Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generation af selvsamlede vaskulære menneskelige hudækvivalenter

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62125
Automatic Translation
1, 1
1Departments of Bioengineering, University of California

Summary

Målet med denne protokol er at beskrive generation og volumetrisk analyse af vaskulære menneskelige hudækvivalenter ved hjælp af tilgængelige og enkle teknikker til langsigtet kultur. I videst muligt omfang beskrives begrundelsen for trin for at give forskere mulighed for at tilpasse baseret på deres forskningsbehov.

Abstract

Human hud ækvivalenter (HSEs) er væv manipuleret konstruktioner, model epidermale og dermale komponenter i den menneskelige hud. Disse modeller er blevet brugt til at studere hududvikling, sårheling og podningsteknikker. Mange HSE'er mangler fortsat vaskulatur og analyseres desuden gennem postkulturens histologiske sektion, som begrænser volumetrisk vurdering af strukturen. Præsenteret her er en ligetil protokol, der bruger tilgængelige materialer til at generere vaskulære menneskelige hudækvivalenter (VHSE); yderligere beskrevet er volumetrisk billeddannelse og kvantificering teknikker af disse konstruktioner. Kort, VHSEs er konstrueret i 12 godt kultur skær, hvor dermale og epidermale celler er seedet i rotte hale kollagen type I gel. Det dermale rum består af fibroblast og endotelceller spredt over kollagengel. Det epidermale rum består af keratinocytter (hudepitele celler), der differentierer ved den luft-flydende grænseflade. Det er vigtigt, at disse metoder kan tilpasses baseret på forskerens behov, med resultater, der demonstrerer VHSE-generation med to forskellige fibroblalastcelletyper: menneskelige dermale fibroblaster (hDF) og menneskelige lungefibroblaster (IMR90s). VHSEs blev udviklet, afbildet gennem konfokal mikroskopi, og volumetrically analyseret ved hjælp af beregningsmæssige software på 4- og 8-ugers tidspunkter. En optimeret proces til at rette, plette, billede og klare VHSEs til volumetrisk undersøgelse er beskrevet. Denne omfattende model, billedbehandling og analyseteknikker kan let tilpasses de specifikke forskningsbehov i de enkelte laboratorier med eller uden forudgående HSE-erfaring.

Introduction

Menneskelig hud udfører mange væsentlige biologiske funktioner, herunder fungerer som en immun / mekanisk barriere, der regulerer kropstemperaturen, deltager i væskeophobning og sensoriske roller1,2,3,4. Anatomisk, huden er det største organ i den menneskelige krop og består af tre hovedlag (epidermis, dermis, og hypodermis) og besidder et komplekst system af stromale, vaskulære, kirtel, og immun / nervesystem komponenter ud over epidermale celler. Selve epidermis består af fire lag celler, der løbende fornyes for at opretholde barrierefunktion og andre strukturer af indfødt hud (dvs. sved og talgkirtler, negle)3. Hudfysiologi er vigtig i immunforsvaret, sårheling, kræftbiologi og andre områder, hvilket fører forskere til at bruge en bred vifte af modeller, fra in vitro monokulturer til in vivo dyremodeller. Dyremodeller giver mulighed for at studere den fulde kompleksitet af hudens fysiologi, men almindeligt anvendte dyremodeller som mus har betydelige fysiologiske forskelle sammenlignet med mennesker5. Disse begrænsninger, og de øgede omkostninger ved dyremodeller, har fået mange forskere til at fokusere på at udvikle in vitro-modeller, der i højere grad afspejler den menneskelige huds fysiologi1,6. Af disse er en af de enklere modeltyper den menneskelige epidermale ækvivalent (HEE; også kaldet halvtykkelses hudmodeller), som kun består af epidermale keratinocytter på en acellulær dermal matrix, men fanger epidermal differentiering og stratificering set in vivo. Med udgangspunkt i dette omtales modeller, der indeholder dermale og epidermale komponenter (keratinocytter og fibroblaster), ofte som menneskelige hudækvivalenter (HSE), hudmodeller i fuld tykkelse eller organotypiske hudkonstruktioner (OSC). Kort, disse modeller er genereret ved at indkapsle dermale celler i gel matricer og såning epidermale celler på toppen. Epidermal differentiering og stratificering kan derefter opnås via specialiserede medier og lufteksponering7. Hudækvivalenter er oftest blevet genereret ved hjælp af selvmonteringsteknikker ved hjælp af dermal geler af kollagentype I (enten af rottehale eller kvæghud)1, 8 , men lignende modeller har indarbejdet andre matrixkomponenter såsom fibrin 9 , 10 , fibroblast afledt 1,8, men lignende modeller har indarbejdet andre matrixkomponenter såsom fibrin9,10,fibroblast afledt11,12, kadaveriske de-epidermiserede membraner13,14,15,16, kommercielt tilgængelige geler og andre1,12,13,17,18,19. I øjeblikket er der hudækvivalenter kommercielt tilgængelige (som tidligere gennemgået1,2). Disse er dog primært udviklet til terapeutiske formål og kan ikke let tilpasses specifikke forskningsspørgsmål.

HSE er blevet anvendt i undersøgelser af sårheling, podning, toksikologi og hudsygdom/udvikling11,12,13,16,8,20,21,22,23. Selv om 3D-kultur mere omfattende modellerer funktioner i humant væv sammenlignet med 2D-kulturer24, gør inddragelsen af forskellige celletyper , der mere præcist afspejler in vivo-populationen , det muligt at studere cellecellekoordinering i komplekse væv24,25,26. De fleste HSE omfatter kun dermal fibroblaster og epidermal keratinocytter27, selv om in vivo hud miljø omfatter mange andre celletyper. Nylige undersøgelser er begyndt at inkludere flere cellepopulationer; disse omfatter endotelceller i vaskulatur10,28,29,30,31,32,33,34, adipocytter i sub-kutan væv35,36, nervekomponenter19,21, stamceller27,37,38, immunceller10,39,40,41,42og andre sygdoms-/kræftspecifikke modeller16,40,43,44,45,46,47. Særligt vigtigt blandt disse er vaskulatur; mens nogle HSE'er omfatter vaskulære celler, mangler de generelt stadig omfattende kapillærelementer med forbindelse på tværs af hele dermis10,29 , udvidet in vitro-stabilitet28og passende kartæthed. Desuden vurderes HSE-modeller typisk gennem postkulturel histologisk sektion, som begrænser analysen af HSE'ernes tredimensionelle struktur. Tredimensionel analyse giver mulighed for volumetrisk vurdering af vaskulærtæthed 48,49 samt regional variation af epidermal tykkelse og differentiering.

Selvom HSE'er er en af de mest almindelige organotypiske modeller, er der mange tekniske udfordringer ved at generere disse konstruktioner, herunder identifikation af passende ekstracellulære matrix- og celletætheder, medieopskrifter, korrekte luftvæskegrænsefladeprocedurer og postkulturanalyse. Selv om HEE- og HSE-modellerne har offentliggjort protokoller, findes der heller ikke en detaljeret protokol, der indeholder dermal vaskulatur og volumetrisk billeddannelse i stedet for histologiske analyser. Dette arbejde præsenterer en tilgængelig protokol for kulturen af vaskulære menneskelige hudækvivalenter (VHSE) fra hovedsagelig kommercielle cellelinjer. Denne protokol er skrevet til at være let tilpasses, giver mulighed for ligetil tilpasning til forskellige celletyper og forskningsbehov. Af hensyn til tilgængelighed, tilgængelighed og omkostninger blev brugen af enkle produkter og produktionsteknikker prioriteret frem for brugen af kommercielt tilgængelige produkter. Endvidere beskrives enkle volumetriske billeddannelses- og kvantificeringsmetoder, der gør det muligt at vurdere VHSE's tredimensionelle struktur. Oversættelse af denne procedure til en robust og tilgængelig protokol gør det muligt for ikke-specialiserede forskere at anvende disse vigtige modeller i personlig medicin, vaskulær vævsteknik, graftudvikling og lægemiddelevaluering.

Protocol

1. Forberedelse til 3D-kultur

  1. Forbered rotte hale kollagen lager på 8 mg / mL, ved hjælp af etablerede protokoller50,51,52. Alternativt kan rottehalekollagen købes hos leverandører (se materialelisten) i passende koncentrationer.
    BEMÆRK: Kollagen kan tilberedes eller købes i forskellige koncentrationer i intervallet 3-10 mg/mL eller højere50,51,52. Beregningerne i protokollen forudsætter en koncentration på 8 mg/mL, men kan justeres ud fra forskerens behov.
  2. Udvid cellelinjer: Endotel- og fibroblastceller skal være klar til såning i starten af 3D-kollagen dermal komponentgenerering (trin 2). Keratinocytter skal være klar på dag 7 af 3D-kultur. En komplet VHSE-konstruktion kræver 7,5 x10 5 endotelceller. 7,5 x 104 fibroblaster; og 1,7 x 105 keratinocytter til generation(tabel 1).
    BEMÆRK: Disse tætheder er passende til 12-brønds størrelse gennemtrængelige vævskulturindsatser eller tilsvarende. Celletæthed og format kan skaleres op eller ned baseret på forskerens behov. For at præcisere, denne mængde af endotel-og fibroblast celler vil frø 1-3 dermal komponenter, mens hver epidermal komponent kræver 1,7 x 105 keratinocytter.
  3. Udfør al celle centrifugering i denne protokol i 5 min ved 300 x g, men dette kan reduceres for mere skrøbelige celletyper.

2. Generering af 3D kollagen dermal komponent

BEMÆRK: Trin 2 er en tidsfølsom procedure og skal udføres i én indstilling. Det tilrådes at gennemføre en kvalitetskontrol af kollagenbestanden for at sikre korrekt gelering og homogenitet, før du begynder dermal komponent såning, se fejlfinding i diskussionen.

