Summary
本协议的目标是使用可访问和简单的长期培养技术，描述血管化人类皮肤等价物的生成和体积分析。尽可能描述步骤的理由，使研究人员能够根据他们的研究需求定制。
Abstract
人类皮肤等价物 （HSEs） 是组织工程构造，可模拟人的皮肤表皮和皮肤成分。这些模型已用于研究皮肤发育、伤口愈合和嫁接技术。许多HES仍然缺乏血管学，并通过文化后组织学剖面进行进一步分析，从而限制了对结构的体积评估。这里介绍的是一个简单的协议，利用可访问的材料产生血管化的人类皮肤等价物（VHSE）：进一步描述的是这些构造的体积成像和定量技术。简言之，VHSE构建在12个良好的培养基插入物中，其中皮肤和表皮细胞被植入大鼠尾胶原蛋白I型凝胶中。皮肤室由成纤维细胞和内皮细胞组成，分散在整个胶原蛋白凝胶中。表皮隔间由在空气-液体接口分化的角蛋白细胞（皮肤上皮细胞）组成。重要的是，这些方法是可根据研究人员的需求定制的，结果证明VHSE生成具有两种不同的成纤维细胞类型：人皮肤成纤维细胞（hDF）和人类肺成纤维细胞（IMR90s）。VHSE 的开发、通过共焦显微镜进行成像，并在 4 周和 8 周的时间点使用计算软件进行体积分析。描述了用于体积检查的修复、污渍、图像和清除 VHSEs 的优化过程。这种全面的模型、成像和分析技术很容易根据具有或没有 HSE 经验的各个实验室的具体研究需求进行定制。
Introduction
人的皮肤执行许多重要的生物功能，包括作为免疫/机械屏障，调节体温，参与水的保留和感官作用1，2，3，4。从解剖学上讲，皮肤是人体中最大的器官，由三个主要层（表皮、真皮和皮下层）组成，除了表皮细胞外，还具有复杂的支离、血管、腺体和免疫/神经系统成分系统。表皮本身由四层细胞组成，这些细胞不断更新，以保持屏障功能和原生皮肤（即汗和皮脂腺、指甲）3的其他结构。皮肤生理学在免疫功能、伤口愈合、癌症生物学等领域非常重要，导致研究人员使用从体外单一培养到体内动物模型等多种模型。动物模型提供了研究皮肤生理学的全部复杂性的能力，然而，与人类相比，老鼠等常用的动物模型具有显著的生理差异。这些限制，以及动物模型成本的增加，导致许多研究人员专注于开发体外模型，更密切地反映人类皮肤的生理1，6。其中，一种更简单的模型类型是人类表皮等价物（HEE;也称为半厚皮肤模型），它只由细胞基质上的表皮角质细胞组成，但捕获内在中看到的表皮分化和分层。在此基础上，包含皮肤和表皮成分（角蛋白细胞和成纤维细胞）的模型通常被称为人类皮肤等价物（HSE）、全厚皮肤模型或有机皮肤构造（OSC）。简言之，这些模型是通过封装凝胶基质内的皮肤细胞和在顶部播种表皮细胞而生成的。然后，通过专门的介质和空气曝光7实现表皮分化和分层。皮肤等价物最常通过使用胶原蛋白I型（大鼠尾巴或牛皮起源）1，8制成的皮肤凝胶的自组装技术产生，但类似的模型已经纳入了其他基质成分，如纤维素9，10，成纤维细胞 衍生11，12，尸体去表皮膜13，14，15，16，商业可用的凝胶和其他1，12，13，17，18，19。目前，有皮肤等价物商业可用（如先前审查的1，2）。然而，这些主要用于治疗目的，不能很容易地针对特定的研究问题定制。
在伤口愈合、移植、毒理学及皮肤病/发展研究中，已应用HES，包括11、12、13、16、8、20、21、22、23。虽然与2D培养24相比，3D培养更全面地模型人体组织的功能，但包含更准确地反映体内群体的不同细胞类型，使得对复杂组织24、25、26中的细胞-细胞协调性的研究得以进行。大多数HSE只包括皮肤成纤维细胞和表皮角蛋白细胞27，虽然体内皮肤环境包括许多其他细胞类型。最近的研究已经开始包括更多的细胞群：这些细胞包括血管内皮细胞10、28、29、30、31、32、33、34、皮下组织35、36、神经成分19、21、干细胞27，37，38，免疫细胞10，39，40，41，42，和其他疾病/癌症特异性模型16，40，43，44，45，46，47。其中特别重要的是血管：虽然一些HES包括血管细胞，但总体而言，它们仍然缺乏与整个皮肤10、29、延长体外稳定性28和适当血管密度的连接性的综合毛细管元素。此外，HSE 模型通常通过文化后组织学剖析进行评估，从而限制了对 HSES 三维结构的分析。三维分析可对血管密度48、49以及表皮厚度和分化的区域变化进行体积评估。
虽然 HSE 是最常见的有机模型之一，但在生成这些构造方面面临许多技术挑战，包括识别适当的细胞外矩阵和细胞密度、介质配方、适当的空气液体接口程序以及后培养分析。此外，虽然 HEE 和 HSE 模型已发布协议，但不存在包含皮肤血管和体积成像而非病理分析的详细协议。这项工作提出了一个可访问的协议，从主要商业细胞系血管化人类皮肤等价物（VHSE）的文化。此协议的编写易于定制，允许直截了当地适应不同的细胞类型和研究需求。为了方便性、可用性和成本，使用简单的产品和生成技术优先于使用市售产品。此外，还描述了直接的体积成像和定量方法，以便评估 VHSE 的三维结构。将此程序转化为一个强大且易于访问的协议，使非专家研究人员能够将这些重要模型应用于个性化医学、血管组织工程、移植开发和药物评估。
Protocol
1. 3D 文化的准备
- 准备老鼠尾胶原蛋白库存在8毫克/mL，使用既定的协议50，51，52。或者，大鼠尾胶原蛋白可以以适当的浓度从供应商处购买（参见材料列表）。
注：胶原蛋白可在3-10毫克/mL或高于50、51、52的不同浓度下制备或购买。协议中的计算假设浓度为 8 毫克/mL，但可以根据研究人员的需要进行调整。 - 扩大细胞系：内皮细胞和成纤维细胞需要准备好在3D胶原蛋白皮肤成分生成（第2步）开始播种。角蛋白细胞需要在3D文化的第7天准备好。一个完整的VHSE构造需要7.5 x 105 内皮细胞：7.5 x 104 成纤维细胞;和 1.7 x 105 角蛋白细胞为一代 （表 1） 。
注意：这些密度适用于 12 井大小的透渗透组织培养插入或等效。细胞密度和格式可以根据研究人员的需求向上或向下放大或缩小。为了澄清这一量的内皮和成纤维细胞将播种1-3皮肤成分，而每个表皮成分需要1.7 x 105 角蛋白细胞。 - 在此协议中执行所有细胞离心，在 300 x g下执行 5 分钟，但对于更脆弱的细胞类型，这可能会减少。
2. 3D胶原蛋白皮肤成分的生成
注意：第 2 步是一个时间敏感程序，必须在一个设置中完成。建议在开始皮肤成分播种之前完成胶原蛋白库存的质量检查，以确保适当的凝胶和均质性，请参阅讨论中的故障排除。
- 细胞胶原蛋白层制备和播种
- 准备两个1.7 mL封顶的微中性管，一个用于细胞支撑，一个用于细胞真皮。此步骤中给出的量将准备 1 mL 的 3 毫克/mL 胶原蛋白（目标胶原蛋白浓度），足以满足 （3） 12 井大小的 VHSEs。如果需要调整，则列出方程。体积和密度都可以根据研究人员的需求进行缩放（表 2中给出了常见的参考编号）。
- 在每个管中，添加 100 μL 的文化等级 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （一管将产生 3 VHSE）， 并添加 8.6 μL 的 1 N NaOH。将盖管放在湿冰上冷却至少10分钟。
Cs = 胶原蛋白库存浓度
Vf= 需要胶原蛋白的最终卷
Ct= 目标胶原蛋白浓度
Vs = 所需的库存胶原蛋白量 （Vf）
Vpbs = 目标胶原蛋白浓度所需的 10 倍 PBS 体积 （Ct）
V纳赫=Ct所需的1N纳赫体积
V媒体=Ct所需的媒体量、呼叫暂停或ddH2O
- 准备 1000 和 250 μL 正位移移液器，供使用并预留。由于后一步对时间敏感，因此加载移液器提示和设置体积（分别为 375 μL 和 125 μL）非常方便。此外，为 516 μL 设置一个正常的 1000 μL 移液器。
注意：如有必要，正位移移器可与普通移液器替代，但由于胶原蛋白的高粘度和此过程的时间/温度敏感性，建议使用正位移移如果使用正常的移液器，请使用慢动作。 - 准备培养插入井板：使用无菌钳将三个12井大小的培养物插入无菌的12井组织培养板中，放入中心柱中。
- 设置适合成纤维细胞和内皮细胞类型的冷介质。
- 封顶管冷却后，将一根管子（用于细胞支撑）放在机架上，里面的内容可见。将另一根管子（用于细胞真皮）留在冰上。
