Bioengineering

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62125

¹Departments of Bioengineering, University of California

Summary

이 프로토콜의 목표는 장기 문화를 위한 접근가능하고 간단한 기술을 사용하여 혈관화된 인간 피부 등가물의 생성 및 체적 분석을 설명하는 것입니다. 가능한 한, 단계에 대한 근거는 연구원이 연구 요구에 따라 사용자 정의 할 수있는 능력을 허용하기 위해 설명된다.

Abstract

인간 피부 등가물(HSEs)은 인간의 피부의 표피 및 진피 성분을 모델링하는 조직 설계 구조입니다. 이 모형은 피부 발달, 상처 치유 및 접목 기술을 연구하기 위하여 이용되었습니다. 많은 HsEs는 혈관이 계속 부족하고 구조의 체적 평가를 제한하는 포스트 배양 조직학적 단면을 통해 추가로 분석됩니다. 여기에 제출 혈관 인체 피부 등가물을 생성하기 위해 접근 가능한 재료를 활용하는 간단한 프로토콜 (VHSE); 또한 설명된 것은 이러한 구조의 체적 이미징 및 정량화 기술이다. 간단히, VHSEs는 진피 및 표피 세포가 쥐 꼬리 콜라겐 타입 I 젤로 종향되는 12개의 잘 배양 인서트에서 생성됩니다. 진피 구획은 콜라겐 젤 전체에 분산된 섬유아세포 및 내피 세포로 구성됩니다. 표피 구획은 공기 액체 인터페이스에서 분화하는 각질 세포 (피부 상피 세포)로 구성됩니다. 중요 한 것은, 이러한 방법은 연구원의 요구에 따라 사용자 정의, 두 개의 다른 섬유 아 세포 유형VHSE 세대를 보여주는 결과: 인간 진 피 섬유 아 세포 (hDF) 그리고 인간의 폐 섬유 아 세포 (IMR90s). VHS는 공초점 현미경 검사를 통해 개발되었으며, 4주 및 8주 시점에서 계산 소프트웨어를 사용하여 볼륨으로 분석되었습니다. 볼륨 검사를 위한 수정, 얼룩, 이미지 및 명확한 VHS를 위한 최적화된 프로세스가 설명되어 있습니다. 이 포괄적인 모델, 이미징 및 분석 기술은 이전 HSE 경험이 있거나 없는 개별 실험실의 특정 연구 요구에 쉽게 사용자 정의할 수 있습니다.

Introduction

인간의 피부는 면역/기계적 장벽으로 작용하고, 체온을 조절하며, 물 보존 및 감각 역할에 참여하는 등 많은 필수 생물학적 기능을 수행한다^1,^2,^3,^4. 해부학적으로, 피부는 인체에서 가장 큰 기관이며 3 개의 주요 층 (표피, 진피 및 피하)으로 구성되어 있으며 표피 세포 외에도 기질, 혈관, 선 및 면역 / 신경계 구성 요소의 복잡한 시스템을 가지고 있습니다. 표피 자체는 기본 피부의 장벽 기능 및 기타 구조(즉, 땀과 피지선,^손톱)를유지하기 위해 지속적으로 갱신되는 4층의 세포로 구성된다. 피부 생리학은 면역 기능, 상처 치유, 암 생물학 및 기타 분야에서 중요하며, 연구자는 체외 단문화에서 생체 내 동물 모델에 이르기까지 광범위한 모델을 사용하는 데 중요합니다. 동물 모델은 피부 생리학의 전체 복잡성을 연구하는 기능을 제공하지만, 마우스와 같은 일반적으로 사용되는 동물 모델은 인간에 비해 상당한 생리적 차이가^5. 이러한 제한, 그리고 동물 모델의 증가 비용, 더 밀접 하 게 인간의 피부의 생리를 반영 하는 체 외 모델 개발에 초점을 많은 연구원을 주도^했다^1,^6. 이들 중, 간단한 모델 유형 중 하나는 세포형 진피 매트릭스에 표피 각질 세포만으로 구성된 인간 표피 등가(HEE; 반두께 피부 모델라고도 함)이지만 생체내에서 볼 수 있는 표피 분화 및 계층화를 포착한다. 이를 바탕으로 진피 및 표피 성분(각질 세포 및 섬유아세포)을 포함하는 모델은 종종 인간 피부 등가물(HSE), 전체 두께 피부 모델 또는 조직형 피부 구조(OSC)라고 합니다. 간략하게, 이 모형은 겔 행렬 내의 진피 세포를 캡슐화하고 위에 표피 세포를 파종하여 생성됩니다. 표피 분화 및 계층화는 전문 매체 및 공기 노출^7을통해 달성될 수 있다. 피부 등가물은 콜라겐 타입 I(쥐 꼬리 또는 소 피부 원점 중^하나)로만든 진피 젤을 사용하여 자체 조립 기술을 통해 가장 자주 발생하였지만, 유사한 모델은피브린^9,^10과같은 다른 매트릭스 성분을 통합했다. 섬유아세포 유래^11,^12,cadaveric 탈표형 멤브레인^13,^14,^15,^16,시판 가능한 젤 및 기타^1,^12,^13,^17,^18,^19. 현재, 시판되는 피부 등가물(이전에 검토된^1,^2)이있다. 그러나, 이들은 주로 치료 목적을 위해 개발 하 고 특정 연구 질문에 쉽게 사용자 지정 할 수 없습니다.

HsEs는 상처 치유, 접목, 독성학 및 피부질환/발달^11,^12,^13,^16,^8,^20,^21,^22,²³^등의연구에 적용되었다. 3D 배양은 2D^{배양(24)에}비해 인간 조직의 기능을 보다 포괄적으로 모델로 하지만, 생체 내 인구를 보다 정확하게 반영하는 다양한 세포 유형을 포함하면 복잡한^조직(24,^25,^26)에서세포-세포 조정에 대한 연구가 가능하게 됩니다. 대부분의 HSEs는 생체 내 피부 환경이 다른 많은 세포 유형을 포함하지만, 대부분의 HSEs는 진피 섬유아세포와 표피 각질 세포^27을포함한다. 최근 연구는 더 많은 세포 인구를 포함 하 여 시작 했습니다.; 이들 로는 혈관 내분비^세포(10,^28,^29,^30,^31,^32,^33,^{34, 34)}및 하복부 구형 조직에서의 분피^세포(35,^36,신경성분^{19)를 포함한다.}^,^21,줄기세포^27,^37,^38,면역세포^10,^39,^40,^{41, 42,}기타 질병/암^{특이모델(16,}^40,^43,^44,^45,^{46, 46,}⁴⁷⁾및 기타 질환/암 특이적 모델. 이들 중 특히 중요 한 혈관; 일부 HsEs는 혈관 세포를 포함하지만, 전반적으로 그들은 여전히 전체 진피 에 걸쳐 연결포괄적 인 모세관 요소가 부족^10,^29, 시험관 내 안정성⁽²⁸⁾및 적절한 혈관 밀도 확장. 또한, HSE 모델은 일반적으로 HSE의 3차원 구조의 분석을 제한하는 배양 후 조직학적 단면을 통해 평가된다. 3차원 분석을 통해 혈관^밀도(48,^49)의 체적 평가뿐만 아니라 표피 두께 및 분화의 지역적 변화를 가능하게 한다.

HsE는 가장 일반적인 organotypic 모델 중 하나이지만 적절한 세포 외 매트릭스 및 세포 밀도, 미디어 레시피, 적절한 공기 액체 인터페이스 절차 및 배양 후 분석을 포함하여 이러한 구조를 생성하는 데 많은 기술적 인 문제가 있습니다. 또한 HEE 및 HSE 모델은 프로토콜을 발표했지만, 조직학적 분석보다는 진피 혈관 및 체적 이미징을 통합한 상세한 프로토콜은 존재하지 않는다. 이 작품은 주로 상업적세포주로부터 혈관화된 인간 피부 등가물(VHSE)의 배양에 접근할 수 있는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 쉽게 사용자 정의 할 수 있도록 작성, 다른 세포 유형과 연구 요구에 직선 적응을 허용. 접근성, 가용성 및 비용을 위해 간단한 제품 및 생성 기술의 사용은 시판되는 제품을 사용하는 데 우선순위를 두였습니다. 또한, VHSE의 3차원 구조의 평가를 허용하는 간단한 체적 이미징 및 정량화 방법이 설명된다. 이 절차를 강력하고 접근 가능한 프로토콜로 변환하면 비 전문 연구자들은 개인화 된 의학, 혈관 조직 공학, 이식 개발 및 약물 평가에 이러한 중요한 모델을 적용 할 수 있습니다.

Protocol

1. 3D 문화 준비

8 mg /mL에서 쥐 꼬리 콜라겐 스톡을 준비, 설립 프로토콜을 사용하여^50,^51,^52. 또는 쥐 꼬리 콜라겐은 적절한 농도에서 공급 업체 (재료 목록 참조)에서 구입할 수 있습니다.
참고: 콜라겐은 3-10 mg/mL, 또는^50,^51,⁵²이상의 범위에서 상이한 농도로 제조또는 구입할 수 있다. 프로토콜의 계산은 8 mg / mL 농도를 가정하지만 연구원의 요구에 따라 조정할 수 있습니다.
세포주 확장: 내피성 및 섬유아세포 세포는 3D 콜라겐 진피 성분 생성(2단계)의 시작시 파종할 준비가 되어 있어야 합니다. 각질 세포는 3D 문화의 7 일째에 준비해야합니다. 하나의 완전한 VHSE 구조는 7.5 x 10⁵ 내피 세포를 필요로한다; 7.5 x 10⁴ 섬유아세포; 및 1.7 x 10⁵ 케나티노사이클생성(표1).
참고: 이러한 밀도는 12웰 크기의 투과성 조직 배양 삽입또는 이와 동등한 것에 적합합니다. 세포 밀도와 포맷은 연구원의 요구에 따라 확장되거나 축소될 수 있습니다. 명확히 하기 위해, 내피 및 섬유아세포 세포의 이 양은 1-3 진피 성분을 종자하고, 각 표피 성분은 1.7 x 10⁵ 각질 세포를 필요로 합니다.
300 x g에서5 분 동안이 프로토콜에서 모든 세포 원심 분리를 수행하지만, 이것은 더 깨지기 쉬운 세포 유형에 대해 감소 될 수있다.