  1. Acellulær kollagen lag forberedelse og såning
    1. Forbered to 1,7 mL udjævnede mikrocentrifugerør, et til acellulær støtte og et til cellulær dermis. De mængder, der gives i dette trin, vil forberede 1 mL 3 mg/mL kollagen (målkollagenkoncentration), der er tilstrækkelig til (3) 12-brønds størrelse VHSE. Ligninger vises, hvis justering er nødvendig. Både volumen og tæthed kan skaleres på grundlag af forskerens behov (fælles referencenumre er anført i tabel 2).
    2. Til hvert rør tilsættes 100 μL dyrkningskvalitet 10x fosfatbufferet saltvand (PBS) (et rør giver 3 VHSE) og tilsættes 8,6 μL 1 N NaOH. Placer udjævnede rør på vådis for at køle i mindst 10 minutter.
      Cs = Koncentration af kollagenbestand
      Vf = Sidste bind af kollagen Nødvendig
      Ct = Koncentration af målkollagen
      Vs = Mængden af lagercollagen, der er nødvendig for den ønskede mængde (Vf)
      Vpbs = Volumen på 10X PBS, der er nødvendig for målkollagenkoncentrationen (Ct)
      VNaOH = Volumen af 1N NaOH er nødvendig for Ct
      Vmedia = Medievolumen, suspendering af opkald eller ddH2O, der kræves til Ct
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
    3. Der fremstilles 1000 og 250 μL positive forskydningspipetter til brug og afsæt dem. Da senere trin er tidsfølsomme, er det praktisk at indlæse pipettespidser og indstille mængder (henholdsvis 375 μL og 125 μL). Derudover skal du opsætte en normal 1000 μL pipette til 516 μL.
      BEMÆRK: Positive forskydningspipetter kan udskiftes med normale pipetter, hvis det er nødvendigt, men på grund af kollagenens høje viskositet og tid/temperaturfølsomhed i denne procedure anbefales positive forskydningspipetter for at hjælpe med at producere ensartede såningsresultater. Hvis du bruger normale pipetter, skal du bruge langsomme bevægelser.
    4. Forbered kulturindsatsbrøndplader: Brug sterile pincet til at placere tre 12-brønds kulturindsatser i en steril 12-brønds vævskulturplade, sted i midtersøjlerne.
    5. Angiv kolde medier, der passer til fibroblaster og endotelcelletyper.
    6. Efter afkøling af rør med loft placeres et rør (til acellulær støtte) på et stativ, hvor indholdet er synligt. Lad det andet rør (til cellulær dermis) være på is.
    7. Fjern 8 mg/mL kollagen lager fra køling og sted på vådis.
      BEMÆRK: Brug ikke fryseis eller -20 °C bordkølere, da dette vil fryse kollagenen.
    8. Til det kolde rør tilsættes 516 μL medier, og der tilsættes straks 375 μL kold kollagen ved hjælp af 1000 μL positiv forskydningspipette. Dispenser kollagen i opløsningen (ikke til siden af røret). Fjern straks den tomme pipettespids, og skift til den forberedte 250 μL positive forskydningspipette, der skal blandes.
      1. Bland hurtigt, men forsigtigt for at forhindre bobledannelse, fjern ikke spidsen fra opløsningen, hvis det er muligt. Bland indtil opløsningen er af homogen farve, som typisk tager omkring 5 pipettecyklusser eller 10 s (hvis du bruger medier med phenolrød, bliver farven lysere og ensartet). Når du blander, skal du sørge for at trække fra forskellige positioner af røret (bund og top) for ensartet blanding.
        BEMÆRK: Dette kan udføres med 516 μL vand af cellekulturkvalitet eller anden væske af cellekulturkvalitet, men phenolrød i de fleste medier er en god indikator for blandingen. Brug enten fibroblast eller endotelmedier, der blev brugt til 2D-udvidelser.
    9. 125 μL acellulær kollagen spredes straks på membranen i hver af de tre 12-brønds dyrkningsindsatser. For at sikre ensartet dækning af den acellulære kollagengel, rock skålen; Hvis det ikke skaber ensartet membrandækning, skal du bruge pipettespidsen til i det væsentlige at male membranen ved forsigtigt at sprede kollagen rundt; undgå at lægge pres på membranen. Gelation begynder næsten øjeblikkeligt; udføre dette trin hurtigt for at sikre jævn dækning.
      BEMÆRK: Der vil være overskydende acellulær kollagen. Volumenet kan reduceres, men at forberede mindre end 1 ml kollagenaffjedring kan resultere i vanskeligheder med at blande opløsningen og utilstrækkelig gelering.
    10. Flyt straks 12-brøndspladen til en 37 °C cellekulturinkubator for at lade den gele i mindst 20 minutter (acellulær kollagen kan gelere i længere tid, hvis det er nødvendigt; i løbet af denne geleringstid fortsæt til trin 2.2). Kollagenaffjedringen fjernes fra isen og lægges tilbage i køling (kollagenen er mest stabil ved 4 °C).
  2. Cellesuspension og såningspræparat
    BEMÆRK: For kultur tidslinjen for denne protokol, svarer dette til Submersion Day 1 (SD1)
    1. Under vallak af acellulære kollagen støtte, trypsinize og tælle endotel og fibroblast cellelinjer.
    2. Ophæng 7,5 x 105 endotelceller og 7,5 x 104 fibroblaster i 258 μL af deres respektive medier, og kombiner celleaffjedring for at skabe en 516 μL aliquot. Hold celleaffjedringerne på vådis, indtil de bruges.
    3. Der fremstilles 1000 og 250 μL positive forskydningspipetter til brug og afsæt dem. Da senere trin er tidsfølsomme, er det praktisk at indlæse pipettespidser og indstille mængder (henholdsvis 375 μL og 250 μL). Derudover skal du opsætte en normal 1000 μL pipette til 516 μL.
  3. Cellebelastet kollagen såning af dermal rum
    1. Efter geleringsperioden fjernes 12-brøndpladen af acellulær kollagen fra inkubatoren.
      BEMÆRK: Hvis denne kollagen ikke er gelé efter 30 min, skal du ikke fortsætte proceduren, da der sandsynligvis var en fejl under såning eller kollagenlageret kan have et problem (se fejlfinding i diskussionen).
    2. Fjern det 1,7 mL udjævnede rør fra vådis (indeholder 10x PBS og NaOH). Placer røret i et stativ, så indholdet er synligt. Løsn/åbn alle hætter (celleaffjedring, koldt rør med loft).
    3. Lagerkollagen (8 mg/mL) fjernes fra 4 °C-køling, og den anbringes på vådis. Lad hætten stå åben.
    4. Tilsæt 516 μL afkølet celleaffjedring til det kolde rør med loft. Brug den positive forskydningspipette på 1000 μL til straks at pipette 375 μL kold kollagenopløsning direkte ind i opløsningen af det udjævnede rør.
    5. Udvis alle kollagen fra pipette ind i røret og kassér den positive forskydning pipette spids. Skift straks til den positive forskydningspipette på 250 μL, og bland kollagenopløsningen.
    6. Bland kollagenopløsningen som afsluttet tidligere (hurtigt, men forsigtigt for at forhindre bobledannelse), fjern ikke spidsen fra gelen, hvis det er muligt. Bland indtil opløsningen er homogen (ca. 5 pipettecyklusser eller 10 s). Når du blander sørg for at trække fra forskellige positioner af røret (bund og top) for ensartet blanding.
    7. Når den er blandet, overføres straks 250 μL cellulær kollagenopløsning til de acellulære kollagenstøtter i hver af de tre 12-brønds kulturindsatser. For at sikre ensartet dækning af den acellulære kollagenstøtte skal skålen rockes og/eller bruge den positive forskydningspipette til forsigtigt at flytte den nyseedede cellulære kollagen rundt uden at forstyrre det acellulære lag.
    8. Flyt straks 12-brøndspladen til 37 °C cellekulturinkubator for at lade den gele i mindst 30 minutter. Kollagen tilbage i 4 °C-køling efter brug.
    9. Efter 30-minutters gel tid, forsigtigt vippe pladen til at vurdere gelering. Sørg for, at kollagenen er størknet.
    10. Der tilsættes henholdsvis 500 μL og 1000 μL blandingsmedier (halv endotel og halvfiblastvedligeholdelsesmedie) til det øverste kammer og underkammeret på indsatsen (først øverst og derefter nederst for at forhindre hydrostatisk tryk i at skubbe kollagen op). Tilføj medier langsomt til siden af brønden, ikke direkte på kollagen gel, for at minimere forstyrrelser af kollagen.
      1. Sørg for, at kollagengelen er nedsænket, tilsæt om nødvendigt flere medier. Placer brøndpladen i celleinkubatoren til inkubation natten over. På nuværende tidspunkt indeholder medierne 10% FBS; det normale vedligeholdelsesmedie for hver cellelinje (tidslinje og skematisk angivet i figur 1, A).
        BEMÆRK: Medier i hele VHSE-kulturen kan tilpasses til brugerdefinerede celletyper; nogle optimering kan være nødvendig.
  4. Ændring af medier fra 2.
    1. Skift 10% FBS medier i VHSE brønde til 5% FBS halv fibroblast, halv endotel medier suppleret med 100 μg/mL L-Ascorbinsyre. Der tilsættes 500 μL til det øverste kammer i dyrkningsindsatsen ved siden af brønden (igen tilsættes forsigtigt til sidevæggen for at minimere forstyrrelser af kollagen) og tilsæt 1000 μL til underkammeret.
    2. Forny medier hver 2. dag (SD4 og SD6) indtil indsænkningsdag 7 (SD7).
    3. Brug en manuel pipette til at fjerne medier fra brøndene. Brug af en aspirator er mulig, men kan resultere i skade eller ødelæggelse af konstruktionen.
      BEMÆRK: L-ascorbinsyre skal gøres frisk hver 2-3 dage (det oxiderer i opløsning for at producere brintoverilte således, fremkalde oxidativ stress og i sidste ende cellulære skader53). Således skal medierne ændres hver 2-3 dage fra SD2 til slutningen af VHSE-kulturen, da L-ascorbinsyre er til stede. Det er nemmest at lave en bestand af medier og tilføje en frisklavet mængde L-ascorbinsyre til et medie aliquot hver fodring dag. Brug vand eller medier af kulturkvalitet som opløsningsmiddel, og forbered frisk L-ascorbinsyre ved 100 mg/mL. L-ascorbinsyre stimulerer kollagensyntesen ved fibroblaster i et passende tempo og fremmer kollagenstabiliteten54,55,56; det reducerer også endotelpermeabiliteten og bevarer beholderens vægintegritet56,57 og bidrager desuden til dannelse af epidermale barrierer6,58.

3. Såning af epidermale komponenter og stratificeringsinduktion

  1. Submersion Dag 7 (SD7): frø keratinocytter
    BEMÆRK: Frø keratinocytter at etablere epidermis på SD7. Dette tidspunkt kan flyttes baseret på forskerens behov. Varigheden af submersionskultur uden keratinocytter bør ikke overstige 9 dage, da en længere submersion ofte fører til øget dermal sammentrækning. Hvis sammentrækning sker før SD7, anbefales det at forkorte indsænkningsperioden til 5 dage og frø epidermis på SD5. Optimer undermersionsperioden efter behov for bestemte eksperimenter (se fejlfinding i diskussionen).
    1. Kultur keratinocytter (N/TERT-120,59 eller andre egnede celler) til deres sammenløbsgrænse før trypsinisering og såning på VHSEs. For N/TERT-1-celler bør sammenløbet ikke overstige 30 % væsentligt for at forhindre uønsket differentiering af keratinocytter i 2D-kultur59. For andre relevante cellelinjer, såsom primære menneskelige epidermale keratinocytter, anvendes en sammenløbsgrænse på 75-80% generelt60.
    2. Efter trypsinisering tælles og suspenderes 510.000 celler i 600 μL human hudækvivalent (HSE) Differentieringsmedie suppleret med 5% FBS (Tabel 1).
      BEMÆRK: 510.000 celler i 600 μL tillader 170.000 celler/konstruktion ved såning af 200 μL pr. konstruktion (3 VHSE).
    3. Brug en manuel pipette, indsamle og kassere medier i øjeblikket i bunden og øverste kammer for hver konstruere godt. Sørg for at indsamle så mange medier som muligt. Opsamle medier, der kan sidde fast direkte under den gennemtrængelige membran ved forsigtigt at placere pipettespidsen under dyrkningsstregmembranen og midlertidigt slå indsatsen ud af sted. Medierne kan have siddet fast på grund af overfladespænding. Sørg for, at indsatserne sidder fladt i deres brønde, før du fortsætter. Brug af en aspirator er mulig, men kan resultere i skade eller ødelæggelse af konstruktionen.
    4. Tilføj 1 mL HSE medier suppleret med 5% FBS til det nederste kammer i hver brønd. Derefter tilsættes 200 μL celleaffjedring til det øverste kammer i hver brønd. Frø direkte på dermal konstruere overfladen. Lad keratinocytter nøjes med 2 timer i inkubatoren.
    5. To timer efter såning af keratinocytterne tilsættes forsigtigt 300 μL HSE-medier suppleret med 5% FBS til det øverste kammer i hver konstruktionsbrønd; langsomt pipette medier på siden af kulturen indsætte. Læg medierne meget omhyggeligt i det øverste kammer for ikke at forstyrre afsatte keratinocytter, der måske ikke har holdt sig tæt til den underliggende kollagengel endnu.
    6. Når mediet er indlæst, skal du placere konstruktionen tilbage i inkubatoren.
  2. 8/9-indsænkningsdag (SD8 eller SD9)
    1. HSE-medier suppleret med 1% FBS og 100 μg/mL L-ascorbinsyre.
    2. Fjern medier fra både den øverste og den nederste kamre med en manuel pipetor.
    3. Der tilsættes først 500 μL-medier i det øverste kammer og derefter 1 mL i det nederste kammer. (Dette trin kan udføres på SD8 eller SD9)
  3. 9/10 (SD9 eller SD10, dette skal være dagen efter trin 3.2)
    1. Der fyldes op serumfri HSE-differentieringsmedier med 100 μg/mL L-ascorbinsyre.
    2. Fjern medier fra både den øverste og den nederste kamre med en manuel pipetor.
    3. 500 μL indlæses i det øverste kammer og 1 mL i underkammeret.
  4. Luft-flydende grænseflade dag 1 (ALI1)
    BEMÆRK: ALI udføres dagen efter trin 3.3.
    1. Løft hver konstruktion til luft-flydende interface (ALI) ved at fjerne medieaffald fra det øverste kammer alene. Brug en manuel pipette til at komme så tæt på det epidermale lag som muligt uden at røre ved eller beskadige det.
    2. Vip pladen lidt i forskellige vinkler for at samle mediet. Fjern så mange medier som muligt i dette trin. Tilsæt ca. 2 mL sterilt vand til de omgivende brønde i pladen for at opretholde ensartet fugtighed; holde brønde fyldt med vand i hele kulturen.
    3. Kontroller pladen et par timer senere for at sikre, at keratinocytterne stadig er på den luftvæskegrænseflade. Hvis der er medier i det øverste kammer, skal du fjerne det. Hold styr på, hvor meget medier der fjernes for hver VHSE-brønd (Det oprindelige volumen af øvre og nedre kamre (1500 μL) - fjernede medier = et godt udgangspunkt for ALI-fodring).
      BEMÆRK: VHSE kræver ikke nødvendigvis det samme medieniveau for luftløft; normalt, hvis VHSEs er seedet sammen, så de har brug for omtrent samme niveau af medier til luftløft, men det er ikke altid tilfældet. Juster mængderne efter behov for at opretholde ALI, men sørg for, at medieniveauerne ikke er så lave, at VHSE tørrer ud. Det er sikrere at være forsigtig og fjerne små mediemængder dagligt, indtil en balance mellem luftløft og hydrering er opfyldt.
  5. ALI Dag 2 (ALI2)
    1. Brug fra dette tidspunkt kun serumfri HSE-medier suppleret med 100 μg/mL L-ascorbinsyre. Skift medie på ALI Dag 2 (ALI2). Hvis der er medier i det øverste kammer, skal du fjerne det og føje det til mængden af fjernede medier, der er optaget tidligere. Beregn den mediemængde, der skal bruges ved hjælp af ligningen i forrige trin. For eksempel: Hvis 200 μL medier blev fjernet fra det øverste kammer, tilsættes 1300 μL for at etablere ALI (som 1500 μL - 200 μL = 1300 μL)
    2. Brug det volumen, der er beregnet til at indlæse i det nederste kammer i hver brønd, og placer derefter pladen tilbage i celleinkubatoren. Hold styr på den mængde, der bruges pr. dag. Ved brug af de anbefalede kollagenmængder i 12-brønds dyrkningsindsatser falder det sædvanlige interval af ALI-værdier mellem 750 μL og 1300 μL. Typisk falder volumenet over dyrkningsmodning og bliver konsistent omkring uge 2/3 af ALI. Afhængigt af kulturspecifikke oplysninger kan dette nummer ændres og skal optimeres (som beskrevet i 3.4.2 - 4.1).

4. Rutinemæssig vedligeholdelse af vaskulære menneskelige hudækvivalenter

  1. Fra ALI Dag 3 (ALI3) til dyrkningsslutpunktet: Forny medier i underkammeret hver 2-3. dag ved hjælp af serumfri HSE-medier med 100 μg/mL L-ascorbinsyre. Fortsæt med at justere og spore det medieniveau, der er nødvendigt i det nederste kammer for ALI som beskrevet i trin 3.5.2.
  2. Da den epidermale overflade skal forblive i kontakt med luften, skal du kontrollere og justere medieniveauet dagligt, indtil der er etableret ensartede ALI-niveauer. Det epidermale lag skal se hydreret ud, ikke tørt, men der bør ikke være medier samlet oven på konstruktionen. Kulturer med 8 ugers ALI har givet den mest konsekvente morfologi og udtryk; Afhængigt af ansøgningen kan kulturer på 4 til 12 uger dog være hensigtsmæssige. Kulturvarighed for forskellige celle- og kulturforhold skal muligvis optimeres.
    BEMÆRK: Ændring af medier mandag, onsdag, fredag er en god praksis. VHSEs er sunde i løbet af weekenden, men medierne bør ændres tidligt mandag og sent på fredag. Efter helt at have afsluttet trin 1-4 er generering af en VHSE afsluttet. Trin 5-end af protokollen er valgfrie behandlings- og billedbehandlingsteknikker, der er optimeret til denne type 3D-konstruktion.

5. Fiksering og gennemtrængning af 3D-konstruktioner

BEMÆRK: Trin 5 er optimeret til billedbehandlingsteknikker, der er specifikke for denne 3D-konstruktion, og som er skitseret i resten af protokollen. Følgende trin er ikke nødvendige for at oprette en VHSE.

  1. Fiksering/gennemtrængning
    1. Fjern forsigtigt alle medier fra øverste og nederste kamre i hver brønd i slutningen af kulturperioden.
      BEMÆRK: Det epidermale lag er muligvis skrøbeligt, håndteres med forsigtighed og omrøres ikke epidermis med aggressiv pipettering.
    2. Tilsæt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 6,9) til den øverste kammervæg (ikke direkte på konstruktionen) og derefter til det nederste kammer for at forfikse hver konstruktion. Tilsæt 1 mL pr. kammer og eksponer i 5 minutter ved stuetemperatur.
      ADVARSEL: PFA er farlig og bør håndteres med forsigtighed og passende personlige værnemidler (PPE), herunder øjenværn.
    3. Fjern 4% PFA-opløsning efter 5 min og tilsæt 0,5% Triton X 100 i 4% PFA-opløsning til de øvre og nedre kamre som beskrevet i det foregående trin. Eksponere i 1 time ved stuetemperatur; VHSE konstruktion kræver ikke et sterilt miljø fra nu af.
    4. Efter 1 time skal permeabiliserings-/fikseringsopløsningen forsigtigt fjernes fra begge kamre, og prøven vaskes 3 gange med 1x PBS.
    5. Prøver opbevares i PBS i 4 °C-køling eller straks plet. For at opbevare prøverne skal du pakke skålen ind i en plastfolie og derefter folie for at minimere fordampning og lyseksponering
      BEMÆRK: Pausepunkt - Efter fiksering og gennemtrængning kan denne procedure standses midlertidigt, da prøverne er stabile i flere uger, hvis de er forberedt som beskrevet i trin 5.1.5. Alternativt kan farvning (som beskrevet i trin 6) udføres umiddelbart efter trin 5.

6. Immunfluorescerende farvning af 3D-konstruktioner

  1. Forberedelse af konstruktion
    BEMÆRK: VHSE pletter godt, når de er adskilt fra dyrkningsindsatsens porøse membran; adskillelse fra membranen er også nødvendig for ikke-blokeret billeddannelse og muliggør reducerede mængder til farvning.
    1. For at forberede konstruktionen til immunfluorescent farvning, drej en indsats på hovedet og læg den over sin brønd på brøndpladen (hvis VHSE falder, vil den falde i brønden med PBS) (Supplerende figur 1A).
    2. Stabilisere indsatsen med den ene hånd over brønden, mens du bruger fine spids pincet og / eller en præcision kniv til at skære omkring halvdelen af omkredsen af skærmembranen. Skær så tæt på plasthuset som muligt med en blid hånd for at forhindre skader på VHSE-konstruktionen.
    3. Brug de fine spidsplys, tag fat i kanten af den afskårne membranklap og skræl forsigtigt den porøse membran af indsatsen samt VHSE-konstruktionen. Gør dette meget omhyggeligt og langsomt for at forhindre skader på VHSE konstruere struktur. Hvis VHSE konstruere adskiller let så det skal falde i brønden nedenfor, hvis det sidder fast på siden af kammeret derefter bruge fine spids pincet eller en lille scoopula at flytte den til brønden. Vær meget opmærksom på det epidermale lag, da det normalt er skrøbeligt (Supplerende figur 1A).
      BEMÆRK: Nogle gange kommer membranen ikke let af eller kommer af i stykker, hvis dette sker, skal du bruge værktøjerne til forsigtigt at trække membranen og VHSE-konstruktionen fra hinanden. Sørg for, at VHSE'erne ikke tørrer ud under denne proces ved om nødvendigt at dyppe i PBS.
    4. Når VHSE er i brønden, kassér eventuelle resterende stykker af skærmembranen, og hold dyrkningsindsatshuset i hver brønd for at holde VHSE'erne i en nedsænket position under farvning.
  2. Farvning
    BEMÆRK: Farvning og tilhørende håndtering/manipulation og vask skal udføres så forsigtigt som muligt, da VHSE'er kan være skrøbelige. Hvis dele af epidermis løftes af, kan stykkerne farves separat; øverste lag af epidermis er skrøbelige og går gennem naturlig desquamation4, men til analyse er det vigtigt at opretholde integritet så meget som muligt.
    1. De valgte primære antistofpletter fremstilles i 700 μL blokeringsbuffer pr. konstruktionsbrønd (typisk kan alle primære antistoffer være i samme farvningsopløsning, men dette skal bekræftes for nye antistoffer). 700 μL arbejder for 12-brønds størrelse, men kan justeres for andre kulturformater. Anbefalede koncentrationer af primære og sekundære antistoffer med blokerende bufferopskrift er anført i tabel 3 (optimering kan være påkrævet).
    2. Fjern enhver PBS fra brønden ved hjælp af en manuel pipette, vær omhyggelig med at pipette væk fra VHSEs (da VHSEs flyder, anbefales vakuum aspiration ikke).
    3. Tilsæt den primære pletopløsning til hver brønd, og placer dyrkningsindsatshuset i brønden for at holde VHSE nedsænket i væske (Supplerende figur 1B). Pak brøndpladen ind med plastfolie. Folie og plet i 48 timer i 4 °C køling uden omrøring eller rokkende (rokkende kan beskadige VHSE-konstruktionen).
    4. Efter 48 timer fremstilles sekundære antistoffer og kemiske pletter i 700 μL blokerende buffer (pr. brønd).
    5. Fjern dyrkningsindsatshuset og den primære pletopløsning og vask med 1x PBS, 3x i 5 minutter, før du tilføjer den sekundære pletopløsning. Placer kulturindsatshuset tilbage i brønden for at holde VHSE-konstruktionen nedsænket (Supplerende figur 1B). Udsættes for 48 timer i 4 °C køling uden omrøring eller rokkende.
    6. Efter 48 timers eksponering fjernes pletopløsningen med en manuel pipetor og vaskes forsigtigt 3x med PBS; Rør ikke væske direkte på VHSEs, da de kan være skrøbelige. Rehydrere med overskydende PBS og placere kulturindsatsen huset tilbage i brønden for at holde VHSE nedsænket og hydreret under opbevaring (opbevares ved indpakning i plastfolie og folie for at minimere fordampning og lyseksponering)
  3. Rydning (valgfrit og terminal)
    BEMÆRK: Rydning er valgfri til billedbehandling. Hvis det er afsluttet, skal det ske efter farvning/billeddannelse af prøven helt, da rydning forhindrer yderligere farvning, kan ændre fluorophore ydeevne og kan beskadige VHSE-strukturen. Flere vævsrydningsmetoder findes49,61,62 og kan optimeres til specifikke projekter. Methylsalikalat clearing, beskrevet nedenfor, er både enkel og effektiv for VHSE. Følgende rydningsteknik skal være afsluttet i glasbeholdere, og pipettespidserne skal være glas eller polypropylen (polystyren opløses i kontakt med methylsasylat). Fuldfør alle rydningsproceduren i et godt ventileret område eller røghætte.
    1. Tilsæt 100% methanol til en lille lavvandet glasbeholder (glas Petri retter fungerer godt). Brug den mindst mulige beholder, der passer til konstruktionen (for at minimere reagensaffald).
    2. Fjern konstruktionen fra brøndpladen ved hjælp af pincet/scoopula (Supplerende figur 1C) og læg den i den methanolfyldte beholder. Tilsæt mere methanol, hvis konstruktionen ikke er nedsænket.
    3. VHSE-konstruktionen dehse i methanol i 3 x 10 min. methanol udskiftes fuldt ud efter hver nedsænkning, og methanol fjernes straks efter det sidste bad. I løbet af denne procedure kan konstruktionen blive mere uigennemsigtig og krympe lidt.
      BEMÆRK: Disse varigheder og gentagelser er blevet optimeret, men methanol og følgende methylsalikalatprocedurer skal muligvis tilpasses afhængigt af det specifikke kulturformat og pletter.
    4. Umiddelbart efter fjernelse af methanol tilsættes methylsalikalat og nedsænkes VHSE i 5 x 5 min. nedsænkninger. Reagenset udskiftes helt efter hver nedsænkning, og VHSE efterlades i den 5. nedsænkningsopløsning til opbevaring. I løbet af denne procedure bliver konstruktionen gennemsigtig.
    5. Billedet konstrueres eller opbevares ved 4 °C. Efter rydning skal al billedbehandling fuldføres så hurtigt som muligt, da fluorophorerne kan nedbrydes i methylsalikalat inden for få dage. Rydning får konstruktionerne til at blive sprøde, og den udvidede opbevaring, selvom det ikke anbefales, har brug for en regelmæssig kontrol for at sikre, at der er en tilstrækkelig mængde methylsalikalat.