- 从制冷中取出8毫克/mL胶原蛋白，放在湿冰上。
注意：不要使用冰柜冰或-20°C台式冷却器，因为这将冻结胶原蛋白。 - 在冷盖管中，加入 516 μL 的介质，并立即使用 1000 μL 正位移移液器添加 375 μL 的冷胶原蛋白。将胶原蛋白分配到溶液中（而不是到管子的一侧）。立即取出空移液器尖端，切换到准备好的 250 μL 正位移移器进行混合。
- 快速但轻轻地混合以防止气泡形成，如果可能，不要从溶液中去除尖端。混合，直到溶液是同质的颜色，这通常需要约5个移液器周期或10s（如果使用媒体与苯酚红色，颜色将变得更轻，统一）。混合时，请务必从管子的不同位置（底部和顶部）提取，以便进行均匀混合。
注意：这可以用516μL的细胞培养级水或其他细胞培养级液体进行，然而，大多数介质的苯酚红色是混合的良好指标。使用用于 2D 扩展的成纤维细胞或内皮介质。
- 快速但轻轻地混合以防止气泡形成，如果可能，不要从溶液中去除尖端。混合，直到溶液是同质的颜色，这通常需要约5个移液器周期或10s（如果使用媒体与苯酚红色，颜色将变得更轻，统一）。混合时，请务必从管子的不同位置（底部和顶部）提取，以便进行均匀混合。
- 立即将 125 μL 的细胞胶原蛋白分散到三个 12 井培养基插入物的膜上。为了确保细胞胶原蛋白凝胶的均匀覆盖，摇动菜：如果不能创建均匀的膜覆盖，则使用移液器尖端通过轻轻将胶原蛋白周围扩散来绘制膜;避免对膜施加压力。凝胶几乎立即开始：快速执行此步骤，以确保均匀覆盖。
注意：会有多余的细胞胶原蛋白。体积可以减少，但是，准备少于1mL的胶原蛋白悬浮会导致溶液混合困难和凝胶不足。 - 立即将12井板移到37°C细胞培养孵化器，使其凝胶至少20分钟（如果需要，细胞胶原蛋白可以凝胶更长的时间;在此凝胶时间，继续步骤2.2）。从冰中取出胶原蛋白悬浮，重新放入制冷（胶原蛋白在 4 °C 时最稳定）。
- 细胞悬架和播种准备
注：对于此协议的文化时间表，这相当于潜水日 1 （SD1）- 在凝胶的乙酰胶原蛋白支持，尝试脱脂和计数内皮和成纤维细胞系。
- 在各自介质的 258 μL 中悬浮 7.5 x10 5 5 内皮细胞和 7.5 x10 4 成纤维细胞，并结合细胞悬架创建 516 μL aliquot。在湿冰上保持细胞悬架，直到使用。
- 准备 1000 和 250 μL 正位移移液器，供使用并预留。由于后一步对时间敏感，因此加载移液器提示和设置体积（分别为 375 μL 和 250 μL）非常方便。此外，为 516 μL 设置一个正常的 1000 μL 移液器。
- 皮肤隔间的细胞载胶原蛋白播种
- 凝胶期后，从孵化器中取出12个井板的细胞胶原蛋白。
注意：如果这种胶原蛋白在 30 分钟后未凝胶，请不要继续操作，因为播种过程中可能存在错误或胶原蛋白库存可能有问题（请参阅讨论中的故障排除）。 - 从湿冰中取出 1.7 mL 盖管（包含 10 倍 PBS 和 NaOH）。将管子放在架子上，以便对内容可见。松开/打开所有盖子（细胞悬架、冷盖管）。
- 从 4 °C 制冷中取出库存胶原蛋白 （8 毫克/mL），并将其放置在湿冰上。打开盖。
- 将 516 μL 的冷却细胞悬架添加到冷盖管中。使用 1000 μL 正位移移移液器，立即将 375 μL 的冷胶原蛋白溶液直接放入封顶管的溶液中。
- 将所有胶原蛋白从移液器中排出到管中，并丢弃正位移移器尖端。立即切换到 250 μL 正位移移液，并混合胶原蛋白溶液。
- 混合胶原蛋白溶液，如以前完成（快速但轻轻地防止气泡形成），如果可能，不要从凝胶中取出尖端。混合，直到溶液是同质的（约5个移液器周期或10s）。混合时，一定要从管子的不同位置（底部和顶部）提取，以便均匀混合。
- 混合后，立即将 250 μL 的细胞胶原蛋白溶液转移到三个 12 井培养基插入物中的乙酰胶原蛋白支架上。为了确保细胞胶原蛋白支持的均匀覆盖，摇动菜和/或使用正位移移液器在不干扰细胞层的情况下轻轻移动新播种的细胞胶原蛋白。
- 立即将 12 井板移动至 37 °C 细胞培养孵化器，使其凝胶至少 30 分钟。使用后将胶原蛋白放回4°C制冷。
- 30分钟凝胶时间后，轻轻倾斜板来评估凝胶。确保胶原蛋白凝固。
- 分别在插入的上腔室和下腔中加入 500 μL 和 1000 μL 的混合介质（半内皮和半成纤维细胞维护介质）（先上，后下，以防止静水压力将胶原蛋白向上推）。将介质缓慢地添加到井边，而不是直接添加到胶原蛋白凝胶上，以尽量减少胶原蛋白的破坏。
- 确保胶原蛋白凝胶被淹没，如有必要，添加更多介质。将井板放在细胞孵化器中进行隔夜孵化。在这个阶段，媒体包含10%的FBS：每个细胞系的正常维护介质（图1中给出的时间线和示意图，A）。
注：VHSE 文化的媒体可以适应自定义细胞类型：可能需要进行一些优化。
- 确保胶原蛋白凝胶被淹没，如有必要，添加更多介质。将井板放在细胞孵化器中进行隔夜孵化。在这个阶段，媒体包含10%的FBS：每个细胞系的正常维护介质（图1中给出的时间线和示意图，A）。
- 凝胶期后，从孵化器中取出12个井板的细胞胶原蛋白。
- 淹没日 2 （SD2） 媒体变化
- 将 VHSE 井中的 10% FBS 介质更改为 5% FBS 半成纤维细胞，半内皮介质辅以 100μg/mL L-阿斯科尔比酸。将 500 μL 添加到井侧的培养物插入的上腔（再次，小心地添加到侧壁，以尽量减少胶原蛋白的破坏），并将 1000 μL 添加到下腔室。
- 每 2 天更新一次媒体 （SD4 和 SD6）， 直到淹没日 7 （SD7） 。
- 使用手动移液器从井中去除介质。使用吸气器是可能的，但可能导致构造的损坏或破坏。
注意：L-抗氧酸必须每2-3天新鲜一次（它在溶液中氧化以产生过氧化氢，从而产生氧化应激，并最终造成细胞损伤53）。因此，由于存在 L-抗酸，因此必须每 2-3 天更换一次 SD2 至 VHSE 文化结束的媒体。最容易制作媒体库存，并在每天喂食时向媒体添加新鲜准备的 L-抗酸量。使用培养品位水或介质作为溶剂，在100毫克/毫升下准备新鲜的L-抗酸。L-抗曲酸以适当的速度通过成纤维细胞刺激胶原蛋白合成，促进胶原蛋白稳定性54、55、56：它还降低了内皮渗透性，保持了船壁的完整性56，57，并进一步有助于表皮屏障形成6，58。
3. 表皮成分和分层感应的播种
- 潜水日 7 （SD7）： 种子角蛋白细胞
注：种子角蛋白细胞，以建立SD7上的表皮。这个时间点可以根据研究人员的需要进行移动。没有角蛋白细胞的浸入培养的持续时间不应超过9天，因为更长的浸入通常会导致皮肤收缩增加。如果收缩发生在 SD7 之前，建议将浸入期缩短到 5 天，并在 SD5 上进行种子表皮。根据特定实验的要求优化浸入期（请参阅讨论中的故障排除）。- 培养角蛋白细胞（N/TERT-120，59或其他适当的细胞）到它们的共性限制之前尝试胰蛋白和播种到VHSEs。对于N/TERT-1细胞，共聚性不应显著超过30%，以防止在2D培养59中角蛋白细胞的不想要的分化。对于其他适当的细胞系，如原发性人类表皮角蛋白细胞，一般使用60的共量限制75-80%。
- 尝试脱脂后，在600μL的人类皮肤等价物（HSE）分化介质中计数并暂停510，000个细胞，并辅以5%FBS（表1）。
注：600 μL 中的 510，000 个细胞允许在每个构造播种 200 μL（3 VHSEs） 时允许 170，000 个细胞/构造。 - 使用手动移液器，收集和丢弃目前在底部和顶部室的介质，为每个构造井。一定要收集尽可能多的媒体。通过轻轻地将移液器尖端置于培养物插入膜下，并暂时将插入物敲出位置，收集可能直接卡在透气膜下的介质。媒体可能因为表面张力而卡住。在继续之前，请确保插入物平放在井中。使用吸气器是可能的，但可能导致构造的损坏或破坏。
- 将 1 毫升的 HSE 介质添加到每口油井的下腔，并辅以 5% FBS。然后将 200 μL 的细胞悬浮添加到每个油井的顶室中。种子直接进入皮肤构造表面。让角蛋白细胞在孵化器中沉淀2小时。
- 播种角蛋白细胞后，小心地将 300 μL 的 HSE 介质补充为 5% FBS 到每个构造井的顶室：慢慢地移液器介质到文化插入侧面。将介质非常小心地加载到顶室，以免干扰可能尚未紧密粘附在底层胶原蛋白凝胶上的固定角蛋白细胞。
- 加载介质后，将构建重新放入孵化器中。
- 潜水日 8/9 （SD8 或 SD9）
- 组成 HSE 介质，辅以 1% FBS 和 100μg/mL L 抗酸。
- 用手动移液器从上下腔室中去除介质。
- 先将 500 μL 介质添加到顶室，然后将 1 mL 添加到底室中。（此步骤可在 SD8 或 SD9 上完成）
- 淹没日 9/10 （SD9 或 SD10，这应该是步骤 3.2 后的第二天）
- 用100微克/毫升L-抗酸组成无血清HSE分化介质。
- 用手动移液器从上下腔室中去除介质。
- 将 500 μL 加载到上腔室，在下腔室中加载 1 mL。
- 空气-液体接口第1天（ALI1）
注：ALI 执行步骤 3.3 后的第二天。- 仅通过从上腔中去除介质废物，将每个构造提升为空气液体接口 （ALI）。使用手动移液器尽可能靠近表皮层，而不会接触或损坏表皮层。
- 将盘子稍微倾斜不同角度以收集介质。在此步骤中删除尽可能多的媒体。在板内的周围井中加入约2mL的无菌水，以保持一致的湿度：在整个文化中保持充满水的水井。
- 稍后检查板，以确保角蛋白细胞仍位于空气液体接口。如果上腔有介质，则将其删除。跟踪每个 VHSE 井的移除介质量（上下腔室的初始体积 （1500 μL） - 移除的介质 = ALI 馈送的良好起点）。
注：VHSEs 不一定要求相同的媒体水平进行空运：通常，如果VHSEs是一起播种的，那么他们需要大约相同水平的媒体进行空运，但情况并非总是如此。根据需要调整音量以保持 ALI，但确保介质级别不会太低，以使 VHSEs 干涸。在达到空运和水化之间的平衡之前，谨慎行事并每天去除少量介质更安全。
- 阿里日 2 （阿里 2）
- 从此，仅使用血清免费 HSE 介质，并辅以 100 微克/毫升 L-抗酸。在 ALI 第 2 天 （ALI2） 更改媒体。如果顶部腔室中有介质，则将其删除并添加到之前记录的已删除的介质量中。使用上一步的方程计算所需的媒体量。例如：如果从上腔中去除 200 μL 的介质，则添加 1300 μL 以建立 ALI（如 1500 μL - 200 μL = 1300 μL）
- 使用计算的体积加载到每个油井的底部腔室，然后将板放回细胞孵化器中。跟踪每天使用的音量。在 12 井培养物中使用推荐的胶原蛋白量时，通常的 ALI 值范围在 750 μL 和 1300 μL 之间。 通常，音量会随着文化成熟而减少，并在 ALI 的第 2/3 周左右保持一致。根据文化细节，此数字可能会发生变化，并且必须进行优化（如 3.4.2 - 4.1 所述）。
4. 血管人体皮肤等价物的常规维护
- 从 ALI 第 3 天 （ALI3） 到文化终点：每 2-3 天使用 100 微克/毫升 L-抗酸的无血清 HSE 介质更新下腔介质。继续调整和跟踪第 3.5.2 步中描述的 ALI 底部腔室所需的介质级别。
- 由于表皮表面必须与空气保持接触，因此每天检查和调整介质水平，直到确定一致的 ALI 水平。表皮层应看起来水合，而不是干燥，但不应有介质汇集在结构顶部。具有8周ALI的文化提供了最一致的形态和表达：但是，根据应用的不同，4 至 12 周的文化可能是适当的。可能需要优化不同细胞和文化条件的文化持续时间。
注：周一、周三、周五更换媒体是一个很好的做法。VHSEs 在周末很健康，但媒体应该在周一早，周五晚些时候更换。在完全完成步骤 1-4 后，VHSE 的生成完成。协议的第 5 步是可选的处理和成像技术，这些技术已针对此类 3D 构造进行了优化。
5. 3D 构造的固定和渗透
注：步骤 5 已优化为该 3D 构造特定的成像技术，该技术在协议的其余部分中概述。生成 VHSE 不需要以下步骤。
- 固定/渗透
- 在文化时期的末点，小心地从每个井的上下室中删除所有介质。
注意：表皮层可能是脆弱的，小心处理，不要用攻击性管道搅动表皮。 - 在 PBS （pH 6.9） 中加入 4% 的副甲醛 （PFA） 到上腔壁（不直接在构造上），然后添加到下腔室，以预先修复每个构造。每室加1毫升，在室温下暴露5分钟。
注意：PFA 是危险的，应小心处理和适当的个人防护设备 （PPE），包括眼睛保护。 - 5 分钟后删除 4% PFA 解决方案，并在 4% PFA 解决方案中加入 0.5% Triton X 100，如上一步所述。在室温下暴露1小时;从现在起，VHSE 结构不需要无菌环境。
- 1 小时后，小心地从两个腔室中取出渗透/固定溶液，用 1 倍 PBS 清洗样品 3 次。
- 将样品存放在 PBS 中，以 4 °C 制冷或立即污渍。要存储样品，将盘子包裹在塑料包装中，然后用铝箔将蒸发和光线照射降至最低
注意：暂停点 - 固定和渗透后，此程序可以暂停，因为样品稳定数周，如果按照步骤 5.1.5 中概述的准备。或者，污渍（如第 6 步所述）可在第 5 步之后立即完成。
- 在文化时期的末点，小心地从每个井的上下室中删除所有介质。
6. 3D 构造的免疫荧光染色
- 构造准备
注意：VHSEs 与文化插入的多孔膜分离时污渍良好：从膜分离也是无阻塞成像的必要，并使染色体积减少。- 要准备免疫荧光染色结构，请倒置插入物，并将其放在井板上的井上（如果 VHSE 掉落，它将与 PBS 一起掉入井中）（补充图 1A）。
- 用一只手在井上稳定插入物，同时使用细尖钳和/或精密刀切开插入膜约一半的周长。用温柔的手尽可能靠近塑料外壳，以防止 VHSE 构造损坏。
- 使用细尖钳，抓住切膜皮瓣的边缘，轻轻剥去插入物和 VHSE 构造上的多孔膜。非常小心和缓慢地这样做，以防止 VHSE 构造结构损坏。如果 VHSE 构造很容易分离，那么它应该掉到下面的井里，如果它卡在腔室的一侧，然后使用细尖钳或一个小勺子将其移动到井中。非常注意表皮层，因为它通常是脆弱的（补充图1A）。
注意：有时膜不会轻易脱落或成片脱落，如果发生这种情况，请使用工具小心地将膜和 VHSE 构造分开。如有必要，请通过浸入 PBS，确保 VHSEs 在此过程中不会干涸。 - 一旦 VHSE 进入井中，丢弃插入膜的任何剩余部分，并将培养物插入每个井中，以便在染色过程中将 VHSE 置于水下位置。
- 染色
注意：由于 VHSEs 可能很脆弱，因此应尽可能轻轻地进行染色和相关处理/操作和洗涤。如果表皮部分脱落，可以单独染色：表皮的上层是脆弱的，经历自然脱毛4，但对于分析，重要的是保持完整性尽可能多。- 在每个构造井的阻塞缓冲区 700 μL 中准备所选的主要抗体污渍（通常，所有主要抗体都可以在同一染色溶液中，但应确认为新的抗体）。700 μL 适用于 12 井大小，但可以根据其他文化格式进行调整。建议浓度的初级和次生抗体与阻塞缓冲配方在 表3（ 可能需要优化）。
- 使用手动移液器从井中取出任何 PBS，小心移液器远离 VHSEs（由于 VHSEs 是浮动的，不建议使用真空吸气）。
- 将主要污渍溶液添加到每口油井中，并将培养物插入井中，以保持 VHSE 浸入液体中（补充图 1B）。用塑料包装井板。在 4 °C 制冷中，在 4°C 制冷时，箔和污渍可保持 48 小时，而不会搅拌或摇晃（摇晃可能会损坏 VHSE 构造）。
- 48 小时后，在 700 μL 阻塞缓冲区（每口井）中准备二次抗体和化学污渍。
- 在添加辅助污渍溶液之前，取出培养物插入外壳和主污渍溶液，用 1 倍 PBS 清洗，3 次洗涤 5 分钟。将文化插入房屋回井，以保持VHSE结构淹没（补充图1B）。在 4 °C 制冷中暴露 48 小时，无需搅拌或摇动。
- 48 h 曝光后，用手动移液器取出污渍溶液，用 PBS 轻轻洗 3 次：不要将移液液直接输送到VHSEs上，因为它们可能是脆弱的。用多余的 PBS 补充水分，并将培养物插入回井中，以保持储油过程中 VHSE 的水下和水分（通过用塑料包装和铝箔储存，以尽量减少蒸发和光线照射）
- 结算（可选和终端）
注：结算可选用于成像。如果完成，它应该做染色/成像样品完全，因为清除防止进一步染色，可能会改变氟化物性能，并可能损坏VHSE结构。存在多种组织清除方法49、61、62，可针对特定项目进行优化。甲基水杨酸盐清除，如下所述，是简单和有效的VHSE。以下清除技术必须在玻璃容器中完成，移液器尖端必须是玻璃或聚丙烯（聚苯乙烯会与甲基水杨酸盐接触溶解）。在通风良好的区域或烟气罩中完成所有清除程序。- 在小型浅玻璃容器中加入 100% 甲醇（玻璃培养皿效果良好）。使用适合构造的最小容器（以尽量减少试剂废物）。
- 使用钳子/勺子（补充图1C）从井板上取出构造，并放置在甲醇填充容器中。如果构造未被淹没，则添加更多甲醇。
- 脱水VHSE构造在甲醇3×10分钟浸泡：每次浸泡后完全更换甲醇，并在上次洗澡后及时去除甲醇。在此过程中，构造可能会变得更加不透明，并略有收缩。
注意：这些持续时间和重复已优化，但甲醇和以下甲基水杨酸盐程序可能需要根据特定的文化格式和污渍进行定制。 - 去除甲醇后，立即加入甲基水杨酸盐，并在5×5分钟内浸入VHSE。每次浸入后完全更换试剂，并将 VHSE 留在第 5 个浸入式解决方案中以进行存储。在此过程中，构造变得透明。
- 将构造或存储在 4 °C 进行映像。 清除后，尽快完成所有成像，因为氟磷可能在几天内在甲基水杨酸盐中降解。清除会导致构造变得脆，虽然不建议扩展存储，但需要定期检查，以确保甲基水杨酸盐量充足。
7. 3D 构造的共聚焦成像
注意：通过组织培养塑料成像不会产生与通过盖片玻璃成像相同的图像质量，此方法描述定制玻璃底井的制造，以防止在共焦成像过程中干燥。通常，这足以进行至少 3 小时的成像。
- 成像前两天：准备多晶硅氧烷 （PDMS）
- 准备 PDMS48，63，64在建议浓度 [9：1]， 基础： 交联器.准备 30 g PDMS 总计：27 克基础组件和 3 克交联器。将任何干净的混合容器放在称重平衡上，并擦干秤。添加基座（27克），然后添加交叉链接器（3克），以实现总共30克。始终在交联之前添加基座。
- 大力搅拌溶液至少4分钟：这将产生小气泡。充分混合后，将 PDMS 倒入 100 毫米培养皿中，或类似的平底耐热容器中。
- 在真空室中去气 PDMS，直到混合产生的所有气泡消失，PDMS 清晰。缓慢释放真空并（缓慢）去除 PDMS。将菜放入烤箱过夜（50-60 °C）：确保菜是平的，PDMS均匀地治愈。
注意：固化后，PDMS 应清晰，表面应光滑且不粘（粘性可能表示混合不足）。
- 成像前一天：PDMS 准备充分
- 使用钢冲床或手持精密刀，从 7.1 中准备的 PDMS 板中冲出或切出圆形井。油井的大小应与 VHSE 构造大致相同。在圆形油井周围切一个方形补丁，以创建一个单个 PDMS 井。准备的 30 克 PDMS 量应至少产生四口定制井。
注：PDMS 井必须接近 VHSE 构造的大小。在成像过程中，它必须限制样本运动。多个油井可以同时制造，并无限期地储存在干净的容器中。 - 使用与 PDMS 井大小相近的玻璃盖片，将氰丙烯酸胶（例如超级胶水）添加到 PDMS 的底部表面（与培养皿接触的光滑表面），并用一次性移液器尖均匀涂抹。将 PDMS 按到玻璃上，同时在打孔的圆圈内留下一个透明的玻璃窗（确保胶水不会涂抹在观看窗口上）。
注：如果可用，PDMS与盖片的等离子粘接是替代65，66，67。 - 使用前，让胶水干燥数小时或过夜。这些是可重复使用的，直到它们打破正常的磨损。
注意：不建议将粘合的 PDMS 中的样品染色，这些样品用于成像。这些油井保持液体几个小时，但在较长的染色过程中可能会泄漏。
- 使用钢冲床或手持精密刀，从 7.1 中准备的 PDMS 板中冲出或切出圆形井。油井的大小应与 VHSE 构造大致相同。在圆形油井周围切一个方形补丁，以创建一个单个 PDMS 井。准备的 30 克 PDMS 量应至少产生四口定制井。
- VHSE 成像
注意：如果成像未清除样品，请使用 PBS 作为成像解决方案。如果成像与清除的样品，使用甲基水杨酸盐（或选定的清除解决方案）作为成像解决方案。- 将几滴成像溶液添加到 PDMS 井中，并检查是否有泄漏（如果有泄漏，请用氰酸酯超级胶水点/涂抹修复或使用另一口井）。
- 添加 VHSE 时，请将成像解决方案保存在 PDMS 中。使用勺子或细尖钳（补充图1C），从12井板中取出构造，放入PDMS井到玻璃盖上。以利益取向面向目标的地方建设。例如，使用倒置显微镜对表皮进行成像，请确保表皮朝下朝下朝玻璃。
- 或者，对于直立显微镜，要面对表皮向上。以下成像程序用于倒显微镜，但可以很容易地适应直立。
注意：在操作 VHSE 时要小心以避免损坏。转移井板，以防VHSE掉落。弯曲，扁平的尖端铲是最简单的方法来转移构造（补充图1C）。
- 或者，对于直立显微镜，要面对表皮向上。以下成像程序用于倒显微镜，但可以很容易地适应直立。
- 确保样品平放在井中，并且表皮或真皮部分不会折叠在样品下。如果发生折叠，用钳子或勺子轻轻操纵样品：暂时添加额外的成像解决方案以浮动 VHSE 可能会帮助它理顺。可以通过眼睛或显微镜看到样品的折叠或皱纹。
- 用成像溶液填充油井，使用足够的液体来保持样品水分：过多的液体会漂浮样品，导致成像过程中的运动。构造应位于玻璃观景窗上：通过倾斜PDMS来测试运动。如果有运动，取出一些液体：明智地添加和去除液体滴落，直到运动停止。
- 在井上放置玻璃滑梯，以尽量减少成像过程中的蒸发（补充图1D）。对于更长的成像会话，请经常检查样本，以确保适当的流体水平。如果可访问，可以在成像过程中使用加湿室（尽管通常没有必要）。
- 将样品放在显微镜舞台上，并通过玻璃盖片窗口（补充图1D）放置图像。此技术允许至少 3 小时的连续共焦成像，但应定期检查样品的水化情况，必要时添加成像解决方案。
注意：如果样品被清除，甲基水杨酸盐会随着时间的推移降低胶水。PDMS 粘合的胶水可以在成像运行之间重新应用：或者样品可以定期转移到新井。在有等离子粘接的油井中，这不会是问题。 - 成像后，将样品尽可能多地用成像液漂浮在井中。使用勺子或细尖钳将样品转移到其存储井中。在样品掉落时，在井板上进行转移。
- 每个 PDMS 井和顶部玻璃盖片都可以重复使用，直到它们断裂。在成像前清洁井底玻璃，无论是井内还是井外。在重复使用之前，请务必检查泄漏，并在必要时用胶水进行修复。
- 存储步骤 6.3.6 中描述的样本，并每隔几个月添加 PBS 以维护;如果样品被清除，使用甲基水杨酸盐储存在玻璃中，并定期检查水平。清除的样品可能会迅速降解（在几天内），并应尽快成像。
Representative Results
这里介绍了一个协议，用于生成体外血管化人类皮肤等价物 （VHSE） 使用端粒酶反向转录酶 （TERT） 不朽角蛋白细胞 （N/TERT-120，59），成人人类皮肤成纤维细胞 （hDF） 和人类微血管内皮细胞 （HMEC-1） （图 1）.此外，在使用常用的肺成纤维细胞 （IMR90） 而不是 hDF 时，还演示了 VHSE 的生成和稳定性，突出了此协议的可定制性。VHSE 的生成以步骤 1-4 完成，而步骤 5-7 是可选的端点处理和成像技术，这些 VHSES 已进行优化。需要注意的是，VHSEs 可以根据特定的研究问题进行处理，并且不需要步骤 5-7 生成构造。完成了体积成像、分析和 3D 渲染，以演示体积分析方法。这些体积构造制备和成像协议将 VHSE 结构保留在微观和宏观两个级别，从而允许进行全面的 3D 分析。
表皮和真皮的特征在VHSE结构中显示人体皮肤的适当免疫荧光标记物（图2，3）。细胞克制素10（CK10）是一种早期分化角质细胞标记物，通常标记皮肤等价物18、30、68（图2）中的所有超巴塞层。非自愿和丝蛋白是角蛋白细胞的后期分化标记，在皮肤等价物12、30、68、69（图2）中标记最上层的超巴索层。一种远红荧光核染料（见材料清单）用于在表皮和真皮中标记核，其中科尔四号标记真皮的血管（图2，图3，图4）。表皮基膜 （BM） 成分并不总是正确表达在 HSE 文化15，16：并且使用此协议不始终观察到BM的 COL IV 染色。研究的重点BM组件和结构将受益于额外的媒体，细胞和成像优化14。
虽然通过大部分 VHSE 培养物进行共焦成像通常产生高分辨率图像，足以计算分析真皮和表皮，但所描述的清除方法允许更深入的组织成像。清除可提高共焦激光穿透深度，VHSE 中的有效成像可用于清除样品，可达到 1 毫米以上（而未清除的样品可达到 250μm）。描述的清除技术（甲醇脱水和甲基水杨酸盐）充分匹配折射指数在整个VHSE样本组织61。清除 VHSE 允许在不进行操作的情况下通过整个构造进行直接成像（例如，重新定向构造以分别映像真皮和表皮）（图3）。
体积图像允许生成 3D 渲染，以绘制整个构造中的血管图（图 4）。简言之，在皮肤上对几卷VHSE的表皮方向进行了对焦图像集，以检测胶原蛋白IV污渍（标记容器壁）和核（以远红荧光核染料为标志）。图像堆栈加载到计算软件（参见材料列表）和自定义算法（基于这些源48，70，71，72，73，74，75）用于 3D 渲染和量化，如前所述48。此算法会根据 Col IV 污渍自动分割血管组件。体积分割传递到基于快速行进75，76，77的骨架化算法。骨架化找到每个Col IV标记容器的确定中心，由此产生的数据可用于计算容器直径和血管分数（图4）。如果激光扫描显微镜不可用，宽场荧光显微镜是一个可访问的选项：血管网络和表皮可以通过广域荧光显微镜（补充图2）成像。使用 VHSEs 的广域成像而不是激光扫描显微镜可以进行三维定量，尽管由于飞机外光线，可能需要对图像进行更多的过滤和分解。
图1：血管化人类皮肤等价生成的原理图时间线。A） 显示 VHSE 模型从 1） 皮肤成分播种、2） 角蛋白细胞播种到皮肤成分的进展，3） 通过空气液体接口和文化维护进行上皮分层。后文化处理和体积成像可以在培养端点进行。 B） 文化中 hDF VHSE 宏观结构的相机图像插入其文化终点，8 周。对于 VHSE 来说，不同程度的收缩是正常的：收缩可以减少协议描述。(1 & 2)收缩样本较少。(3 & 4)更多的收缩样本仍然产生适当的皮肤元素。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：通过免疫荧光标记进行表皮特征。 所有图像都是通过共聚焦显微镜在 8wk 文化时间点拍摄的 VHSE。相应的染色方法在协议步骤 6 中描述。hDF VHSE（左列）和IMR90 VHSE（右列）都存在适当的上皮标记。非自愿和菲拉格林是角蛋白细胞的后期分化标记，并证明表皮在两种VHSE类型中都完全分层。细胞克制素 10 是一个早期分化标记，它识别 VHSEs 中的超巴塞层。核以黄色正交视图显示。通过计算软件渲染了 En 面和正交最大投影图像：图像单独缩放，并带有背景减法和中位数过滤，以获得清晰度。比例杆为 100μm。（在 表 3中提供带有内部阻塞缓冲配方的初级和次要抗体）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：未清除与清除VHSE的比较。 此 VHSE 生成于 IMR90s，图像通过共聚焦显微镜在 4wk 培养时间点拍摄。胶原蛋白四以青色显示：核以洋红色显示：清除的 3D 渲染中的洋红色表示 VHSE 表皮层中核的整合。未清除的 VHSE 图像是较厚的 VHSE 构造中激光衰减的示例，通过清除（甲醇和甲基水杨酸盐），整个构造可以从构造的皮肤侧对整个构造进行小/无激光衰减的成像。降低成像设置，包括激光线、增益和针孔，以清除 VHSE 以减少过度饱和。清除和成像工作如协议第 6 和第 7 步所述完成。正交最大投影图像和 3D 渲染通过计算软件完成，3D 渲染由清除的构造图像生成。图像单独缩放，并带有背景减法和中位数过滤，以获得清晰度。比例栏是 100μm 。 请点击这里查看此图的更大版本。
图4：VHSES内血管的三维分析。 通过对焦显微镜拍摄的体积图像通过计算图像分析，使血管参数定量在培养物端点实现。从VHSE子卷中，检测胶原蛋白IV污渍（青色）标记血管内皮壁，并允许根据胶原蛋白IV位置分割血管：然后对细分数据进行骨架化，并找到每个容器的中心（品红色）。3D 骨架化示例显示为 4 周和 8 周 IMR90 VHSE 样本，未清除。IMR90 VHSE 实验集的生成数据用于计算每个构造中四个子体积（每个 250 μm 在 z 方向）中的容器直径和血管分数，每个 VHSE 平均数据，每个培养时间点进一步平均。这些数据表明，血管网络平衡跨越4和8周培养持续时间，直径与体内人的皮肤78相关，血管分数与体内人的皮肤79 相同（胶原蛋白构造中的血管分量已证明可定制48， 可以进一步优化以增加值）。数据表示为标准误差均值（S.E.M±手段）;n=3表示每个时间点。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 媒体 | 组件 |
| 人类皮肤纤维细胞系 （hDF） | 德梅姆赫格 |
| 5% 胎儿牛血清 （FBS） | |
| 1% 青霉素/链霉素 （P/S） | |
| IMR90纤维细胞系 | 德梅姆/哈姆的F12 50：50 |
| 10% FBS | |
| 1% 市盈率 | |
| HMEC-1 内皮细胞系 | MCDB131 基础介质 |
| 10% FBS | |
| 1% 市盈率 | |
| L-谷氨酰胺 [10 米] | |
| 表皮生长因子 （EGF） [10 ng/mL] | |
| 氢皮质松 [10μg/mL] | |
| N/TERT-1 角蛋白细胞系 | K-SFM 媒体库 |
| 1% 市盈率 | |
| 牛垂垂提取物 （BPE） [25μg/mL]， 从 K-SFM 补充套件 | |
| 表皮生长因子 （EGF） [0.2 ng/mL]， 来自 K-SFM 补充套件 | |
| 卡克莱尔2 [0.3百万] | |
| 人的皮肤等价物 （HSE） 分化 | 3：1 DMEM： 哈姆的F12 |
| 1% 市盈率 | |
| 0.5 微米氢皮质松 | |
| 0.5 μM 异丙醇 | |
| 0.5 微克/mL 胰岛素 |
表1：媒体食谱。提供人类皮肤成纤维细胞、IMR90成纤维细胞、HMEC-1和N/TERT-1角蛋白细胞的2D文化媒体配方。这些配方用于在生成 VHSE 之前扩展细胞系。人的皮肤等价物 （HSE） 分化介质用于生成 VHSE：在潜入培养和分层感应过程中，应按照协议第 3 中描述的逐渐减少的 FBS 量添加基本配方。HSE食谱基于这些来源11，80。
| 胶原蛋白库存浓度（C）： | 8 | 毫克/毫升 | ||
| 所需音量（Vf）： | 1 | 毫升 | ||
| 正常化纳赫调整*： | 1 | X | ||
| *需要测试每一批胶原蛋白，以确定设置pH 7-7.4所需的NaOH量 | ||||
| 所需胶原蛋白浓度（毫克/mL） | ||||
| 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 10倍PBS（V磅） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 胶原蛋白股票 （Vs） | 0.25 | 0.375 | 0.5 | 0.625 |
| 1N 纳赫 （V纳赫） | 0.00575 | 0.008625 | 0.0115 | 0.014375 |
| 媒体 （V媒体） | 0.64425 | 0.516375 | 0.3885 | 0.260625 |
表2：胶原蛋白计算参考表。参考表给出了通常所需的胶原蛋白浓度计算假设8毫克/mL胶原蛋白库存浓度和所需的最终体积1 mL：所有值都在mL中。用于计算这些金额的方程以协议步骤 2.2 给出。检查每个胶原蛋白库存的pH值很重要：如有必要，应添加 NaOH 量以实现 pH 7 - 7.4（在 PBS、NaOH、胶原蛋白库存、媒体添加之后）。该协议已使用 3 毫克/mL 胶原蛋白浓度对 VHSEs 进行了优化：胶原蛋白浓度的变化可能是必要的不同的细胞系/期望的最终结果48。
| 主要抗体 | 源 | 浓度 | 用 |
| 菲拉格林 （AKH1） 鼠标单克隆 IgG | 圣克鲁斯; sc-66192 （200μg/mL） |
[1:250] | 后期分化标记15 |
| 非自愿兔子多克隆 Igg | 蛋白质技术; 55328-1-AP （30 微克/150 微升） |
[1:250] | 后期终端分化标记15 |
| 细胞克制素 10 （DE-K10） 鼠标 IgG， 超自然 | 圣克鲁斯; sc-52318 |
[1:350] | 超巴塞表皮标记14，36，59 |
| 胶原蛋白 IV 兔子多克隆 | 蛋白质技术; 55131-1-AP |
[1:500] | 内皮血管壁67 |
| 德拉克 7 | 细胞信号;7406 （0.3 mM） | [1:250] | 核标记 |
| 次要抗体 | 源 | 浓度 | 用 |
| 山羊抗兔 Igg Dylight ™ 488 结合 | 英异激素;35552 （1毫克/升） | [1:500] | 胶原蛋白四次 |
| 抗兔IgG （H&L） （山羊） 抗体， 戴莱特™ 549 共聚 | 罗克兰免疫化学;611-142-002 | [1:500] | 非自愿次要 |
| 山羊反鼠标 Igg （H&L）， 戴莱特™ 488 | 恒温科学：35502 （1毫克/升） | [1:500] | 菲拉格林或细胞克林 10 次 |
| 阻塞缓冲区 （500 mL） | |||
| 试剂 | 量 | ||
| 德赫2O | 450毫升 | ||
| 10 x PBS | 50升 | ||
| 牛血清白蛋白 （BSA） | 5 克 | ||
| 补间 20 | 0.5升 | ||
| 冷水鱼明胶 | 1 克 | ||
| 阿齐德钠 （10% 二恶英中的阿齐德钠） | 5mL（最终浓度为0.1%） | ||
表3：具有阻塞缓冲配方的初级和次要抗体。所列抗体和化学污渍用于染色图2，图3，图4。使用此处列出的阻塞缓冲配方，在协议步骤 6 中按照所示完成染色。根据所选的培养技术和细胞系，可能需要对染色浓度和持续时间进行一些优化。
补充表1：缩写列表。 为了方便读者，包括缩写列表。请单击此处下载此表。
补充 图1：VHSE处理技术辅助。 VHSE 的处理具有挑战性，尤其是在固定、处理和染色期间。 A-D 与步骤 5-7 中的说明相对应。 A 显示了从培养物插入中去除多孔膜以确保正确染色的技术处理。 B 展示了如何在染色和存储期间保持每个 VHSE 浸入。 C 显示了将构造移动到 PDMS 成像井的最安全、最简单的方法。 D 显示 VHSE 位于 PDMS 成像井中：PDMS 井粘在底部的玻璃滑梯上，创建成像窗口，在顶部放置玻璃滑梯，通过长时间成像运行来保持湿度。请单击此处下载此文件。
补充 图2：标准广域荧光显微镜可用于评估VHSE。 当激光扫描显微镜不可用时，宽场成像可用于体积成像，用于常规评估。例如，从和玄武岩两个方面对 VHSEs 的成像显示为面部和正交（正交）最大投影。（上图 ）表皮是使用非自愿和核作为标记的。（底部）皮肤血管是使用胶原蛋白IV作为标记的图像。图像是背景减去，以获得清晰度。飞机外光线导致正交视图中明显的"条纹"或"火焰"文物。宽场成像可用于量化，但可能需要更多的图像处理。请单击此处下载此文件。
Discussion
该协议为 VHSEs 的生成及其三维分析演示了一种简单且可重复的方法。重要的是，这种方法依赖于很少的专业技术或设备件，使其为一系列实验室访问。此外，细胞类型可以替换为协议中的有限更改，使研究人员能够根据其特定需求调整此协议。
适当的胶原蛋白凝胶是建立皮肤培养的具有挑战性的步骤。特别是在不纯化的情况下使用粗制剂时，微量污染物会影响凝胶过程。为了帮助确保一致性，应使用与 VHSE 生成相同的胶原蛋白库存进行一组实验。此外，凝胶最好发生在 7-7.4 的 pH 度下，微量污染物可能会改变 pH。在使用任何胶原蛋白库存之前，应按照所需的浓度进行练习性乙酰凝胶，并在凝胶凝胶之前测量pH。在开始皮肤成分播种之前完成这种胶原蛋白质量检查，在建立完整的实验之前，将找出适当的凝胶和胶原蛋白均质的问题。而不是将细胞胶原蛋白直接播种到培养物插入上，而是将一些胶原蛋白播种到评估整个 pH 级并验证 7-7.4 pH 的 pH 的 pH 片上。凝胶可以通过将胶原蛋白凝胶溶液的液滴涂在盖片或组织培养塑料井板上进行评估（建议使用井板来模拟培养物插入的封闭侧面）。凝胶时间过后，胶原蛋白应为固体，即当板倾斜时不应流动。在相对比显微镜下，胶原蛋白应看起来均匀而清晰。胶原蛋白播种偶尔产生的气泡是正常的，但透明凝胶中不透明胶原蛋白的大无定形斑点表明，由于混合不足、pH值错误和/或在混合过程中未能保持胶原蛋白冷却，可能会出现问题。
细胞播种量和介质可以调整。在上述协议中，封装的细胞量已优化为 12 井插入 7.5 x 104成纤维细胞和 7.5 x10 5内皮细胞每 mL 胶原蛋白与 1.7 x 105角蛋白细胞种子在皮肤结构之上。细胞密度已优化为这个VHSE协议的基础上，初步研究和以前的研究3D血管网络生成的各种胶原蛋白浓度48和HSE一代22，80，81。在类似的系统中，已公布的内皮细胞密度为1.0×106细胞/mL胶原蛋白48：纤维细胞浓度通常范围从胶原蛋白22、28、82到1 x 105细胞/mL的胶原蛋白8、58、83、84、85：角蛋白细胞浓度范围从0.5 x 105 [细胞/厘米2]80到 1 x 105 [细胞/厘米2]8.细胞密度可以针对特定的细胞和研究问题进行优化。具有收缩细胞（如成纤维细胞）的三维培养物可收缩，导致生存能力降低，培养损失86，87。应完成初步实验，以测试皮肤室的收缩（这可能发生在更多的皮肤细胞，更多的收缩皮肤细胞，更长的浸入培养，或较软的矩阵），并测试表皮表面覆盖。此外，如果发生过度皮肤收缩或需要不同比例的角蛋白细胞覆盖，也可以定制浸入中的天数和减少血清含量的速度。例如，如果在皮肤浸入期间或角膜细胞建立表面单层时注意到收缩，则通过血清锥化过程移动更快，并将 VHSE 提升到 ALI 可以帮助防止额外的收缩。同样，如果角蛋白细胞覆盖不理想，更改 VHSE 在没有血清的情况下被淹没的天数可能有助于增加表皮单层覆盖，并减轻血清被排除在外后的收缩。必须针对特定的培养和研究目标优化细胞密度的变化或上述其他建议。
为了在空气液体接口 （ALI） 期间建立表皮的适当分层，必须定期检查和保持每口井中的流体水平，以便在整个培养长度中保持每个构造的ALI和适当的水化。应每天检查和跟踪媒体级别，直到建立一致的 ALI 级别。表皮层应看起来水合，而不是干燥，但结构上不应有介质池。在 ALI 期间，构造将发展出不透明的白色/黄色，这是正常的。表皮层可能发育不均匀。通常，VHSEs 由于胶原蛋白播种或皮肤收缩而倾斜。观察结构中间较高的表皮部分（24口井大小）和12口井大小的VHSE周边的山脊地层也是正常的。结构 13 的收缩可能会更改这些地形地层，并且/或根本不可能观察到。
VHSEs 的染色和成像为 VHSEs 引入了机械操作。计划和限制对每种文化的操纵是非常重要的。当需要操作时，在从插入膜中去除 VHSE 时，在向构造表面添加染色或洗涤溶液时，以及在成像准备过程中在存储/成像井中拆卸和更换 VHSE 时，保持温和的运动。具体来说，表皮成分的顶层可能是脆弱的，有从基底表皮层脱落的风险。表皮的顶层是脆弱的，即使在原生组织4中也会经历脱毛，但要准确分析表皮结构，必须尽量减少损伤或损失。如果表皮层从构造中取出，则可以单独成像。表皮的基底层很可能仍然附着在真皮上，而部分皮层可能分离。对于表皮的可视化，核污渍有助于观察这一点，因为密集的原子核是表皮中下层的特征。
协议中已经讨论了 VHSE 修复后的对焦成像，但也可以通过直立光学相干断层扫描（OCT）88、89、90、91、92、93来对整个文化中的 VHSE 进行成像。VHSE 足够稳定，能够承受不孵化或加湿的成像至少两个小时，不会产生明显效果。由于 OCT 标签为无和非侵入性，因此可以跟踪成熟期间的表皮厚度。其他非侵入性成像模式也可能被采用。
由于 VHSE 中较深的激光衰减，合并的皮肤和表皮结构的体积成像可能具有挑战性。这可以通过成像结构在两个方向，从表皮侧（图1）和皮肤侧（图2），使皮肤血管结构和表皮的良好分辨率减轻。此外，可以清除样品，允许以最小的衰减度对整个结构进行体积图像。然而，尝试了几种清除方法，所描述的甲醇/甲基水杨酸盐方法产生了最佳效果。有兴趣优化其他结算方法的研究人员针对这些评论49，61，62。如果清除，建议在清除前对样品进行完全成像，因为该方法可能会损坏氟磷和/或结构。此外，成像应在清除后尽快完成，因为荧光可能在几天内消失。
为了简单和无障碍，该协议利用了在以前的文献11，80中发现的最简单的媒体混合。虽然使用简单的媒体混合有很多优点，但这种选择的局限性也得到了认可。其他组研究了特定介质成分对表皮和皮肤健康的影响，发现其他介质添加剂94，如外部自由脂肪酸/脂质，增强表皮的地层角膜，改善皮肤屏障功能。虽然我们的免疫荧光标记显示表皮的适当分化和分层，但根据正在进行的研究，可能需要额外的介质优化。此外，在评估此处介绍的 VHSE 时，没有对表皮 BM 进行广泛分析。BM 的完整性是皮肤等价物的重要标志：各组对BM标记95的文化持续时间及其对BM标记的影响进行了研究，并分析了成纤维细胞的存在，并增加了生长因子对BM表达14的影响。需要注意的是，使用此协议时应评估和优化 BM 组件的分析。
在此协议中，描述了 VHSE 生成的程序，在 ALI 的 8 周后演示结果。VHSE 文化在 ALI 的培养时间长达 12 周，没有明显变化或生存能力丧失，而且它们可能存活的时间更长。重要的是，此协议很容易适应常见的细胞类型，用IMR90肺成纤维细胞替换皮肤成纤维细胞就证明了这一点。根据研究人员的需求和可用资源，可以调整细胞类型和培养物上的介质混合，尽管更不同的细胞类型可能需要媒体优化。总之，这些程序旨在为皮肤生物学和疾病研究提供VHSEs文化的清晰性。为了最大限度地提高可访问性，该协议使用通用设备、细胞线和试剂开发了这种简单而坚固的，作为一种最低限度的有效方法，可以根据研究的具体需求进一步定制。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢吉姆·莱因瓦尔德博士59 和艾伦·范登·博加德博士20， 感谢他们慷慨的N/TERT细胞系的礼物。这项工作得到了美国心脏协会（19IPLOI34760636）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Fisher Chemical | S318-100 | (Dilute from Lab stock) |
| 4% Paraformaldehyde | ACROS Organics | #41678-5000, Lot # B0143461 | Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9 |
| Autoclaved forceps | Fine Science Tools | #11295-00 | Dumont #5 forceps |
| CaCl2 | Fisher bioreagents | Cat # BP510-250, Lot # 190231 | Rnase, Dnase, Protease-Free |
| Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) | ATCC | CRL-3243 | SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used. |
| Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult | ATCC | PCS-201-012 | Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used. |
| Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) | ATCC | CCL-186 | Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used. |
| Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 | Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines. | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R | (standard lab equipment) | |
| Computational Software | MATLAB | MATLAB 2020a | MathWorks, Natick, MA. |
| Confocal Microscope | Leica TCS SPEII confocal | Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy. | |
| Cover Glass (22 x 22) | Fisher Scientific | 12-545F | 0.13-0.17 mm No.1 Thickness |
| Cyanoacrylate super glue or silicone grease | Glue Masters | #THI0102 | Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred |
| DMEM media base | Corning; Mediatech, Inc | REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 | DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| DMEM/F-12 50/50 | Corning; Mediatech, Inc | REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethanol | Decon Labs | #V1101 | (standard lab reagent) |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 | Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered |
| Fine tip forceps | Fine Science Tools | #11295-00 | Dumont #5 forceps |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 | Made up in 0.1% BSA in PBS |
| Hydrocortisone | Alpha Easar | Lot # 5002F2A | made up in DMSO |
| Insulin (human) | Peprotech | Lot # 9352621 | |
| Inverted Light/Phase Contrast Microscope | VWR | 76317-470 | (standard lab equipment) |
| Isoproterenol | Alfa Aesar | #AAJ6178806 | DL-Isoproterenol hydrochloride, 98% |
| Keratinocyte-SFM (1x) media base | Gibco; Life Technologies Corporation | REF #: 10724-011; Lot # 2085518 | Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium |
| L-Ascorbic Acid | Fisher Chemical | Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 | Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt |
| L-glutamine (solid) | Fisher Bioreagents | CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 | L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder |
| MCDB 131 media base | Gen Depot | CM034-050, Lot # 03062021 | MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered |
| Metal punches | Sona Enterprises (SE) | 791LP, 12PC | Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2". |
| Methanol | Fisher Chemical | CAS # 67-56-1 | (optional). For clearing dehydration step. |
| Methyl Salicylate | Fisher Chemical | O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 | (optional). For clearing. |
| Microtubes, 1.7 mL | Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics | Cat # 24-282; Lot # 19467 | 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free |
| PBS, 10x Culture grade or autoclaved | APEX Bioresearch Products | Cat # 20-134, Lot # 202237 | PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. |
| PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium | Genesee Scientific Corporation | Ref # 25-508; Lot # 07171015 | |
| PBS, 1x non-Culture grade | APEX Bioresearch Products | Cat # 20-134, Lot # 202237 | PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | Ref # 15140-122, Lot # 2199839 | Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin) |
| Petri Dish, glass, small | Corning | PYREX 316060 | (optional). To be used as a clearing container |
| Petri Dishes, 100 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | Use for making up PDMS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | GMID 02065622, Batch # H04719H035 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI) |
| Dow Corning | GMID 02065622, Batch # H047JC4003 | DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent | |
| note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components. | |||
| Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) | Gilson | 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L | M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL |
| Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) | Gilson | 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S | Sterilized capillaries and pistons |
| Round tipped scoopula | (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging | ||
| Supplements for Keratinocyte-SFM media | Gibco; Life Technologies Corporation | Ref # 37000-015, Lot # 2154180 | Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014) |
| Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size | Corning; Costar | REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057 | Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, |
| Tissue Culture Plates, 12 well size | Greiner Bio-one; CellStar | Cat # 665 180; Lot # E18103QT | 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic |
| Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area | Genesee Scientific Corporation | Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B | Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene |
| Triton x 100 | Ricca Chemical Company | Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 | Wetting agent |
| Trypsin 0.25% | Corning; Mediatech, Inc | Ref # 25-053-CI | 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate |
| Type 1 Collagen isolated from Rat tail | Pel-Freez Biologicals | 56054-1 | Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249) |
| Vaccum chamber, benchtop | Bel-Art | F42010-0000 | (standard lab equipment) |
| Handheld Precision knife | X-Acto | X3311 | (X-Acto knife optional if purchased steel punches) |
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