2. 3D 콜라겐 진피 성분의 생성

참고: 2단계는 시간에 민감한 절차이며 한 설정에서 완료해야 합니다. 진피 성분 파종을 시작하기 전에 적절한 겔화와 균질성을 보장하기 위해 콜라겐 주식의 품질 검사를 완료하고 논의에서 문제 해결을 참조하는 것이 좋습니다.

세포 콜라겐 층 제제 및 파종
1. 1.7mL 캡된 미세원심분리기 튜브 2개를 준비하고, 하나는 세포 유지를 위해, 하나는 세포 진피용으로 준비한다. 이 단계에서 주어진 금액은 (3) 12 웰 크기의 VHSE에 충분한 3 mg / mL 콜라겐 (표적 콜라겐 농도)의 1 mL을 준비할 것입니다. 조정이 필요한 경우 방정식이 나열됩니다. 부피와 밀도 모두 연구원의 요구에 따라 확장할 수 있습니다(일반적인 참조 번호는 표 2에주어집니다).
2. 각 튜브에 배양 등급 100 μL을 추가하여 10배 인산염 완충식식염(PBS)(한 튜브은 3VHSEs를 산출)하고 N NaOH 1의 8.6 μL을 추가합니다. 젖은 얼음에 덮인 튜브를 놓고 적어도 10 분 동안 식힙니다.
  C_s = 콜라겐 재고 농도
  V_f = 콜라겐의 최종 부피 필요
  C_t = 표적 콜라겐 농도
  V_s = 원하는 양에 필요한 주식 콜라겐의 부피 (V_f)
  V_pbs = 대상 콜라겐 농도에 필요한 10X PBS의 부피 (C_t)
  V_NaOH = C_t에 필요한 1N NaOH의 부피
  V_미디어 = C_에 필요한 미디어 볼륨, 통화 정지 또는 ddH2O
3. 1000 및 250 μL 양변위 파이펫을 준비하고 따로 둡니다. 이후 단계는 시간에 민감하므로 파이펫 팁과 세트 볼륨(각각 375 μL 및 125 μL)을 로드하는 것이 편리합니다. 또한 516 μL에 대해 일반 1000 μL 파이펫을 설정합니다.
  참고: 양수 변위 파이펫은 필요한 경우 일반 파이펫으로 대체 할 수 있지만 콜라겐의 높은 점도와이 절차의 시간 / 온도 민감도 때문에 일관된 시딩 결과를 생성하는 데 도움이되는 긍정적 인 변위 파이펫을 권장합니다. 일반 파이펫을 사용하는 경우 느린 움직임을 사용합니다.
4. 배양 물자 잘 플레이트 를 준비 : 멸균 집게를 사용하여 멸균 12 웰 조직 배양 플레이트에 세 개의 12 웰 크기 배양 인서트를 배치하여 중앙 기둥에 배치하십시오.
5. 섬유아세포 및 내피 세포 유형에 적합한 감기 매체를 설정합니다.
6. 캡된 튜브를 냉각한 후 내용이 보이는 랙에 튜브 1개(세포 전 지원용)를 배치합니다. 얼음에 다른 튜브 (셀룰러 진피)를 둡니다.
7. 냉장에서 8 mg / mL 콜라겐 주식을 제거하고 젖은 얼음에 놓습니다.
  참고: 콜라겐이 동결될 때 냉동실 얼음 이나 -20 °C 벤치탑 쿨러를 사용하지 마십시오.
8. 차가운 덮인 튜브에 516 μL의 미디어를 추가하고 즉시 1000 μL 양성 변위 파이펫을 사용하여 375 μL의 차가운 콜라겐을 추가합니다. 콜라겐을 용액에 분배합니다(튜브의 측면이 아님). 즉시 빈 파이펫 팁을 제거하고 혼합준비 250 μL 양성 변위 파이펫으로 전환합니다.
  1. 거품 형성을 방지하기 위해 빠르고 부드럽게 혼합, 가능하면 용액에서 팁을 제거하지 마십시오. 용액이 동질적인 색상이 될 때까지 혼합하면 일반적으로 약 5 파이펫 사이클 또는 10 s가 걸립니다 (페놀 레드미디어를 사용하면 색상이 더 가볍고 균일해질 것입니다). 혼합 할 때, 균일 한 혼합튜브 (아래와 상단)의 다른 위치에서 그릴해야합니다.
    참고: 이것은 세포 배양 등급물 또는 다른 세포 배양 등급 액체의 516 μL로 수행될 수 있지만, 대부분의 미디어의 페놀 레드는 혼합의 좋은 지표이다. 2D 확장에 사용 되 었던 섬유 아 세포 또는 내 피 미디어를 사용.
9. 세포콜라겐 125 μL을 각각 의 막에 즉시 분산시킵니다. 세포 콜라겐 젤의 균일 한 범위를 보장하기 위해, 접시를 바위; 균일 한 멤브레인 커버리지를 생성하지 않는 경우 는 부드럽게 주위에 콜라겐을 확산하여 본질적으로 멤브레인을 페인트 파이펫 팁을 사용합니다; 멤브레인에 압력을 가하지 마십시오. 겔화는 거의 즉시 시작됩니다. 이 단계를 신속하게 수행하여 커버리지도 보장합니다.
  참고 : 과잉 세포 콜라겐이있을 것입니다. 그러나 콜라겐 서스펜션의 1mL 미만을 준비하는 것은 용액을 혼합하고 겔화가 불충분할 수 있다.
10. 12웰 플레이트를 37°C 세포 배양 인큐베이터로 즉시 이동하여 적어도 20분 동안 겔을 할 수 있게 하였다(세포콜라겐은 필요한 경우 더 이상 겔화할 수 있다; 이 겔화 시간 동안, 2.2단계로 진행). 콜라겐 서스펜션을 얼음에서 제거하고 냉장에 다시 넣습니다(콜라겐은 4°C에서 가장 안정적입니다).
셀 서스펜션 및 시드 준비
참고: 이 프로토콜의 문화 권면 타임라인의 경우 이는 잠수일 1(SD1)에 해당합니다.
1. 세포 콜라겐 지지체의 겔화 하는 동안, 트립시닝 하 고 내 피 및 섬유 아 세포주를 계산.
2. 7.5 x 10⁵ 내피 세포와 7.5 x 10⁴ 섬유아세포는 각각의 258 μL에서 중단하고 세포 현탁액을 결합하여 516 μL 알리쿼트를 생성합니다. 사용 전까지 젖은 얼음에 셀 서스펜션을 유지합니다.
3. 1000 및 250 μL 양변위 파이펫을 준비하고 따로 둡니다. 이후 단계는 시간에 민감하므로 파이펫 팁과 세트 볼륨(각각 375 μL 및 250 μL)을 로드하는 것이 편리합니다. 또한 516 μL에 대해 일반 1000 μL 파이펫을 설정합니다.
진피 구획의 셀 라덴 콜라겐 파종
1. 겔화 기간 후, 인큐베이터로부터 세포콜라겐의 12웰 플레이트를 제거한다.
  참고: 이 콜라겐이 30분 후에 겔화되지 않으면 시드 중에 실수가 있었거나 콜라겐 재고가 문제가 있을 수 있기 때문에 절차를 계속하지 마십시오(토론에서 문제 해결 참조).
2. 젖은 얼음에서 1.7 mL 캡핑 튜브를 제거합니다 (10 배 PBS 및 NaOH 포함). 내용이 보이면 튜브를 랙에 놓습니다. 모든 캡(셀 서스펜션, 콜드 캡 튜브)을 풀기/엽니다.
3. 4°C 냉장에서 스톡 콜라겐(8 mg/mL)을 제거하고 젖은 얼음 위에 놓습니다. 캡을 열어 둡니다.
4. 냉각된 셀 서스펜션 516 μL을 차가운 덮인 튜브에 추가합니다. 1000 μL 양변위 파이펫을 사용하여 차가운 콜라겐 용액의 375 μL을 캡된 튜브의 용액에 직접 피펫375 μL을 즉시 피펫합니다.
5. 파이펫에서 모든 콜라겐을 튜브로 추방하고 양수 변위 파이펫 팁을 폐기하십시오. 즉시 250 μL 포지티브 변위 파이펫으로 전환하고 콜라겐 용액을 혼합합니다.
6. 콜라겐 용액을 이전에 완료한 대로 혼합하십시오(거품 형성을 방지하기 위해 빠르지만 부드럽게) 가능하면 젤에서 팁을 제거하지 마십시오. 용액이 균일 할 때까지 혼합 (약 5 파이펫 사이클 또는 10 s). 혼합 할 때 균일 한 혼합튜브 (아래와 상단)의 다른 위치에서 그릴 해야합니다.
7. 혼합되면, 세포 콜라겐 용액의 250 μL을 세포 콜라겐 용액을 각각 12웰 배양 인서트 각각에 세포 콜라겐 지지체로 즉시 이송한다. 세포 콜라겐 지지체의 균일한 커버리지를 보장하기 위해, 접시를 흔들거나 양성 변위 파이펫을 사용하여 사세포 층을 방해하지 않고 갓 씨를 뿌린 세포 콜라겐을 부드럽게 움직입니다.
8. 12웰 플레이트를 37°C 세포 배양 인큐베이터로 즉시 이동하여 적어도 30분 동안 젤을 할 수 있게 한다. 사용 후 콜라겐을 4°C 냉장으로 다시 넣습니다.
9. 30분 젤 시간 후에 접시를 부드럽게 기울여 겔화를 평가합니다. 콜라겐이 고형화되었는지 확인합니다.
10. 블렌드 미디어 500 μL 및 1000 μL(반 내피 및 반 섬유아세포 유지 보수 매체)을 삽입의 상부 챔버 및 하부 챔버에 각각 추가합니다(먼저 위쪽, 아래쪽은 수압이 콜라겐을 위로 밀어내는 것을 방지합니다). 콜라겐 젤에 직접 가아니라 우물 측면에 천천히 미디어를 추가하여 콜라겐의 붕괴를 최소화합니다.
  1. 콜라겐 젤이 침수되었는지 확인하고 필요한 경우 더 많은 미디어를 추가하십시오. 하룻밤 배양을 위해 셀 인큐베이터에 웰 플레이트를 놓습니다. 이 단계에서 미디어에는 10 % FBS가 포함되어 있습니다. 각 셀라인에 대한 정상 유지 보수 매체(도 1,A에주어진 타임라인 및 회로도).
    참고: VHSE 배양 전반에 걸친 미디어는 사용자 지정 셀 유형에 맞게 조정할 수 있습니다. 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.
잠수일 2 (SD2) 미디어 변경
1. VHSE 웰의 10% FBS 미디어를 5% FBS 반 섬유아세포, 반 내피성 미디어로 100 μg/mL L-아스코르비산으로 보충하였다. 500 μL을 우물 측에 삽입하는 배양 의 상부 챔버에 추가하고(다시, 콜라겐의 중단을 최소화하기 위해 사이드월에 신중하게 추가) 하부 챔버에 1000 μL을 추가합니다.
2. 잠수일 7일(SD7)까지 2일마다 미디어를 갱신합니다(SD4 및 SD6).
3. 수동 파이펫을 사용하여 우물에서 미디어를 제거합니다. 흡착기 사용이 가능하지만 구조물의 손상이나 파괴가 발생할 수 있습니다.
  참고: L-아스코르브산은 2-3일마다 신선하게 이루어져야 합니다(과산화수소를 생성하기 위해 용액으로 산화되어 산화스트레스를 유발하고 결국 세포 손상^53). 따라서, L-아스코르브산이 존재하기 때문에, 미디어는 SD2에서 VHSE 배양이 끝날 때까지 2-3일마다 변경되어야 한다. 미디어를 만들고 매일 수유할 때마다 미디어에 새로 준비된 양의 L-아스코르빅 산을 추가하는 것이 가장 쉽습니다. 배양 등급의 물이나 미디어를 용매로 사용하고 신선한 L-아스코르브 산을 100 mg/mL에서 준비하십시오. L-아스코르브산은 섬유아세포에 의한 콜라겐 합성을 적절한 속도로 자극하고 콜라겐 안정성^54,^55,^56을촉진한다. 또한 내피 투과성을 감소시키고 혈관 벽 무결성^56,^57을 유지하고 표피 장벽 형성^6,^58에추가로 기여한다.

3. 표피 성분의 파종 및 계층화 유도

침수일 7 (SD7): 종자 각질 세포
참고: SD7에 표피를 설정하기 위해 종자 각질 세포. 이 시점은 연구원의 필요에 따라 이동할 수 있습니다. 각질 세포가없는 침수 배양의 지속 시간은 종종 더 긴 침수로 인해 진피 수축이 증가하기 때문에 9 일을 초과해서는 안됩니다. SD7 이전에 수축이 발생하는 경우 침수 기간을 5일로 단축하고 SD5의 종자 표피를 종자 표피를 줄이는 것이 좋습니다. 특정 실험에 필요한 대로 잠수 기간을 최적화합니다(토론의 문제 해결 참조).
1. 배양 각질 세포 (N/TERT-1^20,⁵⁹ 또는 기타 적절한 세포) 트립시화 및 VHSEs에 종자하기 전에 그들의 합류 한계에. N/TERT-1 세포의 경우, 2D^{배양(59)에서}각질 세포의 원치 않는 분화를 방지하기 위해 인플루언서가 30%를 크게 초과해서는 안 된다. 1차 인간 표피 각질 세포세포와 같은 다른 적절한 세포주를 위해, 75-80%의 인플루엔지 제한은 일반적으로^60을사용한다.
2. 트립시화 후, 510,000개의 세포를 인간 피부 등가물(HSE) 분화 매체의 600μL에서 5%의 FBS(표1)로보충하였다.
  참고: 600 μL에 510,000개의 셀이 170,000개의 세포/구산(3VHS)을 시드할 때 170,000개의 세포/구종을 허용합니다.
3. 수동 파이펫을 사용하여 현재 하단 및 상단 챔버에 있는 미디어를 수집하고 폐기합니다. 가능한 한 많은 미디어를 수집해야 합니다. 배양 삽입 멤브레인 아래에 파이펫 팁을 부드럽게 배치하고 삽입물을 일시적으로 제자리에 두드려 투과성 멤브레인 바로 아래에 붙어있을 수 있는 미디어를 수집합니다. 표면 장력으로 인해 미디어가 막혀 있을 수 있습니다. 삽입은 진행하기 전에 우물에 평평하게 앉아 있는지 확인하십시오. 흡착기 사용이 가능하지만 구조물의 손상이나 파괴가 발생할 수 있습니다.
4. 각 우물의 하부 챔버에 5 % FBS로 보충 된 HSE 미디어의 1 mL을 추가합니다. 그런 다음 각 웰의 상단 챔버에 200 μL의 셀 서스펜션을 추가합니다. 진피 구조 표면에 직접 시드합니다. 각질 세포가 인큐베이터에서 2 시간 동안 정착하게하십시오.
5. 각질 세포를 시드 한 후 2 h, 신중 하 게 추가 300 HSE 미디어의 μL 의 보충 5% FBS 각 구조의 상단 챔버잘; 천천히 배양 삽입의 측면에 파이펫 미디어. 아직 기본 콜라겐 젤에 단단히 부착하지 않았을 수 있습니다 정착 각질 세포에 방해하지 않도록 매우 신중하게 상단 챔버에 미디어를로드합니다.
6. 미디어를 로드한 후 인큐베이터에 다시 구성을 배치합니다.
침수일 8/9 (SD8 또는 SD9)
1. 1% FBS와 100 μg/mL L-아스코르브 산으로 보충된 HSE 미디어를 구성합니다.
2. 수동 피펫으로 상부 챔버와 하부 챔버 모두에서 미디어를 제거합니다.
3. 500 μL 미디어를 먼저 상단 챔버에 넣고 1mL을 하단 챔버에 넣습니다. (이 단계는 SD8 또는 SD9에서 수행할 수 있습니다.
잠수일 9/10 (SD9 또는 SD10, 이 단계 3.2 후 날이어야 한다)
1. 100 μg/mL L-아스코르브산으로 세럼 무료 HSE 분화 매체를 구성합니다.
2. 수동 피펫으로 상부 챔버와 하부 챔버 모두에서 미디어를 제거합니다.
3. 상부 챔버에 500 μL을 적재하고 하부 챔버에 1 mL를 로드합니다.
공기-액체 인터페이스 일 1 (ALI1)
참고: ALI는 3.3단계 다음 날 수행됩니다.
1. 상부 챔버에서만 미디어 폐기물을 제거하여 각 컨스트럭처를 공기-액체 인터페이스(ALI)로 들어올립니다. 수동 파이펫을 사용하여 표피 층을 만지거나 손상시키지 않고 가능한 한 피피 레이어에 가깝게 가십시오.
2. 접시를 다른 각도로 약간 기울여 미디어를 수집합니다. 이 단계에서 가능한 한 많은 미디어를 제거합니다. 일관된 습도를 유지하기 위해 플레이트의 주변 우물에 약 2mL의 멸균 물을 추가하십시오. 문화 전반에 걸쳐 물로 채워진 우물을 유지하십시오.
3. 몇 시간 후에 플레이트를 확인하여 각질 세포가 공기 액체 인터페이스에 있는지 확인합니다. 상부 챔버에 미디어가 있는 경우 제거합니다. 각 VHSE에 대해 제거되는 미디어양을 잘 추적합니다(상하실의 초기 부피(1500μL) - 미디어 제거 = ALI 공급에 대한 좋은 출발점).
  참고: VHSEs는 반드시 에어 리프트에 대해 동일한 미디어 레벨을 필요로 하는 것은 아닙니다. 일반적으로 VHS가 함께 시드되는 경우 에어 리프트에 대해 동일한 수준의 미디어가 필요하지만 항상 그런 것은 아닙니다. ALI를 유지하기 위해 필요에 따라 볼륨을 조정하지만 미디어 수준이 너무 낮지 않아 VHS가 건조하지 않도록 합니다. 에어 리프트와 수분 공급 사이의 균형이 충족될 때까지 매일 작은 미디어 양을 조심하고 제거하는 것이 더 안전합니다.
알리 데이 2 (ALI2)
1. 이 시점부터 는 100 μg/mL L-아스코르브 산으로 보충된 세럼 무료 HSE 미디어만 사용하십시오. ALI 2일(ALI2)에서 미디어를 변경합니다. 맨 위 챔버에 미디어가 있는 경우 이를 제거하고 이전에 기록된 제거된 미디어의 양에 추가합니다. 이전 단계에서 방정식을 사용하여 필요한 미디어 볼륨을 계산합니다. 예를 들어, 상부 챔버에서 200 μL의 미디어가 제거된 경우 1300 μL을 추가하여 ALI를 설정합니다(1500 μL - 200 μL = 1300 μL)을 설정합니다.
2. 계산된 부피를 사용하여 각 우물의 하단 챔버에 적재한 다음 플레이트를 셀 인큐베이터에 다시 넣습니다. 하루에 사용되는 볼륨을 추적합니다. 권장 콜라겐 양을 12웰 배양 인서트에서 사용하는 경우, 일반적인 범위의 ALI 값은 750 μL과 1300 μL 사이입니다. 배양 세부 사항에 따라 이 숫자는 변경될 수 있으며 최적화해야 합니다(설명된 대로 3.4.2 - 4.1).

4. 혈관 인간의 피부 동등한의 일상적인 유지 보수

ALI Day 3(ALI3)부터 배양 종점까지: 100 μg/mL-아스코르브산을 사용한 혈청 무료 HSE 미디어를 사용하여 2-3일마다 하부 챔버의 미디어를 갱신합니다. 단계 3.5.2에 설명된 대로 ALI의 하단 챔버에 필요한 미디어 레벨을 계속 조정하고 추적합니다.
표피 표면이 공기와 접촉해야 하므로 일관된 ALI 수준이 확립될 때까지 매일 미디어 수준을 확인하고 조정해야 합니다. 표피 층은 건조하지 않고 수분을 공급받아야 하지만 구성 상의 상단에 미디어가 풀링되어서는 안됩니다. ALI의 8 주를 가진 배양은 가장 일관된 형태와 표현을 제공했습니다; 그러나, 응용 프로그램에 따라, 4 ~ 12 주 문화가 적절 할 수 있습니다. 다른 세포 및 배양 조건에 대한 배양 지속 시간을 최적화해야 할 수도 있습니다.
참고: 월요일, 수요일, 금요일을 변경하는 것은 좋은 관행입니다. VHS는 주말 동안 건강하지만 미디어는 월요일 초와 금요일 늦게 변경해야합니다. 1-4단계를 완전히 완료한 후 VHSE 생성이 완료됩니다. 프로토콜의 단계 5-end는 이러한 유형의 3D 구조에 최적화된 선택적 처리 및 이미징 기술입니다.

5. 3D 구문의 고정 및 투과화

참고: 5단계는 프로토콜의 나머지 부분에 설명된 이 3D 구조에 특정한 이미징 기술에 최적화되었습니다. VHSE를 생성하는 데 다음 단계가 필요하지 않습니다.

고정/투과성
1. 문화 기간의 끝점에 각 우물의 상하 챔버에서 모든 미디어를 주의 깊게 제거합니다.
  참고: 표피 층은 아마도 깨지기 쉽고 조심스럽게 다루며 공격적인 파이펫팅으로 표피를 자극하지 않습니다.
2. PBS(pH 6.9)에서 4% 파라포름데히드(PFA)를 상부 챔버 벽(컨스트럭트에 직접 켜지지 않음)한 다음 하부 챔버에 추가하여 각 구조를 미리 수정합니다. 챔버당 1mL를 추가하고 실온에서 5 분 동안 노출하십시오.
  주의: PFA는 위험하며 눈 보호를 포함하여 주의하고 적절한 개인 보호 장비 (PPE)로 처리해야합니다.
3. 5 분 후 4 % PFA 솔루션을 제거하고 이전 단계에서 설명 된 바와 같이 상부 및 하부 챔버에 4 % PFA 솔루션에 0.5 % Triton X 100을 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 노출; VHSE 구조는 지금부터 멸균 환경을 필요로하지 않습니다.
4. 1 시간 후, 조심스럽게 챔버 모두에서 투과 / 고정 용액을 제거하고 1 x PBS로 샘플을 3 번 세척합니다.
5. PBS에 샘플을 4°C 냉장 또는 즉시 얼룩으로 저장합니다. 샘플을 저장하려면 접시를 플라스틱 랩에 싸서 증발과 광 노출을 최소화합니다.
  참고: 일시 정지 점 - 고정 및 투과화 후 5.1.5 단계에서 설명된 대로 준비된 경우 샘플이 몇 주 동안 안정되어 있기 때문에 이 절차를 일시 중지할 수 있습니다. 대안적으로, 염색(6단계에서 설명된 대로)은 5단계 직후에 완료될 수 있다.

6. 3D 구문의 면역형광 염색

구성 준비
참고: 배양물의 다공성 막으로부터 분리될 때 VHSEs 얼룩이 잘 얼룩질 수 있습니다. 막에서 분리는 또한 방해되지 않는 화상 진찰을 위해 필요하고 염색을 위한 감소된 부피를 가능하게 합니다.
1. 면역형광 염색을 위한 구조를 준비하려면 인서트를 거꾸로 뒤집어 웰 플레이트 위에 놓습니다(VHSE가 떨어지면 PBS와 잘 어플됩니다)(보충도 1A).
2. 미세 팁 집게 및/또는 정밀 나이프를 사용하여 인서드 멤브레인의 둘레의 절반 정도를 자르면서 한 손으로 우물 위에 인서트를 안정화합니다. VHSE 구조의 손상을 방지하기 위해 부드러운 손으로 가능한 한 플라스틱 하우징에 가깝게 절단.
3. 미세 팁 집게를 사용하여 절단 멤브레인 플랩의 가장자리를 잡고 VHSE 구조뿐만 아니라 인서트에서 다공성 멤브레인을 부드럽게 벗깁니다. VHSE 구조 구조의 손상을 방지하기 위해 매우 신중하고 천천히 이 작업을 수행하십시오. VHSE 구조가 쉽게 분리되면 챔버 의 측면에 붙어있는 경우 아래 우물에 떨어질 것입니다. 일반적으로 깨지기 쉬운 표피 층을 매우 염두에 두어야합니다(보충 도 1A).
  참고 : 때때로 멤브레인이 쉽게 벗겨지지 않거나 조각으로 벗겨지며, 이런 일이 발생하면 도구를 사용하여 멤브레인과 VHSE 구조를 조심스럽게 당깁니다. 필요한 경우 PBS에 찍어이 과정에서 VHS가 건조하지 않도록하십시오.
4. VHSE가 잘 되면, 삽입 막의 남은 조각을 버리고 배양 삽입 하우징을 각 우물에 보관하여 염색 중에 잠수된 위치에 VHSEs를 고정하십시오.
얼룩
참고: 염색 및 관련 처리/조작 및 세서는 VHS가 깨지기 쉽기 때문에 가능한 한 부드럽게 수행해야 합니다. 표피의 일부가 들어 올리면 조각은 별도로 염색 될 수 있습니다. 표피의 상부 층은 깨지기 쉽고 자연 적층^4를거치지만 분석을 위해 가능한 한 무결성을 유지하는 것이 중요합니다.
1. 선택한 1차 항체 얼룩을 구조당 블로킹 버퍼의 700 μL로 준비합니다(전형적으로 모든 1차 항체는 동일한 염색 용액에 있을 수 있지만 새로운 항체에 대해 확인되어야 함). 700 μL은 12웰 크기로 작동하지만 다른 배양 형식에 맞게 조정할 수 있습니다. 차단 완충 레시피를 가진 1 차 및 이차 항체의 권장 농도는 표 3에 주어집니다 (최적화가 필요할 수 있습니다).
2. 수동 파이펫을 사용하여 우물에서 PBS를 제거하고 VHSEs에서 피펫을 피펫하십시오 (VHSEs가 떠다니므로 진공 포부는 권장되지 않습니다).
3. 각 우물에 1차 얼룩 용액을 추가하고 배양 삽입 하우징을 우물에 배치하여 VHSE가유체(보충 도 1B)에잠정된 것을 유지합니다. 웰 플레이트를 플라스틱 랩으로 감쌉시다. 4°C에서 48h의 호일 및 얼룩은 동요 또는 흔들림 없이 냉장(흔들기 는 VHSE 구조에 손상을 줄 수 있음).
4. 48h 후, 블로킹 버퍼의 700 μL (잘 당)에서 이차 항체 및 화학 얼룩을 준비합니다.
5. 배양 인서트와 1차 얼룩 용액을 제거하고 1x PBS로 세척하고, 이차 얼룩 용액을 추가하기 전에 5분 동안 3배세척한다. VHSE 구조가 침수된 상태로 유지하려면 배양 인서트 하우징을 다시 우물에 배치합니다(보조도 1B). 동요 나 흔들림없이 4 °C 냉장에서 48 h에 노출.
6. 48h 노출 후 수동 피펫으로 얼룩 용액을 제거하고 PBS로 3배 부드럽게 세척하십시오. 그들은 깨지기 쉬운 수 있습니다 VHS에 바로 유체를 피펫하지 마십시오. 과도한 PBS로 재수화하고 VHSE가 저장 중에 침수 및 수분을 유지하기 위해 배양 인서트 하우징을 다시 우물에 배치합니다(증발 및 광 노출을 최소화하기 위해 플라스틱 랩과 호일로 포장하여 보관)
클리어링(옵션 및 터미널)
참고: 지우기는 이미징의 선택 사항입니다. 완료되면 클리어링이 추가 염색을 방지하고 불소 성능을 변화시킬 수 있으며 VHSE 구조를 손상시킬 수 있으므로 샘플을 완전히 염색/이미징한 후에 수행해야 합니다. 다중 조직 청산 방법은^49,^61,^62가 존재하며 특정 프로젝트에 최적화될 수 있다. 아래에 설명된 메틸 살리실레이트 클리어링은 VHSE에 간단하고 효과적입니다. 다음 클리어링 기술은 유리 용기에서 완료되어야하며 파이펫 팁은 유리 또는 폴리 프로필렌해야합니다 (폴리스티렌은 메틸 살리실레이트와 접촉하여 용해됩니다). 통풍이 잘 되는 부위 또는 연기 후드에서 모든 클리어링 절차를 완료하십시오.
1. 작은 얕은 유리 용기에 100% 메탄올을 넣습니다(유리 페트리 요리가 잘 작동함). 시약 폐기물을 최소화하기 위해 구조에 맞는 가장 작은 용기를 사용합니다.
2. 집게/스푸쿨라(보충도1C)를사용하여 웰 플레이트에서 컨스트럭션을 제거하고 메탄올 채워진 용기에 놓습니다. 구문이 잠기지 않으면 메탄올을 더 추가합니다.
3. 3 x 10 분 몰입에 대 한 메탄올에서 VHSE 구조를 탈수; 각 침수 후 메탄올을 완전히 교체하고 마지막 목욕 후 즉시 메탄올을 제거하십시오. 이 절차의 과정을 통해, 구조는 더 불투명하고 약간 축소 될 수 있습니다.
  참고: 이러한 지속 시간과 반복은 최적화되었지만 메탄올과 다음 메틸 살리실레이트 절차는 특정 문화 형식및 얼룩에 따라 사용자 지정해야 할 수 있습니다.
4. 메탄올을 제거한 직후 메틸 살리실레이트를 추가하고 VHSE를 5 x 5분 몰입에 담급합니다. 각 침수 후 시약을 완전히 교체하고 VHSE를 저장용 5번째 침수 솔루션에 둡니다. 이 절차를 통해 구문이 투명해집니다.
5. 4°C에서 구문 또는 저장소를 이미지합니다. 클리어링 후, 가능한 한 빨리 모든 이미징을 완료, 형광은 일 이내에 메틸 살리실레이트에서 저하 될 수 있습니다. 클리어링으로 인해 구문이 부서지기 쉽고 확장된 저장소는 권장되지 않지만 충분한 양의 메틸 살리실레이트가 있는지 확인하기 위해 정기적인 검사가 필요합니다.

7. 3D 구문의 공초점 이미징

참고 : 조직 배양 플라스틱을 통해 이미징커버 슬립 유리를 통해 이미징과 동일한 이미지 품질을 생성하지 않습니다,이 방법은 공초점 이미징 동안 건조를 방지하기 위해 사용자 정의 유리 바닥 우물의 제조를 설명합니다. 전형적으로, 이것은 화상 진찰의 적어도 3 h를 위해 충분합니다.

이미징 2일 전: 폴리디메틸실록산(PDMS) 준비
1. [9:1], 베이스: 크로스링커의 제안된 농도에서 PDMS^48,^63,^64를 준비한다. PDMS 총 30g의 기본 성분 27g과 크로스링커 3g을 준비합니다. 깨끗한 믹싱 용기는 계량 저울에 놓고 스케일을 세레합니다. 베이스(27g)를 추가한 다음 크로스링커(3g)를 추가하여 총 30g을 달성합니다. 항상 크로스링커 앞에 베이스를 추가하십시오.
2. 용액을 적어도 4 분 동안 적극적으로 저어주세요. 이렇게 하면 작은 거품이 생성됩니다. 충분한 혼합 후 PDMS를 100mm 페트리 접시 또는 이와 유사한 평평한 바닥 내열 용기에 붓습니다.
3. 혼합에서 모든 거품이 사라지고 PDMS가 명확 할 때까지 진공 챔버에서 PDMS를 분리합니다. 진공을 천천히 풀어 PDMS(천천히)를 제거합니다. 하룻밤 동안 치료하기 위해 오븐에 접시를 놓습니다 (50-60 °C); PDMS가 균등하게 치료할 수 있도록 접시가 평평하게 앉아 있는지 확인하십시오.
  참고: 경화 후 PDMS는 명확해야 하며 표면은 매끄럽고 끈적거리지 않아야 합니다(끈적끈적함은 부적절한 혼합을 나타낼 수 있음).
이미징 하루 전: PDMS 잘 준비
1. 강철 펀치 또는 핸드헬드 정밀 나이프를 사용하여 7.1로 준비된 PDMS 시트에서 원형을 잘 절단합니다. 우물은 VHSE 구조와 동일한 크기여야 합니다. 원형 주위에 사각형 패치를 잘 잘라 하나의 PDMS를 잘 만듭니다. 준비된 30g PDMS 양은 적어도 4개의 사용자 지정 우물을 산출해야 합니다.
  참고: PDMS는 VHSE 구문의 크기에 가까워야 합니다. 이미징 중에 샘플 모션을 수축시켜야 합니다. 여러 개의 우물을 한 번에 조작하고 깨끗한 용기에 무기한 보관할 수 있습니다.
2. PDMS와 유사한 크기의 유리 커버슬립을 사용하여 PDMS의 하단 표면에 시아노아크라일트 접착제(예: 슈퍼 접착제)를 추가하고 일회용 파이펫 팁으로 고르게 얼룩을 가집니다. 펀치 원 내에 투명한 유리 창을 남기면서 PDMS를 유리에 잘 누르고(접착제가 보기 창 위에 얼룩지지 않도록).
  참고: 사용 가능한 경우, PDMS의 플라즈마 접합은 대체^65,^66,^67이다.
3. 접착제를 사용하기 전에 몇 시간 동안 또는 하룻밤 동안 건조하게하십시오. 그들은 정상적인 마모에서 휴식 때까지 이재 사용할 수 있습니다.
  참고: 이미징에 잘 사용되는 접착 된 PDMS의 샘플을 염색하지 않는 것이 좋습니다. 이 우물은 몇 시간 동안 액체를 보유하지만 더 긴 염색 중에 누출 될 수 있습니다.
VHSE 이미징
참고: 불분명한 샘플을 이미징하는 경우 PBS를 이미징 솔루션으로 사용합니다. 클리어된 샘플을 사용한 이미징이 있는 경우 메틸 살리실레이트(또는 선택한 클리어링 솔루션)를 이미징 솔루션으로 사용합니다.
1. PDMS에 이미징 솔루션을 몇 방울 더 추가하고 누출을 확인합니다 (누출이있는 경우, 시아노아크라일레이트 슈퍼 접착제의 점 / 얼룩으로 수리하거나 다른 우물을 사용하십시오).
2. VHSE를 추가할 때 이미징 솔루션을 PDMS에 잘 보관합니다. 스푸쿨라 또는 미세 팁 집게(보충 도 1C)를사용하여 12 웰 플레이트에서 구조를 제거하고 PDMS에 유리 커버 슬립에 잘 넣습니다. 목표에 대한 관심의 방향으로 구성을 배치합니다. 예를 들어, 반전된 현미경을 사용하여 표피를 이미지화하려면 표피가 아래로 향하고 있는지 확인하여 유리쪽으로 향합니다.
  1. 또는, 똑바로 현미경을 위해, 표피를 위로 직면. 아래 화상 진찰 절차는 반전된 현미경을 위해 기술됩니다, 그러나 똑바로 적응될 수 있었습니다.
    참고: 손상을 방지하기 위해 VHSE를 조작할 때는 주의해야 합니다. VHSE가 떨어지는 경우 웰 플레이트 위로 전송합니다. 구부러지고 평평한 팁 스쿠쿨라가 구공을 전달하는 가장 쉬운방법입니다(보충 도 1C).
3. 샘플이 우물에 평평하게 앉아 있는지 확인하고 표피 또는 진피의 일부가 샘플 아래에 접히지 않았는지 확인하십시오. 접이식이 발생하면 집게 나 스쿠쿨라로 샘플을 부드럽게 조작하십시오. VHSE를 띄우려면 일시적으로 추가 이미징 솔루션을 추가하면 곧게 펴는 데 도움이 될 수 있습니다. 시료의 접기 또는 주름은 눈이나 현미경을 사용하여 볼 수 있다.
4. 시료를 수화시키기에 충분한 유체를 사용하여 이미징 용액으로 잘 채우십시오. 너무 많은 유체가 시료를 띄워 이미징 중에 움직임을 일으킵니다. 구조는 유리 보기 창에 앉아 있어야합니다. PDMS를 잘 기울여 이동을 테스트합니다. 움직임이 있는 경우, 일부 유체를 제거; 움직임이 멈출 때까지 유체 드롭을 현명하게 추가하고 제거합니다.
5. 이미징(보조 도 1D)에서증발을 최소화하기 위해 유리 슬라이드를 우물 위에 놓습니다. 더 긴 이미징 세션의 경우 적절한 유체 수준을 보장하기 위해 샘플을 자주 확인하십시오. 접근이 가능하면 이미징 중에 가습 챔버를 사용할 수 있습니다(일반적으로 필요하지는 않지만).
6. 유리 커버슬립창(보충도 도 1D)을통해 현미경 단계와 이미지에 샘플을 배치합니다. 이 기술은 연속 공초점 화상 진찰의 적어도 3 h를 허용합니다, 그러나 견본의 수분공급은 필요할 때 추가된 화상 진찰 해결책으로, 정기적으로 검사되어야 합니다.
  참고: 샘플이 지워지면 메틸 살리실레이트는 시간이 지남에 따라 접착제가 저하됩니다. PDMS를 접합하는 접착제는 이미징 실행 사이에 다시 적용할 수 있습니다. 또는 샘플은 주기적으로 새로운 우물로 전송될 수 있다. 플라즈마 결합이있는 우물에서는 문제가되지 않습니다.
7. 이미징 후, 잘 에서 가능한 한 이미징 유체와 샘플을 플로트. 스쿠쿨라 또는 미세 팁 집게를 사용하여 샘플을 저장소로 잘 옮길 수 있습니다. 샘플이 떨어지는 경우 웰 플레이트를 통해 전송을 수행합니다.
8. 각 PDMS웰과 상단 유리 커버슬립은 파손될 때까지 재사용할 수 있습니다. 이미징 전에 바닥 유리를 청소하십시오. 다시 사용하기 전에 항상 필요에 따라 누출을 확인하고 접착제로 수리하십시오.
9. 6.3.6 단계에서 설명된 바와 같이 샘플을 저장하고 유지 보수위해 몇 개월마다 PBS를 추가합니다. 샘플을 지워두면 메틸 살리실레이트를 사용하여 유리에 보관하고 정기적으로 레벨을 확인하십시오. 지워진 샘플은(며칠 내에) 빠르게 저하될 수 있으며 가능한 한 빨리 이미지화되어야 합니다.

Representative Results

여기에 텔로머라아제 역실사(TERT)를 이용한 체외 혈관 혈관 인체 피부 등가물(VHSE)의 생성을 위한 프로토콜이 제시되고 있다(N/TERT-1^20,^59),성인 인간 진피 섬유아세포(hDF), 및 인간 미세혈관 내피세포(HMEC-1)(그림1). 또한, 이 프로토콜의 사용자 지정 특성은 hDF 대신 일반적으로 이용 가능한 폐 섬유아세포(IMR90)를 사용할 때 VHSE 생성 및 안정성을 입증함으로써 강조됩니다. VHSE의 생성은 1-4단계로 완료되며, 5-7단계는 이러한 VHSE에 최적화된 선택적 엔드포인트 처리 및 이미징 기술입니다. VHS는 특정 연구 질문에 따라 처리될 수 있으며 5-7단계는 구문을 생성할 필요가 없습니다. 체적 이미징, 분석 및 3D 렌더링이 완료되어 체적 분석 방법을 시연했습니다. 이러한 체적 구성 준비 및 이미징 프로토콜은 현미경 및 거시적 수준 모두에서 VHSE 구조를 보존하여 포괄적인 3D 분석을 가능하게 합니다.

표피와 진피의 특성화는 VHSE 구조에서 인간의 피부에 적합한 면역 형광 마커를 나타내준다(도2,3). 사이토케라틴(10)은 일반적으로 피부 등가물^18,^30,^68(도 2)의모든 초분화 각질 마커이다. 인볼루크린과 필라그린은 각질 세포에서 후기 분화 마커이며 피부^{등가물 12,}^30,^68,⁶⁹ (도 2)에서가장 상부 적인 수프라다살 층을 표시한다. 극한형형핵염(재료목록 참조)은 표피와 진피 모두에서 핵을 표시하는 데 사용되었으며, Col IV는 진피의 혈관을 표시하였다(도2, 도 3, 도 4). 표피 지하 멤브레인 (BM) 성분은 HSE^배양15,^16에서항상 제대로 발현되지 는 않는다. BM의 Col IV 염색은 이 프로토콜을 사용하여 일관되게 관찰되지 않습니다. 연구에 초점을 맞춘 BM 구성 요소 및 구조는 추가 미디어, 세포 및 이미징 최적화^14의혜택을 누릴 수 있습니다.

VHSE 배양의 대부분을 통해 공초점 화상 진찰은 종종 진피와 표피의 계산 분석에 충분한 고해상도 심상을 산출하지만, 설명 된 클리어링 방법은 더 깊은 조직 이미징을 허용합니다. 클리어링은 공초점 레이저 침투 깊이를 향상시키고, VHSEs의 효과적인 이미징은 클리어드 시료의 경우 1mm 이상으로 달성될 수 있습니다(불분명한 경우 ~250 μm에 비해). 설명된 클리어링 기술(메탄올 탈수 및 메틸 살리실레이트)은 VHSE 샘플^{조직(61)을}통해 굴절률과 충분히 일치한다. VHSE를 지우면 조작 없이 전체 구체를 통한 간단한 이미징이 허용되었습니다(예를 들어, 진피와 표피를 따로 이미지화하기 위해 구조방향을 조정함),(도 3).

체적 이미지는 각구조(그림 4)에걸쳐 혈관을 매핑하는 3D 렌더링의 생성을 허용합니다. 간단히, 공초점 이미지 세트는 콜라겐 IV 얼룩 (마킹 용기 벽) 및 핵 (극한형 형광 핵 염료로 표시)를 검출하기 위해 VHSEs의 여러 하위 부용량의 표피 방향으로 진피 방향으로 촬영되었다. 이미지 스택은 계산 소프트웨어(재료 목록 참조)와 사용자 지정 알고리즘(이러한 소스 ^48,^70,^71,^72,^73,^{74, 75)에}따라^3D렌더링 및 정량화에 사용됩니다. 이 알고리즘은 Col IV 얼룩을 기반으로 혈관 구성 요소를 자동으로 분할합니다. 체적 세분화는 빠른행진^75,^76,^77을기반으로 한 골격화 알고리즘으로 전달된다. 골격화는 각 Col IV 표시 용기의 최종 중심을 발견하고 결과 데이터는 혈관 분획뿐만 아니라 혈관 직경을 계산하는 데 사용될 수 있습니다(도 4). 와이드필드 형광 현미경 검사는 레이저 스캐닝 현미경 검사를 사용할 수 없는 경우 접근 가능한 옵션입니다. 혈관 망 및 표피는 넓은 필드 형광 현미경 검사법(보충 도 2)으로심을 수 있습니다. 3차원 정량화는 레이저 스캐닝 현미경 검사법보다는 VHSEs의 와이드필드 이미징을 사용하여 가능하지만, 비행기 밖에서 의한 빛으로 인해 더 많은 필터링 및 감소가 필요할 수 있습니다.

그림 1: 혈관화된 인간 피부 동등한 생성의 회로도 타임라인. A) 진피 성분 파종, 2) 근해 성분에 대한 각질 세포 종자, 3) 공기 액체 인터페이스 및 배양 유지를 통한 상피 계층화로부터 VHSE 모델의 진행을 나타낸다. 배양 후 처리 및 체적 이미징은 배양 종점에서 수행될 수 있다. B) 문화 권면에 있는 hDF VHSE 매크로구조의 카메라 이미지8주. 다양한 수준의 수축은 VHS의 경우 정상입니다. 프로토콜이 설명한 대로 수축을 줄일 수 있습니다. (1 & 2) 덜 수축된 샘플. (3 & 4) 더 많은 수축된 샘플은 여전히 적절한 피부 요소를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 면역 형광 마커를 통한 표피 특성화. 모든 이미지는 공초점 현미경 검사를 통해 8wk 배양 타임 포인트에서 VHSEs를 촬영했습니다. 해당 염색 방법은 프로토콜 단계 6에 설명되어 있습니다. 적절한 상피 마커는 hDF VHSEs(왼쪽 컬럼)와 IMR90 VHS(오른쪽 열)에 모두 존재한다. Involucrin과 Filaggrin은 각질 세포의 늦은 분화 마커이며 표피가 두 VHSE 유형 모두에서 완전히 계층화되어 있음을 보여줍니다. 사이토케라틴(10)은 VHSEs에서 초라바살 층을 식별하는 초기 분화 마커이다. 핵은 노란색으로 직교 뷰로 표시됩니다. En 얼굴 및 직교 최대 투영 이미지는 계산 소프트웨어를 통해 렌더링되었습니다. 이미지는 배경 빼기 및 중앙값 필터링으로 개별적으로 확장되어 명확성을 제공합니다. 스케일 바는 100 μm입니다(사내 차단 완충레시피를 사용하는 기본 및 이차 항체는 표 3에주어집니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 불분명한 VHSE의 비교. 이 VHSE는 IMR90s로 생성되었으며 이미지는 공초점 현미경 검사를 통해 4wk 배양 시점으로 촬영되었습니다. 콜라겐 IV는 시안으로 도시된다; 핵은 마젠타에서 표시된다; 지워진 3D 렌더링에서 마젠타는 VHSE의 표피 층에서 핵의 통합을 나타낸다. 불분명한 VHSE 이미지는 두꺼운 VHSE 구조에서 레이저 감쇠의 예이며, 클리어링(메탄올 및 메틸 살리실레이트)을 통해 전체 구조는 컨스트럭처의 진피 측으로부터 레이저 감쇠가 거의/없음으로 이미지될 수 있다. 레이저 라인, 게인 및 핀홀을 포함한 이미징 설정은 과포화를 줄이기 위해 클리어된 VHSE를 위해 낮아졌습니다. 지우기 및 이미징은 프로토콜에서 6 단계 및 7 단계에 설명된 대로 완료되었습니다. 직교 최대 프로젝션 이미지와 3D 렌더링은 계산 소프트웨어로 완료되었으며, 3D 렌더링은 지워진 생성 이미지에서 생성되었습니다. 이미지는 배경 빼기 및 중앙값 필터링으로 개별적으로 확장되어 명확성을 제공합니다. 스케일 바는 100 μm입니다.

그림 4: VHS 내의 혈관의 입체 분석. 공초점 현미경을 통해 촬영한 체적 이미지는 계산 영상 분석을 통해 배양 종점에서 혈관 파라미터 정량화를 가능하게 합니다. VHSE 하위 부피로부터, 콜라겐 IV 얼룩(cyan)의 검출은 혈관의 내피성 벽을 표시하고 콜라겐 IV 위치에 기초한 혈관의 분할을 허용한다; 그런 다음 세분화 데이터가 골격화되고 각 용기의 중심이 발견됩니다(마젠타). 3D 골격화의 예는 4주 및 8주 IMR90 VHSE 샘플에 대해 표시되어 지워지지 않았습니다. IMR90 VHSE 실험 세트의 결과 데이터는 각 구조물 내의 4개의 하위 부피(z-방향으로 각각 250 μm)에 대한 혈관 직경 및 혈관 분획을 계산하는 데 사용되었으며, 데이터는 VHSE당 평균및 배양 시중당 더 평균되었다. 이러한 데이터는 생체 내 인간^{피부(78)와}관련된 직경을 가진 4 주 및 8주 배양 기간에 걸친 혈관 네트워크 항상성을 나타내며, 생체 내 인간^{피부(79)와} 동일한 순서 내에서 혈관 분획(콜라겐 구조의 혈관 분획은 사용자 정의^가능하고 증가된 값에 최적화될 수 있음). 데이터는 표준 오차 평균(S.E.M)을 ± 수단으로 표시됩니다. 각 시간포인트에 대해 n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

미디어	구성 요소
인간 진피 섬유아세포 세포주 (hDF)	DMEM HG
	5% 태아 소 세럼 (FBS)
	1% 페니실린/연쇄절제술 (P/S)
IMR90 섬유아세포 세포주	DMEM/HAM의 F12 50:50
	10% FBS
	1% P/S
HMEC-1 내피 세포주	MCDB131 베이스 매체
	10% FBS
	1% P/S
	L-글루타민 [10mM]
	표피 성장 인자 (EGF) [10 ng/mL]
	하이드로코르티손 [10 μg/mL]
N/TERT-1 케라틴세포 세포주	K-SFM 미디어 베이스
	1% P/S
	소 뇌 하 수 체 추출 물 (BPE) [25 μg/mL], K-SFM 보충 키트에서
	표피 성장 인자 (EGF) [0.2 ng/mL], K-SFM 보충 키트에서
	CaCl2 [0.3 mM]
인간 피부 에 상응하는 (HSE) 분화	3:1 DMEM: 햄의 F12
	1% P/S
	0.5 μM 하이드로코르티손
	0.5 μM 이소프로테레놀
	0.5 μg/mL 인슐린

표 1: 미디어 레시피. 인간 진피 섬유아세포, IMR90 섬유아세포, HMEC-1 및 N/TERT-1 각질 세포의 2D 배양을 위한 미디어 레시피가 제공됩니다. 이러한 조리법은 VHS를 생성하기 전에 세포주를 확장하는 데 사용되었습니다. 인간 피부 등가(HSE) 분화 매체는 VHSEs를 생성하는 데 사용됩니다. 기본 레시피가 주어지며, 침수 배양 및 계층화 유도의 일부 동안, 의정서 3단계에 설명된 바와 같이 FBS의 가늘어지는 양을 추가해야 한다. 이러한 소스를 기반으로 HSE 조리법^11,⁸⁰.

콜라겐 재고 농도_(C):	8	mg/mL
원하는 볼륨(V_f):	1	mL
NaOH 조정 을 정상화*:	1	X
*콜라겐의 각 많은 pH 7 - 7.4를 설정하는 데 필요한 NaOH의 양을 결정하기 위해 테스트 할 필요가
		원하는 콜라겐 농도 (mg/mL)
	2	3	4	5
10X PBS(V_pbs)	0.1	0.1	0.1	0.1
콜라겐 스톡(V_s)	0.25	0.375	0.5	0.625
1N 나오(V_NaOH)	0.00575	0.008625	0.0115	0.014375
미디어(V_미디어)	0.64425	0.516375	0.3885	0.260625

표 2: 콜라겐 계산 참조 테이블. 기준표는 8 mg/mL 콜라겐 재고 농도와 원하는 최종 부피 1mL을 가정하여 계산되는 일반적으로 원하는 콜라겐 농도를 제공합니다. 모든 값은 mL에 있습니다. 이러한 금액을 계산하는 데 사용되는 방정식은 프로토콜 단계 2.2에 제공됩니다. 각 콜라겐 스톡에 대한 pH를 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우, NaOH 금액을 추가하여 pH 7 - 7.4(PBS, NaOH, 콜라겐 스톡, 미디어 추가 후)를 달성해야 합니다. 프로토콜은 3 mg/mL 콜라겐 농도를 사용하여 VHSEs에 최적화되었습니다. 콜라겐 농도의 변화는 상이한 세포주/바람직한 최종^{결과(48)에}필요할 수 있다.

1차 항체	근원	농도	쓰다
필라그린 (AKH1) 마우스 모노클로날 IgG	산타 크루즈; sc-66192 (200 μg/mL)	[1:250]	늦은 분화 마커¹⁵
인볼루크린 토끼 폴리클로날 IgG	프로틴테크; 55328-1-AP (30 μg/150 μL)	[1:250]	늦은 말단 분화 마커¹⁵
사이토케라틴 10 (DE-K10) 마우스 IgG, 상주	산타 크루즈; sc-52318	[1:350]	수프라바살 표피 마커^14,^36,⁵⁹
콜라겐 IV 토끼 폴리클로날	프로틴테크; 55131-1-AP	[1:500]	내피 혈관 벽⁶⁷
DRAQ 7	셀 시그널링; 7406 (0.3mM)	[1:250]	핵 마커
이차 항체	근원	농도	쓰다
염소 안티 래빗 IgG DyLight™ 488 컨쥬게이트	인비트로겐; 35552 (1 mg/mL)	[1:500]	콜라겐 IV 보조
안티 래빗 IgG (H&L) (염소) 항체, 다이라이트™ 549 컨쥬게이트	록랜드 면역화학물질; 611-142-002	[1:500]	인볼루크린 보조
염소 안티 마우스 IgG (H&L), 다이라이트™ 488	열 과학; 35502 (1 mg/mL)	[1:500]	필라그린 또는 사이토케라틴 10 보조
블로킹 버퍼(500mL)
시약	분량
ddH2O	450mL
10 x PBS	50mL
소세럼 알부민 (BSA)	5 g
트웬 20	0.5mL
차가운 물 물고기 젤라틴	1 g
아지데 나트륨 (디H2O의 아지드 나트륨 10%)	5mL (0.1 % 최종 농도)

표 3: 버퍼 레시피를 차단하는 초등 및 이차 항체. 나열된 항체 및 화학 얼룩은 도 2, 도3, 도 4에도시된 염색에 사용되었다. 여기에 나열된 차단 버퍼 레시피를 사용하여 프로토콜 단계 6에서 주어진 대로 염색이 완료되었습니다. 염색 농도및 지속시간의 일부 최적화는 선택한 배양 기술 및 세포주에 따라 필요할 수 있다.

보충 표 1: 약어 목록. 약어 목록은 독자의 편의를 위해 포함되어 있습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 도 1: 처리를위한 VHSE 기술 지원. 특히 고정, 처리 및 염색 중에 VHS를 처리하는 것은 어려운 일입니다. A-D는 5-7단계의 지침에 해당합니다. A는 적절한 염색을 보장하기 위해 배양 인서트에서 다공성 멤브레인을 제거하는 기술적 처리를 보여줍니다. B는 각 VHSE를 스테인딩 및 보관 중에 잠수시키는 방법을 보여줍니다. C는 PDMS 이미징 웰로 구인을 이동하는 가장 안전하고 쉬운 방법을 보여줍니다. D는 PDMS 이미징에 잘 앉아 있는 VHSE를 보여줍니다: PDMS는 바닥에 유리 슬라이드에 잘 붙어 이미징을 위한 창을 만들고, 유리 슬라이드는 긴 이미징 실행을 통해 습도를 유지하기 위해 상단에 배치됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 2: 표준 광장 형광 현미경 검사는 VHSEs를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 와이드필드 이미징은 레이저 스캐닝 현미경 검사를 사용할 수 없을 때 일상적인 평가를 위해 체적 이미징에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 정맥 및 바식측 양상 모두에서 VHS의 이미징은 en 얼굴 및 직교 (직교)의 최대 투영으로 표시됩니다. (상단) 표피는 인볼루크린과 핵을 마커로 사용하여 이미지화되었다. (하단) 진피 혈관은 콜라겐 IV를 마커로 사용하여 이미지화되었다. 이미지는 명확성을 위해 배경이 빼됩니다. 평면 에서 벗어난 빛은 직교 보기에서 분명하게 드러나는 "줄무늬" 또는 "플레어" 유물로 이어집니다. 와이드필드 이미징은 정량화에 사용될 수 있지만 더 많은 이미지 처리가 필요할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 VHSEs 생성및 3차원 분석을 위한 간단하고 반복가능한 방법을 보여 주었습니다. 중요한 것은 이 방법은 몇 가지 특수 기술이나 장비 조각에 의존하여 다양한 실험실에 액세스할 수 있도록 합니다. 또한, 세포 모형은 프로토콜에 있는 제한적인 변경으로 대체될 수 있습니다, 연구원이 그들의 특정 필요에 이 프로토콜을 적응할 수 있도록.

적절한 콜라겐 겔화는 피부 문화를 확립하는 데 있어 어려운 단계입니다. 특히 정제 없이 원유 제제를 사용할 때, 미량 오염물질은 겔화 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 일관성을 보장하기 위해 VHSE 생성에 사용되는 동일한 콜라겐 스톡으로 실험 그룹을 수행해야 합니다. 또한, 겔화는 이상적으로 7-7.4의 pH에서 발생해야 하며, 미량 오염물질은 pH를 이동할 수 있다. 콜라겐 스톡을 사용하기 전에, 연습 세포 젤은 원하는 농도에서 만들어져야하며 pH는 겔화 전에 측정되어야한다. 진피 성분 파종을 시작하기 전에 이 콜라겐 품질 검사를 완료하면 완전한 실험을 시작하기 전에 적절한 겔화 및 콜라겐 균질성에 대한 문제를 식별합니다. 세포세포 콜라겐을 배양 삽입에 직접 파종하는 대신, 일부 콜라겐을 pH 스케일 전체를 평가하고 7-7.4의 pH를 확인하는 pH 스트립에 시드합니다. 겔화는 콜라겐 젤 용액의 액적액을 커버슬립 또는 조직 배양 플라스틱 웰 플레이트에 적용하여 평가될 수 있다(양문화 인서트가 제한된 측면을 시뮬레이션하는 것이 좋습니다). 겔화 시간 후에, 콜라겐은 단단해야 한다, 즉, 접시가 기울어질 때 흐어서서는 안 된다. 상 대비 현미경 검사에서 콜라겐은 균일하고 명확해 보일 것입니다. 콜라겐 파종에서 가끔 거품은 정상이지만 명확한 젤 내에서 불투명 콜라겐의 큰 비정질 방울은 혼합이 부족하여 문제가 발생할 수 있음을 나타냅니다, 잘못된 pH, 및 /또는 혼합 하는 동안 냉각 콜라겐을 유지 하지 못하는.

세포 시싱 양 및 매체가 조절될 수 있다. 상기 프로토콜에서 캡슐화된 세포 양은 진피 구조 위에 시드된 콜라겐의 mL당 7.5 x 10⁴ 섬유아세포 및 7.5 x 10⁵ 내피세포에서 12웰 삽입에 최적화되었다. 세포 밀도는 다양한 콜라겐 농도⁴⁸ 및 HSE 세대^22,^80,^81에서3D 혈관 네트워크 생성을 조사하는 예비 연구 및 이전 연구를 기반으로 이러한 VHSE^{프로토콜에}최적화되었습니다. 유사한 시스템에서, 발표된 내피 세포 밀도는 1.0 x 10⁶ 세포/mL 콜라겐^48; 섬유아세포 농도는 콜라겐 22, 28, 82 ~ 1 x 10 5 세포/mL의 콜라겐^22,^{22, 28,}¹ x 10 5 세포/mL의 0.4 x 10⁵세포/mL로부터 의 범위^8,^58,^83,^84,^85; 및 각질 세포 농도는 0.5 x 10⁵ [세포/cm 2]⁸⁰ ~ 1 x 10⁵ [세포/cm^2]^{8범위이다.} 세포 밀도는 특정 세포 및 연구 질문에 최적화될 수 있습니다. 섬유아세포와 같은 수축세포를 가진 3차원 배양은 생존력 감소 및 배양^손실(86,^87)으로이어지는 계약을 체결할 수 있다. 예비 실험은 진피 구획의 수축을 테스트하기 위해 완료되어야합니다 (더 많은 진피 세포, 더 수축 성 진피 세포, 더 긴 침수 배양 또는 부드러운 행렬로 발생할 수 있음) 표피 표면 커버리지를 테스트합니다. 또한, 침수일 수 및 세럼 함량을 가감하는 속도또한 과도한 진피 수축이 발생하거나 각질 세포 커버리지의 다른 비율이 필요한 경우 사용자 정의 할 수 있습니다. 예를 들어, 진피 침수 기간 동안 수축이 발견되거나 각질 세포가 표면 단층을 설정하는 동안 혈청 테이퍼링 공정을 통해 더 빠르게 이동하고 VHS를 ALI로 올리는 것은 추가 수축을 방지하는 데 도움이 될 수 있다. 마찬가지로, 각질 세포 적용범위가 이상적이지 않다면, 혈청 없이 VHSE가 침수되는 일수를 변경하면 표피 단층 커버리지를 증가시키고 혈청이 제외되기 때문에 수축을 완화하는 데 도움이 될 수 있다. 위의 세포 밀도 또는 기타 제안의 변화는 특정 배양 및 연구 목표에 최적화되어야 합니다.

공기 액체 인터페이스(ALI) 기간 동안 표피의 적절한 계층화를 확립하기 위해 각 우물의 유체 수준을 정기적으로 확인하고 유지하여 각 구조의 ALI 및 적절한 수분 공급이 배양 길이 전반에 걸쳐 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 일관된 ALI 수준이 설정될 때까지 미디어 수준을 매일 확인하고 추적해야 합니다. 표피 층은 건조하지 않고 수분을 유지해야 하지만 구성에 미디어 풀이 없어야 합니다. ALI 동안, 구조는 정상 불투명 한 흰색 / 노란색 색상을 개발할 것입니다. 표피 층은 고르지 않게 개발할 것입니다. 일반적으로, VHSEs는 콜라겐 파종 또는 진피 수축으로 인해 기울어져 있습니다. 또한 12웰 크기로 VHSE의 둘레 주변의 더 작은 구문(24웰 크기)과 능선 형성으로 구문 중간에 더 높은 표피 부분을 관찰하는 것이 정상이다. ^{구문(13)의} 수축은 이러한 지형 형성을 변화시킬 수 있으며, 전혀 관찰되지 않을 수 있다.

VHS의 염색 및 이미징은 VHS에 기계적 조작을 도입합니다. 각 문화의 조작을 계획하고 제한하는 것이 매우 중요합니다. 조작이 필요한 경우 삽입 막에서 VHS를 제거할 때, 구조 표면에 염색 또는 세척 솔루션을 추가할 때, 이미징 준비 중에 저장/이미징 우물에서 VHSEs를 제거하고 교체할 때 부드러운 움직임을 유지합니다. 구체적으로, 표피 성분의 정맥 층은 깨지기 쉬우며 기저 표피 층을 벗겨낼 위험이 있다. 표피의 표피 층은 고약하고 토착 조직^4에서도담수를 거치지만 표피 구조의 정확한 분석을 위해 손상이나 손실을 최소화하는 것이 중요합니다. 표피 레이어가 구문에서 들어 올리면 별도로 이미지를 지정할 수 있습니다. 표피의 기저층은 여전히 진피에 부착되어 있으며, apical 층의 일부가 분리될 수 있습니다. 표피의 시각화를 위해, 핵 얼룩은 조밀한 핵이 표피의 하부 및 중간 층의 특성이기 때문에 이를 관찰하는 데 도움이됩니다.

VHSE 후 고착의 공초점 화상 진찰은 프로토콜에서 논의되고 있으나, 직립 기반 광학 일관성 단층 촬영(OCT)^88,^89,^90,^91,^{92, 93을}통해 배양 전반에 걸쳐 VHSEs를 이미지화할 수도 있다. VHSE는 눈에 띄는 효과 없이 적어도 2 시간 동안 잠복또는 가습 없이 화상 진찰을 견딜 수 있을 만큼 안정적입니다. OCT는 라벨이 없고 비침습적이기 때문에 성숙 시 표피 두께를 추적할 수 있습니다. 그밖 비침범적인 화상 진찰 양식은 가능성이 또한 고용될 수 있습니다.

결합된 진피 및 표피 구조물의 체적 화상 진찰은 VHSE에서 더 깊은 레이저 감쇠 때문에 도전적일 수 있습니다. 이는 표피측(도 1)과진피 측(도2)으로부터두 방향으로 컨스트럭쳐하여 진피 혈관 구조및 표피의 좋은 해상도를 허용함으로써 완화될 수 있다. 또한 샘플을 지울 수 있으므로 전체 구조의 체적 이미지를 최소화하여 감쇠가 최소화할 수 있습니다. 여러 클리어링 방법을 시도했지만, 메탄올/메틸 살리실레이트 방법은 최상의 결과를 산출했다. 다른 클리어링 방법을 최적화하는 데 관심이 있는 연구자들은 이러한 리뷰^49,^61,^62를대상으로 합니다. 클리어링하는 경우, 방법이 형광및/또는 구조를 손상시킬 수 있으므로, 클리어하기 전에 샘플을 완전히 이미지화하는 것이 좋습니다. 또한, 형광이 며칠 내에 퇴색할 수 있기 때문에, 이미징은 청산 후 가능한 한 빨리 완료되어야 합니다.

단순성과 접근성을 위해 이 프로토콜은 이전 문헌^11,^80에서가장 간단한 미디어 블렌드를 활용했다. 간단한 미디어 블렌드를 사용하는 데는 많은 장점이 있지만 이 선택의 한계도 인식됩니다. 다른 그룹은 표피와 진피 건강에 특정 미디어 구성 요소의 효과를 연구하고 다른 미디어 첨가제^(94,외부 자유 지방산 / 지질 등, 표피의 층 각막을 강화하고 피부 장벽 기능을 향상 발견. 우리의 면역 형광 마커는 표피에서 적절한 분화 및 계층화를 보여주지만, 수행되는 연구에 따라 추가 적인 미디어 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 여기에 제시된 VHS를 평가할 때 표피 BM에 대한 광범위한 분석은 수행되지 않았다. BM의 무결성은 피부 등가물의 중요한 표시입니다; 다양한 그룹은 BM^{표시(95)에} 대한 배양 지속 시간 및 그 영향에 대한 연구뿐만 아니라 섬유아세포 존재의 분석및 BM^{발현(14)에}대한 성장 인자 효과를 추가했다. 이 프로토콜을 사용할 때 BM 구성 요소의 분석을 평가하고 최적화해야 합니다.

이 프로토콜에서 VHSE 생성에 대한 절차를 설명하며, ALI에서 8주 후에 결과를 입증합니다. VHSE 배양은 눈에 띄는 변화 또는 생존력의 손실없이 ALI에서 최대 12 주 까지 배양되었으며, 더 이상 실행 가능 할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 IMR90 폐 섬유아세포로 진피 섬유아세포의 교체에 의해 입증된 바와 같이, 일반적으로 이용 가능한 세포 모형에 쉽게 적응할 수 있습니다. 연구원의 필요와 사용 가능한 자원에 따라, 더 유사한 세포 모형이 미디어 최적화를 요구할 수 있더라도, 문화에 세포 모형 및 매체 혼합을 조정할 수 있습니다. 요약하자면, 이러한 절차는 피부 생물학 과 질병의 연구를 위한 VHSEs의 문화에 대한 명확성을 제공하기 위한 것입니다. 접근성을 극대화하기 위해 이 프로토콜은 연구 연구의 특정 요구에 맞게 더욱 사용자 정의할 수 있는 최소한의 효과적인 접근 법으로 공통 장비, 세포주 및 시약을 사용하여 간단하고 견고한 개발되었습니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 짐 라인발트 박사^(59)와 박사 엘렌 H. 반 덴 보가르드²⁰ N / TERT 세포주의 관대 한 선물에 감사드립니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (19IPLOI34760636)에 의해 지원되었다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N NaOH	Fisher Chemical	S318-100	(Dilute from Lab stock)
4% Paraformaldehyde	ACROS Organics	#41678-5000, Lot # B0143461	Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9
Autoclaved forceps	Fine Science Tools	#11295-00	Dumont #5 forceps
CaCl2	Fisher bioreagents	Cat # BP510-250, Lot # 190231	Rnase, Dnase, Protease-Free
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1)	ATCC	CRL-3243	SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult	ATCC	PCS-201-012	Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90)	ATCC	CCL-186	Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1			Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.
Centrifuge	Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R		(standard lab equipment)
Computational Software	MATLAB	MATLAB 2020a	MathWorks, Natick, MA.
Confocal Microscope	Leica TCS SPEII confocal		Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.
Cover Glass (22 x 22)	Fisher Scientific	12-545F	0.13-0.17 mm No.1 Thickness
Cyanoacrylate super glue or silicone grease	Glue Masters	#THI0102	Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred
DMEM media base	Corning; Mediatech, Inc	REF # 10-013-CM; Lot # 26119007	DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
DMEM/F-12 50/50	Corning; Mediatech, Inc	REF # 10-090-CV; Lot # 21119006	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethanol	Decon Labs	#V1101	(standard lab reagent)
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	Cat # FB12999102, Lot # AE29451050	Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered
Fine tip forceps	Fine Science Tools	#11295-00	Dumont #5 forceps
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218	Made up in 0.1% BSA in PBS
Hydrocortisone	Alpha Easar	Lot # 5002F2A	made up in DMSO
Insulin (human)	Peprotech	Lot # 9352621
Inverted Light/Phase Contrast Microscope	VWR	76317-470	(standard lab equipment)
Isoproterenol	Alfa Aesar	#AAJ6178806	DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%
Keratinocyte-SFM (1x) media base	Gibco; Life Technologies Corporation	REF #: 10724-011; Lot # 2085518	Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium
L-Ascorbic Acid	Fisher Chemical	Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7	Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt
L-glutamine (solid)	Fisher Bioreagents	CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9	L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder
MCDB 131 media base	Gen Depot	CM034-050, Lot # 03062021	MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered
Metal punches	Sona Enterprises (SE)	791LP, 12PC	Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2".
Methanol	Fisher Chemical	CAS # 67-56-1	(optional). For clearing dehydration step.
Methyl Salicylate	Fisher Chemical	O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8	(optional). For clearing.
Microtubes, 1.7 mL	Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics	Cat # 24-282; Lot # 19467	1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free
PBS, 10x Culture grade or autoclaved	APEX Bioresearch Products	Cat # 20-134, Lot # 202237	PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium	Genesee Scientific Corporation	Ref # 25-508; Lot # 07171015
PBS, 1x non-Culture grade	APEX Bioresearch Products	Cat # 20-134, Lot # 202237	PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water.
Penicillin/Streptomycin	Gibco; Life Technologies Corporation	Ref # 15140-122, Lot # 2199839	Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)
Petri Dish, glass, small	Corning	PYREX 316060	(optional). To be used as a clearing container
Petri Dishes, 100 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Use for making up PDMS.
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	GMID 02065622, Batch # H04719H035	Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)
	Dow Corning	GMID 02065622, Batch # H047JC4003	DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL)	Gilson	1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L	M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL)	Gilson	1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S	Sterilized capillaries and pistons
Round tipped scoopula			(optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging
Supplements for Keratinocyte-SFM media	Gibco; Life Technologies Corporation	Ref # 37000-015, Lot # 2154180	Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size	Corning; Costar	REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057	Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates,
Tissue Culture Plates, 12 well size	Greiner Bio-one; CellStar	Cat # 665 180; Lot # E18103QT	12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area	Genesee Scientific Corporation	Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B	Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene
Triton x 100	Ricca Chemical Company	Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34	Wetting agent
Trypsin 0.25%	Corning; Mediatech, Inc	Ref # 25-053-CI	0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate
Type 1 Collagen isolated from Rat tail	Pel-Freez Biologicals	56054-1	Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)
Vaccum chamber, benchtop	Bel-Art	F42010-0000	(standard lab equipment)
Handheld Precision knife	X-Acto	X3311	(X-Acto knife optional if purchased steel punches)

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Bioengineering

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

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Materials

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