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Bioengineering

स्वयं-इकट्ठे संवहनी मानव त्वचा समकक्ष की पीढ़ी

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62125
Automatic Translation
1, 1
1Departments of Bioengineering, University of California

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य दीर्घकालिक संस्कृति के लिए सुलभ और सरल तकनीकों का उपयोग करके संवहनी मानव त्वचा समकक्ष की पीढ़ी और मात्रात्मक विश्लेषण का वर्णन करना है। संभव हद तक, कदम के लिए तर्क शोधकर्ताओं को अपने अनुसंधान की जरूरत के आधार पर अनुकूलित करने की क्षमता की अनुमति के लिए वर्णित है ।

Abstract

मानव त्वचा समकक्ष (एचईएस) ऊतक इंजीनियर निर्माण हैं जो मानव त्वचा के मॉडल एपिडर्मल और डर्मल घटक हैं। इन मॉडलों का उपयोग त्वचा के विकास, घाव भरने और ग्राफ्टिंग तकनीकों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। कई HSEs के लिए vasculature कमी जारी है और इसके अतिरिक्त पोस्ट संस्कृति हिस्टोलॉजिकल अनुभाग जो संरचना के वॉल्यूमेट्रिक मूल्यांकन सीमा के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं । यहां प्रस्तुत एक सीधा प्रोटोकॉल है जो संवहनी मानव त्वचा समकक्ष (वीएचएसई) उत्पन्न करने के लिए सुलभ सामग्रियों का उपयोग करता है; इसके अलावा वर्णित इन निर्माणों की वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन तकनीक हैं। संक्षेप में, वीएचएसई का निर्माण 12 अच्छी तरह से संस्कृति आवेषण में किया जाता है जिसमें डर्मल और एपिडर्मल कोशिकाओं को चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार I जेल में वरीयता दी जाती है। डर्मल डिब्बे फाइब्रोब्लास्ट से बना है और एंडोथेलियल कोशिकाओं को कोलेजन जेल भर में फैलाया जाता है। एपिडर्मल डिब्बा केराटिनोसाइट्स (त्वचा एपिथेलियल कोशिकाओं) से बना है जो हवा-तरल इंटरफेस में अंतर करता है। महत्वपूर्ण बात, इन तरीकों शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर अनुकूलन कर रहे हैं, दो अलग फाइब्रोब्लास्ट सेल प्रकार के साथ VHSE पीढ़ी का प्रदर्शन परिणाम के साथ: मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट (hDF) और मानव फेफड़ों फाइब्रोब्लास्ट (IMR90s) । वीएचएसई को विकसित किया गया था, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से चित्रित किया गया था, और 4-और 8-सप्ताह के टाइमपॉइंट पर कंप्यूटेशनल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वॉल्यूमेट्रिकली रूप से विश्लेषण किया गया था। वॉल्यूमेट्रिक परीक्षा के लिए ठीक करने, दाग, छवि और स्पष्ट वीएचएसई के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। यह व्यापक मॉडल, इमेजिंग और विश्लेषण तकनीक पूर्व एचएसई अनुभव के साथ या बिना व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं की विशिष्ट अनुसंधान आवश्यकताओं के लिए आसानी से अनुकूलित हैं।

Introduction

मानव त्वचा प्रतिरक्षा/यांत्रिक बाधा के रूप में कार्य करने, शरीर के तापमान को विनियमित करने, जल प्रतिधारण और संवेदी भूमिकाओं में भाग लेने सहित कई आवश्यक जैविक कार्य करती है1,2,3,4। शारीरिक रूप से, त्वचा मानव शरीर में सबसे बड़ा अंग है और तीन मुख्य परतों (एपिडर्मिस, डर्मिस, और हाइपोडर्मिस) से बना है और एपिडर्मल कोशिकाओं के अलावा स्ट्रोमल, संवहनी, ग्रंथि और प्रतिरक्षा/तंत्रिका तंत्र घटकों की एक जटिल प्रणाली है। एपिडर्मिस स्वयं कोशिकाओं की चार परतों से बना है जो बाधा समारोह और देशी त्वचा की अन्य संरचनाओं (यानी पसीने और स्नेहक ग्रंथियों, नाखून)3को बनाए रखने के लिए लगातार नवीनीकृत होते हैं। त्वचा शरीर विज्ञान प्रतिरक्षा समारोह, घाव भरने, कैंसर जीव विज्ञान, और अन्य क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है, अग्रणी शोधकर्ताओं ने मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करने के लिए, इन विट्रो मोनोकल्चर से वीवो पशु मॉडल में। पशु मॉडल त्वचा शरीर विज्ञान की पूरी जटिलता का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करते हैं, हालांकि, आमतौर पर चूहों जैसे पशु मॉडलों में मनुष्यों की तुलना में महत्वपूर्ण शारीरिक अंतर होते हैं5। इन सीमाओं, और पशु मॉडलों की बढ़ी हुई लागत ने कई शोधकर्ताओं को विट्रो मॉडल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए नेतृत्व किया है जो मानव त्वचा1,6के शरीर विज्ञान को अधिक बारीकी से प्रतिबिंबित करते हैं। इनमें से एक सरल मॉडल प्रकार मानव एपिडर्मल समकक्ष (एचईई; जिसे आधी मोटाई वाले त्वचा मॉडल भी कहा जाता है) है जो एक कोलेकुलर डर्मल मैट्रिक्स पर केवल एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स से बना होता है, लेकिन वीवो में देखे गए एपिडरमल विभेदन और स्तरीकरण पर कब्जा करता है। इस पर निर्माण, डर्मल और एपिडर्मल घटकों (केराटिनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट) वाले मॉडलों को अक्सर मानव त्वचा समकक्ष (एचएसई), पूर्ण मोटाई त्वचा मॉडल, या ऑर्गेनोटिपिक त्वचा निर्माण (ऊएससी) के रूप में जाना जाता है। संक्षेप में, ये मॉडल जेल मैट्रिस के भीतर डर्मल कोशिकाओं को एनकैप्सुलेट करके उत्पन्न होते हैं और शीर्ष पर एपिडर्मल कोशिकाओं को सीडिंग करते हैं। एपिडर्मल विभेदन और स्तरीकरण तो विशेष मीडिया और हवा जोखिम7के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । त्वचा के समकक्ष अक्सर कोलेजन प्रकार से बने डर्मल जैल (चूहे की पूंछ या गोजातीय त्वचा मूल के)1, 8से बने डर्मल जैल का उपयोग करके स्वयं-असेंबली तकनीकों के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, लेकिन इसीतरहके मॉडलों ने फाइब्रिन9,10,फाइब्रोबला जैसे अन्य मैट्रिक्स घटकों को शामिल किया है11,12, कैडेवद डी-एपिडर्मिज झिल्ली13, 14,15,16,व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैल और अन्य 1 ,12,13,17,18,19. वर्तमान में, व्यावसायिक रूप से त्वचा समकक्ष उपलब्ध हैं (जैसा कि पहले1,2की समीक्षा की गई थी)। हालांकि, ये मुख्य रूप से चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए विकसित किए गए हैं और विशिष्ट शोध प्रश्नों के लिए आसानी से अनुकूलित नहीं किए जा सकते हैं।

एचईएस को घाव भरने, ग्राफ्टिंग, विष विज्ञान और त्वचा रोग/विकास11, 12, 13, 16,8,20,22,23केअध्ययनोंमें लागू किया गया है। यद्यपि 3 डी संस्कृति 2डी संस्कृतियों की तुलना में मानव ऊतक के कार्यों को अधिक व्यापक रूप से मॉडल करती है, 24 , 25,26 ,26जटिल ऊतकों में विविध कोशिका प्रकारों को शामिल करना जो अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित होते हैं । अधिकांश एचएसई में केवल डर्मल फाइब्रोब्लास्ट और एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स27शामिल हैं, हालांकि वीवो त्वचा वातावरण में कई अन्य सेल प्रकार शामिल हैं। हाल के अध्ययनों में अधिक सेल आबादी शामिल है; इनमें वेक्यूलेचर 10,28, 29,30, 31,32,33,34,उप-कटनी ऊतकों में एडिपोसाइट्स35,36,तंत्रिकाघटक19,21, स्टेम सेल27,37,38, प्रतिरक्षा कोशिकाएं10,39,40 , 41,42और अन्य रोग/ कैंसर विशिष्ट मॉडल16,40,43,44,45,46,47. इनमें से विशेष रूप से महत्वपूर्ण वास्कुलेचर है; जबकि कुछ एचएसई में संवहनी कोशिकाएं शामिल हैं, कुल मिलाकर उनके पास अभी भी पूरे डर्मिस10,29 मेंकनेक्टिविटी के साथ व्यापक केशिका तत्वों की कमी है, जो विट्रोस्थिरता 28में विस्तारित है, और उचित पोत घनत्व है। इसके अलावा, एचएसई मॉडल आमतौर पर पोस्ट-कल्चर हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग के माध्यम से मूल्यांकन किए जाते हैं जो एचईएस की त्रि-आयामी संरचना के विश्लेषण को सीमित करता है। त्रिआयामी विश्लेषण संवहनी घनत्व48, 49के वॉल्यूमेट्रिक मूल्यांकन के साथ-साथ एपिडर्मलमोटाई और भेदभाव के क्षेत्रीय भिन्नता के लिए अनुमति देता है।

हालांकि एचएसईएस सबसे आम ऑर्गेनोटिपिक मॉडल में से एक हैं, लेकिन इन निर्माणों को उत्पन्न करने में कई तकनीकी चुनौतियां हैं जिनमें उचित एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स और सेल घनत्व, मीडिया व्यंजनों, उचित एयर लिक्विड इंटरफेस प्रक्रियाओं और संस्कृति के बाद विश्लेषण की पहचान शामिल है। इसके अलावा, जबकि एचईई और एचएसई मॉडल ने प्रोटोकॉल प्रकाशित किए हैं, एक विस्तृत प्रोटोकॉल जिसमें हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के बजाय डर्मल वैक्यूलेचर और वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग शामिल है। यह काम मुख्य रूप से वाणिज्यिक सेल लाइनों से संवहनी मानव त्वचा समकक्ष (वीएचएसई) की संस्कृति के लिए एक सुलभ प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से अनुकूलन योग्य होने के लिए लिखा गया है, जो विभिन्न सेल प्रकारों और अनुसंधान आवश्यकताओं के लिए सीधे-आगे अनुकूलन की अनुमति देता है। पहुंच, उपलब्धता और लागत के हित में, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध उत्पादों के उपयोग पर सरल उत्पादों और उत्पादन तकनीकों के उपयोग को प्राथमिकता दी गई थी। इसके अलावा, सीधी वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन विधियों का वर्णन किया जाता है जो वीएचएसई की त्रि-आयामी संरचना के आकलन के लिए अनुमति देते हैं। इस प्रक्रिया को एक मजबूत और सुलभ प्रोटोकॉल में अनुवाद करना गैर-विशेषज्ञ शोधकर्ताओं को व्यक्तिगत चिकित्सा, संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग, भ्रष्टाचार विकास और दवा मूल्यांकन में इन महत्वपूर्ण मॉडलों को लागू करने में सक्षम बनाता है।

Protocol

1. 3 डी संस्कृति के लिए तैयारी

  1. स्थापितप्रोटोकॉल50, 51, 52का उपयोग करके 8 मिलीग्राम/एमएलपर चूहा पूंछ कोलेजन स्टॉक तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, चूहा पूंछ कोलेजन उचित सांद्रता पर विक्रेताओं (सामग्री सूची देखें) से खरीदा जा सकता है।
    नोट: कोलेजन को 3-10 मिलीग्राम/एमएल, या उच्च50, 51, 52की सीमा में विभिन्न सांद्रता पर तैयार या खरीदा जासकताहै। प्रोटोकॉल में गणना एक 8 मिलीग्राम/mL एकाग्रता मान लेकिन शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है ।
  2. सेल लाइनों का विस्तार करें: एंडोथेलियल और फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को 3 डी कोलेजन डर्मल घटक उत्पादन (चरण 2) की शुरुआत में सीडिंग के लिए तैयार रहने की आवश्यकता है। केराटिनोसाइट्स को 3डी कल्चर के 7 दिन तैयार रहने की जरूरत है । एक पूर्ण वीएचएसई निर्माण के लिए 7.5 x 105 एंडोथेलियल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है; 7.5 x 104 फाइब्रोब्लास्ट; और 1.7 x 105 केराटिनोसाइट्स पीढ़ी(तालिका 1)के लिए।
    नोट: ये घनत्व 12-अच्छी तरह से आकार पारमी ऊतक संस्कृति आवेषण या समकक्ष के लिए उपयुक्त हैं। कोशिका घनत्व और प्रारूप को शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है। स्पष्ट करने के लिए, एंडोथेलियल और फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं की यह मात्रा 1-3 डर्मल घटकों को बीज देगी, जबकि प्रत्येक एपिडर्मल घटक को 1.7 x 105 केराटिनोसाइट्स की आवश्यकता होती है।
  3. 300 x gपर 5 मिनट के लिए इस प्रोटोकॉल में सभी सेल अपकेंद्रित्र प्रदर्शन, लेकिन यह अधिक नाजुक सेल प्रकार के लिए कम किया जा सकता है।

2. 3डी कोलेजन डर्मल घटक का उत्पादन

नोट: चरण 2 एक समय संवेदनशील प्रक्रिया है और इसे एक सेटिंग में पूरा किया जाना चाहिए। डर्मल घटक सीडिंग शुरू करने से पहले उचित जेलेशन और एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए कोलेजन स्टॉक की गुणवत्ता जांच पूरी करने की सलाह दी जाती है, चर्चा में समस्या निवारण देखें।

  1. एसेलुलर कोलेजन लेयर तैयारी और सीडिंग
    1. दो 1.7 एमएल कैप्ड माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब तैयार करें, एक एसेलुलर सपोर्ट के लिए और एक सेलुलर डर्मिस के लिए। इस चरण में दी गई राशि 3 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन (लक्ष्य कोलेजन एकाग्रता) का 1 एमएल तैयार करेगी, जो (3) 12-अच्छी आकार के वीएचएसई के लिए पर्याप्त है। यदि समायोजन आवश्यक है तो समीकरण सूचीबद्ध हैं। शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर मात्रा और घनत्व दोनों को बढ़ाया जा सकता है (तालिका 2में सामान्य संदर्भ संख्या दी जाती है)।
    2. प्रत्येक ट्यूब में, संस्कृति ग्रेड 10x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) (एक ट्यूब 3 वीएचएसई निकलेगा) के 100 माइक्रोन जोड़ें और 1 एन नाओएच के 8.6 माइक्रोन जोड़ें। कम से कम 10 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए गीली बर्फ पर छाया हुआ ट्यूब रखें।
      Cs = कोलेजन स्टॉक एकाग्रता
      वीएफ = कोलेजन की अंतिम मात्रा की जरूरत
      Ct = लक्ष्य कोलेजन एकाग्रता
      Vs = वांछित राशि के लिए आवश्यक स्टॉक कोलेजन की मात्रा (Vf)
      वीपीबीएस = लक्ष्य कोलेजन एकाग्रता के लिए आवश्यक 10X पीबीएस की मात्रा (सीटी)
      वीNaOH = सीटी के लिए आवश्यक 1N NaOH की मात्रा
      Vमीडिया = मीडिया की मात्रा, कॉल निलंबन, या Ct के लिए आवश्यक ddH2O
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
    3. उपयोग के लिए 1000 और 250 माइक्रोन सकारात्मक विस्थापन पिपेट तैयार करें और अलग सेट करें। चूंकि बाद के चरण समय संवेदनशील होते हैं, इसलिए पिपेट टिप्स लोड करना और वॉल्यूम सेट करना सुविधाजनक है (क्रमशः 375 माइक्रोल और 125 माइक्रोन)। इसके अतिरिक्त, 516 माइक्रोल के लिए एक सामान्य 1000 माइक्रोन पिपेट सेटअप करें।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो सकारात्मक विस्थापन पिपेट को सामान्य पिपेट के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन कोलेजन की उच्च चिपचिपाहट और इस प्रक्रिया के समय/तापमान संवेदनशीलता के कारण, सकारात्मक विस्थापन पिपेट को लगातार सीडिंग परिणाम पैदा करने में मदद करने की सिफारिश की जाती है । यदि सामान्य पिपेट का उपयोग कर रहे हैं, तो धीमी गति से आंदोलनों का उपयोग करें।
    4. तैयार संस्कृति अच्छी तरह से प्लेटें डालें: बाँझ संदंश का उपयोग करने के लिए एक बाँझ 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में तीन 12 अच्छी तरह से आकार संस्कृति आवेषण जगह है, केंद्र स्तंभों में जगह है ।
    5. फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त कोल्ड मीडिया सेट करें।
    6. कैप्ड ट्यूबों को ठंडा करने के बाद, दिखाई देने वाली सामग्री के साथ रैक पर एक ट्यूब (एसेलुलर समर्थन के लिए) रखें। बर्फ पर दूसरी ट्यूब (सेलुलर डर्मिस के लिए) छोड़ दें।
    7. रेफ्रिजरेशन से 8 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन स्टॉक निकालें और गीली बर्फ पर रखें।
      नोट: फ्रीजर बर्फ या -20 डिग्री सेल्सियस बेंचटॉप कूलर का उपयोग न करें, क्योंकि इससे कोलेजन फ्रीज हो जाएगा।
    8. ठंडी छाया वाली ट्यूब में, मीडिया के 516 माइक्रोन जोड़ें और तुरंत 1000 माइक्रोन सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके 375 माइक्रोन कोल्ड कोलेजन जोड़ें। कोलेजन को समाधान में वितरित करें (ट्यूब के पक्ष में नहीं)। तुरंत खाली पिपेट टिप को हटा दें और मिश्रण करने के लिए तैयार 250 माइक्रोन सकारात्मक विस्थापन पिपेट पर स्विच करें।
      1. बुलबुला गठन को रोकने के लिए जल्दी से मिलाएं लेकिन धीरे-धीरे, यदि संभव हो तो समाधान से टिप न निकालें। मिश्रण जब तक समाधान समरूप रंग का है, जो आम तौर पर लगभग 5 पिपेट चक्र या 10 एस लेता है (यदि फिनॉल लाल के साथ मीडिया का उपयोग कर, तो रंग हल्का और समान हो जाएगा)। मिश्रण करते समय, समान मिश्रण के लिए ट्यूब (नीचे और ऊपर) के विभिन्न पदों से आकर्षित करना सुनिश्चित करें।
        नोट: यह सेल कल्चर ग्रेड वॉटर या अन्य सेल कल्चर ग्रेड लिक्विड के 516 माइक्रोन के साथ किया जा सकता है, हालांकि, अधिकांश मीडिया का फिनॉल लाल मिश्रण का एक अच्छा संकेतक है। 2D विस्तार के लिए उपयोग किए जाने वाले फाइब्रोब्लास्ट या एंडोथेलियल मीडिया का उपयोग करें।
    9. तुरंत तीन 12-अच्छी संस्कृति आवेषण में से प्रत्येक की झिल्ली पर एसेलुलर कोलेजन के 125 माइक्रोन को तितर-बितर करें। एसेलुलर कोलेजन जेल की एक समान कवरेज सुनिश्चित करने के लिए, पकवान को रॉक करें; यदि यह एक समान झिल्ली कवरेज नहीं बनाता है, तो अनिवार्य रूप से कोलेजन को धीरे-धीरे फैलाकर झिल्ली को पेंट करने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें; झिल्ली पर दबाव लगाना बचें। जेलेशन लगभग तुरंत शुरू होता है; यहां तक कि कवरेज सुनिश्चित करने के लिए इस कदम को जल्दी से करें।
      नोट: अतिरिक्त एसेलुलर कोलेजन होगा। मात्रा को कम किया जा सकता है, हालांकि, कोलेजन निलंबन के 1 एमएल से कम तैयारी करने से समाधान और अपर्याप्त जेलेशन को मिलाने में कठिनाइयां हो सकती हैं।
    10. तुरंत 12-अच्छी प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में ले जाएं ताकि इसे कम से कम 20 मिनट के लिए जेल दिया जा सके (एसेलुलर कोलेजन यदि आवश्यक हो तो लंबे समय तक जेल कर सकता है; इस जेलेशन समय के दौरान, चरण 2.2 पर आगे बढ़ें)। कोलेजन निलंबन को बर्फ से निकालें और वापस प्रशीतन में रखें (कोलेजन 4 डिग्री सेल्सियस पर सबसे स्थिर है)।
  2. सेल सस्पेंशन और सीडिंग तैयारी
    नोट: इस प्रोटोकॉल की संस्कृति समय रेखा के लिए, यह पनडुब्बी दिवस 1 (SD1) से मेल खाती है
    1. एसेलुलर कोलेजन समर्थन के जेलेशन के दौरान, एंडोथेलियल और फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों को ट्रिप्सिनाइज और गिनें।
    2. अपने संबंधित मीडिया के 258 माइक्रोल में7.5 x 10 5 एंडोथेलियल कोशिकाओं और7.5 x 10 4 फाइब्रोब्लास्ट को निलंबित करें और 516 माइक्रोन एलिकोट बनाने के लिए सेल निलंबन को जोड़ें। उपयोग होने तक गीली बर्फ पर सेल निलंबन बनाए रखें।
    3. उपयोग के लिए 1000 और 250 माइक्रोन सकारात्मक विस्थापन पिपेट तैयार करें और अलग सेट करें। चूंकि बाद के चरण समय संवेदनशील होते हैं, इसलिए पिपेट टिप्स लोड करना और वॉल्यूम सेट करना (क्रमशः 375 माइक्रोल और 250 माइक्रोन) करना सुविधाजनक है। इसके अतिरिक्त, 516 माइक्रोल के लिए एक सामान्य 1000 माइक्रोन पिपेट सेटअप करें।
  3. डर्मल डिब्बे की सेल लादेन कोलेजन सीडिंग
    1. जेलेशन अवधि के बाद, इनक्यूबेटर से एसेलुलर कोलेजन की 12 अच्छी प्लेट को हटा दें।
      नोट: यदि यह कोलेजन 30 मिनट के बाद नहीं है, तो प्रक्रिया जारी न रखें क्योंकि सीडिंग के दौरान गलती होने की संभावना थी या कोलेजन स्टॉक में समस्या हो सकती है (चर्चा में समस्या निवारण देखें)।
    2. गीली बर्फ से 1.7 एमएल कैप्ड ट्यूब निकालें (इसमें 10x पीबीएस और नाओएच शामिल हैं)। ट्यूब को एक रैक में रखें ताकि सामग्री दिखाई दे। ढीला/सभी टोपियां (सेल निलंबन, ठंड छाया ट्यूब) खुला ।
    3. स्टॉक कोलेजन (8 मिलीग्राम/एमएल) को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेशन से निकाल कर गीले बर्फ पर रखें। टोपी को खुला छोड़ दें।
    4. ठंडी कैप्ड ट्यूब में कूल्ड सेल सस्पेंशन का 516 माइक्रोन जोड़ें। 1000 माइक्रोन सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग तुरंत कोल्ड कोलेजन समाधान के 375 माइक्रोन को कैप्ड ट्यूब के समाधान में करने के लिए करें।
    5. ट्यूब में पिपेट से सभी कोलेजन को निष्कासित करें और सकारात्मक विस्थापन पिपेट टिप को त्याग दें। तुरंत 250 माइक्रोन सकारात्मक विस्थापन पिपेट पर स्विच करें और कोलेजन समाधान को मिलाएं।
    6. कोलेजन समाधान को पहले से पूरा करें (जल्दी से लेकिन धीरे-धीरे बुलबुला गठन को रोकने के लिए) मिलाएं, यदि संभव हो तो जेल से टिप न निकालें। जब तक समाधान समरूप न हो जाए तब तक मिलाएं (लगभग 5 पिपेट चक्र या 10 एस)। मिश्रण करते समय एक समान मिश्रण के लिए ट्यूब (नीचे और ऊपर) के विभिन्न पदों से आकर्षित करना सुनिश्चित करें।
    7. एक बार मिश्रित होने के बाद, तीन 12-अच्छी संस्कृति आवेषण में से प्रत्येक में सेल्युलर कोलेजन समर्थन पर सेलुलर कोलेजन समाधान के 250 माइक्रोन को तुरंत स्थानांतरित करें। acellular कोलेजन समर्थन की एक समान कवरेज सुनिश्चित करने के लिए, पकवान रॉक और/या सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करने के लिए धीरे से एकसेलुलर परत परेशान बिना चारों ओर हौसले से वरीयता प्राप्त सेलुलर कोलेजन कदम ।
    8. 12-अच्छी प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में ले जाएं ताकि इसे कम से कम 30 मिनट के लिए जेल दिया जा सके। उपयोग के बाद कोलेजन को 4 डिग्री सेल्सियस प्रशीतन में वापस रखें।
    9. 30 मिनट के जेल समय के बाद, धीरे-धीरे प्लेट को जेलेशन का आकलन करने के लिए झुकाएं। सुनिश्चित करें कि कोलेजन जम गया है।
    10. मिश्रण मीडिया के 500 माइक्रोल और 1000 माइक्रोन जोड़ें (आधा एंडोथेलियल और आधा फाइब्रोब्लास्ट रखरखाव मीडिया) क्रमशः ऊपरी कक्ष और डालने के निचले कक्ष में (ऊपर पहले, तो नीचे कोलेजन को धक्का से हाइड्रोस्टैटिक दबाव को रोकने के लिए)। कोलेजन के व्यवधान को कम करने के लिए, कोलेजन जेल पर सीधे नहीं, अच्छी तरह से के पक्ष में धीरे-धीरे मीडिया जोड़ें।
      1. सुनिश्चित करें कि कोलेजन जेल जलमग्न है, यदि आवश्यक हो तो अधिक मीडिया जोड़ें। रात भर इनक्यूबेशन के लिए सेल इनक्यूबेटर में अच्छी तरह से प्लेट रखें। इस स्तर पर, मीडिया में 10% एफबीएस होते हैं; प्रत्येक सेल लाइन के लिए सामान्य रखरखाव मीडिया (चित्रा 1,एमें दी गई टाइमलाइन और योजनाबद्ध)।
        नोट: पूरे वीएचएसई संस्कृति में मीडिया को कस्टम सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है; कुछ अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।
  4. पनडुब्बी दिवस 2 (SD2) मीडिया परिवर्तन
    1. वीएचएसई कुओं में 10% एफबीएस मीडिया को 5% एफबीएस हाफ फाइब्रोब्लास्ट में बदलें, आधा एंडोथेलियल मीडिया 100 माइक्रोग्राम/एमएल एल-एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक है। अच्छी तरह से के पक्ष में संस्कृति डालने के ऊपरी कक्ष में 500 μL जोड़ें (फिर से, कोलेजन के व्यवधान को कम करने के लिए साइडवॉल में ध्यान से जोड़ें) और निचले कक्ष में 1000 माइक्रोन जोड़ें।
    2. पनडुब्बी दिवस 7 (SD7) तक हर 2 दिन (SD4 और SD6) मीडिया को नवीनीकृत करें।
    3. कुओं से मीडिया को हटाने के लिए एक मैनुअल पिपेट का उपयोग करें। एक एस्पिरेटर का उपयोग करना संभव है, लेकिन निर्माण के नुकसान या विनाश में परिणाम कर सकते हैं।
      नोट: एल-एस्कॉर्बिक एसिड को हर 2-3 दिनों में ताजा बनाया जाना चाहिए (यह इस प्रकार हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उत्पादन करने के लिए समाधान में ऑक्सीकरण करता है, ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करता है और अंततः सेलुलर क्षति53)। इस प्रकार, मीडिया को SD2 से हर 2-3 दिनों में वीएचएसई संस्कृति के अंत तक बदल दिया जाना चाहिए क्योंकि एल-एस्कॉर्बिक एसिड मौजूद है। मीडिया का स्टॉक बनाना और हर फीडिंग डे पर मीडिया को एल-एस्कॉर्बिक एसिड की एक ताजा तैयार मात्रा जोड़ना सबसे आसान है। कल्चर ग्रेड वाटर या मीडिया को सॉल्वेंट के तौर पर इस्तेमाल करें और 100 मिलीग्राम/एमएल पर फ्रेश एल-एस्कॉर्बिक एसिड तैयार करें। एल-एस्कॉर्बिक एसिड फाइब्रोब्लास्ट द्वारा कोलेजन संश्लेषण को उचित दर पर उत्तेजित करता है और कोलेजन स्थिरता को बढ़ावा देता है54,55,56; यह एंडोथेलियल पारगम्यता को भी कम करता है और पोत वॉल इंटीग्रिटी56,57 को बनाए रखता है और इसके अतिरिक्त एपिडर्मल बैरियरफॉर्मेशन 6,58में योगदान देता है ।

3. एपिडर्मल घटक और स्तरीकरण प्रेरण की सीडिंग

  1. पनडुब्बी दिवस 7 (SD7): बीज keratinocytes
    नोट: SD7 पर एपिडर्मिस स्थापित करने के लिए बीज केराटिनोसाइट्स। इस बार प्वाइंट को शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर शिफ्ट किया जा सकता है। केराटिनोसाइट्स के बिना पनडुब्बी संस्कृति की अवधि 9 दिनों से अधिक नहीं होनी चाहिए, क्योंकि लंबे समय तक पनडुब्बी अक्सर डर्मल संकुचन की ओर ले जाती है। यदि संकुचन SD7 से पहले होता है, तो पनडुब्बी अवधि को 5 दिनों तक छोटा करने और SD5 पर बीज एपिडर्मिस की सिफारिश की जाती है। विशिष्ट प्रयोगों के लिए आवश्यक पनडुब्बी अवधि का अनुकूलन करें (चर्चा में समस्या निवारण देखें)।
    1. संस्कृति keratinocytes (N/TERT-120,५९ या अंय उपयुक्त कोशिकाओं) VHSEs पर trypsinization और बोने से पहले उनकी ढुलमुल सीमा के लिए । N/TERT-1 कोशिकाओं के लिए, 2डी संस्कृति59में केराटिनोसाइट्स के संयुक्त राष्ट्र-वांछित भेदभाव को रोकने के लिए 30% से अधिक नहीं होना चाहिए। प्राथमिक मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स जैसी अन्य उपयुक्त सेल लाइनों के लिए, 75-80% की एक समान सीमा आम तौर पर60का उपयोग किया जाता है।
    2. ट्राइपिनाइजेशन के बाद, 5% एफबीएस (टेबल 1) के साथ पूरक मानव त्वचा समकक्ष (एचएसई) विभेदन मीडिया के 600 माइक्रोन में510,000कोशिकाओं की गणना और निलंबन करें।
      नोट: 600 माइक्रोन में 510,000 कोशिकाएं 170,000 कोशिकाओं को निर्माण की अनुमति देती हैं जब प्रति निर्माण (3 वीएचएसई) 200 माइक्रोल सीडिंग होती है।
    3. एक मैनुअल पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक निर्माण के लिए वर्तमान में नीचे और शीर्ष कक्ष में मीडिया को इकट्ठा और त्यागें। जितना हो सके मीडिया इकट्ठा करना सुनिश्चित करें। मीडिया को इकट्ठा करें जो धीरे-धीरे संस्कृति डालने झिल्ली के नीचे पिपेट टिप रखकर पारगम्य झिल्ली के नीचे फंस सकता है और अस्थायी रूप से जगह से बाहर डालने दस्तक दे सकता है। हो सकता है कि सतही तनाव के कारण मीडिया फंस गया हो । सुनिश्चित करें कि आवेषण आगे बढ़ने से पहले अपने कुओं में फ्लैट बैठते हैं। एक एस्पिरेटर का उपयोग करना संभव है, लेकिन निर्माण के नुकसान या विनाश में परिणाम कर सकते हैं।
    4. प्रत्येक कुएं के निचले कक्ष में 5% एफबीएस के साथ पूरक एचएसई मीडिया के 1 एमसीएल जोड़ें। फिर प्रत्येक कुएं के शीर्ष कक्ष में सेल निलंबन के 200 माइक्रोन जोड़ें। सीधे डर्मल निर्माण सतह पर बीज। केराटिनोसाइट्स को इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए व्यवस्थित होने दें।
    5. केराटिनोसाइट्स सीडिंग के बाद दो एच, ध्यान से प्रत्येक निर्माण के शीर्ष कक्ष में 5% एफबीएस के साथ पूरक एचएसई मीडिया के 300 माइक्रोन जोड़ें; धीरे-धीरे संस्कृति डालने के पक्ष में मीडिया को पिपेट करें। शीर्ष कक्ष में मीडिया को बहुत सावधानी से लोड करें क्योंकि बसे हुए केराटिनोसाइट्स को परेशान न करें जो अभी तक अंतर्निहित कोलेजन जेल का कसकर पालन नहीं कर सकते हैं।
    6. मीडिया को लोड करने के बाद, जगह इनक्यूबेटर में वापस निर्माण करें।
  2. पनडुब्बी दिवस 8/9 (SD8 या SD9)
    1. 1% एफबीएस और 100 μg/mL L-ascorbic एसिड के साथ पूरक एचएसई मीडिया बनाओ ।
    2. एक मैनुअल पिपेटर के साथ ऊपरी और निचले दोनों कक्षों से मीडिया निकालें।
    3. पहले शीर्ष कक्ष में 500 माइक्रोन मीडिया जोड़ें और फिर नीचे कक्ष में 1 एमएल। (यह कदम SD8 या SD9 पर किया जा सकता है)
  3. पनडुब्बी दिवस 9/10 (SD9 या SD10, यह कदम 3.2 के बाद दिन होना चाहिए)
    1. 100 μg/mL L-ascorbic एसिड के साथ सीरम मुक्त एचएसई भेदभाव मीडिया बनाओ।
    2. एक मैनुअल पिपेटर के साथ ऊपरी और निचले दोनों कक्षों से मीडिया निकालें।
    3. ऊपरी कक्ष में 500 माइक्रोन लोड और निचले कक्ष में 1 एमएल।
  4. एयर-लिक्विड इंटरफेस डे 1 (ALI1)
    नोट: अली दिन के बाद 3.3 कदम प्रदर्शन किया जाता है.
    1. केवल ऊपरी कक्ष से मीडिया कचरे को हटाकर एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) के लिए प्रत्येक निर्माण को उठाएं। एक मैनुअल पिपेट का उपयोग करें ताकि इसे छूने या नुकसान पहुंचाए बिना एपिडर्मल परत के जितना संभव हो सके, उसके करीब हो।
    2. मीडिया को इकट्ठा करने के लिए प्लेट को विभिन्न कोणों पर थोड़ा झुकाएं। इस कदम में जितना संभव हो उतना मीडिया निकालें। लगातार आर्द्रता बनाए रखने के लिए प्लेट में आसपास के कुओं में बाँझ पानी के लगभग 2 मिलील जोड़ें; कुओं को पूरे संस्कृति में पानी से भरा रखें।
    3. प्लेट को कुछ एच बाद में देखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि केराटिनोसाइट्स अभी भी एयर-लिक्विड इंटरफेस पर हैं। यदि ऊपरी कक्ष में मीडिया है तो इसे हटा दें। प्रत्येक वीएचएसई के लिए मीडिया को अच्छी तरह से कितना मीडिया हटा दिया जाता है, (ऊपरी और निचले कक्षों (1500 माइक्रोन) की प्रारंभिक मात्रा - मीडिया ने हटा दिया = अली फीडिंग के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु)।
      नोट: VHSEs जरूरी एयर लिफ्ट के लिए एक ही मीडिया स्तर की आवश्यकता नहीं है; आमतौर पर अगर VHSEs एक साथ वरीयता प्राप्त कर रहे है तो वे हवा लिफ्ट के लिए मीडिया के एक ही स्तर के बारे में की जरूरत है, लेकिन यह हमेशा मामला नहीं है । अली को बनाए रखने के लिए आवश्यक मात्रा को समायोजित करें लेकिन यह सुनिश्चित करें कि मीडिया का स्तर इतना कम न हो कि वीएचएसई सूख जाएं। एयर लिफ्ट और हाइड्रेशन के बीच संतुलन पूरा होने तक रोजाना सतर्क रहना और छोटी मीडिया मात्रा को हटाना सुरक्षित है ।
  5. अली दिन 2 (ALI2)
    1. इस बिंदु से, केवल सीरम मुक्त एचएसई मीडिया का उपयोग करें १०० μg/mL L-ascorbic एसिड के साथ पूरक । अली दिवस 2 (ALI2) पर मीडिया बदलें । यदि शीर्ष कक्ष में मीडिया है, तो इसे हटा दें और इसे पहले दर्ज किए गए मीडिया की मात्रा में जोड़ें। पिछले चरण में समीकरण का उपयोग करके आवश्यक मीडिया की मात्रा की गणना करें। उदाहरण के लिए: यदि ऊपरी कक्ष से मीडिया के 200 माइक्रोन को हटा दिया गया था तो अली को स्थापित करने के लिए 1300 माइक्रोल जोड़ें (1500 माइक्रोन के रूप में - 200 माइक्रोल = 1300 माइक्रोन)
    2. प्रत्येक कुएं के नीचे कक्ष में लोड करने के लिए गणना की मात्रा का उपयोग करें, फिर प्लेट को सेल इनक्यूबेटर में वापस रखें। प्रति दिन उपयोग की जाने वाली मात्रा का ट्रैक रखें। 12-अच्छी संस्कृति आवेषण में अनुशंसित कोलेजन राशि का उपयोग करते समय, अली मूल्यों की सामान्य सीमा 750 माइक्रोन और 1300 माइक्रोन के बीच आती है। आमतौर पर, मात्रा संस्कृति परिपक्वता पर कम हो जाती है और अली के 2/3 सप्ताह के आसपास सुसंगत हो जाती है। संस्कृति की बारीकियों के आधार पर, यह संख्या बदल सकती है और अनुकूलित की जानी चाहिए (जैसा कि 3.4.2 - 4.1 में वर्णित है)।

4. संवहनी मानव त्वचा के समकक्ष नियमित रखरखाव

  1. अली दिवस 3 (ALI3) से संस्कृति अंत बिंदु के माध्यम से: १०० μg/mL L-ascorbic एसिड के साथ सीरम मुक्त एचएसई मीडिया का उपयोग कर हर 2-3 दिनों में निचले कक्ष के मीडिया को नवीनीकृत करें । चरण 3.5.2 में वर्णित अली के लिए नीचे कक्ष में आवश्यक मीडिया स्तर को समायोजित और ट्रैक करना जारी रखें।
  2. चूंकि एपिडर्मल सतह को हवा के संपर्क में रहना चाहिए, इसलिए मीडिया स्तर को दैनिक रूप से जांचें और समायोजित करें जब तक कि लगातार अली स्तर स्थापित न हो जाएं। एपिडर्मल परत हाइड्रेटेड दिखनी चाहिए, सूखी नहीं, लेकिन निर्माण के शीर्ष पर मीडिया पूल नहीं होना चाहिए। अली के 8 सप्ताह के साथ संस्कृतियों सबसे सुसंगत आकृति विज्ञान और अभिव्यक्ति प्रदान की है; हालांकि, आवेदन के आधार पर, 4 से 12 सप्ताह की संस्कृतियां उपयुक्त हो सकती हैं। विभिन्न कोशिका और संस्कृति स्थितियों के लिए संस्कृति अवधि को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    नोट: मीडिया बदलना सोमवार, बुधवार, शुक्रवार एक अच्छा अभ्यास है । VHSEs सप्ताहांत में स्वस्थ हैं, लेकिन मीडिया सोमवार को जल्दी और शुक्रवार को देर से बदल जाना चाहिए । पूरी तरह से चरण 1-4 को पूरा करने के बाद, एक वीएचएसई की पीढ़ी पूरी हो जाती है। प्रोटोकॉल के चरण 5-अंत वैकल्पिक प्रसंस्करण और इमेजिंग तकनीक हैं जिन्हें इस प्रकार के 3डी निर्माण के लिए अनुकूलित किया गया है।

5. 3 डी निर्माण का निर्धारण और पारीकरण

नोट: चरण 5 को इस 3 डी निर्माण के लिए विशिष्ट इमेजिंग तकनीकों के लिए अनुकूलित किया गया है जो प्रोटोकॉल के शेष में उल्लिखित हैं। वीएचएसई उत्पन्न करने के लिए निम्नलिखित कदम आवश्यक नहीं हैं।

  1. फिक्सेशन/परिधीकरण
    1. संस्कृति अवधि के अंत बिंदु पर प्रत्येक कुएं के ऊपरी और निचले कक्षों से सभी मीडिया को सावधानीपूर्वक हटा दें।
      नोट: एपिडर्मल परत संभवतः नाजुक है, देखभाल के साथ संभाल और आक्रामक pipetting के साथ एपिडर्मिस उत्तेजित नहीं है ।
    2. प्रत्येक निर्माण को पूर्व-ठीक करने के लिए, ऊपरी कक्ष की दीवार (सीधे निर्माण पर नहीं) और फिर निचले कक्ष में पीबीएस (पीएच 6.9) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) जोड़ें। प्रति कक्ष 1 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बेनकाब करें।
      सावधानी: पीएफए खतरनाक है और आंखों की सुरक्षा सहित देखभाल और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के साथ संभाला जाना चाहिए।
    3. 5 मिनट के बाद 4% पीएफए समाधान निकालें और पिछले चरण में वर्णित ऊपरी और निचले कक्षों के लिए 4% पीएफए समाधान में 0.5% ट्राइटन एक्स 100 जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बेनकाब; वीएचएसई निर्माण के लिए अब से बाँझ वातावरण की आवश्यकता नहीं है।
    4. 1 घंटे के बाद, ध्यान से दोनों कक्षों से पारमेबिलाइजेशन/निर्धारण समाधान को हटा दें और 1x पीबीएस के साथ 3 बार नमूना धोएं।
    5. पीबीएस में नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस प्रशीतन या तुरंत दाग में स्टोर करें। नमूनों को स्टोर करने के लिए, डिश को प्लास्टिक की चादर में लपेटें और फिर वाष्पीकरण और प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए पन्नी
      नोट: ठहराव बिंदु - निर्धारण और पारमेबिलाइजेशन के बाद, इस प्रक्रिया को रोका जा सकता है क्योंकि नमूने कई हफ्तों तक स्थिर होते हैं यदि चरण 5.1.5 में उल्लिखित तैयार किए जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, धुंधला (जैसा कि चरण 6 में वर्णित है) को चरण 5 के तुरंत बाद पूरा किया जा सकता है।

6. 3 डी निर्माण के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला

  1. निर्माण की तैयारी
    नोट: VHSEs अच्छी तरह से दाग जब संस्कृति डालने की असुरक्षित झिल्ली से अलग; झिल्ली से पृथक्करण संयुक्त राष्ट्र-बाधित इमेजिंग के लिए भी आवश्यक है और धुंधला करने के लिए कम मात्रा को सक्षम करता है।
    1. इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला के लिए निर्माण तैयार करने के लिए, एक डालें उल्टा बारी और यह अच्छी तरह से थाली पर अपनी अच्छी तरह से जगह (यदि VHSE गिर जाता है, यह PBS के साथ अच्छी तरह से गिर जाएगी)(पूरक चित्रा 1A)।
    2. डालने झिल्ली की परिधि के बारे में आधा कटौती करने के लिए ठीक टिप संदंश और/या एक सटीक चाकू का उपयोग करते हुए अच्छी तरह से एक हाथ से सम्मिलित को स्थिर करें । वीएचएसई निर्माण की क्षति को रोकने के लिए एक सौम्य हाथ से संभव के रूप में प्लास्टिक आवास के करीब कटौती करें।
    3. ठीक टिप संदंश का उपयोग करना, कट झिल्ली फ्लैप के किनारे को पकड़ो और धीरे-धीरे डालने से छिद्रपूर्ण झिल्ली को छीलने के साथ-साथ वीएचएसई निर्माण भी करें। वीएचएसई निर्माण संरचना को नुकसान को रोकने के लिए इसे बहुत सावधानीपूर्वक और धीरे-धीरे करें। यदि वीएचएसई निर्माण आसानी से अलग हो जाता है तो इसे नीचे कुएं में गिरना चाहिए, यदि यह कक्ष के किनारे पर फंस जाता है तो इसे अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए ठीक टिप संदंश या एक छोटे से स्कूपुला का उपयोग करें। एपिडर्मल परत के प्रति बहुत ध्यान रखें क्योंकि यह आमतौर पर नाजुक है(पूरक चित्रा 1A)।
      नोट: कभी-कभी झिल्ली आसानी से नहीं आती है या टुकड़ों में बंद हो जाती है, यदि ऐसा होता है तो झिल्ली को ध्यान से खींचने के लिए उपकरणों का उपयोग करें और वीएचएसई अलग-अलग निर्माण करें। सुनिश्चित करें कि यदि आवश्यक हो तो पीबीएस में डुबकी लगाकर इस प्रक्रिया के दौरान वीएचएसई सूख न जाएं।
    4. एक बार जब वीएचएसई कुएं में हो, तो डालने झिल्ली के किसी भी शेष टुकड़े को त्याग दें और संस्कृति को धुंधला करने के दौरान एक जलमग्न स्थिति में वीएचएसई को पकड़ने के लिए प्रत्येक कुएं में आवास डालें।
  2. धुंधला
    नोट: धुंधला और संबद्ध हैंडलिंग/हेरफेर और वॉश के रूप में धीरे से संभव के रूप में प्रदर्शन किया जाना चाहिए के बाद से VHSEs नाजुक हो सकता है । यदि एपिडर्मिस के कुछ हिस्से बंद हो जाते हैं, तो टुकड़ों को अलग से दाग दिया जा सकता है; एपिडर्मिस की ऊपरी परतें नाजुक हैं और प्राकृतिक विस्क्वमेशन4से गुजरती हैं, लेकिन विश्लेषण के लिए जितना संभव हो उतना अखंडता बनाए रखना महत्वपूर्ण है।
    1. प्रति निर्माण को अच्छी तरह से अवरुद्ध करने के 700 माइक्रोन में चुने हुए प्राथमिक एंटीबॉडी दाग तैयार करें (आमतौर पर, सभी प्राथमिक एंटीबॉडी एक ही धुंधला समाधान में हो सकते हैं, लेकिन नए एंटीबॉडी के लिए इसकी पुष्टि की जानी चाहिए)। 700 μL 12-अच्छी आकार के लिए काम करता है, लेकिन अन्य संस्कृति प्रारूपों के लिए समायोजित किया जा सकता है। बफर नुस्खा को अवरुद्ध करने के साथ प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की अनुशंसित सांद्रता तालिका 3 में दी जाती है (अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है)।
    2. किसी भी पीबीएस को मैनुअल पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से हटा दें, वीएचएसई से दूर होने के लिए सावधान रहें (जैसा कि वीएचएसई तैर रहे हैं, वैक्यूम आकांक्षा की सिफारिश नहीं की जाती है)।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से प्राथमिक दाग समाधान जोड़ें और संस्कृति को अच्छी तरह से आवास डालें ताकि वीएचएसई को तरल पदार्थ में डूबे रहें(पूरक चित्रा 1B)। अच्छी तरह से प्लेट को प्लास्टिक की चादर से लपेटें। आंदोलन या कमाल के बिना 4 डिग्री सेल्सियस प्रशीतन में 48 घंटे के लिए पन्नी और दाग (कमाल वीएचएसई निर्माण को नुकसान पहुंचा सकता है)।
    4. 48 एच के बाद, बफर (प्रति अच्छी तरह) को अवरुद्ध करने के 700 माइक्रोन में माध्यमिक एंटीबॉडी और रासायनिक दाग तैयार करें।
    5. संस्कृति डालने आवास और प्राथमिक दाग समाधान निकालें और माध्यमिक दाग समाधान जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए 1x PBS, 3x के साथ धोने । वीएचएसई निर्मित जलमग्न(पूरक चित्रा 1B)रखने के लिए संस्कृति आवास को वापस अच्छी तरह से डालें। आंदोलन या कमाल के बिना 4 डिग्री सेल्सियस प्रशीतन में 48 घंटे के लिए बेनकाब करें।
    6. 48 एच एक्सपोजर के बाद, मैनुअल पिपेटर के साथ दाग समाधान को हटा दें और पीबीएस के साथ धीरे-धीरे 3x धोएं; सीधे वीएचएसई पर तरल पदार्थ को पिपेट न करें क्योंकि वे नाजुक हो सकते हैं। अतिरिक्त पीबीएस के साथ रिहाइड्रेट करें और संस्कृति को आवास को भंडारण के दौरान जलमग्न और हाइड्रेटेड रखने के लिए आवास को वापस अच्छी तरह से रखें (वाष्पीकरण और प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए प्लास्टिक की चादर और पन्नी में लपेटकर स्टोर करें)
  3. समाशोधन (वैकल्पिक और टर्मिनल)
    नोट: समाशोधन इमेजिंग के लिए वैकल्पिक है। यदि पूरा हो जाता है, तो यह नमूने को पूरी तरह से धुंधला करने के बाद किया जाना चाहिए क्योंकि समाशोधन आगे धुंधला होने से रोकता है, फ्लोरोफोर प्रदर्शन को बदल सकता है, और वीएचएसई संरचना को नुकसान पहुंचा सकता है। कई ऊतक समाशोधन विधियां49,61,62 मौजूद हैं और विशिष्ट परियोजनाओं के लिए अनुकूलित की जा सकती हैं। मिथाइल सैलिसिलेट समाशोधन, नीचे वर्णित है, वीएचएसई के लिए सरल और प्रभावी दोनों है। निम्नलिखित समाशोधन तकनीक को ग्लास कंटेनरों में पूरा किया जाना चाहिए और पिपेट टिप्स ग्लास या पॉलीप्रोपाइलीन होना चाहिए (पॉलीस्टीरिन मिथाइल सैलिसिलेट के संपर्क में भंग हो जाएगा)। एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र या धुएं हुड में सभी समाशोधन प्रक्रिया को पूरा करें।
    1. एक छोटे उथले ग्लास कंटेनर में 100% मेथनॉल जोड़ें (ग्लास पेट्री व्यंजन अच्छी तरह से काम करते हैं)। सबसे छोटे संभव कंटेनर का उपयोग करें जो निर्माण में फिट होगा (अभिवाचित कचरे को कम करने के लिए)।
    2. संदंश/स्कूपुला(पूरक चित्रा 1C)का उपयोग करके अच्छी तरह से प्लेट से निर्माण को हटा दें और मेथनॉल से भरे कंटेनर में रखें। यदि निर्माण जलमग्न नहीं है तो अधिक मेथनॉल जोड़ें।
    3. 3 x 10 मिनट विसर्जन के लिए मेथनॉल में वीएचएसई का निर्माण निर्जलित करें; प्रत्येक विसर्जन के बाद मेथनॉल को पूरी तरह से बदल दें और अंतिम स्नान के बाद मेथनॉल को तुरंत हटा दें। इस प्रक्रिया के दौरान, निर्माण अधिक अपारदर्शी हो सकता है और थोड़ा सिकुड़ सकता है।
      नोट: इन अवधियों और पुनरावृत्ति को अनुकूलित किया गया है लेकिन विशिष्ट संस्कृति प्रारूप और दाग के आधार पर मेथनॉल और निम्नलिखित मिथाइल सैलिसिलेट प्रक्रियाओं को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    4. मेथनॉल निकालने के तुरंत बाद मिथाइल सैलिसिलेट डालें और वीएचएसई को 5 x 5 मिनट के विसर्जन में जलमग्न कर दें। पूरी तरह से प्रत्येक विसर्जन के बाद अभिवाखधा की जगह और भंडारण के लिए 5 विसर्जन समाधान में VHSE छोड़ दें । इस प्रक्रिया के दौरान, निर्माण पारदर्शी हो जाता है।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्माण या स्टोर छवि। समाशोधन के बाद, जितनी जल्दी हो सके सभी इमेजिंग को पूरा करें, क्योंकि फ्लोरोफोरस दिनों के भीतर मिथाइल सैलिसिलेट में नीचा हो सकता है। समाशोधन के कारण निर्माण भंगुर हो जाते हैं और विस्तारित भंडारण, जबकि अनुशंसित नहीं है, यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित जांच की आवश्यकता होती है कि मिथाइल सैलिसिलेट की पर्याप्त मात्रा है।

7. 3 डी निर्माण की कॉन्फोकल इमेजिंग

नोट: ऊतक संस्कृति प्लास्टिक के माध्यम से इमेजिंग कवरस्लिप ग्लास के माध्यम से इमेजिंग के रूप में छवि की एक ही गुणवत्ता उपज नहीं होगा, इस विधि एक कस्टम ग्लास के निर्माण का वर्णन-नीचे अच्छी तरह से confocal इमेजिंग के दौरान सुखाने को रोकने के लिए । आमतौर पर, यह इमेजिंग के कम से कम 3 घंटे के लिए पर्याप्त है।

  1. इमेजिंग से दो दिन पहले: पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) तैयार करें
    1. पीडीएमएस48,63,64 [9:1], आधार: क्रॉसलिंकर की एक सुझाई गई एकाग्रता पर तैयार करें। कुल 30 ग्राम पीडीएमएस तैयार करें: 27 ग्राम बेस कंपोनेंट और 3 ग्राम क्रॉसलिंकर। किसी भी साफ मिश्रण पोत को वजन संतुलन पर रखें और पैमाने पर धड़ाएं। आधार (27 ग्राम) जोड़ें और फिर कुल 30 ग्राम प्राप्त करने के लिए क्रॉसलिंकर (3 ग्राम) जोड़ें। क्रॉसलिंकर से पहले हमेशा आधार जोड़ें।
    2. कम से कम 4 मिनट के लिए समाधान को सख्ती से हिलाएं; यह छोटे बुलबुले पैदा करेगा। पर्याप्त मिश्रण के बाद, पीडीएमएस को 100-मिमी पेट्री डिश, या इसी तरह के फ्लैट बॉटम हीट प्रतिरोधी कंटेनर में डालें।
    3. डी-गैस एक वैक्यूम चैंबर में पीडीएमएस जब तक मिश्रण से सभी बुलबुले गायब हो जाते हैं और पीडीएमएस स्पष्ट नहीं होते हैं। वैक्यूम को धीरे-धीरे छोड़ें और पीडीएमएस (धीरे-धीरे) को हटा दें। रात भर (50-60 डिग्री सेल्सियस) का इलाज करने के लिए पकवान को ओवन में रखें; सुनिश्चित करें कि पकवान समान रूप से इलाज करने के लिए पीडीएमएस के लिए फ्लैट बैठा है।
      नोट: इलाज के बाद, पीडीएमएस स्पष्ट होना चाहिए और सतह चिकनी होनी चाहिए और चिपचिपा नहीं होना चाहिए (चिपचिपापन अपर्याप्त मिश्रण का संकेत दे सकता है)।
  2. इमेजिंग से एक दिन पहले: पीडीएमएस अच्छी तरह से तैयारी
    1. एक स्टील पंच या हाथ में सटीक चाकू का उपयोग करना, पंच या 7.1 में तैयार पीडीएमएस शीट से अच्छी तरह से एक परिपत्र काट दिया। कुआं वीएचएसई निर्माण के समान आकार के आसपास होना चाहिए। एक भी पीडीएमएस को अच्छी तरह से बनाने के लिए परिपत्र के चारों ओर एक वर्ग पैच काटें। तैयार की गई 30 ग्राम पीडीएमएस राशि से कम से कम चार कस्टम कुएं निकलने चाहिए।
      नोट: पीडीएमएस अच्छी तरह से वीएचएसई निर्माण के आकार के करीब होना चाहिए। यह इमेजिंग के दौरान नमूना गति कसना चाहिए। कई कुओं को एक बार में गढ़ा जा सकता है और एक साफ कंटेनर में अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. पीडीएमएस के समान आकार के ग्लास कवरलिप का उपयोग करके, पीडीएमएस की निचली सतह (चिकनी सतह जो पेट्री डिश के संपर्क में थी) में साइनोएक्रिलेट गोंद (उदाहरण के लिए, सुपर गोंद) जोड़ें और डिस्पोजेबल पिपेट टिप के साथ समान रूप से धब्बा लगाएं। केंद्र, और पीडीएमएस को अच्छी तरह से ग्लास पर दबाएं, जबकि छिद्रित सर्कल के भीतर एक स्पष्ट ग्लास खिड़की छोड़ दें (सुनिश्चित करें कि गोंद देखने वाली खिड़की पर गंदा नहीं है)।
      नोट: यदि उपलब्ध है, तो कवरस्लिप के लिए पीडीएमएस का प्लाज्मा संबंध एक वैकल्पिक65,66,67है।
    3. उपयोग करने से पहले गोंद को कई घंटों या रात भर सूखने दें। ये पुन: प्रयोज्य हैं जब तक वे सामान्य टूट-फूट से नहीं टूटते।
      नोट: इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से उपयोग किए जाने वाले चिपके हुए पीडीएमएस में नमूनों को दागने की सिफारिश नहीं की जाती है। इन कुओं कई घंटे के लिए तरल पदार्थ पकड़ लेकिन अब धुंधला के दौरान रिसाव कर सकते हैं ।
  3. वीएचएसई इमेजिंग
    नोट: यदि इमेजिंग नमूनों को अस्पष्ट कर दिया गया है, तो पीबीएस को इमेजिंग समाधान के रूप में उपयोग करें। यदि मंजूरी दे दी नमूनों के साथ इमेजिंग, इमेजिंग समाधान के रूप में मिथाइल सैलिसिलेट (या चुना समाशोधन समाधान) का उपयोग करें।
    1. पीडीएमएस में इमेजिंग समाधान की कुछ बूंदें अच्छी तरह से जोड़ें और लीक की जांच करें (यदि कोई रिसाव है, तो इसे साइनोक्रेलेट सुपर गोंद के डॉट/स्मिर के साथ मरम्मत करें या किसी अन्य कुएं का उपयोग करें)।
    2. वीएचएसई को जोड़ते समय पीडीएमएस में इमेजिंग सॉल्यूशन अच्छी तरह से रखें। स्कूपुला या फाइन टिप संदंश(पूरक चित्रा 1C)का उपयोग करके, 12-अच्छी प्लेट से निर्माण को हटा दें और ग्लास कवरस्लिप पर अच्छी तरह से पीडीएमएस में रखें। उद्देश्य की ओर सामना करना पड़ ब्याज के अभिविन्यास के साथ जगह का निर्माण। उदाहरण के लिए, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एपिडर्मिस की छवि बनाने के लिए, सुनिश्चित करें कि एपिडर्मिस नीचे का सामना कर रहा है, कांच की ओर।
      1. वैकल्पिक रूप से, एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के लिए, एपिडर्मिस का सामना करें। नीचे इमेजिंग प्रक्रियाओं को एक उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन आसानी से एक ईमानदार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
        नोट: नुकसान से बचने के लिए वीएचएसई में हेरफेर करते समय सतर्क रहें। वीएचएसई गिरने की स्थिति में अच्छी प्लेट पर स्थानांतरण करें। एक तुला, फ्लैट टिप स्कूपुला निर्माण(पूरक चित्रा 1C)को स्थानांतरित करने का सबसे आसान तरीका है।
    3. सुनिश्चित करें कि नमूना अच्छी तरह से फ्लैट में बैठा है और एपिडर्मिस या डर्मिस के किसी भी हिस्से को नमूने के नीचे नहीं मोड़ा जाता है। यदि तह होता है, तो धीरे-धीरे नमूने को संदंश या स्कूपुला के साथ हेरफेर करें; वीएचएसई को फ्लोट करने के लिए अस्थायी रूप से अतिरिक्त इमेजिंग समाधान जोड़ने से इसे सीधा करने में मदद मिल सकती है। नमूने की तह या झुर्रियों को आंखों द्वारा या माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा जा सकता है।
    4. नमूना हाइड्रेटेड रखने के लिए बस पर्याप्त तरल पदार्थ का उपयोग करके इमेजिंग समाधान के साथ अच्छी तरह से भरें; बहुत अधिक तरल पदार्थ नमूना फ्लोट करेगा, जिसके परिणामस्वरूप इमेजिंग के दौरान गति होगी। निर्माण ग्लास देखने की खिड़की पर बैठना चाहिए; पीडीएमएस को अच्छी तरह से झुकाकर आंदोलन के लिए परीक्षण करें। यदि आंदोलन है, तो कुछ तरल पदार्थ निकालें; जोड़ने और तरल पदार्थ ड्रॉप बुद्धिमान हटाने जब तक आंदोलन बंद हो जाता है।
    5. इमेजिंग(पूरक चित्रा 1D)के दौरान वाष्पीकरण को कम करने के लिए कुएं पर एक ग्लास स्लाइड रखें। लंबे इमेजिंग सत्रों के लिए, उचित तरल पदार्थ के स्तर को सुनिश्चित करने के लिए अक्सर नमूने की जांच करें। यदि सुलभ हो, तो इमेजिंग के दौरान एक आर्द्रीकृत कक्ष का उपयोग किया जा सकता है (हालांकि यह आमतौर पर आवश्यक नहीं है)।
    6. कांच के कवरलिप विंडो(पूरक चित्रा 1D)के माध्यम से माइक्रोस्कोप स्टेज और इमेज पर नमूना रखें। यह तकनीक कम से कम 3 घंटे तक निरंतर कॉन्फोकल इमेजिंग की अनुमति देती है, लेकिन नमूने के हाइड्रेशन की नियमित रूप से जांच की जानी चाहिए, जिसमें जरूरत पड़ने पर इमेजिंग समाधान जोड़ा जाता है।
      नोट: यदि नमूना साफ हो जाता है, तो मिथाइल सैलिसिलेट समय के साथ गोंद को नीचा कर देगा। पीडीएमएस के गोंद संबंध को इमेजिंग रन के बीच फिर से लागू किया जा सकता है; या नमूना समय-समय पर नए कुओं में स्थानांतरित किया जा सकता है। प्लाज्मा संबंध के साथ कुओं में, यह एक मुद्दा नहीं होगा ।
    7. इमेजिंग के बाद, अच्छी तरह से जितना संभव हो इमेजिंग तरल पदार्थ के साथ नमूना फ्लोट करें। नमूने को अपने भंडारण में अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए स्कूपुला या ठीक टिप संदंश का उपयोग करें। नमूना गिरने की स्थिति में एक अच्छी तरह से प्लेट पर स्थानांतरण करें।
    8. प्रत्येक पीडीएमएस अच्छी तरह से और शीर्ष ग्लास कवरलिप को तब तक फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है जब तक कि वे टूट न जाएं। इमेजिंग से पहले नीचे ग्लास साफ, दोनों के अंदर और बाहर अच्छी तरह से । फिर से उपयोग करने से पहले, हमेशा लीक और गोंद के साथ मरम्मत के लिए जांच करें, जैसा कि आवश्यक है।
    9. चरण 6.3.6 में वर्णित नमूनों को स्टोर करें और बनाए रखने के लिए हर कुछ महीनों में पीबीएस जोड़ें; यदि नमूनों को मंजूरी दे दी जाती है, तो मिथाइल सैलिसिलेट का उपयोग करके ग्लास में स्टोर करें और नियमित रूप से स्तरों की जांच करें। स्वीकृत नमूने तेजी से (दिनों के भीतर) को नीचा कर सकते हैं और जितनी जल्दी हो सके इमेजकिया जाना चाहिए।

Representative Results

यहां टेलोमेराज़ रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (टीईआरटी) अमर केराटिनोसाइट्स (एन/टीईआरटी-120,59),वयस्क मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट (एचडीएफ), और मानव माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएमईसी-1)(चित्रा 1)का उपयोग करके इन विट्रो वैस्कुलर मानव त्वचा समकक्ष (वीएचएसई) के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल की अनुकूलन प्रकृति को एचडीएफ के बजाय आमतौर पर उपलब्ध फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट (IMR90) का उपयोग करते समय वीएचएसई पीढ़ी और स्थिरता का प्रदर्शन करके भी हाइलाइट किया जाता है। वीएचएसई की उत्पादन चरण 1-4 में पूरी की जाती है, जबकि चरण 5-7 वैकल्पिक अंत बिंदु प्रसंस्करण और इमेजिंग तकनीक हैं जिन्हें इन वीएचएसई के लिए अनुकूलित किया गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वीएचएसई को विशिष्ट शोध प्रश्नों के अनुसार संसाधित किया जा सकता है और निर्माण उत्पन्न करने के लिए चरण 5-7 की आवश्यकता नहीं है। वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण विधि प्रदर्शित करने के लिए वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग, विश्लेषण और 3 डी रेंडरिंग पूरी की गई। ये वॉल्यूमेट्रिक तैयारी और इमेजिंग प्रोटोकॉल व्यापक 3 डी विश्लेषण की अनुमति देते हुए सूक्ष्म और स्थूल दोनों स्तरों पर वीएचएसई संरचना को संरक्षित करते हैं।

एपिडर्मिस और डर्मिस का लक्षण वर्णन वीएचएसई निर्माण(चित्र 2,3)में मानव त्वचा के लिए उपयुक्त इम्यूनोफ्लोर्सेंट मार्कर दिखाता है। साइटोकेराटिन 10 (सीके 10) एक प्रारंभिक विभेदन केराटिनोसिट मार्कर है जो आमतौर पर त्वचा के समकक्ष18,30,68 (चित्रा 2)में सभी सुपरबेसल परतों को चिह्नित करता है। इनवोलुक्रिन और फिलाग्रिन केराटिनोसाइट्स में देर से भेदभाव मार्कर होते हैं और त्वचाके समकक्ष12, 30, 68,69(चित्रा 2)में ऊपरी सबसे सुपराबेसल परतों को चिह्नित करते हैं। एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट परमाणु डाई (सामग्री सूची देखें) का उपयोग एपिडर्मिस और डर्मिस दोनों में नाभिक को चिह्नित करने के लिए किया गया था, जिसमें कर्नल चतुर्थ ने डर्मिस के वाक्यूलेचर को चिह्नित किया था(चित्रा 2, चित्र 3, चित्रा 4)। एपिडर्मल बेसमेंट झिल्ली (बीएम) घटक हमेशा एचएसई संस्कृतियों में हमेशा ठीक से व्यक्त नहीं किए जाते हैं15,16; और बीएम के कर्नल चतुर्थ धुंधला लगातार इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर नहीं मनाया जाता है। अनुसंधान केंद्रित बीएम घटकों और संरचना अतिरिक्त मीडिया, सेल, और इमेजिंग अनुकूलन14से लाभ होगा ।

हालांकि वीएचएसई संस्कृतियों के थोक के माध्यम से कॉन्फोकल इमेजिंग अक्सर उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों की पैदावार करती है जो डर्मिस और एपिडर्मिस के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं, वर्णित समाशोधन विधि गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए अनुमति देती है। समाशोधन कॉन्फोकल लेजर प्रवेश गहराई में सुधार करता है, और वीएचएसई में प्रभावी इमेजिंग को मंजूरी दिए गए नमूनों के लिए 1 मिमी से अधिक प्राप्त किया जा सकता है (अस्वीकृत के लिए ~ 250 माइक्रोन की तुलना में)। वर्णित समाशोधन तकनीक (मेथनॉल डिहाइड्रेशन और मिथाइल सैलिसिलेट) वीएचएसई नमूना ऊतक61में अपवर्तक सूचकांक से पर्याप्त रूप से मेल खाती है। वीएचएसई को हेरफेर के बिना पूरे निर्माण के माध्यम से सीधा इमेजिंग के लिए अनुमति दी गई (उदाहरण के लिए, अलग-अलग डर्मिस और एपिडर्मिस छवि के निर्माण को फिर से तैयार करना),(चित्र 3)।

वॉल्यूमेट्रिक छवियां प्रत्येक निर्माण(चित्र 4)में वाक्यूलेचर को मैप करने के लिए 3डी रेंडरिंग की पीढ़ी के लिए अनुमति देती हैं। संक्षेप में, कॉन्फोकल इमेज सेट को डर्मल में कोलेजन चतुर्थ दाग (अंकन पोत दीवारों) और नाभिक (एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट परमाणु डाई द्वारा चिह्नित) का पता लगाने के लिए वीएचएसई के कई उप-संस्करणों के एपिडर्मल अभिविन्यास के लिए लिया गया था। छवि के ढेर को कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर (सामग्री सूची देखें) में लोड किया जाता है और एक कस्टम एल्गोरिदम (इन स्रोतों के आधार पर 48,70,71,72,73,74,75)का उपयोग 3 डी प्रतिपादन और मात्राकरण के लिए किया जाता है जैसा कि पहले48वर्णित है। यह एल्गोरिदम स्वचालित रूप से कर्नल चतुर्थ दाग के आधार पर संवहनी घटक को खंडित करता है। 75 , 76,77मार्चको तेजी से मार्च करने के आधार पर वॉल्यूमेस्ट्रिक सेगमेंटेशन को कंकालीकरण एल्गोरिदम में पारित कियाजाताहै । कंकालीकरण प्रत्येक कर्नल चतुर्थ चिह्नित पोत के निश्चित केंद्र पाता है और जिसके परिणामस्वरूप डेटा पोत व्यास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संवहनी अंश(चित्रा 4)की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी उपलब्ध नहीं है तो वाइडफील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी एक सुलभ विकल्प है; वैस्कुलर नेटवर्क और एपिडर्मिस को वाइडफील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी(पूरक चित्रा 2)के साथ चित्रित किया जा सकता है। लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के बजाय वीएचएसई के वाइडफील्ड इमेजिंग का उपयोग करके त्रि-आयामी मात्राकरण संभव है, हालांकि इसके लिए आउट-ऑफ-प्लेन लाइट के कारण छवियों को अधिक फ़िल्टरिंग और डिकोवोल्यूशन की आवश्यकता हो सकती है।

Figure 1
चित्रा 1:संवहनी मानव त्वचा समकक्ष पीढ़ी की योजनाबद्ध समय रेखा। ए) 1 से वीएचएसई मॉडल की प्रगति दिखाता है) डर्मल कंपोनेंट सीडिंग, 2) केराटिनोसिट सीडिंग पर डर्मल कंपोनेंट, 3) एपिथेलियल स्ट्रैटििफिकेशन के जरिए एयर लिक्विड इंटरफेस और कल्चर मेंटेनेंस । संस्कृति के बाद प्रसंस्करण और वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग संस्कृति अंत बिंदु पर किया जा सकता है। ख) संस्कृति में एचडीएफ वीएचएसई मैक्रोस्ट्रक्चर की कैमरा छवियां उनकी संस्कृति के अंत बिंदु पर 8 सप्ताह की हैं। वीएचएसई के लिए संकुचन के विभिन्न स्तर सामान्य हैं; संकुचन को कम किया जा सकता है क्योंकि प्रोटोकॉल का वर्णन होता है। (1 & 2) कम अनुबंधित नमूने। (3 & 4) अधिक अनुबंधित नमूने अभी भी उचित त्वचा तत्वों उपज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:इम्यूनोफ्लोर्सेंट मार्कर के माध्यम से एपिडर्मल लक्षण वर्णन। सभी छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 8wk संस्कृति टाइमपॉइंट पर वीएचएसई के लिए ले जाया गया था। इसी धुंधला तरीकों प्रोटोकॉल चरण 6 में वर्णित हैं। उचित एपिथेलियल मार्कर एचडीएफ वीएचएसई (बाएं कॉलम) और आईएमआर90 वीएचएसई (दाएं कॉलम) दोनों में मौजूद हैं। इनोलूक्राइन और फिलाग्रिन केराटिनोसाइट्स के देर से विभेदन मार्कर हैं और यह प्रदर्शित करते हैं कि एपिडर्मिस पूरी तरह से वीएचएसई दोनों प्रकारों में स्तरीकृत है। साइटोकेराटिन 10 एक प्रारंभिक विभेदन मार्कर है जो वीएचएसई में सुपराबेसल परतों की पहचान कर रहा है। नाभिक पीले रंग में ऑर्थोगोनल विचारों में दिखाया गया है। एन फेस और ऑर्थोगोनल मैक्स प्रोजेक्शन छवियां कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्रदान की गई थीं; छवियों को व्यक्तिगत रूप से पृष्ठभूमि घटाव और स्पष्टता के लिए औसत फ़िल्टरिंग के साथ पहुंचाया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन हैं। (इन-हाउसब्लॉकिंग बफर नुस्खा के साथ प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी तालिका 3 में दिए गए हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:अस्वीकृत बनाम मंजूरी दे दी VHSE की तुलना । यह वीएचएसई IMR90s के साथ उत्पन्न किया गया था और छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 4wk संस्कृति समय बिंदु पर लिया गया था। कोलेजन चतुर्थ सियान में दिखाया गया है; नाभिक मजेंटा में दिखाया गया है; मंजूरी दे दी 3 डी प्रतिपादन में मजेंटा VHSE के एपिडर्मल परत में नाभिक के समेकन का प्रतिनिधित्व करता है। अस्पष्ट VHSE छवि मोटे VHSE निर्माण में लेजर क्षीणन का एक उदाहरण है, समाशोधन के माध्यम से (मेथनॉल और मिथाइल सैलिसिलेट) पूरे निर्माण के निर्माण के डर्मल पक्ष से थोड़ा/कोई लेजर क्षीणन के साथ छवि की जा सकती है । ओवरसैचुरेशन को कम करने के लिए मंजूरी दे दी VHSE के लिए लेजर लाइन, लाभ, और पिनहोल सहित इमेजिंग सेटिंग्स को कम किया गया था। प्रोटोकॉल में चरण 6 और 7 में वर्णित समाशोधन और इमेजिंग पूरी की गई थी । ऑर्थोगोनल मैक्स प्रोजेक्शन इमेजेज और 3डी रेंडरिंग को कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर के साथ पूरा किया गया था, 3डी रेंडरिंग को मंजूरी दी गई निर्माण छवियों से उत्पन्न किया गया था। छवियों को व्यक्तिगत रूप से पृष्ठभूमि घटाव और स्पष्टता के लिए औसत फ़िल्टरिंग के साथ पहुंचाया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4:वीएचएसई के भीतर वाक्यूलेचर का त्रि-आयामी विश्लेषण। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ली गई वॉल्यूमेट्रिक छवियां कंप्यूटेशनल छवि विश्लेषण के माध्यम से संस्कृति के अंत बिंदुओं पर संवहनी पैरामीटर मात्राकरण को सक्षम करती हैं। वीएचएसई उप-खंडों से, कोलेजन चतुर्थ दाग (सियान) का पता लगाना वैक्यूल्चर की एंडोथेलियल दीवारों को चिह्नित करता है और कोलेजन चतुर्थ स्थान के आधार पर संवहनी के विभाजन की अनुमति देता है; विभाजन डेटा तो कंकाल है, और प्रत्येक पोत के केंद्र (मजेंटा) पाया जाता है । 3 डी कंकालीकरण के उदाहरण 4 सप्ताह और 8 सप्ताह IMR90 VHSE नमूनों के लिए दिखाए जाते हैं, संयुक्त राष्ट्र को मंजूरी दे दी । एक IMR90 VHSE प्रयोग सेट के परिणामस्वरूप डेटा पोत व्यास और चार उप मात्रा के लिए संवहनी अंशों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (जेड दिशा में प्रत्येक २५० μm) प्रत्येक निर्माण के भीतर, डेटा VHSE प्रति औसत था और आगे संस्कृति समय बिंदु प्रति औसत । ये डेटा वीवो मानव त्वचा78में प्रासंगिक व्यासों के साथ 4 और 8 सप्ताह की संस्कृति अवधि में फैले संवहनी नेटवर्क होमोस्टेसिस को दिखाते हैं, और वीवो मानव त्वचा79 (कोलेजन निर्माण में संवहनी अंश को अनुकूलित48 दिखाया गया है और बढ़े हुए मूल्यों के लिए आगे अनुकूलित किया जा सकता है)। डेटा को मानक त्रुटि ± मतलब (एसई.M) के रूप में दर्शाया गया है; n = 3 प्रत्येक समय बिंदु के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मीडिया घटक
मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइन (एचडीएफ) डीएमईएम एचजी
5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)
1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस)
IMR90 फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइन DMEM/हैम F12 50:50
10% एफबीएस
1% पी/एस
एचएमईसी-1 एंडोथेलियल सेल लाइन MCDB131 बेस माध्यम
10% एफबीएस
1% पी/एस
एल-ग्लूटामाइन [10 mM]
एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) [10 एनजी/एमएल]
हाइड्रोकॉर्टिसोन [10 μg/mL]
N/TERT-1 Keratinocyte सेल लाइन K-SFM मीडिया बेस
1% पी/एस
गोजातीय पिट्यूटरी एक्सट्रैक्ट (BPE) [25 μg/mL], कश्मीर-SFM पूरक किट से
एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) [0.2 एनजी/एमएल], K-SFM पूरक किट से
CaCl2 [0.3 mM]
मानव त्वचा समकक्ष (एचएसई) भेदभाव 3:1 DMEM: हैम F12
1% पी/एस
0.5 माइक्रोनएम हाइड्रोकॉर्टिसोन
0.5 माइक्रोनएम आइसोप्रोटेरेनोल
0.5 μg/mL इंसुलिन

तालिका 1: मीडिया व्यंजनों। मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट, IMR90 फाइब्रोब्लास्ट, एचएमईसी-1, और एन/टीईआरटी-1 केराटिनोसाइट्स की 2डी संस्कृति के लिए मीडिया व्यंजनों को दिया जाता है। इन व्यंजनों का उपयोग वीएचएसई उत्पन्न करने से पहले सेल लाइनों का विस्तार करने के लिए किया जाता था। मानव त्वचा समकक्ष (एचएसई) भेदभाव मीडिया का उपयोग वीएचएसई उत्पन्न करने के लिए किया जाता है; पनडुब्बी संस्कृति और स्तरीकरण प्रेरण के कुछ हिस्सों के दौरान एक आधार नुस्खा दिया जाता है, एफबीएस की टेपरिंग मात्रा को प्रोटोकॉल चरण 3 में वर्णित के रूप में जोड़ा जाना चाहिए। इन स्रोतों पर आधारित एचएसई नुस्खा11,80.

कोलेजन स्टॉक एकाग्रता(सीएस): 8 मिलीग्राम/एमएल
वांछित वॉल्यूम(वीएफ): 1 मिलीलीटर
नाओएच समायोजन को सामान्य बनाना *: 1 एक्स
* पीएच 7 - 7.4 सेट करने के लिए आवश्यक NaOH की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक कोलेजन का परीक्षण किया जाना चाहिए
वांछित कोलेजन एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल)
2 3 4 5
10X पीबीएस(वीपीबीएस) 0.1 0.1 0.1 0.1
कोलेजन स्टॉक(Vs) 0.25 0.375 0.5 0.625
1N NaOH(VNaOH) 0.00575 0.008625 0.0115 0.014375
मीडिया(वीमीडिया) 0.64425 0.516375 0.3885 0.260625

तालिका 2:कोलेजन गणना संदर्भ तालिका। संदर्भ तालिका आमतौर पर वांछित कोलेजन सांद्रता एक 8 मिलीग्राम/ सभी मूल्य एमएल में हैं। इन राशियों की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समीकरण प्रोटोकॉल चरण 2.2 में दिए गए हैं। प्रत्येक कोलेजन स्टॉक के लिए पीएच की जांच करना महत्वपूर्ण है; यदि आवश्यक हो, तो पीएच 7 - 7.4 (पीबीएस, नाओएच, कोलेजन स्टॉक, मीडिया जोड़े जाने के बाद) प्राप्त करने के लिए नाओएच राशि जोड़ी जानी चाहिए। प्रोटोकॉल को 3 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन एकाग्रता का उपयोग करके वीएचएसई के लिए अनुकूलित किया गया है; कोलेजन एकाग्रता में परिवर्तन विभिन्न सेल लाइनों के लिए आवश्यक हो सकताहै/

प्राथमिक एंटीबॉडी स्रोत एकाग्रता प्रयोग
फिलाग्रिन (AKH1) माउस मोनोक्लोनल आईजीजी सांताक्रूज़;
अनुसूचित जाति-66192 (200 μg/mL)		 [1:250] देर से भेदभाव मार्कर15
इनवोल्यूक्रिन खरगोश पॉलीक्लोनल आईजीजी प्रोटीनटेक;
55328-1-एपी (30 μg/150 μL)		 [1:250] देर से टर्मिनल भेदभाव मार्कर15
साइटोकेराटिन 10 (डी-के10) माउस आईजीजी, सुपरनैट सांताक्रूज़;
अनुसूचित जाति-52318		 [1:350] सुप्राबासल एपिडर्मल मार्कर14,36,59
कोलेजन चतुर्थ खरगोश पॉलीक्लोनल प्रोटीनटेक;
55131-1-एपी		 [1:500] एंडोथेलियल वैस्कुलर वॉल67
डीआरक्यू 7 सेल सिग्नलिंग; 7406 (0.3 mM) [1:250] परमाणु मार्कर
माध्यमिक एंटीबॉडी स्रोत एकाग्रता प्रयोग
बकरी विरोधी खरगोश IgG DyLight™ ४८८ संयुग्मित इनविटरोजन; 35552 (1 मिलीग्राम/एमएल) [1:500] कोलेजन चतुर्थ माध्यमिक
एंटी-रैबिट आईजीजी (एचएंडएल) (बकरी) एंटीबॉडी, डाइलाइट™ 549 संयुग्मित रॉकलैंड इम्यूनोकेमिकल्स; 611-142-002 [1:500] इनवोल्यूक्रिन माध्यमिक
बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एचएंडएल), डाइलाइट™ 488 थर्मो साइंटिफिक; 35502 (1 मिलीग्राम/एमएल) [1:500] फिलाग्रिन या साइटोकेराटिन 10 माध्यमिक
बफर अवरुद्ध (500 एमएल)
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) राशि
ddH2O 450 एमएल
10 एक्स पीबीएस 50 एमएल
गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) 5 ग्राम
ट्वीन 20 0.5 एमएल
ठंडे पानी मछली जिलेटिन 1 ग्राम
सोडियम एजाइड (diH2O में 10% सोडियम अज़ाइड) 5 एमएल (0.1% अंतिम एकाग्रता)

तालिका 3: बफर नुस्खा को अवरुद्ध करने के साथ प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी। सूचीबद्ध एंटीबॉडी और रासायनिक दाग का उपयोग चित्र 2 , चित्र 3, चित्र 4में दिखाए गए दाग के लिए किया गया था । धुंधला यहां सूचीबद्ध अवरुद्ध बफर नुस्खा का उपयोग कर प्रोटोकॉल चरण 6 में दिया के रूप में पूरा किया गया था । चुने हुए संस्कृति तकनीकों और सेल लाइनों के आधार पर धुंधला सांद्रता और अवधि के कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

पूरक तालिका 1: संक्षिप्त सूची। संक्षिप्त सूची पाठक की सुविधा के लिए शामिल हैं । कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1:हैंडलिंग के लिए वीएचएसई तकनीकी सहायता। विशेष रूप से निर्धारण, प्रसंस्करण और धुंधला के दौरान वीएचएसई की हैंडलिंग चुनौतीपूर्ण है। ए-डी चरण 5-7 में निर्देशों से मेल खाती है। एक उचित धुंधला सुनिश्चित करने के लिए एक संस्कृति डालने से असुरक्षित झिल्ली को हटाने की तकनीकी हैंडलिंग से पता चलता है । बी से पता चलता है कि कैसे प्रत्येक VHSE धुंधला और भंडारण के दौरान जलमग्न रखने के लिए । सी पीडीएमएस इमेजिंग कुओं के लिए निर्माण को स्थानांतरित करने का सबसे सुरक्षित और आसान तरीका दिखाता है। डी एक पीडीएमएस इमेजिंग में बैठे एक VHSE अच्छी तरह से दिखाता है: PDMS अच्छी तरह से नीचे एक गिलास स्लाइड से चिपका है, इमेजिंग के लिए एक खिड़की बनाने, एक गिलास स्लाइड शीर्ष पर रखा गया है लंबे इमेजिंग रन के माध्यम से आर्द्रता बनाए रखने के लिए । इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2:वीएचएसई का आकलन करने के लिए मानक वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है। लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी उपलब्ध नहीं होने पर नियमित मूल्यांकन के लिए वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के लिए वाइडफील्ड इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, एपिकल और बेसोटेरल दोनों पहलुओं से वीएचएसई की इमेजिंग को एन फेस और ऑर्थोगोनल (ऑर्थो)) अधिकतम अनुमानों के रूप में दिखाया गया है। (टॉप) एपिडर्मिस को मार्कर के रूप में इन्वोल्यूक्रिन और नाभिक का उपयोग करके चित्रित किया गया था। (नीचे) डर्मल वैक्यूलेचर को मार्कर के रूप में कोलेजन चतुर्थ का उपयोग करके चित्रित किया गया था। छवियां स्पष्टता के लिए घटाया पृष्ठभूमि हैं। बाहर के विमान प्रकाश "लकीर" या "भड़कना" ऑर्थोगोनल विचारों में स्पष्ट कलाकृतियों की ओर जाता है । वाइडफील्ड इमेजिंग का उपयोग मात्राकरण के लिए किया जा सकता है लेकिन अधिक छवि प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस प्रोटोकॉल ने वीएचएसई की पीढ़ी और उनके त्रि-आयामी विश्लेषण के लिए एक सरल और दोहराने योग्य विधि का प्रदर्शन किया है। महत्वपूर्ण बात, यह विधि कुछ विशेष तकनीकों या उपकरणों के टुकड़ों पर निर्भर करती है, जिससे यह प्रयोगशालाओं की एक श्रृंखला के लिए सुलभ हो जाती है। इसके अलावा, सेल प्रकार प्रोटोकॉल में सीमित परिवर्तन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, शोधकर्ताओं को अपनी विशिष्ट जरूरतों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने की अनुमति ।

उचित कोलेजन जेलेशन त्वचा संस्कृति की स्थापना में एक चुनौतीपूर्ण कदम है। विशेष रूप से जब शुद्धि के बिना कच्चे तेल की तैयारी का उपयोग करते हैं, तो संदूषकों का पता लगाने से जेलेशन प्रक्रिया प्रभावित हो सकती है। स्थिरता सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए, प्रयोगों के समूहों को उसी कोलेजन स्टॉक के साथ किया जाना चाहिए जिसका उपयोग वीएचएसई पीढ़ी के लिए किया जाएगा। इसके अलावा, जेलेशन आदर्श रूप से 7-7.4 के पीएच पर होना चाहिए, और संदूषकों का पता लगाने से पीएच बदल सकता है। किसी भी कोलेजन स्टॉक का उपयोग करने से पहले, वांछित एकाग्रता पर एक अभ्यास एसेलुलर जेल बनाया जाना चाहिए और पीएच को जेलेशन से पहले मापा जाना चाहिए। शुरू करने से पहले इस कोलेजन गुणवत्ता की जांच को पूरा करने से एक पूर्ण प्रयोग स्थापित करने से पहले उचित जेलेशन और कोलेजन एकरूपता के साथ समस्याओं की पहचान होगी। एक संस्कृति डालने पर सीधे एसेलुलर कोलेजन बोने के बजाय, एक पीएच पट्टी पर कुछ कोलेजन बीज जो पूरे पीएच पैमाने का मूल्यांकन करता है और 7-7.4 के पीएच को सत्यापित करता है। जेलेशन का मूल्यांकन कोलेजन जेल समाधान की एक बूंद को कवरस्लिप या ऊतक संस्कृति प्लास्टिक वेल प्लेट पर लागू करके किया जा सकता है (संस्कृति डालने के सीमित पक्षों को अनुकरण करने के लिए एक अच्छी तरह से प्लेट की सिफारिश की जाती है)। जेलेशन टाइम के बाद कोलेजन सॉलिड होना चाहिए यानी प्लेट झुका होने पर उसे प्रवाहित नहीं करना चाहिए। चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत, कोलेजन सजातीय और स्पष्ट दिखना चाहिए। कोलेजन सीडिंग से सामयिक बुलबुले सामान्य होते हैं लेकिन स्पष्ट जेल के भीतर अपारदर्शी कोलेजन के बड़े असंगत ब्लॉब्स अपर्याप्त मिश्रण, गलत पीएच, और/या मिश्रण के दौरान कोलेजन को ठंडा रखने में विफलता के कारण समस्या की संभावना को इंगित करता है ।

सेल सीडिंग मात्रा और मीडिया को समायोजित किया जा सकता है। ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में, एनकैप्सुलेटेड सेल मात्रा को 7.5 x 104 फाइब्रोब्लास्ट और 7.5 x 105 एंडोथेलियल कोशिकाओं प्रति एमएल कोलेजन के 1.7 x 10 5 केराटिनोसाइट्स के साथ 1.7 x 105 केराटिनोसाइट्स के लिए अनुकूलित किया गया है। प्रारंभिक अध्ययनों और पिछले शोध के आधार पर इस वीएचएसई प्रोटोकॉल के लिए सेल घनत्व को अनुकूलित किया गया है , जिसमें विभिन्न कोलेजन सांद्रता 48 और एचएसई पीढ़ी22,80 ,81में 3डी वैस्कुलर नेटवर्क उत्पादन की जांच की गई थी । इसी तरह की प्रणालियों में, प्रकाशित एंडोथेलियल सेल घनत्व 1.0 x106 कोशिकाओं/ फाइब्रोब्लास्टसांद्रता अक्सर कोलेजन22, 28,82से1 x10 5 कोशिकाओं/एमएल की 0.4 x 105 कोशिकाओं/एमएल से लेकर कोलेजन8,58,83,84, 85,85से होती है । और केराटिनोसाइट सांद्रता 0.5 x 105 [कोशिकाओं/सेमी2]80 से 1 x 105 [कोशिकाओं/सेमी2]8से लेकर । सेल घनत्व विशिष्ट कोशिकाओं और अनुसंधान प्रश्न के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फाइब्रोब्लास्ट जैसी अनुबंध कोशिकाओं के साथ त्रि-आयामी संस्कृतियां, व्यवहार्यता में कमी और संस्कृति हानि86,87के लिए अग्रणी अनुबंध कर सकती हैं। डर्मल डिब्बे के संकुचन का परीक्षण करने के लिए प्रारंभिक प्रयोग पूरे किए जाने चाहिए (जो अधिक डर्मल कोशिकाओं, अधिक अनुबंधित डर्मल कोशिकाओं, लंबे समय तक पनडुब्बी संस्कृतियों, या नरम मैट्रिस के साथ हो सकता है) और एपिडर्मल सतह कवरेज का परीक्षण करने के लिए। इसके अतिरिक्त, पनडुब्बी में दिनों की संख्या और सीरम सामग्री को पतला करने की दर को भी अनुकूलित किया जा सकता है यदि अत्यधिक डर्मल संकुचन हो रहा है या केराटिनोसाइट कवरेज की एक अलग दर की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, यदि संकुचन डर्मल पनडुब्बी की अवधि के दौरान देखा जाता है या जबकि keratinocytes एक सतह मोनोलेयर की स्थापना कर रहे हैं, सीरम टेपरिंग प्रक्रिया के माध्यम से और अधिक तेजी से आगे बढ़ रहे हैं और अली के लिए VHSEs स्थापना अतिरिक्त संकुचन को रोकने में सहायता कर सकते हैं । इसी तरह, यदि केराटिनोसिट कवरेज आदर्श नहीं है, तो सीरम के बिना वीएचएसई जलमग्न होने वाले दिनों की संख्या को बदलने से एपिडर्मल मोनोलेयर कवरेज बढ़ाने और संकुचन को कम करने में मदद मिल सकती है क्योंकि सीरम को छोड़ दिया जाता है। सेल घनत्व या ऊपर दिए गए अन्य सुझावों में परिवर्तन विशिष्ट संस्कृतियों और अनुसंधान लक्ष्यों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

एयर लिक्विड इंटरफेस (अली) अवधि के दौरान एपिडर्मिस का उचित स्तरीकरण स्थापित करने के लिए, प्रत्येक कुएं में तरल पदार्थ के स्तर की नियमित रूप से जांच करना और बनाए रखना महत्वपूर्ण है ताकि प्रत्येक निर्माण के अली और उपयुक्त जलयोजन को संस्कृति की लंबाई में रखा जा सके। मीडिया के स्तर की जांच की जानी चाहिए और दैनिक ट्रैक जब तक लगातार अली स्तर की स्थापना कर रहे हैं । एपिडर्मल लेयर हाइड्रेटेड दिखना चाहिए, सूखा नहीं, लेकिन निर्माण पर मीडिया के पूल नहीं होने चाहिए। अली के दौरान, निर्माण एक अपारदर्शी सफेद/पीला रंग विकसित करेगा जो सामान्य है । एपिडर्मल परत की संभावना असमान रूप से विकसित होगी। आमतौर पर, वीएचएसई कोलेजन सीडिंग या डर्मल संकुचन के कारण झुकाया जाता है। छोटे निर्माण (24 अच्छी आकार) में निर्माण के बीच में एक उच्च एपिडर्मल भाग और 12 अच्छी आकार में वीएचएसई की परिधि के चारों ओर एक रिज गठन का निरीक्षण करना भी सामान्य है। 13 के निर्माण ों का संकुचन इन स्थलाकृतिक संरचनाओं को बदल सकता है, और/या बिल्कुल नहीं देखा जा सकता है ।

वीएचएसई की स्टेनिंग और इमेजिंग वीएचएसई में यांत्रिक हेरफेर का परिचय देती है। प्रत्येक संस्कृति के हेरफेर की योजना बनाना और उसे सीमित करना बहुत महत्वपूर्ण है । जब हेरफेर आवश्यक हो, तो डालने की झिल्ली से वीएचएसई को हटाते समय कोमल आंदोलनों को बनाए रखें, जब निर्माण सतह पर धुंधला या धोने के समाधान जोड़ते हैं, और इमेजिंग तैयारी के दौरान वीएचएसई को उनके भंडारण/इमेजिंग कुओं में हटाते और बदलते समय। विशेष रूप से, एपिडर्मल घटक की एपिकल परतें नाजुक हो सकती हैं और बेसल एपिडर्मल परतों को बंद करने का खतरा है। एपिडर्मिस की एपिकल परतें नाजुक होती हैं और देशी ऊतक4में भी डिस्क्वमेशन से गुजरती हैं, लेकिन एपिडर्मल संरचना के सटीक विश्लेषण के लिए नुकसान या नुकसान को कम करना महत्वपूर्ण है। यदि एपिडर्मल परतें निर्माण को हटा देती हैं, तो उन्हें अलग से चित्रित किया जा सकता है। एपिडर्मिस की बेसल परतें अभी भी डर्मिस से जुड़ी होती हैं जबकि एपिकल परतों के कुछ हिस्से अलग हो सकते हैं। एपिडर्मिस के दृश्य के लिए, एक परमाणु दाग इसे देखने में सहायक है क्योंकि घने नाभिक एपिडर्मिस की निचली और मध्य परतों की एक विशेषता है।

प्रोटोकॉल में वीएचएसई पोस्ट-फिक्सेशन के कॉन्फोकल इमेजिंग पर चर्चा की गई है, लेकिन ईमानदार आधारित ऑप्टिकल जुटनाटोमोग्राफी (OCT)88, 89,90,91,92,93के माध्यम से संस्कृति में वीएचएसई की छवि बनाना भी संभव है। वीएचएसई बिना ध्यान देने योग्य प्रभावों के कम से कम दो घंटे तक इनक्यूबेशन या आर्द्रीकरण के बिना इमेजिंग का सामना करने के लिए पर्याप्त स्थिर हैं। चूंकि अक्टूबर लेबल मुक्त और गैर-निवास है, परिपक्वता के दौरान एपिडर्मल मोटाई को ट्रैक करना संभव है। अन्य नॉनइनवेसिव इमेजिंग तौर-तरीकों को भी नियोजित किया जा सकता है।

संयुक्त डर्मल और एपिडर्मल संरचनाओं की वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग वीएचएसई में लेजर क्षीणता के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसे दो झुकाव में निर्माण इमेजिंग द्वारा कम किया जा सकता है, एपिडर्मल साइड(चित्रा 1)से और डर्मल साइड(चित्रा 2)से, डर्मल संवहनी संरचनाओं और एपिडर्मिस के अच्छे समाधान की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, नमूने को मंजूरी दी जा सकती है, जिससे न्यूनतम क्षीणता के साथ पूरी संरचना की वॉल्यूमेट्रिक छवियों की अनुमति दी जा सकती है। कई समाशोधन विधियों का प्रयास किया गया, हालांकि, मेथनॉल/मिथाइल सैलिसिलेट विधि का वर्णन सबसे अच्छा परिणाम मिला । अन्य समाशोधन पद्धतियों को अनुकूलित करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं को इन समीक्षाओं की दिशा में निर्देशित किया जाता है49,61,62. यदि समाशोधन, यह पूरी तरह से समाशोधन से पहले नमूना छवि का सुझाव दिया है, के रूप में विधि फ्लोरोफोरस और/या संरचना को नुकसान पहुंचा सकता है । इसके अलावा, इमेजिंग समाशोधन के बाद जितनी जल्दी हो सके पूरा किया जाना चाहिए, के रूप में फ्लोरेसेंस दिनों के भीतर फीका हो सकता है ।

सादगी और पहुंच के लिए, इस प्रोटोकॉल ने पिछले साहित्य11,80में पाए गए सबसे सरल मीडिया मिश्रणों का उपयोग किया। हालांकि सरल मीडिया मिश्रणों का उपयोग करने के कई फायदे हैं, लेकिन इस विकल्प की सीमाएं भी पहचानी जाती हैं। अन्य समूहों ने एपिडर्मल और डर्मल स्वास्थ्य पर विशिष्ट मीडिया घटकों के प्रभावों का अध्ययन किया है और पाया है कि अन्य मीडिया एडिटिव्स94,जैसे बाहरी मुक्त फैटी एसिड/लिपिड, एपिडर्मिस के स्ट्रेटम कॉर्नियम को बढ़ाते हैं और त्वचा बाधा कार्य में सुधार करते हैं। यद्यपि हमारे इम्यूनोफ्लोर्सेंट मार्कर एपिडर्मिस में उचित भेदभाव और स्तरीकरण दिखाते हैं, जो किए जा रहे अध्ययनों के आधार पर, अतिरिक्त मीडिया अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत वीएचएसई का मूल्यांकन करते समय एपिडर्मल बीएम का व्यापक विश्लेषण नहीं किया गया था। बीएम की अखंडता त्वचा समकक्ष का एक महत्वपूर्ण संकेत है; विभिन्न समूहों ने संस्कृति अवधि और बीएम चिह्नों पर इसके प्रभाव पर शोध किया है95 के साथ-साथ फाइब्रोब्लास्ट उपस्थिति का विश्लेषण और बीएम अभिव्यक्ति14पर विकास कारक प्रभाव जोड़ा . यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय बीएम घटक के विश्लेषण का मूल्यांकन और अनुकूलन किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में वीएचएसई पीढ़ी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है, जो अली में 8 सप्ताह के बाद परिणामों का प्रदर्शन करता है। VHSE संस्कृतियों को ध्यान देने योग्य परिवर्तन या व्यवहार्यता की हानि के बिना अली में 12 सप्ताह तक सुसंस्कृत किया गया है, और यह संभव है कि वे अब व्यवहार्य हो सकता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध सेल प्रकारों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है, जैसा कि आईएमआर 90 फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट के साथ डर्मल फाइब्रोब्लास्ट के प्रतिस्थापन द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। शोधकर्ता की जरूरत और उपलब्ध संसाधनों के आधार पर, संस्कृति पर सेल प्रकार और मीडिया मिश्रणों को समायोजित किया जा सकता है, हालांकि अधिक भिन्न सेल प्रकारों को मीडिया अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। संक्षेप में, इन प्रक्रियाओं को त्वचा जीव विज्ञान और रोग के अध्ययन के लिए VHSEs की संस्कृति पर स्पष्टता प्रदान करने के लिए होती हैं । पहुंच को अधिकतम करने के लिए, प्रोटोकॉल को आम उपकरणों, सेल लाइनों और पुनर्प्रांतों का उपयोग करके एक न्यूनतम प्रभावी दृष्टिकोण के रूप में इस सरल और मजबूत विकसित किया गया था जिसे अनुसंधान अध्ययनों की विशिष्ट जरूरतों के लिए आगे अनुकूलित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने एन/टीईआरटी सेल लाइनों के उदार उपहार के लिए डॉ जिम रिनवाल्ड५९ और डॉ एलेन एच वान डेन बोगार्ड20 का शुक्रिया अदा किया । इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (19IPLOI34760636) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N NaOH Fisher Chemical S318-100 (Dilute from Lab stock)
4% Paraformaldehyde ACROS Organics #41678-5000, Lot # B0143461 Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9
Autoclaved forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
CaCl2 Fisher bioreagents Cat # BP510-250, Lot # 190231 Rnase, Dnase, Protease-Free
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) ATCC CRL-3243 SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult ATCC PCS-201-012 Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) ATCC CCL-186 Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.
Centrifuge Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (standard lab equipment)
Computational Software MATLAB MATLAB 2020a MathWorks, Natick, MA.
Confocal Microscope Leica TCS SPEII confocal Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.
Cover Glass (22 x 22) Fisher Scientific 12-545F 0.13-0.17 mm No.1 Thickness
Cyanoacrylate super glue or silicone grease Glue Masters #THI0102 Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred
DMEM media base Corning; Mediatech, Inc REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
DMEM/F-12 50/50 Corning; Mediatech, Inc REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethanol Decon Labs #V1101 (standard lab reagent)
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered
Fine tip forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 Made up in 0.1% BSA in PBS
Hydrocortisone Alpha Easar Lot # 5002F2A made up in DMSO
Insulin (human) Peprotech Lot # 9352621
Inverted Light/Phase Contrast Microscope VWR 76317-470 (standard lab equipment)
Isoproterenol Alfa Aesar #AAJ6178806 DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%
Keratinocyte-SFM (1x) media base Gibco; Life Technologies Corporation REF #: 10724-011; Lot # 2085518 Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium
L-Ascorbic Acid Fisher Chemical Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt
L-glutamine (solid) Fisher Bioreagents CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder
MCDB 131 media base Gen Depot CM034-050, Lot # 03062021 MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered
Metal punches Sona Enterprises (SE) 791LP, 12PC Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2".
Methanol Fisher Chemical CAS # 67-56-1 (optional). For clearing dehydration step.
Methyl Salicylate Fisher Chemical O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 (optional). For clearing.
Microtubes, 1.7 mL Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics Cat # 24-282; Lot # 19467 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free
PBS, 10x Culture grade or autoclaved APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium Genesee Scientific Corporation Ref # 25-508; Lot # 07171015
PBS, 1x non-Culture grade APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. 
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 15140-122, Lot # 2199839 Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)
Petri Dish, glass, small Corning PYREX 316060 (optional). To be used as a clearing container
Petri Dishes, 100 mm Fisher Scientific FB0875713 Use for making up PDMS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning GMID 02065622, Batch # H04719H035 Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)
Dow Corning GMID 02065622, Batch # H047JC4003 DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S Sterilized capillaries and pistons
Round tipped scoopula (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging
Supplements for Keratinocyte-SFM media Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 37000-015, Lot # 2154180 Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size Corning; Costar REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057 Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, 
Tissue Culture Plates, 12 well size Greiner Bio-one; CellStar Cat # 665 180; Lot # E18103QT 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area Genesee Scientific Corporation Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene
Triton x 100 Ricca Chemical Company Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 Wetting agent
Trypsin 0.25% Corning; Mediatech, Inc Ref # 25-053-CI 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate
Type 1 Collagen isolated from Rat tail Pel-Freez Biologicals 56054-1 Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)
Vaccum chamber, benchtop Bel-Art F42010-0000 (standard lab equipment)
Handheld Precision knife X-Acto X3311 (X-Acto knife optional if purchased steel punches)

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Sanchez, M. M., Morgan, J. T. Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents. J. Vis. Exp. (168), e62125, doi:10.3791/62125 (2021).

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