7. Confocal Imaging af 3D-konstruktioner

BEMÆRK: Billeddannelse gennem vævskultur plast vil ikke give den samme kvalitet af billedet som billeddannelse gennem coverlip glas, denne metode beskriver fremstilling af en brugerdefineret glas-bund godt for at forhindre tørring under konfokale billeddannelse. Dette er typisk tilstrækkeligt til mindst 3 timers billeddannelse.

  1. To dage før billeddannelse: forbered polydimethylsiloxan (PDMS)
    1. Forbered PDMS48,63,64 ved en foreslået koncentration på [9:1], base: crosslinker. Forbered 30 g PDMS i alt: 27 g basiskomponent og 3 g crosslinker. Placer enhver ren blandingsbeholder på en vejebalance, og tjære vægten. Tilsæt basen (27 g), og tilsæt derefter crosslinkeren (3 g) for at opnå i alt 30 g. Tilføj altid base før crosslinker.
    2. Opløsningen omrøres kraftigt i mindst 4 min. dette vil skabe små bobler. Efter tilstrækkelig blanding hældes PDMS i en 100 mm petriskål eller lignende flad bundvarmebestandig beholder.
    3. Afgas PDMS i et vakuumkammer, indtil alle bobler fra blanding forsvinder, og PDMS er klart. Vakuumet slippes langsomt, og PDMS'et fjernes (langsomt). Skålen anbringes i en ovn for at hærde natten over (50-60 °C). sørg for, at skålen sidder fladt, så PDMS kan hærde jævnt.
      BEMÆRK: Efter hærdning skal PDMS være klar, og overfladen skal være glat og ikke klæbrig (klæbrighed kan indikere utilstrækkelig blanding).
  2. En dag før billedbehandling: PDMS brøndforberedelse
    1. Ved hjælp af en stålpunch eller håndholdt præcisionskniv skal du slå eller skære en cirkulær brønd ud af PDMS-arket, der er forberedt i 7.1. Brønden skal være omkring samme størrelse som VHSE-konstruktionen. Skær en firkantet patch rundt om den cirkulære brønd for at skabe en enkelt PDMS-brønd. Den forberedte PDMS-mængde på 30 g skal give mindst fire brugerdefinerede brønde.
      BEMÆRK: PDMS-brønden skal være tæt på størrelsen på VHSE-konstruktionen. Det skal snøre prøve bevægelse under billeddannelse. Flere brønde kan fremstilles på én gang og opbevares på ubestemt tid i en ren beholder.
    2. Brug en glasovertræksplade af samme størrelse som PDMS-brønden, tilsæt cyanoacrylatlim (f.eks. superlim) til bunden af PDMS (den glatte overflade, der var i kontakt med Petri-skålen) og smør jævnt med en engangs pipettespids. Centrer, og tryk PDMS godt på glasset, mens du efterlader et klart glasvindue i den stansede cirkel (sørg for, at limen ikke er smurt over visningsvinduet).
      BEMÆRK: Hvis det er muligt, plasmabinding af PDMS til coverlip er et alternativ65,66,67.
    3. Lad limen tørre i flere timer eller natten over, før du bruger. Disse kan genbruges, indtil de bryder fra normal slitage.
      BEMÆRK: Det anbefales ikke at plette prøverne i den limede PDMS, der bruges til billedbehandling. Disse brønde holde væske i flere timer, men kan lække under længere farvning.
  3. VHSE-billedbehandling
    BEMÆRK: Hvis billeddiagnostiske, uklare prøver, skal du bruge PBS som billedopløsning. Hvis der er billeddannelse med klare prøver, skal du bruge methylsallat (eller den valgte rydningsopløsning) som billedopløsning.
    1. Tilføj et par dråber billedopløsning i PDMS-brønden og kontroller for lækager (hvis der er en lækage, skal du reparere den med en prik / smør af cyanoacrylat superlim eller bruge en anden brønd).
    2. Hold billedløsningen i PDMS godt, når du tilføjer VHSE. Brug scoopula eller fine spids tang (Supplerende Figur 1C), fjerne konstruere fra 12-brønd plade og sted i PDMS godt på glasset coverlip. Placer konstruere med orientering af interesse vender mod målet. For eksempel, at billedet epidermis ved hjælp af en omvendt mikroskop, skal du sørge for epidermis vender nedad, mod glasset.
      1. Alternativt, for en opretstående mikroskop, står over for epidermis op. Nedenstående billeddannelsesprocedurer er beskrevet for et omvendt mikroskop, men kan let tilpasses til en opretstående.
        BEMÆRK: Vær forsigtig, når du manipulerer VHSE for at undgå skader. Overfør over brøndpladen, hvis VHSE falder. En bøjet, flad spids scoopula er den nemmeste måde at overføre konstruktionen (Supplerende Figur 1C).
    3. Sørg for, at prøven sidder fladt i brønden, og at ingen dele af epidermis eller dermis foldes under prøven. Hvis der sker foldning, skal prøven forsigtigt manipuleres med pincet eller en scoopula. hvis du tilføjer ekstra billedopløsning midlertidigt for at flyde VHSE, kan det hjælpe med at rette ud. Foldning eller rynker af prøven kan ses med øjet eller ved hjælp af mikroskopet.
    4. Fyld brønden med billedopløsning, ved hjælp af lige nok væske til at holde prøven hydreret; for meget væske vil flyde prøven, hvilket resulterer i bevægelse under billeddannelse. Konstruktionen skal sidde på glasvisningsvinduet; bevægelsesprøve ved at vippe PDMS-brønden. Hvis der er bevægelse, skal du fjerne noget væske; tilsæt og fjern væskedråbe klogt, indtil bevægelsen stopper.
    5. Placer et glas dias over brønden for at minimere fordampning under billeddannelse(Supplerende Figur 1D). Ved længere billedbehandlingssessioner skal du kontrollere prøven ofte for at sikre korrekt væskeniveau. Hvis det er tilgængeligt, kan et befugtet kammer under billeddannelse bruges (selvom det typisk ikke er nødvendigt).
    6. Prøven anbringes på mikroskopstadiet, og billedet gennem vinduet med glassdæksler(supplerende figur 1D). Denne teknik giver mulighed for mindst 3 timers kontinuerlig konfokal billeddannelse, men hydrering af prøven skal kontrolleres regelmæssigt, og billedopløsning tilsættes, når det er nødvendigt.
      BEMÆRK: Hvis prøven ryddes, vil methylsalkolat nedbryde limen over tid. Limen, der binder PDMS'et, kan anvendes på en måde mellem billedkørsler. eller prøven kan overføres til nye brønde med jævne mellemrum. I brønde med plasmabinding vil dette ikke være et problem.
    7. Efter billeddannelse, flyde prøven med billedvæske så meget som muligt i brønden. Brug en scoopula eller fine spids tang til at overføre prøven til opbevaringsbrønden. Udfør overførslen over en brøndplade, hvis prøven falder.
    8. Hver PDMS godt og top glas coverlip kan genbruges, indtil de går i stykker. Rengør bundglas før billeddannelse, både i og uden for brønden. Før genbrug skal du altid kontrollere for lækager og reparere med lim efter behov.
    9. Gem prøver som beskrevet i trin 6.3.6, og tilsæt PBS med få måneders mellemrum for at vedligeholde dem. hvis prøverne er ryddet, opbevares i glas ved hjælp af methylsalkolat, og niveauerne kontrolleres regelmæssigt. Ryddede prøver kan nedbrydes hurtigt (inden for få dage) og skal afbildes så hurtigt som muligt.

Representative Results

Her præsenteres en protokol for generering af in vitro vaskulære humane hudækvivalenter (VHSE) ved hjælp af telomerase reverse transcriptase (TERT) udødeliggjorte keratinocytter (N/TERT-120,59), voksne humane dermale fibroblaster (hDF) og humane mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) ( Figur1). Derudover er den tilpasselige karakter af denne protokol fremhævet ved også at demonstrere VHSE-generering og stabilitet, når du bruger almindeligt tilgængelige lungefibroblaster (IMR90) i stedet for hDF. Generering af VHSE fuldføres i trin 1-4, mens trin 5-7 er valgfrie slutpunktsbehandlings- og billedbehandlingsteknikker, der blev optimeret til disse VHSEs. Det er vigtigt at bemærke, at VHSEs kan behandles i henhold til specifikke forskningsspørgsmål, og trin 5-7 er ikke forpligtet til at generere konstruktionen. Volumetrisk billeddannelse, analyse og 3D-gengivelser blev afsluttet for at demonstrere en volumetrisk analysemetode. Disse volumetriske konstruktionsforberedelses- og billedprotokoller bevarer VHSE-strukturen på både mikroskopiske og makroskopiske niveauer, hvilket giver mulighed for omfattende 3D-analyse.

Karakterisering af epidermis og dermis viser passende immunfluorescerende markører for menneskers hud i VHSE-konstruktionerne (figur 2, 3). Cytokeratin 10 (CK10) er en tidlig differentiering keratinocyte markør, som normalt markerer alle suprabasal lag ihudækvivalenter 18,30,68 ( Figur2). Involucrin og filaggrin er sene differentieringsmarkører i keratinocytter og markerer de øverste suprabasale lag i hudækvivalenter12,30,68,69 ( Figur2). Et langtrødt fluorescerende nukleart farvestof (se materialelisten) blev anvendt til at mærke kerner i både epidermis og dermis, idet Kol IV markerede dermisvakulaturen (Figur 2, Figur 3, Figur 4). Epidermal kældermembran (BM) komponenter udtrykkes ikke altid korrekt i HSE-kulturer15,16; og Col IV farvning af BM er ikke konsekvent observeret ved hjælp af denne protokol. Forskning fokuserede BM komponenter og struktur ville drage fordel af yderligere medier, celle, og billedbehandlingoptimering 14.

Selvom konfokal billeddannelse gennem hovedparten af VHSE kulturer ofte giver billeder i høj opløsning, der er tilstrækkelige til beregningsanalyse af dermis og epidermis, den beskrevne clearing metode giver mulighed for dybere væv billeddannelse. Rydning forbedrer confocal laser penetration dybde, og effektiv billeddannelse i VHSEs kan opnås til over 1 mm for ryddet prøver (sammenlignet med ~ 250 μm for uklare). Den beskrevne clearingteknik (methanoldehydrering og methylsalikalat) svarer tilstrækkeligt til brydningsindekset i hele VHSE-prøvevævet61. Rydning af VHSE muliggjorde ligetil billeddannelse gennem hele konstruktionen uden manipulation (f.eks. omlægning af konstruktionen til at afbilde dermis og epidermis separat) (Figur 3).

Volumetriske billeder giver mulighed for generering af 3D-gengivelse for at kortlægge vaskulatur i hele hver konstruktion (Figur 4). Kort sagt, confocal billedsæt blev taget i dermal til epidermal orientering af flere sub-mængder af VHSEs at opdage Kollagen IV plet (mærkning fartøj vægge) og kerner (præget af en langt rød fluorescerende nukleare farvestof). Billedstakke indlæses i beregningssoftware (se materialelisten), og der bruges en brugerdefineret algoritme (baseret på disse kilder 48,70,71,72,73,74,75) til 3D-gengivelse og kvantificering som beskrevet tidligere48. Denne algoritme segmenterer automatisk den vaskulære komponent baseret på Col IV pletten. Den volumetriske segmentering overføres til en skeletoniseringsalgoritme baseret på hurtig marchering75,76,77. Skeletonisering finder det endelige centrum for hvert Col IV-mærket fartøj, og de resulterende data kan bruges til at beregne beholderdiameter samt vaskulær fraktion (figur 4). Widefield fluorescerende mikroskopi er en tilgængelig mulighed, hvis laserscanning mikroskopi ikke er tilgængelig; det vaskulære netværk og epidermis kan afbildes med bredfeltsfluorescerende mikroskopi (Supplerende figur 2). Tredimensionel kvantificering er mulig ved hjælp af widefield billeddannelse af VHSEs snarere end laserscanning mikroskopi, selv om det kan kræve mere filtrering og dekonvolution af billeder på grund af out-of-plane lys.

Figure 1
Figur 1: Skematisk tidslinje for generering af vaskulært menneskehud. A) Viser progression af VHSE-modellen fra 1) dermal komponent såning, 2) keratinocyt såning på dermal komponent, 3) epitel lagdeling via luftvæske interface og kultur vedligeholdelse. Postkulturbehandling og volumetrisk billedbehandling kan udføres på kulturens slutpunkt. B) Kamera billeder af hDF VHSE makrostruktur i kulturen indsætter på deres kultur slutpunkt, 8 uger. Forskellige niveauer af sammentrækning er normale for VHSE; sammentrækning kan reduceres som protokol beskriver. (1 & 2) Mindre kontraherede prøver. (3 & 4) Flere kontraherede prøver giver stadig ordentlige hudelementer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2:Epidermal karakterisering via immunfluorescerende markører. Alle billeder blev taget af VHSEs på 8wk kultur tidspunkt via konfokal mikroskopi. Tilsvarende farvningsmetoder er beskrevet i protokoltrin 6. Korrekt epitelmarkører findes i både hDF VHSEs (venstre kolonne) og IMR90 VHSEs (højre kolonne). Involucrin og Filaggrin er sene differentieringsmarkører af keratinocytter og viser, at epidermis er fuldt stratificeret i begge VHSE-typer. Cytokeratin 10 er en tidlig differentieringsmarkør, der identificerer suprabasale lag i VHSEs. Nuklei er vist i ortogonale synspunkter i gult. En ansigt og ortogonale max projektion billeder blev gjort via beregningsmæssige software; Billeder skaleres individuelt med baggrundstraktion og medianfiltrering for klarhed. Skalastænger er 100 μm. (Primære og sekundære antistoffer med intern blokeringsbufferopskrift er angivet i tabel 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af uklare vs ryddet VHSE. Denne VHSE blev genereret med IMR90s og billeder blev taget på 4wk kultur tidspunkt via konfokal mikroskopi. Kollagen IV er vist i cyan; Nuclei er vist i magenta; magenta i den ryddede 3D-gengivelse repræsenterer konsolidering af kerner i VHSE's epidermale lag. Det uklare VHSE-billede er et eksempel på laserdæmpning i tykkere VHSE-konstruktioner gennem clearing (methanol og methylsalikalat), som hele konstruktionen kan afbildes med lidt /ingen laserdæmpning fra den dermale side af konstruktionen. Imaging indstillinger, herunder laser linje, gevinst, og pinhole blev sænket for ryddet VHSE at reducere oversaturation. Rydning og billedbehandling blev fuldført som beskrevet i trin 6 og 7 i protokollen. Ortogonale max projektion billeder og 3D-gengivelse blev afsluttet med beregningssoftware, 3D-gengivelse blev genereret fra ryddet konstruere billeder. Billeder skaleres individuelt med baggrundstraktion og medianfiltrering for klarhed. Skalalinjer er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Tredimensionel analyse af vaskulatur i VHSE. Volumetriske billeder taget via konfokal mikroskopi muliggør karparameterkvantificering ved kulturens slutpunkter gennem beregningsanalyse af billeder. Fra VHSE-undervolumener markerer påvisning af kollagen IV-plet (cyan) endotelvægge af vaskulatur og giver mulighed for segmentering af vaskulær baseret på kollagen IV-placering; segmenteringsdata skeletteres derefter, og midten af hvert fartøj findes (magenta). Eksempler på 3D-skeletisering er vist i 4 uger og 8 uger IMR90 VHSE prøver, un-ryddet. Der blev anvendt data fra et IMR90 VHSE-forsøgssæt til at beregne beholderdiametre og vaskulære fraktioner for fire undermængder (hver 250 μm i z-retning) inden for hver konstruktion, data blev gennemsnit pr. VHSE og yderligere gennemsnit pr. kulturtidspunkt. Disse data viser det vaskulære netværk homeostase spænder over 4 og 8 ugers kultur varigheder med diametre er relevante for in vivo menneskelig hud78, og vaskulære fraktion i samme rækkefølge som in vivo menneskelig hud79 (vaskulær fraktion i kollagen konstruktioner har vist sig at være tilpasses48 og kunne optimeres yderligere til øgede værdier). Data repræsenteres som middel ± standardfejlmiddel (S.E.M); n = 3 for hvert tidspunkt. Klik her for at se en større version af dette tal.

medie Komponenter
Human Dermal Fibroblast cellelinje (hDF) DMEM HG
5% Føtalt kvægserum (FBS)
1% Penicillin/Streptomycin (P/S)
IMR90 Fibroblast cellelinje DMEM/HAM'S F12 50:50
10% FBS
1% P/S
HMEC-1 Endotelcellelinje MCDB131 Basismedie
10% FBS
1% P/S
L-glutamin [10 mM]
Epidermal vækstfaktor (EGF) [10 ng/mL]
Hydrocortison [10 μg/mL]
Cellelinje I/TERT-1 Keratinocyte K-SFM mediebase
1% P/S
Bovin hypofyseekstrakt (BPE) [25 μg/mL], fra K-SFM supplement kit
Epidermal Growth Factor (EGF) [0,2 ng/mL], fra K-SFM supplement kit
CaCl2 [0,3 mM]
Differentiering af huden hos mennesker (HSE) 3:1 DMEM: Skinke's F12
1% P/S
0,5 μM Hydrocortison
0,5 μM Isoproterenol
0,5 μg/mL Insulin

Tabel 1: Medieopskrifter. Medier opskrifter på 2D kultur af den menneskelige dermal fibroblaster, IMR90 fibroblaster, HMEC-1, og N/TERT-1 keratinocytter er givet. Disse opskrifter blev brugt til at udvide cellelinjer, før de genererede VHSEs. Human hudækvivalent (HSE) differentieringsmedier bruges til at generere VHSEs; der gives en basisopskrift under dele af submersionskultur og stratificeringsinduktion, tilsættes tilspidsede mængder FBS som beskrevet i protokoltrin 3. HSE opskrift baseret på disse kilder11,80.

Koncentration af kollagenbestande (Cs) : 8 mg/mL
Ønsket volumen (Vf): 1 Ml
Normalisering af NaOH-justering*: 1 ecstasy
* Hvert parti af kollagen skal testes for at bestemme mængden af NaOH er nødvendig for at indstille pH 7 - 7,4
Ønsket kollagenkoncentration (mg/mL)
2 3 4 5
10X PBS (Vpbs) 0.1 0.1 0.1 0.1
Kollagenlager (Vs) 0.25 0.375 0.5 0.625
1N NaOH (VNaOH) 0.00575 0.008625 0.0115 0.014375
Medier (V-medier) 0.64425 0.516375 0.3885 0.260625

Tabel 2:Referencetabel for beregning af kollagen. Referencetabellen indeholder almindeligt ønskede kollagenkoncentrationer beregnet under forudsætning af en koncentration af kollagenbestanden på 8 mg/mL og et ønsket slutvolumen på 1 mL; alle værdier er i mL. De ligninger, der bruges til at beregne disse beløb, er angivet i protokoltrin 2.2. Det er vigtigt at kontrollere pH for hver kollagen lager; om nødvendigt bør NaOH beløb tilsættes for at opnå pH 7 - 7,4 (efter PBS, NaOH, kollagen lager, medier tilsættes). Protokollen er optimeret til VHSE'er ved hjælp af en koncentration på 3 mg/mL kollagen; ændringer i kollagenkoncentrationen kan være nødvendige for forskellige cellelinjer/ønskede slutresultat48.

Primært antistof kilde koncentration brug
Filaggrin (AKH1) mus monoklonal IgG Santa Cruz;
sc-66192 (200 μg/mL)		 [1:250] Sen differentieringsmarkør15
Involucrin kanin polyklonal IgG Proteintech;
55328-1-AP (30 μg/150 μL)		 [1:250] Sen terminaldifferentieringsmarkør15
Cytokeratin 10 (DE-K10) mus IgG, supernatant Santa Cruz;
sc-52318		 [1:350] Suprabasal epidermal markør14,36,59
Kollagen IV kanin polyklonal Proteintech;
55131-1-AP		 [1:500] Endotel vaskulær væg67
DRAQ 7 Cellesignalering; 7406 (0,3 mM) [1:250] Nuklear markør
Sekundært antistof kilde koncentration brug
Ged Anti-Kanin IgG DyLight™ 488 Konjugeret Invitrogen; 35552 (1 mg/mL) [1:500] Kollagen IV sekundær
Anti-kanin IgG (H &L) (GOAT) Antistof, DyLight™ 549 Konjugeret Rockland Immunokemikalier; 611-142-002 [1:500] Involucrin sekundær
Ged Anti-Mouse IgG (H &L), DyLight™ 488 Termovidenskabelig; 35502 (1 mg/mL) [1:500] Filaggrin eller Cytokeratin 10 sekundær
BLOKERINGSBUFFER (500 mL)
Reagens beløb
ddH2O 450 mL
10 x PBS 50 mL
Bovin Serum Albumin (BSA) 5 g
Mellem 20 og 20 0,5 mL
Koldt vand Fisk Gelatine 1 g
Natrium azide (10% natrium azid i diH2O) 5 mL (0,1 % endelig koncentration)

Tabel 3: Primære og sekundære antistoffer med blokerende bufferopskrift. De anførte antistoffer og kemiske pletter blev anvendt til farvning som vist i figur 2, figur 3, figur 4. Farvningen blev afsluttet som angivet i protokoltrin 6 ved hjælp af den blokerende bufferopskrift, der er angivet her. Nogle optimeringer af farvningskoncentrationerne og varigheden kan være påkrævet afhængigt af de valgte kulturteknikker og cellelinjerne.

Supplerende tabel 1: Forkortelser List. Forkortelser liste inkluderet for læserens bekvemmelighed. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: Teknisk VHSE-støtte til håndtering. Håndtering af VHSEs er udfordrende, især under fiksering, behandling og farvning. A-D svarer til instruktionerne i trin 5-7. A viser den tekniske håndtering af at fjerne den porøse membran fra en dyrkningsindsats for at sikre korrekt farvning. B viser, hvordan du holder hver VHSE nedsænket under farvning og opbevaring. C viser den sikreste og nemmeste måde at flytte konstruktioner til PDMS-billedbrønde på. D viser en VHSE sidder i en PDMS billedbehandling godt: PDMS godt er limet til et glas dias på bunden, hvilket skaber et vindue til billedbehandling, et glas dias er placeret på toppen for at opretholde luftfugtigheden gennem lange billedbehandling kører. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende figur 2:Standardmikroskopi af fluorescens i bredformat kan anvendes til at vurdere VHSE. Widefield-billedbehandling kan bruges til volumetrisk billedbehandling til rutinemæssig vurdering, når laserscanningsmikroskopi ikke er tilgængelig. Som et eksempel, billeddannelse af VHSEs fra både apikale og basolaterale aspekter er vist som en ansigt og ortogonale (Ortho.) maksimale fremskrivninger. (Øverst) Epidermis blev afbildet ved hjælp af involucrin og kerner som markører. (Nederst) Dermal vaskulatur blev afbildet ved hjælp af kollagen IV som en markør. Billeder trækkes fra med baggrund for klarhedens skyld. Out-of-plane lys fører til "striber" eller "flare" artefakter tydeligt i ortogonale synspunkter. Widefield-billedbehandling kan bruges til kvantificering, men kan kræve mere billedbehandling. Klik her for at hente denne fil.

Discussion

Denne protokol har vist en enkel og repeterbar metode til generering af VHSEs og deres tredimensionelle analyse. Det er vigtigt, at denne metode er afhængig af få specialiserede teknikker eller udstyrsstykker, hvilket gør den tilgængelig for en række laboratorier. Desuden kan celletyper erstattes med begrænsede ændringer i protokollen, så forskere kan tilpasse denne protokol til deres specifikke behov.

Korrekt kollagen gelering er et udfordrende skridt i etableringen af hudkultur. Især når du bruger rå præparater uden rensning, kan sporforurenende stoffer påvirke geleringsprocessen. For at sikre konsistens bør der udføres grupper af eksperimenter med den samme kollagenbestand, som vil blive brugt til VHSE-generation. Desuden bør geleringen ideelt set forekomme ved en pH-kel på 7-7,4, og sporforurenende stoffer kan flytte pH-knappen. Før du bruger kollagen lager, en praksis acellulær gel bør foretages i den ønskede koncentration og pH skal måles før gelering. Fuldførelse af denne kollagen kvalitetskontrol før begyndelsen dermal komponent såning vil identificere problemerne med korrekt gelering og kollagen homogenitet forud for oprettelsen af et komplet eksperiment. I stedet for såning acellulære kollagen direkte på en kultur indsætte, frø nogle kollagen på en pH-strimmel, der evaluerer hele pH-skalaen og kontrollere en pH-af 7-7,4. Gelation kan evalueres ved at anvende en dråbe af kollagen gelopløsning på en coverslip eller vævskultur plast godt plade (en brønd plade anbefales at simulere de begrænsede sider af en kultur indsætte). Efter geleringstid skal kollagenen være solid, dvs. den bør ikke flyde, når pladen vippes. Under fasekontrastmikroskopi skal kollagenen se homogen og klar ud. Lejlighedsvis bobler fra kollagen såning er normale, men store amorfe klatter af uigennemsigtige kollagen i den klare gel indikerer et problem-sandsynligt på grund af utilstrækkelig blanding, forkert pH, og / eller manglende holde kollagen kølet under blanding.

Cellesåningsmængderne og -mediet kan justeres. I protokollen ovenfor, den indkapslede celle mængder er blevet optimeret til en 12-godt indsætte på 7,5 x 104 fibroblaster og 7,5 x 105 endotelceller pr mL kollagen med 1,7 x 105 keratinocytter seedet på toppen af dermal konstruere. Celletætheder er optimeret til denne VHSE-protokol baseret på de foreløbige undersøgelser og den tidligere forskning, der undersøger 3D vaskulær netværksgenerering i forskellige kollagenkoncentrationer48 og HSE generation22,80,81. I lignende systemer er de offentliggjorte endotelcelletætheder 1,0 x 106 celler/mL kollagen48; fibroblasterne varierer ofte fra 0,4 x 105 celler/mL kollagen22,28,82 til 1 x 105 celler/mL kollagen8,58,83,84,85; og keratinocytkoncentrationerne varierer fra 0,5 x 105 [celler/cm2]80 til 1 x 105 [celler/cm2]8. Celletætheder kan optimeres til specifikke celler og forskningsspørgsmål. Tre-dimensionelle kulturer med kontraktile celler, såsom fibroblaster, kan kontrakt, der fører til levedygtighed reduktion og kultur tab86,87. Indledende forsøg bør gennemføres for at teste sammentrækningen af det dermale rum (som kan forekomme med flere dermale celler, flere kontraktile dermale celler, længere submersionskulturer eller blødere matricer) og for at teste epidermal overfladedækning. Derudover kan antallet af dage i indsænkning og hastigheden af aftagende serumindholdet også tilpasses, hvis der for stor dermal sammentrækning finder sted, eller der kræves en anden hastighed af keratinocytdækning. For eksempel, hvis sammentrækning bemærkes i perioden med dermale submersion, eller mens keratinocytter etablerer en overflademonomer, bevæger sig hurtigere gennem serumud aftagende proces og hæve VHSEs til ALI kan støtte i at forhindre yderligere sammentrækning. Tilsvarende, hvis keratinocyt dækning ikke er ideel, ændre antallet af dage, at VHSE er nedsænket uden serum kan bidrage til at øge den epidermale monolayer dækning og afbøde sammentrækning, da serum er udeladt. Ændringer i celletæthed eller andre forslag ovenfor skal optimeres til de specifikke kulturer og forskningsmål.

For at etablere en korrekt stratificering af epidermis i løbet af air liquid interface (ALI) periode, er det afgørende at regelmæssigt kontrollere og opretholde væskeniveauer i hver brønd, således at ALI og passende hydrering af hver konstruktion holdes i hele kulturen længde. Medieniveauer bør kontrolleres og spores dagligt, indtil der er fastsat ensartede ALI-niveauer. Det epidermale lag skal se hydreret ud, ikke tørt, men der bør ikke være puljer af medier på konstruktionen. Under ALI, vil konstruktionen udvikle en uigennemsigtig hvid / gul farve, som er normal. Det epidermale lag vil sandsynligvis udvikle sig ujævnt. Almindeligvis er VHSEs vippes på grund af kollagen såning eller dermal sammentrækning. Det er også normalt at observere en højere epidermal del i midten af konstruktionen i mindre konstruktioner (24 godt størrelse) og en højderyg formation omkring omkredsen af VHSE i 12 godt størrelse. Sammentrækning af konstruktionerne13 kan ændre disse topografiske formationer og/eller kan slet ikke observeres.

Farvning og billeddannelse af VHSEs introducerer mekanisk manipulation til VHSEs. Det er meget vigtigt at planlægge og begrænse manipulation af hver kultur. Når manipulation er nødvendig, skal du opretholde blide bevægelser, når du fjerner VHSE'er fra skærmembranerne, når du tilføjer farvnings- eller vaskeopløsninger til konstruktionsoverfladen, og når du fjerner og udskifter VHSE'er i deres opbevarings-/billedbrønde under billedbehandlingsforberedelsen. Konkret kan de apikale lag af den epidermale komponent være skrøbelige og risikerer at sloughing off de basale epidermale lag. Apikale lag af epidermis er skrøbelige og går gennem desquamation selv i indfødt væv4, men for nøjagtig analyse af epidermal struktur er det vigtigt at minimere skader eller tab. Hvis epidermale lag løfter konstruktionen, kan de afbildes separat. De basale lag af epidermis er sandsynligvis stadig fastgjort til dermis, mens dele af de apikale lag kan løsne sig. Til visualisering af epidermis er en nuklear plet nyttig til at observere dette, da tætte kerner er karakteristiske for lavere og midterste lag af epidermis.

Confocal billeddannelse af VHSE post-fiksering er blevet drøftet i protokollen, men det er også muligt at billedet VHSEs hele kulturen via opretstående baseret optisk sammenhæng tomografi (OCT)88,89,90,91,92,93. VHSE er stabile nok til at modstå billeddannelse uden inkubation eller befugtning i mindst to timer uden mærkbare virkninger. Da OCT er etiketfri og ikke-invasiv, er det muligt at spore den epidermale tykkelse under modningen. Andre ikke-invasive billeddannelse modaliteter kan sandsynligvis også anvendes.

Volumetrisk billeddannelse af de kombinerede dermale og epidermale strukturer kan være udfordrende på grund af laser dæmpning dybere i VHSE. Dette kan afhjælpes ved at billed konstruktionen i to retninger, fra den epidermale side (Figur 1) og fra den dermale side (Figur 2), hvilket giver mulighed for god opløsning af dermale vaskulære strukturer og epidermis. Derudover kan prøven ryddes, hvilket giver mulighed for volumetriske billeder af hele strukturen med minimal attenuation. Der blev imidlertid forsøgt flere clearingmetoder, men den beskrevne methanol-/methylsalikalatmetode gav de bedste resultater. Forskere interesseret i at optimere andre clearing metoder er rettet mod disse anmeldelser49,61,62. Hvis der ryddes, foreslås det, at prøven afbildes fuldt ud inden rydningen, da metoden kan beskadige fluorophorerne og/eller strukturen. Desuden skal billeddannelsen være afsluttet så hurtigt som muligt efter rydning, da fluorescensen kan falme inden for få dage.

For enkelhed og tilgængelighed udnyttede denne protokol de enkleste medieblandinger, der findes i tidligere litteratur11,80. Selvom der er mange fordele ved at bruge enkle medieblandinger, anerkendes begrænsningerne i dette valg også. Andre grupper har undersøgt virkningerne af specifikke mediekomponenter på epidermal og dermal sundhed og konstateret, at andre medier tilsætningsstoffer94, såsom eksterne frie fedtsyrer / lipiders, forbedre stratum corneum af epidermis og forbedre huden barriere funktion. Selvom vores immunfluorescerende markører viser passende differentiering og stratificering i epidermis, afhængigt af de undersøgelser, der udføres, kan der være behov for yderligere medieoptimering. Desuden blev der ikke foretaget en omfattende analyse af den epidermale BM ved vurderingen af de VHSE'er, der blev præsenteret her. BM'ens integritet er en vigtig indikation af hudækvivalenter. forskellige grupper har forsket i kulturens varighed og dens indvirkning på BM-markeringer95 samt analyse af fibroblast tilstedeværelse og tilføjet vækstfaktoreffekter på BM-udtryk14. Det er vigtigt at bemærke, at analysen af BM-komponenten skal evalueres og optimeres, når du bruger denne protokol.

I denne protokol beskrives en procedure for VHSE-generering, der viser resultater efter 8 uger hos ALI. VHSE kulturer er blevet dyrket op til 12 uger på ALI uden mærkbar ændring eller tab af levedygtighed, og det er muligt, at de kan være levedygtige længere. Det er vigtigt, at denne protokol let kan tilpasses almindeligt tilgængelige celletyper, som det fremgår af udskiftningen af dermale fibroblaster med IMR90 lungefibroblaster. Afhængigt af forskerens behov og tilgængelige ressourcer kan celletyperne og medieblandingerne på kulturen justeres, selvom mere forskellige celletyper kan kræve medieoptimering. Sammenfattende er disse procedurer beregnet til at skabe klarhed om VHSE-kulturen til undersøgelse af hudbiologi og sygdom. For at maksimere tilgængeligheden blev protokollen udviklet denne enkle og robuste ved hjælp af fælles udstyr, cellelinjer og reagenser som en minimal effektiv tilgang, der kan tilpasses yderligere til forskningsundersøgelsernes specifikke behov.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Jim Rheinwald59 og Dr. Ellen H. van den Bogaard20 for deres generøse gave af N / TERT cellelinjer. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (19IPLOI34760636).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N NaOH Fisher Chemical S318-100 (Dilute from Lab stock)
4% Paraformaldehyde ACROS Organics #41678-5000, Lot # B0143461 Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9
Autoclaved forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
CaCl2 Fisher bioreagents Cat # BP510-250, Lot # 190231 Rnase, Dnase, Protease-Free
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) ATCC CRL-3243 SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult ATCC PCS-201-012 Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) ATCC CCL-186 Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.
Centrifuge Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (standard lab equipment)
Computational Software MATLAB MATLAB 2020a MathWorks, Natick, MA.
Confocal Microscope Leica TCS SPEII confocal Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.
Cover Glass (22 x 22) Fisher Scientific 12-545F 0.13-0.17 mm No.1 Thickness
Cyanoacrylate super glue or silicone grease Glue Masters #THI0102 Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred
DMEM media base Corning; Mediatech, Inc REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
DMEM/F-12 50/50 Corning; Mediatech, Inc REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethanol Decon Labs #V1101 (standard lab reagent)
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered
Fine tip forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 Made up in 0.1% BSA in PBS
Hydrocortisone Alpha Easar Lot # 5002F2A made up in DMSO
Insulin (human) Peprotech Lot # 9352621
Inverted Light/Phase Contrast Microscope VWR 76317-470 (standard lab equipment)
Isoproterenol Alfa Aesar #AAJ6178806 DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%
Keratinocyte-SFM (1x) media base Gibco; Life Technologies Corporation REF #: 10724-011; Lot # 2085518 Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium
L-Ascorbic Acid Fisher Chemical Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt
L-glutamine (solid) Fisher Bioreagents CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder
MCDB 131 media base Gen Depot CM034-050, Lot # 03062021 MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered
Metal punches Sona Enterprises (SE) 791LP, 12PC Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2".
Methanol Fisher Chemical CAS # 67-56-1 (optional). For clearing dehydration step.
Methyl Salicylate Fisher Chemical O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 (optional). For clearing.
Microtubes, 1.7 mL Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics Cat # 24-282; Lot # 19467 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free
PBS, 10x Culture grade or autoclaved APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium Genesee Scientific Corporation Ref # 25-508; Lot # 07171015
PBS, 1x non-Culture grade APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. 
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 15140-122, Lot # 2199839 Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)
Petri Dish, glass, small Corning PYREX 316060 (optional). To be used as a clearing container
Petri Dishes, 100 mm Fisher Scientific FB0875713 Use for making up PDMS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning GMID 02065622, Batch # H04719H035 Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)
Dow Corning GMID 02065622, Batch # H047JC4003 DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S Sterilized capillaries and pistons
Round tipped scoopula (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging
Supplements for Keratinocyte-SFM media Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 37000-015, Lot # 2154180 Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size Corning; Costar REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057 Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, 
Tissue Culture Plates, 12 well size Greiner Bio-one; CellStar Cat # 665 180; Lot # E18103QT 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area Genesee Scientific Corporation Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene
Triton x 100 Ricca Chemical Company Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 Wetting agent
Trypsin 0.25% Corning; Mediatech, Inc Ref # 25-053-CI 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate
Type 1 Collagen isolated from Rat tail Pel-Freez Biologicals 56054-1 Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)
Vaccum chamber, benchtop Bel-Art F42010-0000 (standard lab equipment)
Handheld Precision knife X-Acto X3311 (X-Acto knife optional if purchased steel punches)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojic, M., et al. Skin tissue engineering 3. Biomaterials for Skin Repair and Regeneration. , 59 (2019).
  2. Shevchenko, R. V., James, S. L., James, S. E. A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction. Journal of The Royal Society Interface. 7 (43), 229-258 (2010).
  3. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and Physiology of the Skin. Journal of the Dermatology Nurses' Association. 3 (4), (2011).
  4. McGrath, J. A., Eady, R. A. J., Pope, F. M. Anatomy and organization of human skin. Rook's textbook of dermatology. 10, 9781444317633 (2004).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue Engineered Human Skin Equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), (2012).
  7. Oh, J. W., Hsi, T. -C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. The Journal of investigative dermatology. 133 (11), 1-4 (2013).
  8. El-Ghalbzouri, A., Gibbs, S., Lamme, E., Van Blitterswijk, C. A., Ponec, M. Effect of fibroblasts on epidermal regeneration. British Journal of Dermatology. 147 (2), 230-243 (2002).
  9. Sun, T., Haycock, J., MacNeil, S. In situ image analysis of interactions between normal human keratinocytes and fibroblasts cultured in three-dimensional fibrin gels. Biomaterials. 27 (18), 3459-3465 (2006).
  10. Kreimendahl, F., et al. Macrophages significantly enhance wound healing in a vascularized skin model. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1340-1350 (2019).
  11. El Ghalbzouri, A., Commandeur, S., Rietveld, M. H., Mulder, A. A., Willemze, R. Replacement of animal-derived collagen matrix by human fibroblast-derived dermal matrix for human skin equivalent products. Biomaterials. 30 (1), 71-78 (2009).
  12. Roger, M., et al. Bioengineering the microanatomy of human skin. Journal of Anatomy. 234, 438-455 (2019).
  13. Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-Dimensional Tissue Models of Normal and Diseased Skin. Current Protocols in Cell Biology. 41 (1), 1-17 (2008).
  14. El Ghalbzouri, A., Jonkman, M. F., Dijkman, R., Ponec, M. Basement Membrane Reconstruction in Human Skin Equivalents Is Regulated by Fibroblasts and/or Exogenously Activated Keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 124 (1), 79-86 (2005).
  15. Pruniéras, M., Régnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
  16. Ali, N., Hosseini, M., Vainio, S., Taieb, A., Cario-André, M., Rezvani, H. R. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  17. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69-70, 81-102 (2014).
  18. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by chitosan modulated dermal matrices. PLOS ONE. 12 (3), 0174478 (2017).
  19. Vidal, S. E. L., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Abbott, R. D., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. 3D biomaterial matrix to support long term, full thickness, immuno-competent human skin equivalents with nervous system components. Organoids and Ex Vivo Tissue On-Chip Technologies. 198, 194-203 (2019).
  20. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838 (2017).
  21. Lebonvallet, N., et al. Effects of the re-innervation of organotypic skin explants on the epidermis. Experimental Dermatology. 21 (2), 156-158 (2011).
  22. Van Drongelen, V., et al. Barrier Properties of an N/TERT-Based Human Skin Equivalent. Tissue Engineering Part A. 20 (21-22), 3041-3049 (2014).
  23. Hensler, S., Kühlbach, C., Parente, J. D., Krüger-Ziolek, S., Möller, K., Müller, M. Establishment and initial characterization of a simple 3D organotypic wound healing model. , Available from: https://opus.hs-furtwangen.de/frontdoor/index/index/docld/4852 (2018).
  24. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5), 240-249 (2013).
  25. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  26. Amelian, A., Wasilewska, K., Megias, D., Winnicka, K. Application of standard cell cultures and 3D in vitro tissue models as an effective tool in drug design and development. Pharmacological Reports. 69 (5), 861-870 (2017).
  27. Lu, W., et al. Mixture of Fibroblasts and Adipose Tissue-Derived Stem Cells Can Improve Epidermal Morphogenesis of Tissue-Engineered Skin. Cells Tissues Organs. 195 (3), 197-206 (2012).
  28. Marino, D., Luginbühl, J., Scola, S., Meuli, M., Reichmann, E. Bioengineering Dermo-Epidermal Skin Grafts with Blood and Lymphatic Capillaries. Science Translational Medicine. 6 (221), 221 (2014).
  29. Martins-Green, M., Li, Q. -J., Yao, M. A new generation organ culture arising from cross-talk between multiple primary human cell types. The FASEB Journal. 19 (2), 222-224 (2004).
  30. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. -W. 3D Cell Printing of Perfusable Vascularized Human Skin Equivalent Composed of Epidermis, Dermis, and Hypodermis for Better Structural Recapitulation of Native Skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019 (2019).
  31. Baltazar, T., et al. 3D bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 26 (5-6), 227-238 (2019).
  32. Klar, A. S., et al. Tissue-engineered dermo-epidermal skin grafts prevascularized with adipose-derived cells. Biomaterials. 35 (19), 5065-5078 (2014).
  33. Grebenyuk, S., Ranga, A. Engineering Organoid Vascularization. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  34. Black, A. F., Berthod, F., L'heureux, N., Germain, L., Auger, F. A. In vitro reconstruction of a human capillary-like network in a tissue-engineered skin equivalent. The FASEB Journal. 12 (13), 1331-1340 (1998).
  35. Huber, B., Link, A., Linke, K., Gehrke, S. A., Winnefeld, M., Kluger, P. J. Integration of Mature Adipocytes to Build-Up a Functional Three-Layered Full-Skin Equivalent. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (8), 756-764 (2016).
  36. Monfort, A., Soriano-Navarro, M., García-Verdugo, J. M., Izeta, A. Production of human tissue-engineered skin trilayer on a plasma-based hypodermis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 7 (6), 479-490 (2013).
  37. Shamis, Y., et al. Fibroblasts derived from human embryonic stem cells direct development and repair of 3D human skin equivalents. Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 10 (2011).
  38. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
  39. Chau, D. Y. S., Johnson, C., MacNeil, S., Haycock, J. W., Ghaemmaghami, A. M. The development of a 3D immunocompetent model of human skin. Biofabrication. 5 (3), 035011 (2013).
  40. Vanden Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between Keratinocytes and T Cells in a 3D Microenvironment: A Model to Study Inflammatory Skin Diseases. Journal of Investigative Dermatology. 134 (3), 719-727 (2014).
  41. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating Macrophages into Organotypic Co-Cultures: A 3D In Vitro Model to Study Tumor-Associated Macrophages. PLOS ONE. 7 (7), 40058 (2012).
  42. Ouwehand, K., Spiekstra, S. W., Waaijman, T., Scheper, R. J., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Technical Advance: Langerhans cells derived from a human cell line in a full-thickness skin equivalent undergo allergen-induced maturation and migration. Journal of Leukocyte Biology. 90 (5), 1027-1033 (2011).
  43. Weinmüllner, R., et al. Organotypic human skin culture models constructed with senescent fibroblasts show hallmarks of skin aging. npj Aging and Mechanisms of Disease. 6 (1), 4 (2020).
  44. Barker, C. L., et al. The Development and Characterization of an In Vitro Model of Psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 892-901 (2004).
  45. Larcher, F., Espada, J., Díaz-Ley, B., Jaén, P., Juarranz, A., Quintanilla, M. New Experimental Models of Skin Homeostasis and Diseases. Actas Dermo-Sifiliográficas (English Edition). 106 (1), 17-28 (2015).
  46. Varkey, M., Ding, J., Tredget, E. E. Fibrotic Remodeling of Tissue-Engineered Skin with Deep Dermal Fibroblasts Is Reduced by Keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 716-727 (2013).
  47. Moulin, V. J. Reconstitution of skin fibrosis development using a tissue engineering approach. Methods in Molecular Biology. 961, Clifton, N.J. 287-303 (2013).
  48. Morgan, J. T., Shirazi, J., Comber, E. M., Eschenburg, C., Gleghorn, J. P. Fabrication of centimeter-scale and geometrically arbitrary vascular networks using in vitro self-assembly. Biomaterials. 189, 37-47 (2019).
  49. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 1-8 (2016).
  50. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  51. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature Protocols. 1, 2753 (2007).
  52. Bornstein, M. B. Reconstituted rat-tail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  53. Clément, M. -V., Ramalingam, J., Long, L. H., Halliwell, B. The In Vitro Cytotoxicity of Ascorbate Depends on the Culture Medium Used to Perform the Assay and Involves Hydrogen Peroxide. Antioxidants & Redox Signaling. 3 (1), 157-163 (2001).
  54. Tajima, S., Pinnell, S. R. Ascorbic acid preferentially enhances type I and III collagen gene transcription in human skin fibroblasts. Journal of Dermatological Science. 11 (3), 250-253 (1996).
  55. Murad, S., Tajima, S., Johnson, G. R., Sivarajah, A., Pinnell, S. R. Collagen Synthesis in Cultured Human Skin Fibroblasts: Effect of Ascorbic Acid and Its Analogs. Journal of Investigative Dermatology. 81 (2), 158-162 (1983).
  56. Villacorta, L., Azzi, A., Zingg, J. -M. Regulatory role of vitamins E and C on extracellular matrix components of the vascular system. Vitamin E: An Overview of Major Research Directions. 28 (5), 507-537 (2007).
  57. Ashino, H., et al. Novel Function of Ascorbic Acid as an Angiostatic Factor. Angiogenesis. 6 (4), 259-269 (2003).
  58. Ponec, M., et al. The Formation of Competent Barrier Lipids in Reconstructed Human Epidermis Requires the Presence of Vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  59. Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
  60. Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. Journal of visualized experiments: JoVE. (130), e56863 (2017).
  61. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  62. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  63. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  64. Ng, J. M. K., Gitlin, I., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. ELECTROPHORESIS. 23 (20), 3461-3473 (2002).
  65. Eddings, M. A., Johnson, M. A., Gale, B. K. Determining the optimal PDMS-PDMS bonding technique for microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (6), 067001 (2008).
  66. Markov, D. A., Lillie, E. M., Garbett, S. P., McCawley, L. J. Variation in diffusion of gases through PDMS due to plasma surface treatment and storage conditions. Biomedical microdevices. 16 (1), 91-96 (2014).
  67. Katzenberg, F. Plasma-bonding of poly(dimethylsiloxane) to glass. e-Polymers. 5 (1), (2005).
  68. El Ghalbzouri, A., Lamme, E., Ponec, M. Crucial role of fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis. Cell and Tissue Research. 310 (2), 189-199 (2002).
  69. Kanitakis, J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin. European journal of dermatology: EJD. 12 (4), 390-399 (2002).
  70. Kroon, D. -J. Hessian based Frangi Vesselness filter. MATLAB Central File Exchange. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/24409-hessian-based-frangi-vesselness-filter (2010).
  71. Jerman, T., Pernuš, F., Likar, B. Špiclin Enhancement of Vascular Structures in 3D and 2D Angiographic Images. IEEE Transactions on Medical Imaging. 35 (9), 2107-2118 (2016).
  72. Kovesi, P. Phase Preserving Denoising of Images. signal. 4, 6 (1999).
  73. Vincent, L. Morphological grayscale reconstruction in image analysis: applications and efficient algorithms. IEEE Transactions on Image Processing. 2 (2), 176-201 (1993).
  74. Xie, L., et al. Quantitative susceptibility mapping of kidney inflammation and fibrosis in type 1 angiotensin receptor-deficient mice. NMR in Biomedicine. 26 (12), 1853-1863 (2013).
  75. Van Uitert, R., Bitter, I. Subvoxel precise skeletons of volumetric data based on fast marching methods. Medical Physics. 34 (2), 627-638 (2007).
  76. Sethian, J. A. A fast marching level set method for monotonically advancing fronts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1591-1595 (1996).
  77. Sethian, J. A. Fast Marching Methods. SIAM Review. 41 (2), 199-235 (1999).
  78. Braverman, I. M. The Cutaneous Microcirculation. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 3-9 (2000).
  79. Men, S. J., Chen, C. -L., Wei, W., Lai, T. -Y., Song, S. Z., Wang, R. K. Repeatability of vessel density measurement in human skin by OCT-based microangiography. Skin research and technology: official journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (4), 607-612 (2017).
  80. Commandeur, S., Ho, S. H., de Gruijl, F. R., Willemze, R., Tensen, C. P., El Ghalbzouri, A. Functional characterization of cancer-associated fibroblasts of human cutaneous squamous cell carcinoma. Experimental Dermatology. 20 (9), 737-742 (2011).
  81. Thakoersing, V. S., Danso, M. O., Mulder, A., Gooris, G., Ghalbzouri, A. E., Bouwstra, J. A. Nature versus nurture: does human skin maintain its stratum corneum lipid properties in vitro. Experimental Dermatology. 21 (11), 865-870 (2012).
  82. Thakoersing, V. S., Gooris, G. S., Mulder, A., Rietveld, M., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  83. Bouwstra, J. A., Groenink, H. W. W., Kempenaar, J. A., Romeijn, S. G., Ponec, M. Water distribution and natural moisturizer factor content in human skin equivalents are regulated by environmental relative humidity. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 378-388 (2008).
  84. Thakoersing, V. S., van Smeden, J., Mulder, A. A., Vreeken, R. J., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Increased Presence of Monounsaturated Fatty Acids in the Stratum Corneum of Human Skin Equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  85. Smola, H., Thiekötter, G., Fusenig, N. Mutual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction. The Journal of Cell Biology. 122 (2), 417 (1993).
  86. Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal Human Primary Fibroblasts Undergo Apoptosis in Three-Dimensional Contractile Collagen Gels. Journal of Investigative Dermatology. 110 (2), 153-157 (1998).
  87. Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-Term Culture of Fibroblasts in Contracted Collagen Gels: Effects on Cell Growth and Biosynthetic Activity. Journal of Investigative Dermatology. 93 (6), 792-798 (1989).
  88. Smith, L. E., Bonesi, M., Smallwood, R., Matcher, S. J., MacNeil, S. Using swept-source optical coherence tomography to monitor the formation of neo-epidermis in tissue-engineered skin. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4 (8), 652-658 (2010).
  89. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Park, H., Cense, B., De Boer, J. F. Birefringence measurements in human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography. Biomed Opt. 2 (2), 287-291 (2004).
  90. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Hyle Park, B., Cense, B., de Boer, J. F. Advances in Optical Coherence Tomography Imaging for Dermatology. Journal of Investigative Dermatology. 123 (3), 458-463 (2004).
  91. Yeh, A. T., Kao, B., Jung, W. G., Chen, Z., Nelson, J. S., Tromberg, B. J. Imaging wound healing using optical coherence tomography and multiphoton microscopy in an in vitro skin-equivalent tissue model. Journal of Biomedical Optics. 9 (2), 9 (2004).
  92. Derr, K., et al. Fully Three-Dimensional Bioprinted Skin Equivalent Contructs with Validated Morphology and Barrier Funtion. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  93. Park, B. H., de Boer, J. F. Polarization Sensitive Optical Coherence Tomography. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , 1055-1101 (2015).
  94. Batheja, P., Song, Y., Wertz, P., Michniak-Kohn, B. Effects of Growth Conditions on the Barrier Properties of a Human Skin Equivalent. Pharmaceutical Research. 26 (7), 1689-1700 (2009).
  95. Dos Santos, M., Metral, E., Boher, A., Rousselle, P., Thepot, A., Damour, O. In vitro 3-D model based on extending time of culture for studying chronological epidermis aging. Matrix Biology. 47, 85-97 (2015).

Tags

Bioengineering Problem 168 vævsteknik vaskulær vævsteknik hudækvivalent hudregenerering sårreparation volumetrisk billeddannelse hud i fuld tykkelse
Generation af selvsamlede vaskulære menneskelige hudækvivalenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, M. M., Morgan, J. T.… More

Sanchez, M. M., Morgan, J. T. Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents. J. Vis. Exp. (168), e62125, doi:10.3791/62125 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter