmission. Skæring af petiole (hvid pil, 0 s) af blad 1 (L1) i plante udtrykke GCaMP3 udløste en lokal [Ca2 +]cyt stigning (rød pil, 40 s), der blev overført til systemiske blade [blad 3 (L3) og blad 6 (L6)] (orange pile, 80 s). Skalalinje, 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Sårudløset [Glu]apohøjde. Skæring af bladet 1 (L1) (hvid pil, 0 s) i planter, der udtrykker CHIB-iGluSnFR forårsaget en hurtig højde af [Glu]apo (rød pil, 80 s), der formeres gennem vaskulaturen (orange pil, 160 s). Skalalinje, 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Glutamatudløst langdistance Ca2+ signaltransmission. (A) At skære kanten (ca. 1 mm fra spidsen) af blad 1 (L1) i planter, der udtrykker GCaMP3 (hvid pil, 0 s) forårsagede en [Ca2+]cytforøgelse (rød pil, 40 s). (B) Anvendelse af 100 mM glutamat på den afskårne overflade af L1 (hvid pil, 0 s) forårsagede en lokal [Ca2+]cytforøgelse (rød pil, 56 s), der hurtigt formerede sig til distale blade [f.eks. blad 3 (L3), blad 4 (L4) og blad 6 (L6)] (orange pile, 104 s). Skalalinjer, 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: [Ca2+]cytsignatur i systemiske blade som reaktion på mekaniske sår. ROI1 (blå cirkel) og ROI2 (pink cirkel) blev sat på basen og spidsen regionen, henholdsvis. Hvid pil angiver det afskårne sted for blad 1's petiole (L1). I dette tilfælde var afstanden mellem ROI1 og ROI2 2,7 mm. (B) Kvantificering af [Ca2+]cytsignaturer i ROI1 og ROI2. Ændringer i fluorescensintensiteten blev analyseret ved hjælp af billedbehandlingssoftware. (C) Et udvidet spor af data i (B) mellem 0 s og 80 s. Detektionspunkter for en Ca2+-stigning i ROI1 og ROI2 blev defineret som henholdsvis t1 og t2,idet der som kriterium blev gjort brug af en stigning til 2x standardafvigelsen for de forudindstillede værdier (2x SD, sleben linje). Værdien t2 - t1 blev defineret som tidsforskydning (Δt) i den aktuelle protokol. Sort pil angiver den reducerede tid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: [Glu]apo signatur som reaktion på mekaniske sår. ROI1 blev sat i nærheden af cut site. Hvid pil angiver det afskårne område. (B) Kvantantitation af [Glu]apo-signatur i ROI1 overvåges ved hjælp af billedbehandlingssoftware. Sort pil angiver den reducerede tid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Film S1: Langdistance Ca2 + transmission efter mekanisk sår. Mekanisk sår ved bladbladenes lænde 1 (L1) forårsagede encytforøgelse på [Ca2+], der blev overført til distale blade [f.eks. blad 3 (L3) og blad 6 (L6)]. Klik her for at downloade denne film.

Film S2: Forhøjelse af apoplastiske glutamat niveauer som reaktion på skæring. Mekanisk sår i bladet 1 (L1) forårsagede en øjeblikkelig stigning i [Glu]apo. Klik her for at downloade denne film.

Film S3: Elevation af [Ca2 +]cyt niveauer som reaktion på skæring. Mekaniske sår på kanten af blad 1 (L1) forårsagede en øjeblikkelig, lokal [Ca2 +]cyt højde. Klik her for at downloade denne film.

Movie S4: Anvendelse af glutamat udløser systemisk [Ca2 +]cyt stigninger. Anvendelse af 100 mM glutamat udløst Ca2+ transmission på systemiske blade [f.eks. blad 3 (L3), blad 4 (L4) og blad 6 (L6)]. Klik her for at downloade denne film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Systemisk signalering er vigtig for planter til at reagere på lokaliserede eksterne miljømæssige stimuli og derefter at opretholde deres homøostase på et helt anlægsniveau. Selv om de ikke er udstyret med et avanceret nervesystem som dyr, de beskæftiger hurtig kommunikation både inden for og mellem organer baseret på faktorer som mobile elektriske (og muligvis hydrauliske) signaler og formering bølger af ROS og Ca2 + 46,47. Den ovenfor beskrevne protokol giver mulighed for billeddannelse i hele anlægget af aktiviteten i dette signalsystem ved at overvåge dynamikken i Ca2+ og apoplastisk glutamat som reaktion på sår. Denne metode giver et robust værktøj til at forstå hurtige og langdistance signaler i planter, der kombinerer høj spatiotemporal opløsning og brugervenlighed. Denne protokol giver også mulighed for at give ny fysiologisk indsigt i de molekylære mekanismer, der ligger til grund for langdistance sår signalering gennem, f.eks ved hjælp af mutanter, der er defekte i formodede elementer i den hurtige signalering system eller udforskning af virkningerne af farmakologiske reagenser såsom Ca2 + kanal blokkere (f.eks LaCl3) eller hæmmere af andre potentielt centrale signalering aktiviteter6.

En vigtig fordel ved den beskrevne biosensorbilleddannelsesmetode er brugen af enkelt-FP biosensorer med højt fluorescerende udbytte, hvilket i høj grad forenkler både det nødvendige udstyr til at foretage disse målinger og deres i planta-brug. Således er fluorescensbaserede genetisk kodede indikatorer opdelt i to klasser: 1) intensitetsbaserede enkelt-FP biosensorer og 2) ratiometriske FRET-baserede biosensorer10. Selvom ratiometriske FRET-baserede sensorer er kvantitativt nøjagtige, giver intensitetsbaserede Ca2+-indikatorer, herunder GCaMP3 og iGluSnFR, der bruges her, både højere tidsmæssig opløsning og brugervenlighed på grund af deres generelt lysere Ca2+-responsive signal og deres enklere mikroskopkrav10. For eksempel blev den rød-fluorescerende proteinbaserede single-FP Ca2 + indikator R-GECO1 rapporteret at vise en langt større signalændring som reaktion på ekstracellulær ATP og planteforsvaret elicitors flg22 og chitin, sammenlignet med den ratiometriske YC3.6 biosensor27. Til analyse af ratiometriske FRET-baserede sensorer er det også nødvendigt at bruge et specialiseret mikroskop med flere filtre til at indsamle data ved to bølgelængder, mens enkelt-FP-baserede biosensorer kræver, at enheden kun indsamler dataene ved en bølgelængde, en evne, der findes i alle standard fluorescensmikroskoper10. Det er dog vigtigt at bemærke, at der er nogle ulemper ved at bruge enkelt-FP biosensorer. Disse intensitetsbaserede, enkelt-FP biosensorer foretrækkes ikke til at kvantificere absolutte koncentrationsændringer eller til langsigtet billeddannelse over mange timer eller dage. Denne begrænsning skyldes, at signalintensiteten fra disse enkelt-FP-biosensorer ud over f.eks. Ca2+-niveau for GCaMP3 menes at være påvirket af andre faktorer såsom sensorudtryksniveauet eller parametre som cellulær pH, der kan ændre sig over tid.

Til dato er mange nye varianter af disse genetisk kodede indikatorer blevet udviklet til at forbedre signalet til støjforholdet, dynamikområdet, kinetik og sensorstabilitet. For eksempel, efter Nakai et al.26 udviklet den første GCaMP, forskellige på hinanden følgende varianter, såsom GECOs er blevet genereret af en kombination af mutagenesis og omhyggelig karakterisering48,49,50. Det dynamiske område G-GECO (Green-GECO) blev rapporteret at være ca. to gange større end GCaMP328. Desuden førte udskiftningen med forskellige fluorescerende proteiner i disse indikatorer til generering af GECO-varianter med forskellige emissionsspektre, såsom B-GECO (Blue-GECO) og R-GECO (Red-GECO), som gør det muligt at anvende disse indikatorer sammen med andre GFP-spektralvarianter i multifarvede billedbehandlingsapplikationer28. På samme måde har GCaMP fortsat udviklet og forbedret med en række sensorer forbedret for hastighed af respons og amplitude af signal nu er til rådighed50. Til overvågning af glutamatdynamik, bortset fra iGluSnFR, er der udviklet en række FRET-baserede glutamatbiosensorer, FLuorescent Indicator Proteins for Glutamat (FLIPE)40. FLIPE består af cfp og YFP, der er forbundet via glutamat bindende protein ybeJ taget fra E. coli. Ved glutamatbinding til ybeJ observeres et glutamatkoncentrationsafhængigt fald i FRET-effektiviteten. Derfor er der for både Ca2+ og glutamat flere enkelt-FP og ratiometriske sensorer til rådighed. Forskere bør overveje den passende biosensor til at registrere signaldynamik afhængigt af det eksperimentelle design og kravene til målefaktorer såsom høj signal:støj (single-FP sensorer) versus et behov for meget præcis kvantantitation (hvor FRET sensorer udmærker sig).

Den billeddannelsesmetode med et enkelt RP, der er beskrevet her til sår, bør også være nyttig, når den anvendes på andre stresssystemiske signalprocesser. På trods af tilstedeværelsen af talrige rapporter, der tyder på en afgørende rolle langdistance Ca2 + signalering i forskellige stress reaktioner, såsom planteædende angreb6,51,52, salt20, og tørke53, kun få undersøgelser har givet spatiotemporal oplysninger i forbindelse med hurtige langdistance Ca2 + signaler fremkaldt af disse stressresponser6,7,20,52. Brugen af et bredfelts fluorescensmikroskop i denne protokol giver også mulighed for realtidsobservation af mobil signaldynamik ikke kun i blad-til-blad-kommunikation, men også root-to-shoot-kommunikation som for nylig vist38. Selvom vi har fokuseret på protokoller til Arabidopsis, giver denne billeddannelsesmetode i hele fabrikken også et robust værktøj til at forstå de rumlige og tidsmæssige egenskaber ved systemisk Ca2+-signalering i både biotiske og abiotiske stressresponser hos andre plantearter som tobak30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 og 18H05491) til MT, National Science Foundation (IOS1557899 og MCB2016177) og National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G og 80NSSC19K0126) til SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Tags

Biologi Problem 172 calcium GCaMP3 genetisk kodede fluorescerende biosensorer glutamat iGluSnFR langdistancesignal sårende
Wide-Field, Real-Time Imaging af lokale og systemiske sårsignaler i <em>Arabidopsis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter