Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering av selvmonterte vaskulære menneskelige hudekvivalenter

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62125
Automatic Translation
1, 1
1Departments of Bioengineering, University of California

Summary

Målet med denne protokollen er å beskrive generering og volumetrisk analyse av vaskulære menneskelige hudekvivalenter ved hjelp av tilgjengelige og enkle teknikker for langsiktig kultur. I den grad det er mulig, beskrives begrunnelsen for tiltak for å gi forskere muligheten til å tilpasse seg basert på deres forskningsbehov.

Abstract

Humane hudekvivalenter (HSE) er vevskonstruerte konstruksjoner som modellerer epidermale og dermale komponenter i menneskelig hud. Disse modellene har blitt brukt til å studere hudutvikling, sårheling og podningsteknikker. Mange HMS-er mangler fortsatt vaskulatur og analyseres i tillegg gjennom postkultur histologisk seksjonering som begrenser volumetrisk vurdering av strukturen. Presentert her er en enkel protokoll som bruker tilgjengelige materialer for å generere vaskulære menneskelige hudekvivalenter (VHSE); videre beskrevet er volumetriske avbildnings- og kvantifiseringsteknikker for disse konstruksjonene. Kort sagt er VHSE konstruert i 12 brønnkulturinnlegg der dermale og epidermale celler blir sådd i rottehale kollagen type I gel. Dermalrommet består av fibroblast og endotelceller spredt gjennom kollagengel. Epidermalrommet består av keratinocytter (hudepiteleceller) som skiller seg ut ved luftvæskegrensesnittet. Det er viktig at disse metodene kan tilpasses basert på forskerens behov, med resultater som viser VHSE-generering med to forskjellige fibroblastcelletyper: humane dermale fibroblaster (hDF) og humane lungefibroblaster (IMR90s). VHSE ble utviklet, avbildet gjennom konfektmikroskopi, og ble analysert ved hjelp av beregningsprogramvare ved 4- og 8-ukers tidspunkter. En optimalisert prosess for å fikse, flekke, bilde og klare VHSEer for volumetrisk undersøkelse er beskrevet. Denne omfattende modellen, avbildningen og analyseteknikkene kan enkelt tilpasses de spesifikke forskningsbehovene til individuelle laboratorier med eller uten tidligere HMS-erfaring.

Introduction

Menneskelig hud utfører mange viktige biologiske funksjoner, inkludert å fungere som en immun / mekanisk barriere, regulere kroppstemperatur, delta i vannretensjon og sensoriske roller1,2,3,4. Anatomisk er huden det største organet i menneskekroppen og består av tre hovedlag (epidermis, dermis og hypodermis) og har et komplekst system av stromale, vaskulære, kjertel- og immun/nervesystemkomponenter i tillegg til epidermale celler. Epidermis i seg selv består av fire lag med celler som kontinuerlig fornyes for å opprettholde barrierefunksjon og andre strukturer av innfødt hud (dvs. svette og talgkjertler,negler) 3. Hudfysiologi er viktig i immunfunksjon, sårheling, kreftbiologi og andre felt, noe som fører til at forskere bruker et bredt spekter av modeller, fra in vitro monokulturer til in vivo dyremodeller. Dyremodeller tilbyr evnen til å studere den fulle kompleksiteten i hudfysiologi, men ofte brukte dyremodeller som mus har betydelige fysiologiske forskjeller sammenlignet med mennesker5. Disse begrensningene, og den økte kostnaden for dyremodeller, har fått mange forskere til å fokusere på å utvikle in vitro-modeller som nærmere gjenspeiler fysiologien til menneskelig hud1,6. Av disse er en av de enklere modelltypene den menneskelige epidermale ekvivalenten (HEE; også referert til som halvtykkelses hudmodeller) som bare består av epidermale keratinocytter på encellulær dermal matrise, men fanger epidermal differensiering og stratifisering sett in vivo. Basert på dette blir modeller som inneholder dermale og epidermale komponenter (keratinocytter og fibroblaster) ofte referert til som menneskelige hudekvivalenter (HMS), hudmodeller med full tykkelse eller organotypiske hudkonstruksjoner (OSC). Kort sagt, disse modellene genereres ved å innkapsle dermale celler i gelmatriser og så epidermale celler på toppen. Epidermal differensiering og stratifisering kan deretter oppnås via spesialiserte medier og lufteksponering7. Hudekvivalenter har oftest blitt generert gjennom selvmonteringsteknikker ved hjelp av dermale geler laget av kollagen type I (enten av rottehale eller bovin hudopprinnelse)1,8, men lignende modeller har innlemmet andre matrisekomponenter som fibrin9,10, fibroblast avledet11,12, kadaveriske de-epidermiserte membraner13,14,15,16, kommersielt tilgjengelige geler og andre1,12,13,17,18,19. For tiden er det hudekvivalenter kommersielt tilgjengelig (som tidligere gjennomgått1,2). Disse er imidlertid først og fremst utviklet for terapeutiske formål og kan ikke tilpasses lett til spesifikke forskningsspørsmål.

HSE er brukt i studier av sårheling, podning, toksikologi og hudsykdom/utvikling11,12,13,16,8,20,21,22,23. Selv om 3D-kultur mer omfattende modellerer funksjoner av menneskelig vev sammenlignet med 2D-kulturer24, muliggjør inkludering av forskjellige celletyper som mer nøyaktig gjenspeiler in vivo-populasjonen studier av cellecellekoordinering i komplekse vev24,25,26. De fleste HSEer inkluderer bare dermale fibroblaster og epidermale keratinocytter27, selv om in vivo-hudmiljøet inneholder mange andre celletyper. Nyere studier har begynt å inkludere flere cellepopulasjoner; disse inkluderer endotelceller i vaskulatur10,28,29,30,31,32,33,34, adipocytter i sub-kutan vev35,36, nervekomponenter19,21, stamceller27,37,38, immunceller10,39,40,41,42og andre sykdoms-/kreftspesifikke modeller16,40,43,44,45,46,47. Spesielt viktig blant disse er vaskulatur; mens noen HSEer inkluderer vaskulære celler, totalt sett mangler de fortsatt omfattende kapillære elementer med tilkobling over hele dermis10,29 , utvidet in vitro stabilitet28, og passende kartetthet. Videre vurderes HMS-modeller vanligvis gjennom postkulturelle histologiske seksjonering som begrenser analysen av HSEs tredimensjonale struktur. Tredimensjonal analyse muliggjør volumetrisk vurdering av vaskulær tetthet48,49 samt regional variasjon av epidermal tykkelse og differensiering.

Selv om HMS-er er en av de vanligste organotypiske modellene, er det mange tekniske utfordringer med å generere disse konstruksjonene, inkludert identifisering av passende ekstracellulær matrise og celletetthet, medieoppskrifter, riktige luftvæskegrensesnittprosedyrer og postkulturanalyse. Videre, mens HEE- og HMS-modeller har publisert protokoller, eksisterer ikke en detaljert protokoll som omfatter dermal vaskulatur og volumetrisk avbildning i stedet for histologisk analyse. Dette arbeidet presenterer en tilgjengelig protokoll for kulturen av vaskulære menneskelige hudekvivalenter (VHSE) fra hovedsakelig kommersielle cellelinjer. Denne protokollen er skrevet for å være lett tilpassbar, noe som muliggjør rett frem tilpasning til forskjellige celletyper og forskningsbehov. Av hensyn til tilgjengelighet, tilgjengelighet og kostnader ble bruk av enkle produkter og generasjonsteknikker prioritert fremfor bruk av kommersielt tilgjengelige produkter. Videre beskrives enkle volumetriske avbildnings- og kvantifiseringsmetoder som gjør det mulig å vurdere VHSEs tredimensjonale struktur. Ved å oversette denne prosedyren til en robust og tilgjengelig protokoll kan ikke-spesialiserte forskere anvende disse viktige modellene i persontilpasset medisin, vaskulær vevsteknikk, graftutvikling og legemiddelevaluering.

Protocol

1. Forberedelse for 3D-kultur

  1. Forbered rottehale kollagen lager på 8 mg / ml, ved hjelp av etablerte protokoller50,51,52. Alternativt kan rottehale kollagen kjøpes fra leverandører (se materialliste) ved passende konsentrasjoner.
    MERK: Kollagen kan tilberedes eller kjøpes ved forskjellige konsentrasjoner i området 3-10 mg/ml, eller høyere50,51,52. Beregningene i protokollen forutsetter en konsentrasjon på 8 mg/ml, men kan justeres ut fra forskerens behov.
  2. Utvid cellelinjer: Endotel- og fibroblastceller må være klare for såing ved starten av 3D-kollagen dermal komponentgenerering (trinn 2). Keratinocytter må være klare på dag 7 av 3D-kultur. En komplett VHSE-konstruksjon krever 7,5 x 105 endotelceller. 7,5 x 104 fibroblaster; og 1,7 x 105 keratinocytter for generering (Tabell 1).
    MERK: Disse tetthetene passer for 12-brønns permeable vevskulturinnlegg eller tilsvarende. Celletetthet og format kan skaleres opp eller ned basert på forskerens behov. For å klargjøre, vil denne mengden endotel- og fibroblalastceller frø 1-3 dermale komponenter, mens hver epidermal komponent krever 1,7 x 105 keratinocytter.
  3. Utfør all cellesentrifugering i denne protokollen i 5 min ved 300 x g, men dette kan reduseres for mer skjøre celletyper.

2. Generering av 3D kollagen dermal komponent

MERK: Trinn 2 er en tidssensitiv prosedyre og må fullføres i én innstilling. Det anbefales å fullføre en kvalitetssjekk av kollagenbestanden for å sikre riktig gelering og homogenitet før du begynner dermal komponentsåing, se feilsøking i diskusjon.

  1. Acellulær kollagen lag forberedelse og sådd
    1. Forbered to 1,7 ml kappede mikrocentrifugerør, ett for acellulær støtte og ett for cellulær dermis. Mengder gitt i dette trinnet vil forberede 1 ml 3 mg/ml kollagen (mål kollagenkonsentrasjon), tilstrekkelig for (3) 12-brønns VHSEer. Formler vises hvis justering er nødvendig. Både volum og tetthet kan skaleres basert på forskerens behov (vanlige referansenumre er gitt i tabell 2).
    2. Til hvert rør legger du til 100 μL kulturkvalitet 10x fosfatbufret saltvann (PBS) (ett rør vil gi 3 VHSEer) og tilsett 8,6 μL 1 N NaOH. Plasser kappede rør på våt is for å kjøle deg ned i minst 10 minutter.
      C s = Kollagenlagerkonsentrasjon
      Vf = Endelig volum av kollagen nødvendig
      Ct = Konsentrasjon av mål kollagen
      Vs = Volum av lager kollagen nødvendig for ønsket mengde (Vf)
      Vpbs = Volum på 10X PBS som trengs for mål kollagenkonsentrasjon (Ct)
      VNaOH = Volum av 1N NaOH nødvendig for Ct
      V-medier = Volumet av medier, oppringingssuspensjon eller ddH2O som kreves for Ct
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
    3. Forbered 1000 og 250 μL positive forskyvningspipetter for bruk og sett til side. Siden senere trinn er tidssensitive, er det praktisk å laste pipettespisser og stille inn volumer (henholdsvis 375 μL og 125 μL). I tillegg setter du opp en vanlig 1000 μL pipette for 516 μL.
      MERK: Positive forskyvningspipetter kan erstattes med normale pipetter om nødvendig, men på grunn av den høye viskositeten til kollagen og tids-/temperaturfølsomheten til denne prosedyren, anbefales positive forskyvningspipetter for å bidra til å produsere konsistente såingsresultater. Hvis du bruker vanlige pipetter, bruk langsomme bevegelser.
    4. Forbered kulturinnsats brønnplater: Bruk sterile tang til å plassere tre 12-brønns kulturinnlegg i en steril 12-brønns vevskulturplate, plasser i midtsøylene.
    5. Sett ut kalde medier som passer for fibroblast- og endotelcelletyper.
    6. Etter avkjøling av kappede rør, plasser ett rør (for acellulær støtte) på et stativ med innholdet synlig. La det andre røret (for cellulær dermis) stå på is.
    7. Fjern kollagenbestanden på 8 mg/ml fra kjøling og legg den på våt is.
      MERK: Ikke bruk fryseis eller -20 °C benkeplatekjølere, da dette vil fryse kollagenet.
    8. Til det kaldkledde røret legger du til 516 μL medier og tilsett umiddelbart 375 μL kaldt kollagen ved hjelp av 1000 μL positiv forskyvningspipette. Dispenser kollagen i oppløsningen (ikke til siden av røret). Fjern straks den tomme pipettespissen og bytt til den forberedte 250 μL positive forskyvningspipetten for å blande.
      1. Bland raskt, men forsiktig for å forhindre bobledannelse, ikke fjern spissen fra løsningen, om mulig. Bland til løsningen er av homogen farge, som vanligvis tar ca 5 pipettesykluser eller 10 s (hvis du bruker medier med fenolrød, blir fargen lettere og jevn). Ved blanding må du trekke fra forskjellige posisjoner på røret (bunn og topp) for jevn blanding.
        MERK: Dette kan utføres med 516 μL cellekultur klasse vann eller annen cellekultur klasse væske, men fenol rød av de fleste medier er en god indikator på blandingen. Bruk enten fibroblast- eller endotelmedier som ble brukt til 2D-utvidelser.
    9. Disperger umiddelbart 125 μL acellulær kollagen på membranen til hver av de tre 12-brønns kulturinnleggene. For å sikre jevn dekning av den acellulære kollagengelen, rock parabolen; Hvis det ikke skaper jevn membrandekning, bruk pipettespissen til i hovedsak å male membranen ved å forsiktig spre kollagen rundt; unngå å legge trykk på membranen. Gelering begynner nesten umiddelbart; utfør dette trinnet raskt for å sikre jevn dekning.
      MERK: Det vil være overflødig acellulær kollagen. Volumet kan reduseres, men å forberede mindre enn 1 ml kollagen suspensjon kan føre til vanskeligheter med å blande løsningen og utilstrekkelig gelering.
    10. Flytt umiddelbart 12-brønnsplaten til en 37 °C cellekulturinkubator for å la den gele i minst 20 minutter (acellulær kollagen kan gele lenger om nødvendig; i løpet av denne gelasjonstiden, fortsett til trinn 2.2). Fjern kollagenfjæringen fra isen og legg den tilbake i kjøling (kollagenet er mest stabilt ved 4 °C).
  2. Celle suspensjon &seeding forberedelse
    MERK: For kulturtidslinjen i denne protokollen tilsvarer dette Nedsenkningsdag 1 (SD1)
    1. Under gelering av acellulær kollagenstøtte, prøv og tell endotel- og fibroblastcellelinjene.
    2. Suspender 7,5 x 105 endotelceller og 7,5 x 104 fibroblaster i 258 μL av sine respektive medier og kombiner cellefjæringer for å lage en 516 μL aliquot. Vedlikehold cellesuspensjonene på våt is til bruk.
    3. Forbered 1000 og 250 μL positive forskyvningspipetter for bruk og sett til side. Siden senere trinn er tidssensitive, er det praktisk å laste pipettespisser og stille inn volumer (henholdsvis 375 μL og 250 μL). I tillegg setter du opp en vanlig 1000 μL pipette for 516 μL.
  3. Celleladet kollagensåing av dermalt rom
    1. Etter gelasjonsperioden, fjern den 12 brønnplaten av acellulær kollagen fra inkubatoren.
      MERK: Hvis dette kollagenet ikke gelled etter 30 min, må du ikke fortsette prosedyren, da det sannsynligvis var en feil under sådd eller kollagenbestanden kan ha et problem (se feilsøking i diskusjon).
    2. Fjern det 1,7 ml kappede røret fra våt is (inneholder 10x PBS og NaOH). Plasser røret i et stativ slik at innholdet er synlig. Løsne/åpne store bokstaver (celleoppheng, kaldkappede rør).
    3. Fjern lagerkollasjen (8 mg/ml) fra 4 °C kjøling og legg det på våt is. La hetten stå åpen.
    4. Tilsett 516 μL avkjølt celleoppheng til det kaldkledde røret. Bruk den 1000 μL positive forskyvningspipetten til umiddelbart å pipette 375 μL kaldt kollagenoppløsning direkte inn i løsningen av det kappede røret.
    5. Utvis alt kollagen fra pipetten inn i røret og kast pipettespissen for positiv forskyvning. Bytt umiddelbart til den 250 μL positive forskyvningspipetten og bland kollagenoppløsningen.
    6. Bland kollagenoppløsningen som fullført tidligere (raskt, men forsiktig for å forhindre bobledannelse), ikke fjern spissen fra gel hvis mulig. Bland til løsningen er homogen (ca. 5 pipettesykluser eller 10 s). Ved blanding må du passe på å trekke fra forskjellige posisjoner på røret (bunn og topp) for jevn blanding.
    7. Når den er blandet, må du umiddelbart overføre 250 μL cellulær kollagenoppløsning til de acellulære kollagenstøttene i hver av de tre 12-brønns kulturinnleggene. For å sikre jevn dekning av den acellulære kollagenstøtten, gyng parabolen og/eller bruk den positive forskyvningspipetten til å flytte det nyseedede cellulære kollagenet forsiktig rundt uten å forstyrre det acellulære laget.
    8. Flytt umiddelbart 12-brønnsplaten til 37 °C cellekulturinkubator for å la den gele i minst 30 minutter. Plasser kollagenet tilbake i 4 °C kjøling etter bruk.
    9. Etter 30-minutters geltid, vipp platen forsiktig for å vurdere gelasjonen. Sørg for at kollagenet er størknet.
    10. Tilsett 500 μL og 1000 μL blandingsmedier (halvt endotel- og halvt fibroblastvedlikeholdsmedier) til henholdsvis det øvre kammeret og det nedre kammeret på innsatsen (topp først, deretter bunn for å forhindre at hydrostatisk trykk skyver kollagen opp). Tilsett medier langsomt på siden av brønnen, ikke direkte på kollagengelen, for å minimere forstyrrelsen av kollagenet.
      1. Forsikre deg om at kollagengelen er nedsenket, legg til flere medier om nødvendig. Plasser brønnplaten i celleinkubatoren for inkubering over natten. På dette stadiet inneholder media 10% FBS; det vanlige vedlikeholdsmediet for hver cellelinje (tidslinje og skjematisk angitt i figur 1, A).
        MERK: Medier i hele VHSE-kulturen kan tilpasses egendefinerte celletyper; noen optimalisering kan være nødvendig.
  4. Medieendring for nedsenkningsdag 2 (SD2)
    1. Endre 10% FBS-medier i VHSE-brønner til 5% FBS halvfibroblast, halvt endotelmedier supplert med 100 μg / ml L-askorbinsyre. Legg 500 μL til det øvre kammeret i kulturinnsatsen på siden av brønnen (igjen, legg forsiktig til sideveggen for å minimere forstyrrelsen av kollagenet) og legg 1000 μL til nedre kammer.
    2. Forny medier annenhver dag (SD4 og SD6) til nedsenkningsdag 7 (SD7).
    3. Bruk en manuell pipette for å fjerne medier fra brønnene. Bruk av en aspirator er mulig, men kan føre til skade eller ødeleggelse av konstruksjonen.
      MERK: L-askorbinsyre må bestå frisk hver 2-3 dager (den oksiderer i oppløsning for å produsere hydrogenperoksid dermed, indusere oksidativt stress og til slutt cellulær skade53). Dermed må media endres hver 2-3 dager fra SD2 til slutten av VHSE-kulturen siden L-askorbinsyre er til stede. Det er enklest å lage et lager av medier og legge til en ny forberedt mengde L-askorbinsyre til et medie aliquot hver fôringsdag. Bruk vann eller medier av kulturkvalitet som løsningsmiddel og tilbered fersk L-askorbinsyre ved 100 mg/ml. L-askorbinsyre stimulerer kollagensyntese ved fibroblaster til en passende hastighet og fremmer kollagenstabilitet54,55,56; Det reduserer også endotelets permeabilitet og opprettholder fartøyets veggintegritet56,57 og bidrar i tillegg til epidermal barrieredannelse6,58.

3. Såing av epidermal komponent og stratifiseringsinduksjon

  1. Nedsenkningsdag 7 (SD7): frø keratinocytter
    MERK: Frø keratinocytter for å etablere epidermis på SD7. Dette tidspunktet kan skiftes ut fra forskerens behov. Varigheten av nedsenkningskultur uten keratinocytter bør ikke overstige 9 dager, da en lengre nedsenking ofte fører til økt dermal sammentrekning. Hvis sammentrekning oppstår før SD7, anbefales det å forkorte nedsenkingsperioden til 5 dager og frø epidermis på SD5. Optimaliser nedsenkingsperioden etter behov for bestemte eksperimenter (se feilsøking i diskusjon).
    1. Kultur keratinocytter (N/TERT-120,59 eller andre passende celler) til deres samløpsgrense før trypsinisering og såing på VHSEer. For N/TERT-1-celler bør samløpet ikke overstige 30 % betydelig for å forhindre uønsket differensiering av keratinocytter i 2D-kultur59. For andre passende cellelinjer, for eksempel primære humane epidermale keratinocytter, brukes vanligvis en sammenløpsgrense på 75-80%60.
    2. Etter trypsinisering teller og suspenderer du 510 000 celler i 600 μL human skin equivalent (HMS) differensieringsmedier supplert med 5 % FBS (tabell 1).
      MERK: 510 000 celler i 600 μL tillater 170 000 celler/konstruksjon ved såing av 200 μL per konstruksjon (3 VHSEer).
    3. Bruk en manuell pipette, samle og kast medier som for tiden er i bunn- og toppkammeret for hver konstruksjonsbrønn. Sørg for å samle så mye media som mulig. Samle medier som kan sitte fast rett under den gjennomtrengelige membranen ved å plassere pipettespissen forsiktig under kulturinnsatsmembranen og slå innsatsen midlertidig ut av sted. Medier kan ha blitt sittende fast på grunn av overflatespenning. Pass på at innsatsene sitter flatt i brønnene før du fortsetter. Bruk av en aspirator er mulig, men kan føre til skade eller ødeleggelse av konstruksjonen.
    4. Tilsett 1 ml HMS-medier supplert med 5% FBS til det nedre kammeret i hver brønn. Tilsett deretter 200 μL celleoppheng til det øverste kammeret i hver brønn. Frø direkte på den dermale konstruksjonsoverflaten. La keratinocytter bosette seg i 2 timer i inkubatoren.
    5. To timer etter sådd av keratinocyttene, tilsett forsiktig 300 μL HMS-medier supplert med 5% FBS til det øverste kammeret i hver konstruksjon godt; pipettemedier langsomt på siden av kulturinnsatsen. Last media inn i toppkammeret veldig nøye for ikke å forstyrre avgjorte keratinocytter som kanskje ikke har festet seg tett til den underliggende kollagengelen ennå.
    6. Etter at du har lastet inn mediet, plasser konstruert tilbake i inkubatoren.
  2. Nedsenkningsdag 8/9 (SD8 eller SD9)
    1. Utgjør HMS-medier supplert med 1% FBS og 100 μg/ml L-askorbinsyre.
    2. Fjern medier fra både øvre og nedre kamre med en manuell pipettor.
    3. Tilsett 500 μL medier i det øverste kammeret først og deretter 1 ml i bunnkammeret. (Dette trinnet kan gjøres på SD8 eller SD9)
  3. Nedsenkningsdag 9/10 (SD9 eller SD10, dette bør være dagen etter trinn 3.2)
    1. Utgjør serumfrie HMS-differensieringsmedier med 100 μg/ml L-askorbinsyre.
    2. Fjern medier fra både øvre og nedre kamre med en manuell pipettor.
    3. Legg 500 μL inn i det øvre kammeret og 1 ml i det nedre kammeret.
  4. Luft-væske grensesnitt dag 1 (ALI1)
    MERK: ALI utføres dagen etter trinn 3.3.
    1. Løft hver konstruksjon til luft-væske grensesnitt (ALI) ved å fjerne medieavfall fra det øvre kammeret. Bruk en manuell pipette for å komme så nær det epidermale laget som mulig uten å berøre eller skade det.
    2. Vipp platen litt i forskjellige vinkler for å samle mediet. Fjern så mye medier som mulig i dette trinnet. Tilsett ca. 2 ml sterilt vann til de omkringliggende brønnene i platen for å opprettholde konsistent fuktighet; holde brønnene fylt med vann gjennom hele kulturen.
    3. Kontroller platen noen timer senere for å forsikre deg om at keratinocyttene fortsatt er i luftvæskegrensesnittet. Hvis det er medier i det øvre kammeret, fjern det. Hold oversikt over hvor mye medier som fjernes for hver VHSE-brønn(Det første volumet av øvre og nedre kamre (1500 μL) - medier fjernet = et godt utgangspunkt for ALI-fôring).
      MERK: VHSEer krever ikke nødvendigvis samme medienivå for luftløft; vanligvis hvis VHSEene er sådd sammen, trenger de omtrent samme medienivå for luftløft, men dette er ikke alltid tilfelle. Juster volumene etter behov for å opprettholde ALI, men sørg for at medienivåene ikke er så lave at VHSEene tørker ut. Det er tryggere å være forsiktig og fjerne små mediemengder daglig til en balanse mellom luftløft og hydrering er oppfylt.
  5. ALI dag 2 (ALI2)
    1. Fra dette tidspunktet må du bare bruke serumfrie HMS-medier supplert med 100 μg/ml L-askorbinsyre. Endre medier på ALI Day 2 (ALI2). Hvis det er medier i det øverste kammeret, fjerner du det og legger det til i mengden av fjernede medier som er spilt inn tidligere. Beregn medievolumet som trengs ved hjelp av ligningen i forrige trinn. For eksempel: Hvis 200 μL medier ble fjernet fra det øvre kammeret, legg deretter til 1300 μL for å etablere ALI (som 1500 μL - 200 μL = 1300 μL)
    2. Bruk volumet som er beregnet til å laste inn i bunnkammeret til hver brønn, og plasser deretter platen tilbake i celleinkubatoren. Hold oversikt over volumet som brukes per dag. Når du bruker de anbefalte kollagenmengdene i 12-brønns kulturinnlegg, faller det vanlige spekteret av ALI-verdier mellom 750 μL og 1300 μL. Vanligvis reduseres volumet over kulturmodning og blir konsistent rundt uke 2/3 av ALI. Avhengig av kulturspesifikasjonene kan dette tallet endres og må optimaliseres (som beskrevet i 3.4.2 - 4.1).

4. Rutinemessig vedlikehold av vaskulær menneskelig hudekvivalent

  1. Fra ALI Day 3 (ALI3) gjennom kulturendepunktet: Forny medier av det nedre kammeret hver 2-3 dager ved hjelp av serumfrie HMS-medier med 100 μg/ml L-askorbinsyre. Fortsett å justere og spore medienivået som trengs i bunnkammeret for ALI som beskrevet i trinn 3.5.2.
  2. Siden den epidermale overflaten må være i kontakt med luften, kontroller og juster medienivået daglig til konsistente ALI-nivåer er etablert. Det epidermale laget skal se hydrert ut, ikke tørt, men det bør ikke være medier samlet på toppen av konstruksjonen. Kulturer med 8 ukers ALI har gitt den mest konsistente morfologien og uttrykket; Avhengig av søknaden kan imidlertid kulturer på 4 til 12 uker være hensiktsmessige. Kulturvarighet for ulike celle- og kulturforhold må kanskje optimaliseres.
    MERK: Å endre media mandag, onsdag, fredag er en god praksis. VHSE-ene er friske i løpet av helgen, men mediene bør endres tidlig mandag og sent på fredag. Etter å ha fullført trinn 1-4, er genereringen av en VHSE fullført. Trinn 5-end av protokollen er valgfrie prosesserings- og bildeteknikker som er optimalisert for denne typen 3D-konstruksjon.

5. Fiksering og permeabilisering av 3D-konstruksjoner

MERK: Trinn 5 er optimalisert for avbildningsteknikker som er spesifikke for denne 3D-konstruksjonen som er skissert i resten av protokollen. Følgende trinn er ikke nødvendige for å generere en VHSE.

  1. Fiksering/permeabilisering
    1. Fjern forsiktig alle medier fra øvre og nedre kamre i hver brønn på slutten av kulturperioden.
      MERK: Det epidermale laget er muligens skjøre, håndterer med forsiktighet og agiterer ikke epidermis med aggressiv pipettering.
    2. Tilsett 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 6.9) til den øvre kammerveggen (ikke direkte på konstruksjonen) og deretter til det nedre kammeret, for å forhåndsfiksere hver konstruksjon. Tilsett 1 ml per kammer og utsett i 5 min ved romtemperatur.
      FORSIKTIG: PFA er farlig og bør håndteres med forsiktighet og passende personlig verneutstyr (PVU), inkludert øyebeskyttelse.
    3. Fjern 4% PFA-oppløsning etter 5 min og tilsett 0,5% Triton X 100 i 4% PFA-løsning til øvre og nedre kamre som beskrevet i forrige trinn. Eksponere i 1 time ved romtemperatur; VHSE-konstruksjon krever ikke et sterilt miljø fra nå av.
    4. Etter 1 time, fjern forsiktig permeabiliserings-/fikseringsløsningen fra begge kamrene og vask prøven 3 ganger med 1x PBS.
    5. Oppbevar prøver i PBS i 4 °C kjøling eller umiddelbart flekk. For å lagre prøvene, pakk parabolen i en plastfolie og deretter folie for å minimere fordampning og lyseksponering
      MERK: Pausepunkt - Etter fiksering og permeabilisering kan denne prosedyren settes på pause siden prøvene er stabile i flere uker hvis de er utarbeidet som beskrevet i trinn 5.1.5. Alternativt kan farging (som beskrevet i trinn 6) fullføres umiddelbart etter trinn 5.

6. Immunfluorescent farging av 3D-konstruksjoner

  1. Klargjøring av konstruksjon
    MERK: VHSEs flekker godt når de skilles fra porøs membran i kulturinnsatsen; separasjon fra membranen er også nødvendig for ikke-blokkert avbildning og muliggjør reduserte volumer for farging.
    1. For å klargjøre konstruksjonen for immunfluorescerende farging, snu en innsats opp ned og legg den over brønnen på brønnplaten (hvis VHSE faller, vil den falle inn i brønnen med PBS) (Supplerende figur 1A).
    2. Stabiliser innsatsen med en hånd over brønnen mens du bruker fine spisse tang og/eller en presisjonskniv for å kutte omtrent halvparten av omkretsen av innsatsmembranen. Klipp så nær plasthuset som mulig med en forsiktig hånd for å forhindre skade på VHSE-konstruksjonen.
    3. Bruk de fine spisspinnene til å gripe kanten på den kuttede membranklaffen og skrell forsiktig den porøse membranen av innsatsen så vel som VHSE-konstruksjonen. Gjør dette veldig nøye og sakte for å forhindre skade på VHSE-konstruksjonsstrukturen. Hvis VHSE-konstruksjonen skiller seg lett, bør den falle inn i brønnen nedenfor, hvis den sitter fast på siden av kammeret, bruk deretter de fine spisspinnene eller en liten scoopula for å flytte den til brønnen. Vær veldig oppmerksom på det epidermale laget, da det vanligvis er skjøre (Supplerende figur 1A).
      MERK: Noen ganger kommer membranen ikke lett av eller kommer av i stykker, hvis dette skjer, bruk verktøyene til å trekke membranen og VHSE-konstruksjonen forsiktig fra hverandre. Forsikre deg om at VHSEene ikke tørker ut under denne prosessen ved å dyppe i PBS om nødvendig.
    4. Når VHSE er i brønnen, kast eventuelle gjenværende deler av innsatsmembranen og hold kulturinnsatshuset i hver brønn for å holde VHSEene i en nedsenket posisjon under farging.
  2. Flekker
    MERK: Farging og tilhørende håndtering/manipulering og vask bør utføres så skånsomt som mulig siden VHSEer kan være skjøre. Hvis deler av epidermis løfter av, kan brikkene farges separat; øvre lag av epidermis er skjøre og går gjennom naturlig desquamation4, men for analyse er det viktig å opprettholde integritet så mye som mulig.
    1. Forbered de valgte primære antistoffflekker i 700 μL blokkeringsbuffer per konstruksjon godt (vanligvis kan alle primære antistoffer være i samme fargingsløsning, men dette bør bekreftes for nye antistoffer). 700 μL fungerer for 12-brønns størrelse, men kan justeres for andre kulturformater. Anbefalte konsentrasjoner av primære og sekundære antistoffer med blokkeringsbufferoppskrift er gitt i tabell 3 (optimalisering kan være nødvendig).
    2. Fjern eventuelle PBS fra brønnen ved hjelp av en manuell pipette, pass på å pipette bort fra VHSEer (ettersom VHSEer flyter, anbefales ikke vakuumaspirasjon).
    3. Tilsett den primære flekkløsningen i hver brønn og plasser kulturinnsatshuset i brønnen for å holde VHSE nedsenket i væske (Supplerende figur 1B). Pakk brønnplaten med plastfolie. Folie og flekk i 48 timer i 4 °C kjøling uten agitasjon eller gynging (gynging kan skade VHSE-konstruksjonen).
    4. Etter 48 timer, lag sekundære antistoffer og kjemiske flekker i 700 μL blokkeringsbuffer (per brønn).
    5. Fjern kulturinnsatshuset og den primære flekkløsningen og vask med 1x PBS, 3x i 5 minutter før du tilsetter den sekundære flekkløsningen. Plasser kulturinnsatshuset tilbake i brønnen for å holde VHSE-konstruksjonen nedsenket (Supplerende figur 1B). Eksponere i 48 timer i 4 °C kjøling uten agitasjon eller gynging.
    6. Etter 48 h eksponering, fjern flekkløsningen med en manuell pipettor og vask forsiktig 3x med PBS; Ikke rør væske rett på VHSEene, da de kan være skjøre. Rehydrer med overflødig PBS og plasser kulturinnsatshuset tilbake i brønnen for å holde VHSE nedsenket og hydrert under lagring (oppbevar ved å pakke inn plastfolie og folie for å minimere fordampning og lyseksponering)
  3. Tømming (valgfritt og terminal)
    MERK: Tømming er valgfritt for avbildning. Hvis den er fullført, bør den gjøres etter farging/avbildning av prøven helt siden rydding forhindrer ytterligere farging, kan endre fluoroforytelsen og kan skade VHSE-strukturen. Det finnes flere vevsklaringsmetoderpå 49,61,62 og kan optimaliseres for bestemte prosjekter. Metyl salisylatrydding, beskrevet nedenfor, er både enkel og effektiv for VHSE. Følgende ryddeteknikk må fullføres i glassbeholdere, og pipettespisser må være glass eller polypropylen (polystyren oppløses i kontakt med metylsilisylat). Fullfør all avregningsprosedyre i et godt ventilert område eller avtrekkshette.
    1. Tilsett 100% metanol i en liten grunn glassbeholder (glass Petri-retter fungerer bra). Bruk den minste mulige beholderen som passer til konstruksjonen (for å minimere reagensavfall).
    2. Fjern konstruksjonen fra brønnplaten ved hjelp av tang/øse (Tilleggsfigur 1C) og plasser den i den metanolfylte beholderen. Tilsett mer metanol hvis konstruksjonen ikke er nedsenket.
    3. Dehydrer VHSE-konstruksjonen i metanol i 3 x 10 min nedsenkinger; metanol etter hver nedsenking og fjern metanol raskt etter det siste badet. I løpet av denne prosedyren kan konstruksjonen bli mer ugjennomsiktig og krympe litt.
      MERK: Disse varighetene og repetisjonene er optimalisert, men metanol og følgende metylsilisylatprosedyrer må kanskje tilpasses, avhengig av det spesifikke kulturformatet og flekkene.
    4. Umiddelbart etter fjerning av metanol, tilsett metyl salisylat og senk VHSE i 5 x 5 min nedsenking. Sett reagenset helt tilbake etter hver nedsenking og la VHSE stå i den femte nedsenkningsløsningen for lagring. I løpet av denne prosedyren blir konstruksjonen gjennomsiktig.
    5. Bilde konstruksjonen eller lagre ved 4 °C. Etter rydding, fullfør all avbildning så snart som mulig, da fluoroforene kan forringes i metylsilisylat i løpet av dager. Rydding fører til at konstruksjonene blir sprø og den utvidede lagringen, selv om det ikke anbefales, trenger en regelmessig kontroll for å sikre at det er tilstrekkelig mengde metylsilisylat.

7. Confocal Imaging av 3D-konstruksjoner

MERK: Avbildning gjennom vevskultur plast vil ikke gi samme bildekvalitet som avbildning gjennom deksler glass, denne metoden beskriver fabrikasjon av en tilpasset glassbunnbrønn for å forhindre tørking under konfokal avbildning. Dette er vanligvis tilstrekkelig for minst 3 timers avbildning.

  1. To dager før avbildning: klargjør polydimetylsiloksan (PDMS)
    1. Forbered PDMS48,63,64 ved en foreslått konsentrasjon på [9:1], base: crosslinker. Forbered 30 g PDMS totalt: 27 g basiskomponent og 3 g krysskobling. Plasser et rent blandebeholder på en veievekt og tjære vekten. Tilsett sokkelen (27 g) og tilsett deretter krysskoblingen (3 g) for å oppnå totalt 30 g. Legg alltid til base før krysskobling.
    2. Rør løsningen kraftig i minst 4 min; Dette vil skape små bobler. Etter tilstrekkelig blanding, hell PDMS i en 100 mm Petri-tallerken, eller lignende flat bunnvarmebestandig beholder.
    3. Avgass PDMS i et vakuumkammer til alle bobler fra blandingen forsvinner og PDMS er klar. Slipp vakuumet langsomt og fjern PDMS (sakte). Legg retten i en ovn for å kurere over natten (50-60 °C); sørg for at retten sitter flatt slik at PDMS kan kurere jevnt.
      MERK: Etter herding skal PDMS være klar og overflaten skal være glatt og ikke klebrig (klebrighet kan indikere utilstrekkelig blanding).
  2. En dag før bildebehandling: PDMS godt forberedelse
    1. Bruk en stålstans eller håndholdt presisjonskniv til å stanse eller kutte ut en sirkulær brønn fra PDMS-arket som er klargjort i 7.1. Brønnen skal være omtrent like stor som VHSE-konstruksjonen. Klipp en firkantet patch rundt den sirkulære brønnen for å lage en enkelt PDMS-brønn. Det tilberedte 30 g PDMS-beløpet skal gi minst fire tilpassede brønner.
      MERK: PDMS-brønnen må være nær størrelsen på VHSE-konstruksjonen. Det må begrense prøvebevegelsen under avbildning. Flere brønner kan fremstilles samtidig og lagres på ubestemt tid i en ren beholder.
    2. Bruk et glassdeksler av samme størrelse som PDMS-brønnen, tilsett cyanoacrylatlim (f.eks. superlim) på undersiden av PDMS (den glatte overflaten som var i kontakt med Petri-parabolen) og smør jevnt med en engangs pipettespiss. Sentrer og trykk PDMS godt på glasset mens du etterlater et klart glassvindu i den stansede sirkelen (sørg for at limet ikke smøres over visningsvinduet).
      MERK: Hvis tilgjengelig, plasmabinding av PDMS til coverlip er et alternativ65,66,67.
    3. La limet tørke i flere timer, eller over natten, før bruk. Disse kan gjenbrukes til de går i stykker av normal slitasje.
      MERK: Det anbefales ikke å farge prøvene i den limte PDMS-brønnen som brukes til avbildning. Disse brønnene holder væske i flere timer, men kan lekke under lengre farging.
  3. VHSE-avbildning
    MERK: Hvis det ikke er mulig å ta bilder av uklare prøver, bruker du PBS som bildebehandlingsløsning. Hvis du ser på bildet med klare prøver, bruker du metylsilisylat (eller den valgte avregningsløsningen) som bildebehandlingsløsning.
    1. Tilsett noen dråper bildeløsning i PDMS-brønnen og se etter lekkasjer (hvis det er en lekkasje, reparer den med en prikk / smøring av cyanoacrylat superlim eller bruk en annen brønn).
    2. Hold bildeløsningen i PDMS godt når du legger til VHSE. Bruk scoopula eller fine tip tang (Supplemental Figure 1C), fjern konstruksjonen fra 12-brønnsplaten og plasser den i PDMS-brønnen på glassdekslene. Plasser konstruksjon med orientering av interesse vendt mot målet. For eksempel, for å avbilde epidermis ved hjelp av et invertert mikroskop, sørg for at epidermis vender ned, mot glasset.
      1. Alternativt, for et oppreist mikroskop, møt epidermis opp. Bildeprosedyrene nedenfor er beskrevet for et invertert mikroskop, men kan lett tilpasses for en oppreist.
        MERK: Vær forsiktig når du manipulerer VHSE for å unngå skade. Overføring over brønnplaten i tilfelle VHSE faller. En bøyd, flat spiss scoopula er den enkleste måten å overføre konstruksjonen (Supplerende figur 1C).
    3. Pass på at prøven sitter flatt i brønnen, og at ingen deler av epidermis eller dermis er brettet under prøven. Hvis folding oppstår, manipuler forsiktig prøven med tang eller en scoopula; å legge til ekstra bildeløsning midlertidig for å flyte VHSE kan hjelpe den med å rette ut. Folding eller rynke av prøven kan sees av øyet eller ved hjelp av mikroskopet.
    4. Fyll brønnen med avbildningsløsning, bruk akkurat nok væske til å holde prøven hydrert; For mye væske vil flyte prøven, noe som resulterer i bevegelse under bildebehandling. Konstruksjonen skal sitte på glassvinduet; test for bevegelse ved å vippe PDMS-brønnen. Hvis det er bevegelse, fjern litt væske; tilsett og fjern væskedråpen klokt til bevegelsen stopper.
    5. Plasser et glasssklie over brønnen for å minimere fordampning under avbildning (Tilleggsfigur 1D). For lengre bildebehandlingsøkter må du kontrollere prøven ofte for å sikre riktig væskenivå. Hvis tilgjengelig, kan et fuktet kammer under avbildning brukes (selv om det vanligvis ikke er nødvendig).
    6. Plasser prøven på mikroskopstadiet og bildet gjennom glassdekslene (Tilleggsfigur 1D). Denne teknikken tillater minst 3 timer kontinuerlig konfølende avbildning, men hydrering av prøven bør kontrolleres regelmessig, med bildeløsning tilsatt ved behov.
      MERK: Hvis prøven fjernes, vil metylsilisylat forringe limet over tid. Limet som binder PDMS, kan brukes på nytt mellom bildebehandlingskjøringer. eller prøven kan overføres til nye brønner med jevne mellomrom. I brønner med plasmabinding vil dette ikke være noe problem.
    7. Etter avbildning, flyt prøven med bildevæske så mye som mulig i brønnen. Bruk en scoopula eller fine tip tang for å overføre prøven til lagringsbrønnen. Utfør overføringen over en brønnplate i tilfelle prøven faller.
    8. Hver PDMS brønn- og toppglassdeksler kan brukes på nytt til de går i stykker. Rengjør bunnglasset før bildebehandling, både inne og ute i brønnen. Før gjenbruk må du alltid kontrollere om det er lekkasjer og reparasjon med lim etter behov.
    9. Lagre prøver som beskrevet i trinn 6.3.6, og legg til PBS med noen få måneders mellomrom for å vedlikeholde; Hvis prøver fjernes, oppbevares i glass med metylsilisylat og kontroller nivåene regelmessig. Klarerte prøver kan forringes raskt (innen få dager) og bør avbildes så snart som mulig.

Representative Results

Her presenteres en protokoll for generering av in vitro vaskulære menneskelige hudekvivalenter (VHSE) ved hjelp av telomerase omvendt transkripsjonase (TERT) udødeliggjorte keratinocytter (N/TERT-120,59), voksne humane dermale fibroblaster (hDF) og humane mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) ( Figur1). I tillegg fremheves den tilpassbare karakteren til denne protokollen ved også å demonstrere VHSE-generering og stabilitet ved bruk av vanlige tilgjengelige lungefibroblaster (IMR90) i stedet for hDF. Generering av VHSE fullføres i trinn 1-4, mens trinn 5-7 er valgfrie sluttpunktbehandlings- og bildeteknikker som ble optimalisert for disse VHSEene. Det er viktig å merke seg at VHSEene kan behandles i henhold til spesifikke forskningsspørsmål, og trinn 5-7 er ikke nødvendig for å generere konstruksjonen. Volumetrisk avbildning, analyse og 3D-gjengivelser ble fullført for å demonstrere en volumetrisk analysemetode. Disse volumetriske konstruksjons- og bildeprotokollene bevarer VHSE-strukturen både på mikroskopisk og makroskopisk nivå, noe som muliggjør omfattende 3D-analyse.

Karakterisering av epidermis og dermis viser passende immunfluorescerende markører for menneskelig hud i VHSE-konstruksjonene (Figur 2, 3). Cytokeratin 10 (CK10) er en tidlig differensiering keratinocyttmarkør som vanligvis markerer alle suprabasale lag i hudekvivalenter18,30,68 ( Figur2). Involucrin og filaggrin er sen differensieringsmarkører i keratinocytter og markerer de øverste suprabasale lagene i hudekvivalentene12,30,68,69 ( Figur2). Et fjernt rødt fluorescerende kjernefysisk fargestoff (se materiallisten) ble brukt til å markere kjerner i både epidermis og dermis, med Col IV som markerer vaskulaturen til dermis (Figur 2, Figur 3, Figur 4). Epidermal kjellermembran (BM) komponenter er ikke alltid riktig uttrykt i HMS-kulturer15,16; og Kol IV-farging av BM-en observeres ikke konsekvent ved hjelp av denne protokollen. Forskningsfokuserte BM-komponenter og -struktur vil dra nytte av ekstra medie-, celle- og bildeoptimalisering14.

Selv om konfølende avbildning gjennom hoveddelen av VHSE-kulturene ofte gir bilder med høy oppløsning som er tilstrekkelig for beregningsanalyse av dermis og epidermis, gir clearingmetoden som er beskrevet, mulighet for dypere vevsavbildning. Rydding forbedrer konfokal lasergjennomtrengningsdybde, og effektiv bildebehandling i VHSEer kan oppnås til over 1 mm for klarerte prøver (sammenlignet med ~ 250 μm for uklart). Den beskrevne clearing teknikken (metanol dehydrering og metyl salisylat) tilstrekkelig samsvarer med brytningsindeks gjennom VHSE prøvevev61. Fjerning av VHSE tillot enkel avbildning gjennom hele konstruksjonen uten manipulering (for eksempel å omorientere konstruksjonen for å avbilde dermis og epidermis separat), (Figur 3).

Volumetriske bilder gjør det mulig å lage generering av 3D-gjengivelse for å kartlegge vaskulatur gjennom hver konstruksjon (figur 4). Kort sagt ble konfokale bildesett tatt i dermal til epidermal orientering av flere undervolumer av VHSEer for å oppdage Kollagen IV-flekk (merking av karvegger) og kjerner (merket med et fjernt rødt fluorescerende kjernefysisk fargestoff). Bildestakker lastes inn i databehandlingsprogramvare (se materialliste) og en egendefinert algoritme (basert på disse kildene brukes 48,70,71,72,73,74,75) til 3D-gjengivelse og kvantifisering som beskrevet tidligere48. Denne algoritmen segmenterer automatisk den vaskulære komponenten basert på Col IV-flekken. Den volumetriske segmenteringen sendes til en skjelettalgoritme basert på rask marsjering75,76,77. Skeletonization finner det definitive senteret til hvert Col IV-merkede fartøy, og de resulterende dataene kan brukes til å beregne kardiameter samt vaskulær brøkdel (figur 4). Widefield fluorescerende mikroskopi er et tilgjengelig alternativ hvis laserskanning av mikroskopi ikke er tilgjengelig; det vaskulære nettverket og epidermis kan avbildet med widefield fluorescerende mikroskopi (Supplerende figur 2). Tredimensjonal kvantifisering er mulig ved hjelp av widefield-bildebehandling av VHSEer i stedet for laserskanning av mikroskopi, selv om det kan kreve mer filtrering og dekonvolusjon av bilder på grunn av lyset utenfor flyet.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk tidslinje for vaskulær menneskelig hudekvivalent generasjon. A) Viser progresjon av VHSE-modellen fra 1) dermal komponentsåing, 2) keratinocyttsåing på dermal komponent, 3) epitel stratifisering via luftvæskegrensesnitt og kulturvedlikehold. Etterkulturbehandling og volumetrisk avbildning kan utføres på kulturendepunktet. B) Kamerabilder av hDF VHSE makrostruktur i kulturen setter inn på deres kultur endepunkt, 8 uker. Ulike nivåer av sammentrekning er normale for VHSEer; sammentrekning kan reduseres som protokoll beskriver. (1 & 2) Mindre innleide prøver. (3 & 4) Mer kontraherte prøver gir fortsatt riktige hudelementer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Epidermal karakterisering via immunfluorescerende markører. Alle bilder ble tatt av VHSEer ved 8wk kulturtidspunkt via konfikal mikroskopi. Tilsvarende fargingsmetoder er beskrevet i protokolltrinn 6. Riktige epitelmarkører finnes i både hDF VHSEer (venstre kolonne) og IMR90 VHSEer (høyre kolonne). Involucrin og Filaggrin er sen differensieringsmarkører av keratinocytter og viser at epidermis er fullt stratifisert i begge VHSE-typer. Cytokeratin 10 er en tidlig differensieringsmarkør som identifiserer suprabasale lag i VHSEene. Kjerner vises i ortogonale visninger i gult. En ansikt og ortogonale maks projeksjonsbilder ble gjengitt via beregningsprogramvare; Bilder skaleres individuelt med bakgrunnsdeltrekk og medianfiltrering for klarhet. Skalastenger er 100 μm. (Primære og sekundære antistoffer med intern blokkeringsbufferoppskrift er gitt i tabell 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av uklar vs. klarert VHSE. Denne VHSE ble generert med IMR90s og bilder ble tatt på 4wk kultur tidspunkt via confocal mikroskopi. Kollagen IV vises i cyan; Kjerner vises i magenta; magenta i den fjernede 3D-gjengivelsen representerer konsolidering av kjerner i det epidermale laget i VHSE. Det uklare VHSE-bildet er et eksempel på laserdemping i tykkere VHSE-konstruksjoner, gjennom rydding (metanol og metylsilisylat) hele konstruksjonen kan avbildes med liten / ingen laserdemping fra den dermale siden av konstruksjonen. Bildebehandlingsinnstillinger, inkludert laserlinje, forsterkning og hull, ble senket for fjernet VHSE for å redusere overmetning. Clearing og avbildning ble fullført som beskrevet i trinn 6 og 7 i protokollen. Ortogonale maksprojeksjonsbilder og 3D-gjengivelse ble fullført med beregningsprogramvare, 3D-gjengivelse ble generert fra klarerte konstruksjonsbilder. Bilder skaleres individuelt med bakgrunnsdeltrekk og medianfiltrering for klarhet. Skalastenger er 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Tredimensjonal analyse av vaskulatur i VHSEer. Volumetriske bilder tatt via konfektmikroskopi muliggjør vaskulær parameter-kvantifisering ved kulturendepunktene gjennom beregningsbildeanalyse. Fra VHSE-undervolumer markerer påvisning av Kollagen IV-flekk (cyan) endotelvegger av vaskulatur og muliggjør segmentering av vaskulær basert på kollagen IV-plassering; segmenteringsdata blir deretter skjelettisert, og midten av hvert fartøy er funnet (magenta). Eksempler på 3D-skjelettisering vises for 4 ukers og 8 ukers IMR90 VHSE-prøver, ikke tømt. Resulterende data fra et IMR90 VHSE-eksperimentsett ble brukt til å beregne kardiametrene og de vaskulære fraksjonene for fire undervolumer (hver 250 μm i z-retning) innenfor hver konstruksjon, data ble gjennomsnittet per VHSE og ytterligere gjennomsnittet per kulturtidspunkt. Disse dataene viser den vaskulære nettverket homeostase som spenner over 4 og 8 ukers kulturvarigheter med diametre som er relevante for in vivo menneskelig hud78, og den vaskulære fraksjonen i samme rekkefølge som in vivo menneskelig hud79 (vaskulær brøkdel i kollagenkonstruksjoner har vist seg å være tilpassbar48 og kan optimaliseres ytterligere for økte verdier). Data representeres som ± standard feilgjennomsnitt (S.E.M); n = 3 for hvert tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

media Komponenter
Human Dermal Fibroblast cellelinje (hDF) DMEM HG
5% Fetal Bovine Serum (FBS)
1% Penicillin/Streptomycin (P/S)
IMR90 Fibroblast-cellelinje DMEM/HAM'S F12 50:50
10% FBS
1 % P/S
HMEC-1 Endotelcellelinje MCDB131 Basis medium
10% FBS
1 % P/S
L-Glutamin [10 mM]
Epidermal vekstfaktor (EGF) [10 ng/ml]
Hydrokortison [10 μg/ml]
N/TERT-1 Keratinocyte-cellelinje K-SFM mediebase
1 % P/S
Bovine hypofyseekstrakt (BPE) [25 μg/ml], fra K-SFM tilleggssett
Epidermal vekstfaktor (EGF) [0,2 ng/ml], fra K-SFM tilleggssett
CaCl2 [0,3 mM]
Human Skin Equivalent (HMS) differensiering 3:1 DMEM: Skinkes F12
1 % P/S
0,5 μM Hydrokortison
0,5 μM Isoproterenol
0,5 μg/ml insulin

Tabell 1: Medieoppskrifter. Medieoppskrifter for 2D-kultur av de menneskelige dermale fibroblaster, IMR90 fibroblaster, HMEC-1 og N / TERT-1 keratinocytter er gitt. Disse oppskriftene ble brukt til å utvide cellelinjer før de genererte VHSEer. Human hudekvivalente (HMS) differensieringsmedier brukes til å generere VHSEer; En basisoppskrift er gitt, under deler av nedsenkningskultur og stratifiseringsinduksjon, bør avsmalnende mengder FBS legges til som beskrevet i protokolltrinn 3. HMS-oppskrift basert på disse kildene11,80.

Kollagen lager konsentrasjon (Cs) : 8 mg/ml
Ønsket volum (Vf): 1 Ml
Normaliserer NaOH-justering*: 1 X
*Hver masse kollagen må testes for å bestemme hvor mye NaOH som trengs for å sette pH 7 - 7,4
Ønsket kollagenkonsentrasjon (mg/ml)
2 3 4 5
10X PBS (Vpbs) 0.1 0.1 0.1 0.1
Kollagen lager (Vs) 0.25 0.375 0.5 0.625
1N NaOH (VNaOH) 0.00575 0.008625 0.0115 0.014375
Medier (V-medier) 0.64425 0.516375 0.3885 0.260625

Tabell 2: Referansetabell for kollagenberegning. Referansetabellen gir ofte ønskede kollagenkonsentrasjoner beregnet forutsatt en 8 mg / ml kollagenbestandskonsentrasjon og et ønsket sluttvolum på 1 ml; Alle verdier er i ml. Ligningene som brukes til å beregne disse beløpene, er gitt i protokolltrinn 2.2. Det er viktig å sjekke pH for hver kollagenbestand; Om nødvendig bør NaOH-beløp legges til for å oppnå pH 7 - 7,4 (etter at PBS, NaOH, kollagen lager, media er lagt til). Protokollen er optimalisert for VHSEer ved hjelp av en kollagenkonsentrasjon på 3 mg/ml; endringer i kollagenkonsentrasjon kan være nødvendig for ulike cellelinjer/ønskede sluttresultater48.

Primært antistoff kilde konsentrasjon bruk
Filaggrin (AKH1) mus monoklonal IgG Santa Cruz;
sc-66192 (200 μg/ml)		 [1:250] Sen differensieringsmarkør15
Involucrin kanin polyklonal IgG Proteintech;
55328-1-AP (30 μg/150 μL)		 [1:250] Differensieringsmarkør for sen terminal15
Cytokeratin 10 (DE-K10) mus IgG, supernatant Santa Cruz;
sc-52318		 [1:350] Suprabasal epidermal markør14,36,59
Kollagen IV kanin polyklonal Proteintech;
55131-1-AP		 [1:500] Endotel vaskulær vegg67
DRAQ 7 Cellesignalering; 7406 (0,3 mM) [1:250] Kjernefysisk markør
Sekundært antistoff kilde konsentrasjon bruk
Geit Anti-Kanin IgG DyLight™ 488 Konjugert Invitrogen; 35552 (1 mg/ml) [1:500] Kollagen IV sekundær
Anti-kanin IgG (H&L) (GOAT) antistoff, DyLight™ 549 Konjugert Rockland Immunochemicals; 611-142-002 [1:500] Involucrin sekundær
Geit Anti-Mus IgG (H&L), DyLight™ 488 Termovitenskap; 35502 (1 mg/ml) [1:500] Filaggrin eller Cytokeratin 10 sekundær
BLOKKERINGSBUFFER (500 ml)
Reagent beløp
ddH2O 450 ml
10 x PBS 50 ml
Bovine serum albumin (BSA) 5 g
Tween 20 0,5 ml
Kaldt vann Fisk Gelatin 1 g
Natriumazid (10 % natriumazid i diH2O) 5 ml (0,1 % endelig konsentrasjon)

Tabell 3: Primære og sekundære antistoffer med blokkering av bufferoppskrift. De oppførte antistoffene og de kjemiske flekkene ble brukt til farging vist i figur 2, figur 3, figur 4. Fargingen ble fullført som gitt i protokolltrinn 6 ved hjelp av blokkeringsbufferoppskriften som er oppført her. Noen optimaliseringer av fargekonsentrasjonene og varigheten kan være nødvendig avhengig av de valgte kulturteknikkene og cellelinjene.

Supplerende tabell 1: Forkortelser - oversikt. Forkortelsesliste inkludert for leserens bekvemmelighet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende figur 1: VHSE teknisk hjelpemiddel for håndtering. Håndtering av VHSEer er utfordrende, spesielt under fiksering, behandling og farging. A-D tilsvarer instruksjonene i trinn 5-7. A viser den tekniske håndteringen av å fjerne porøsmembranen fra en kulturinnsats for å sikre riktig farging. B viser hvordan du holder hver VHSE nedsenket under farging og lagring. C viser den sikreste og enkleste måten å flytte konstruksjoner til PDMS-bildebrønner på. D viser en VHSE som sitter i en PDMS-bildebrønn: PDMS-brønnen limes til et glasssklie på bunnen, og skaper et vindu for avbildning, et glasssklie plasseres på toppen for å opprettholde fuktigheten gjennom lange bildebehandlingskjøringer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Standard widefield fluorescensmikroskopi kan brukes til å vurdere VHSEer. Widefield-avbildning kan brukes til volumetrisk avbildning for rutinemessig vurdering når laserskanning av mikroskopi ikke er tilgjengelig. Som et eksempel vises avbildning av VHSEer fra både de apikale og basolaterale aspektene som en ansikt og ortogonal (Ortho.) maksimale projeksjoner. (Øverst) Epidermis ble avbildet ved hjelp av involucrin og kjerner som markører. (Nederst) Dermal vaskulatur ble avbildet ved hjelp av kollagen IV som markør. Bilder trekkes fra bakgrunnen for klarhet. Lyset utenfor flyet fører til de "stripete" eller "fakkel" artefaktene som er tydelige i ortogonale visninger. Widefield-avbildning kan brukes til kvantifisering, men kan kreve mer bildebehandling. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne protokollen har vist en enkel og repeterbar metode for generering av VHSEer og deres tredimensjonale analyse. Det er viktig at denne metoden er avhengig av få spesialiserte teknikker eller utstyrsdeler, noe som gjør den tilgjengelig for en rekke laboratorier. Videre kan celletyper erstattes med begrensede endringer i protokollen, slik at forskere kan tilpasse denne protokollen til deres spesifikke behov.

Riktig kollagen gelering er et utfordrende skritt i å etablere hudkultur. Spesielt når du bruker rå preparater uten rensing, kan sporforurensninger påvirke gelasjonsprosessen. For å sikre konsistens bør grupper av eksperimenter utføres med samme kollagenbestand som skal brukes til VHSE-generering. Videre bør gelasjonen ideelt sett forekomme ved en pH på 7-7,4, og sporforurensninger kan skifte pH. Før du bruker kollagenlagenlagen, bør det gjøres en øvelse acellulær gel ved ønsket konsentrasjon og pH bør måles før gelering. Å fullføre denne kollagenkvalitetskontrollen før du begynner dermal komponentsåing, vil identifisere problemene med riktig gelering og kollagen homogenitet før du setter opp et komplett eksperiment. I stedet for å så etcellulært kollagen direkte på en kulturinnsats, kan du frø litt kollagen på en pH-stripe som evaluerer hele pH-skalaen og verifiserer en pH på 7-7,4. Gelering kan evalueres ved å bruke en dråpe av kollagengelløsningen på en deksler eller vevskultur plastbrønnplate (en brønnplate anbefales å simulere de begrensede sidene av en kulturinnsats). Etter gelasjonstid skal kollagenet være solid, det vil si at det ikke skal strømme når platen er vippet. Under fasekontrastmikroskopi skal kollagenet se homogent og klart ut. Sporadiske bobler fra kollagen såing er normale, men store amorfe blober av ugjennomsiktig kollagen i den klare gelen indikerer et problem-sannsynlig på grunn av utilstrekkelig blanding, feil pH, og / eller unnlatelse av å holde kollagenet avkjølt under blanding.

Cellesåingsmengdene og -mediet kan justeres. I protokollen ovenfor er de innkapslede cellemengdene optimalisert for en 12-brønns innsats ved 7,5 x 104 fibroblaster og 7,5 x 105 endotelceller per ml kollagen med 1,7 x 105 keratinocytter frøet på toppen av den dermale konstruksjonen. Celletetthet er optimalisert for denne VHSE-protokollen basert på de foreløpige studiene og den forrige forskningen som undersøkte 3D vaskulær nettverksgenerering i ulike kollagenkonsentrasjoner48 og HMS generasjon22,80,81. I lignende systemer er de publiserte endotelcelletetthetene 1,0 x 106 celler / ml kollagen48; fibroblastkonsentrasjonene varierer ofte fra 0,4 x 105 celler/ml kollagen22,28,82 til 1 x 105 celler/ml kollagen8,58,83,84,85; og keratinocyttkonsentrasjonene varierer fra 0,5 x 105 [celler/cm2]80 til 1 x 105 [celler/cm2]8. Celletetthet kan optimaliseres for spesifikke celler og forskningsspørsmål. Tredimensjonale kulturer med kontraktile celler, for eksempel fibroblaster, kan trekke seg sammen, noe som fører til levedyktighetsreduksjon og kulturtap86,87. Foreløpige eksperimenter bør fullføres for å teste sammentrekning av dermalrommet (som kan oppstå med flere dermale celler, mer sammentrekningsceller, lengre nedsenkningskulturer eller mykere matriser) og for å teste epidermal overflatedekning. I tillegg kan antall dager i nedsenking og hastigheten på avsmalning av seruminnholdet også tilpasses hvis overdreven dermal sammentrekning oppstår eller en annen grad av keratinocyttdekning er nødvendig. For eksempel, hvis sammentrekning blir lagt merke til i løpet av perioden med dermal nedsenking eller mens keratinocytter etablerer en overflatemonolayer, beveger seg raskere gjennom serumavsmalningsprosessen og hever VHSE til ALI kan bidra til å forhindre ytterligere sammentrekning. På samme måte, hvis keratinocyttdekning ikke er ideell, kan endring av antall dager som VHSE er nedsenket uten serum bidra til å øke den epidermale monolayerdekningen og redusere sammentrekningen siden serumet er utelatt. Endringer i celletetthet eller andre forslag ovenfor må optimaliseres for de spesifikke kulturene og forskningsmålene.

For å etablere en riktig stratifisering av epidermis under luftvæskegrensesnittperioden (ALI), er det viktig å regelmessig sjekke og opprettholde væskenivåer i hver brønn slik at ALI og passende hydrering av hver konstruksjon holdes gjennom kulturlengden. Medienivåer bør kontrolleres og spores daglig til konsistente ALI-nivåer er etablert. Det epidermale laget skal se hydrert ut, ikke tørt, men det bør ikke være mediebassenger på konstruksjonen. Under ALI vil konstruksjonen utvikle en ugjennomsiktig hvit / gul farge som er normal. Det epidermale laget vil sannsynligvis utvikle seg ujevnt. Vanligvis vippes VHSEene på grunn av kollagen såing eller dermal sammentrekning. Det er også normalt å observere en høyere epidermal del midt i konstruksjonen i mindre konstruksjoner (24 brønnstørrelse) og en åsformasjon rundt omkretsen av VHSE i 12 brønnstørrelser. Sammentrekning av konstruksjonene13 kan endre disse topografiske formasjonene, og/eller kan ikke observeres i det hele tatt.

Farging og avbildning av VHSEer introduserer mekanisk manipulasjon til VHSEene. Det er svært viktig å planlegge og begrense manipulering av hver kultur. Når manipulering er nødvendig, må du opprettholde skånsomme bevegelser når du fjerner VHSEer fra innsatsmembranene, når du tilsetter farge- eller vaskeløsninger på konstruksjonsoverflaten, og når du fjerner og erstatter VHSEer i lagrings-/bildebrønnene under bildebehandlingsforberedelse. Spesielt kan de apikale lagene i den epidermale komponenten være skjøre og er i fare for å sloughing av basale epidermale lag. Apikale lag av epidermis er skjøre og går gjennom desquamation selv i innfødt vev4, men for nøyaktig analyse av epidermal struktur er det viktig å minimere skade eller tap. Hvis epidermale lag løfter av konstruksjonen, kan de avbildes separat. De basale lagene i epidermis er mest sannsynlig fortsatt festet til dermis mens deler av de apikale lagene kan løsne. For visualisering av epidermis er en kjernefysisk flekk nyttig for å observere dette siden tette kjerner er karakteristiske for nedre og midtre lag av epidermis.

Konfokal avbildning av VHSE-etterfikseringen er diskutert i protokollen, men det er også mulig å avbilde VHSEene i hele kulturen via oppreist basert optisk koherenstomografi (OCT)88,89,90,91,92,93. VHSE er stabil nok til å tåle avbildning uten inkubasjon eller fukting i minst to timer uten merkbare effekter. Siden OCT er etikettfri og ikke-invasiv, er det mulig å spore epidermal tykkelse under modning. Andre ikke-invaderende avbildningsmodaliteter kan sannsynligvis også brukes.

Volumetrisk avbildning av de kombinerte dermale og epidermale strukturene kan være utfordrende på grunn av laserdemping dypere i VHSE. Dette kan reduseres ved å forestille konstruksjonen i to retninger, fra den epidermale siden (figur 1) og fra den dermale siden (figur 2), noe som gir god oppløsning av dermale vaskulære strukturer og epidermis. I tillegg kan prøven fjernes, noe som gir volumetriske bilder av hele strukturen med minimal demping. Flere clearingmetoder ble forsøkt, men den beskrevne metanol/metylsylatmetoden ga de beste resultatene. Forskere som er interessert i å optimalisere andre clearingmetoder, er rettet mot disse vurderingene49,61,62. Ved tømming foreslås det å ta bildet av prøven helt før fjerning, da metoden kan skade fluoroforene og / eller strukturen. Videre bør bildet fullføres så snart som mulig etter rydding, da fluorescensen kan falme i løpet av dager.

For enkelhets skyld og tilgjengelighet benyttet denne protokollen de enkleste medieblandingene som finnes i tidligere litteratur11,80. Selv om det er mange fordeler med å bruke enkle medieblandinger, gjenkjennes også begrensningene i dette valget. Andre grupper har studert effekten av spesifikke mediekomponenter på epidermal og dermal helse og funnet ut at andre medietilsetninger94, for eksempel eksterne frie fettsyrer / lipider, forbedrer epidermis stratum corneum og forbedrer hudbarrierefunksjonen. Selv om våre immunfluorescerende markører viser passende differensiering og stratifisering i epidermis, avhengig av studiene som utføres, kan det være nødvendig med ytterligere medieoptimalisering. Videre ble det ikke utført en omfattende analyse av epidermal BM ved evaluering av VHSEene som presenteres her. Integriteten til BM er en viktig indikasjon på hudekvivalenter; ulike grupper har forsket på kulturens varighet og dens effekt på BM-markeringer95 samt analyse av fibroblast tilstedeværelse og lagt vekstfaktoreffekter på BM uttrykk14. Det er viktig å merke seg at analyse av BM-komponenten bør evalueres og optimaliseres når du bruker denne protokollen.

I denne protokollen er beskrevet en prosedyre for VHSE generasjon, demonstrere resultater etter 8 uker på ALI. VHSE-kulturer har blitt dyrket opptil 12 uker hos ALI uten merkbar endring eller tap av levedyktighet, og det er mulig at de kan være levedyktige lenger. Viktigst, denne protokollen er lett tilpasningsdyktig til vanlige tilgjengelige celletyper, som demonstrert ved utskifting av dermale fibroblaster med IMR90 lungefibroblaster. Avhengig av forskerens behov og tilgjengelige ressurser, kan celletypene og medieblandingene på kulturen justeres, selv om mer forskjellige celletyper kan kreve medieoptimalisering. Oppsummert er disse prosedyrene ment å gi klarhet i kulturen til VHSEer for studiet av hudbiologi og sykdom. For å maksimere tilgjengeligheten ble protokollen utviklet denne enkle og robuste ved hjelp av vanlig utstyr, cellelinjer og reagenser som en minimal effektiv tilnærming som ytterligere kan tilpasses de spesifikke behovene til forskningsstudier.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Jim Rheinwald59 og Dr. Ellen H. van den Bogaard20 for deres sjenerøse gave av N / TERT cellelinjer. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (19IPLOI34760636).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N NaOH Fisher Chemical S318-100 (Dilute from Lab stock)
4% Paraformaldehyde ACROS Organics #41678-5000, Lot # B0143461 Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9
Autoclaved forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
CaCl2 Fisher bioreagents Cat # BP510-250, Lot # 190231 Rnase, Dnase, Protease-Free
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) ATCC CRL-3243 SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult ATCC PCS-201-012 Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) ATCC CCL-186 Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.
Centrifuge Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (standard lab equipment)
Computational Software MATLAB MATLAB 2020a MathWorks, Natick, MA.
Confocal Microscope Leica TCS SPEII confocal Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.
Cover Glass (22 x 22) Fisher Scientific 12-545F 0.13-0.17 mm No.1 Thickness
Cyanoacrylate super glue or silicone grease Glue Masters #THI0102 Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred
DMEM media base Corning; Mediatech, Inc REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
DMEM/F-12 50/50 Corning; Mediatech, Inc REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethanol Decon Labs #V1101 (standard lab reagent)
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered
Fine tip forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 Made up in 0.1% BSA in PBS
Hydrocortisone Alpha Easar Lot # 5002F2A made up in DMSO
Insulin (human) Peprotech Lot # 9352621
Inverted Light/Phase Contrast Microscope VWR 76317-470 (standard lab equipment)
Isoproterenol Alfa Aesar #AAJ6178806 DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%
Keratinocyte-SFM (1x) media base Gibco; Life Technologies Corporation REF #: 10724-011; Lot # 2085518 Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium
L-Ascorbic Acid Fisher Chemical Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt
L-glutamine (solid) Fisher Bioreagents CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder
MCDB 131 media base Gen Depot CM034-050, Lot # 03062021 MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered
Metal punches Sona Enterprises (SE) 791LP, 12PC Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2".
Methanol Fisher Chemical CAS # 67-56-1 (optional). For clearing dehydration step.
Methyl Salicylate Fisher Chemical O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 (optional). For clearing.
Microtubes, 1.7 mL Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics Cat # 24-282; Lot # 19467 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free
PBS, 10x Culture grade or autoclaved APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium Genesee Scientific Corporation Ref # 25-508; Lot # 07171015
PBS, 1x non-Culture grade APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. 
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 15140-122, Lot # 2199839 Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)
Petri Dish, glass, small Corning PYREX 316060 (optional). To be used as a clearing container
Petri Dishes, 100 mm Fisher Scientific FB0875713 Use for making up PDMS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning GMID 02065622, Batch # H04719H035 Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)
Dow Corning GMID 02065622, Batch # H047JC4003 DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S Sterilized capillaries and pistons
Round tipped scoopula (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging
Supplements for Keratinocyte-SFM media Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 37000-015, Lot # 2154180 Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size Corning; Costar REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057 Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, 
Tissue Culture Plates, 12 well size Greiner Bio-one; CellStar Cat # 665 180; Lot # E18103QT 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area Genesee Scientific Corporation Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene
Triton x 100 Ricca Chemical Company Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 Wetting agent
Trypsin 0.25% Corning; Mediatech, Inc Ref # 25-053-CI 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate
Type 1 Collagen isolated from Rat tail Pel-Freez Biologicals 56054-1 Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)
Vaccum chamber, benchtop Bel-Art F42010-0000 (standard lab equipment)
Handheld Precision knife X-Acto X3311 (X-Acto knife optional if purchased steel punches)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojic, M., et al. Skin tissue engineering 3. Biomaterials for Skin Repair and Regeneration. , 59 (2019).
  2. Shevchenko, R. V., James, S. L., James, S. E. A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction. Journal of The Royal Society Interface. 7 (43), 229-258 (2010).
  3. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and Physiology of the Skin. Journal of the Dermatology Nurses' Association. 3 (4), (2011).
  4. McGrath, J. A., Eady, R. A. J., Pope, F. M. Anatomy and organization of human skin. Rook's textbook of dermatology. 10, 9781444317633 (2004).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue Engineered Human Skin Equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), (2012).
  7. Oh, J. W., Hsi, T. -C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. The Journal of investigative dermatology. 133 (11), 1-4 (2013).
  8. El-Ghalbzouri, A., Gibbs, S., Lamme, E., Van Blitterswijk, C. A., Ponec, M. Effect of fibroblasts on epidermal regeneration. British Journal of Dermatology. 147 (2), 230-243 (2002).
  9. Sun, T., Haycock, J., MacNeil, S. In situ image analysis of interactions between normal human keratinocytes and fibroblasts cultured in three-dimensional fibrin gels. Biomaterials. 27 (18), 3459-3465 (2006).
  10. Kreimendahl, F., et al. Macrophages significantly enhance wound healing in a vascularized skin model. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1340-1350 (2019).
  11. El Ghalbzouri, A., Commandeur, S., Rietveld, M. H., Mulder, A. A., Willemze, R. Replacement of animal-derived collagen matrix by human fibroblast-derived dermal matrix for human skin equivalent products. Biomaterials. 30 (1), 71-78 (2009).
  12. Roger, M., et al. Bioengineering the microanatomy of human skin. Journal of Anatomy. 234, 438-455 (2019).
  13. Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-Dimensional Tissue Models of Normal and Diseased Skin. Current Protocols in Cell Biology. 41 (1), 1-17 (2008).
  14. El Ghalbzouri, A., Jonkman, M. F., Dijkman, R., Ponec, M. Basement Membrane Reconstruction in Human Skin Equivalents Is Regulated by Fibroblasts and/or Exogenously Activated Keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 124 (1), 79-86 (2005).
  15. Pruniéras, M., Régnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
  16. Ali, N., Hosseini, M., Vainio, S., Taieb, A., Cario-André, M., Rezvani, H. R. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  17. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69-70, 81-102 (2014).
  18. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by chitosan modulated dermal matrices. PLOS ONE. 12 (3), 0174478 (2017).
  19. Vidal, S. E. L., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Abbott, R. D., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. 3D biomaterial matrix to support long term, full thickness, immuno-competent human skin equivalents with nervous system components. Organoids and Ex Vivo Tissue On-Chip Technologies. 198, 194-203 (2019).
  20. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838 (2017).
  21. Lebonvallet, N., et al. Effects of the re-innervation of organotypic skin explants on the epidermis. Experimental Dermatology. 21 (2), 156-158 (2011).
  22. Van Drongelen, V., et al. Barrier Properties of an N/TERT-Based Human Skin Equivalent. Tissue Engineering Part A. 20 (21-22), 3041-3049 (2014).
  23. Hensler, S., Kühlbach, C., Parente, J. D., Krüger-Ziolek, S., Möller, K., Müller, M. Establishment and initial characterization of a simple 3D organotypic wound healing model. , Available from: https://opus.hs-furtwangen.de/frontdoor/index/index/docld/4852 (2018).
  24. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5), 240-249 (2013).
  25. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  26. Amelian, A., Wasilewska, K., Megias, D., Winnicka, K. Application of standard cell cultures and 3D in vitro tissue models as an effective tool in drug design and development. Pharmacological Reports. 69 (5), 861-870 (2017).
  27. Lu, W., et al. Mixture of Fibroblasts and Adipose Tissue-Derived Stem Cells Can Improve Epidermal Morphogenesis of Tissue-Engineered Skin. Cells Tissues Organs. 195 (3), 197-206 (2012).
  28. Marino, D., Luginbühl, J., Scola, S., Meuli, M., Reichmann, E. Bioengineering Dermo-Epidermal Skin Grafts with Blood and Lymphatic Capillaries. Science Translational Medicine. 6 (221), 221 (2014).
  29. Martins-Green, M., Li, Q. -J., Yao, M. A new generation organ culture arising from cross-talk between multiple primary human cell types. The FASEB Journal. 19 (2), 222-224 (2004).
  30. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. -W. 3D Cell Printing of Perfusable Vascularized Human Skin Equivalent Composed of Epidermis, Dermis, and Hypodermis for Better Structural Recapitulation of Native Skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019 (2019).
  31. Baltazar, T., et al. 3D bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 26 (5-6), 227-238 (2019).
  32. Klar, A. S., et al. Tissue-engineered dermo-epidermal skin grafts prevascularized with adipose-derived cells. Biomaterials. 35 (19), 5065-5078 (2014).
  33. Grebenyuk, S., Ranga, A. Engineering Organoid Vascularization. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  34. Black, A. F., Berthod, F., L'heureux, N., Germain, L., Auger, F. A. In vitro reconstruction of a human capillary-like network in a tissue-engineered skin equivalent. The FASEB Journal. 12 (13), 1331-1340 (1998).
  35. Huber, B., Link, A., Linke, K., Gehrke, S. A., Winnefeld, M., Kluger, P. J. Integration of Mature Adipocytes to Build-Up a Functional Three-Layered Full-Skin Equivalent. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (8), 756-764 (2016).
  36. Monfort, A., Soriano-Navarro, M., García-Verdugo, J. M., Izeta, A. Production of human tissue-engineered skin trilayer on a plasma-based hypodermis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 7 (6), 479-490 (2013).
  37. Shamis, Y., et al. Fibroblasts derived from human embryonic stem cells direct development and repair of 3D human skin equivalents. Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 10 (2011).
  38. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
  39. Chau, D. Y. S., Johnson, C., MacNeil, S., Haycock, J. W., Ghaemmaghami, A. M. The development of a 3D immunocompetent model of human skin. Biofabrication. 5 (3), 035011 (2013).
  40. Vanden Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between Keratinocytes and T Cells in a 3D Microenvironment: A Model to Study Inflammatory Skin Diseases. Journal of Investigative Dermatology. 134 (3), 719-727 (2014).
  41. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating Macrophages into Organotypic Co-Cultures: A 3D In Vitro Model to Study Tumor-Associated Macrophages. PLOS ONE. 7 (7), 40058 (2012).
  42. Ouwehand, K., Spiekstra, S. W., Waaijman, T., Scheper, R. J., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Technical Advance: Langerhans cells derived from a human cell line in a full-thickness skin equivalent undergo allergen-induced maturation and migration. Journal of Leukocyte Biology. 90 (5), 1027-1033 (2011).
  43. Weinmüllner, R., et al. Organotypic human skin culture models constructed with senescent fibroblasts show hallmarks of skin aging. npj Aging and Mechanisms of Disease. 6 (1), 4 (2020).
  44. Barker, C. L., et al. The Development and Characterization of an In Vitro Model of Psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 892-901 (2004).
  45. Larcher, F., Espada, J., Díaz-Ley, B., Jaén, P., Juarranz, A., Quintanilla, M. New Experimental Models of Skin Homeostasis and Diseases. Actas Dermo-Sifiliográficas (English Edition). 106 (1), 17-28 (2015).
  46. Varkey, M., Ding, J., Tredget, E. E. Fibrotic Remodeling of Tissue-Engineered Skin with Deep Dermal Fibroblasts Is Reduced by Keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 716-727 (2013).
  47. Moulin, V. J. Reconstitution of skin fibrosis development using a tissue engineering approach. Methods in Molecular Biology. 961, Clifton, N.J. 287-303 (2013).
  48. Morgan, J. T., Shirazi, J., Comber, E. M., Eschenburg, C., Gleghorn, J. P. Fabrication of centimeter-scale and geometrically arbitrary vascular networks using in vitro self-assembly. Biomaterials. 189, 37-47 (2019).
  49. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 1-8 (2016).
  50. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  51. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature Protocols. 1, 2753 (2007).
  52. Bornstein, M. B. Reconstituted rat-tail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  53. Clément, M. -V., Ramalingam, J., Long, L. H., Halliwell, B. The In Vitro Cytotoxicity of Ascorbate Depends on the Culture Medium Used to Perform the Assay and Involves Hydrogen Peroxide. Antioxidants & Redox Signaling. 3 (1), 157-163 (2001).
  54. Tajima, S., Pinnell, S. R. Ascorbic acid preferentially enhances type I and III collagen gene transcription in human skin fibroblasts. Journal of Dermatological Science. 11 (3), 250-253 (1996).
  55. Murad, S., Tajima, S., Johnson, G. R., Sivarajah, A., Pinnell, S. R. Collagen Synthesis in Cultured Human Skin Fibroblasts: Effect of Ascorbic Acid and Its Analogs. Journal of Investigative Dermatology. 81 (2), 158-162 (1983).
  56. Villacorta, L., Azzi, A., Zingg, J. -M. Regulatory role of vitamins E and C on extracellular matrix components of the vascular system. Vitamin E: An Overview of Major Research Directions. 28 (5), 507-537 (2007).
  57. Ashino, H., et al. Novel Function of Ascorbic Acid as an Angiostatic Factor. Angiogenesis. 6 (4), 259-269 (2003).
  58. Ponec, M., et al. The Formation of Competent Barrier Lipids in Reconstructed Human Epidermis Requires the Presence of Vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  59. Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
  60. Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. Journal of visualized experiments: JoVE. (130), e56863 (2017).
  61. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  62. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  63. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  64. Ng, J. M. K., Gitlin, I., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. ELECTROPHORESIS. 23 (20), 3461-3473 (2002).
  65. Eddings, M. A., Johnson, M. A., Gale, B. K. Determining the optimal PDMS-PDMS bonding technique for microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (6), 067001 (2008).
  66. Markov, D. A., Lillie, E. M., Garbett, S. P., McCawley, L. J. Variation in diffusion of gases through PDMS due to plasma surface treatment and storage conditions. Biomedical microdevices. 16 (1), 91-96 (2014).
  67. Katzenberg, F. Plasma-bonding of poly(dimethylsiloxane) to glass. e-Polymers. 5 (1), (2005).
  68. El Ghalbzouri, A., Lamme, E., Ponec, M. Crucial role of fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis. Cell and Tissue Research. 310 (2), 189-199 (2002).
  69. Kanitakis, J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin. European journal of dermatology: EJD. 12 (4), 390-399 (2002).
  70. Kroon, D. -J. Hessian based Frangi Vesselness filter. MATLAB Central File Exchange. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/24409-hessian-based-frangi-vesselness-filter (2010).
  71. Jerman, T., Pernuš, F., Likar, B. Špiclin Enhancement of Vascular Structures in 3D and 2D Angiographic Images. IEEE Transactions on Medical Imaging. 35 (9), 2107-2118 (2016).
  72. Kovesi, P. Phase Preserving Denoising of Images. signal. 4, 6 (1999).
  73. Vincent, L. Morphological grayscale reconstruction in image analysis: applications and efficient algorithms. IEEE Transactions on Image Processing. 2 (2), 176-201 (1993).
  74. Xie, L., et al. Quantitative susceptibility mapping of kidney inflammation and fibrosis in type 1 angiotensin receptor-deficient mice. NMR in Biomedicine. 26 (12), 1853-1863 (2013).
  75. Van Uitert, R., Bitter, I. Subvoxel precise skeletons of volumetric data based on fast marching methods. Medical Physics. 34 (2), 627-638 (2007).
  76. Sethian, J. A. A fast marching level set method for monotonically advancing fronts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1591-1595 (1996).
  77. Sethian, J. A. Fast Marching Methods. SIAM Review. 41 (2), 199-235 (1999).
  78. Braverman, I. M. The Cutaneous Microcirculation. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 3-9 (2000).
  79. Men, S. J., Chen, C. -L., Wei, W., Lai, T. -Y., Song, S. Z., Wang, R. K. Repeatability of vessel density measurement in human skin by OCT-based microangiography. Skin research and technology: official journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (4), 607-612 (2017).
  80. Commandeur, S., Ho, S. H., de Gruijl, F. R., Willemze, R., Tensen, C. P., El Ghalbzouri, A. Functional characterization of cancer-associated fibroblasts of human cutaneous squamous cell carcinoma. Experimental Dermatology. 20 (9), 737-742 (2011).
  81. Thakoersing, V. S., Danso, M. O., Mulder, A., Gooris, G., Ghalbzouri, A. E., Bouwstra, J. A. Nature versus nurture: does human skin maintain its stratum corneum lipid properties in vitro. Experimental Dermatology. 21 (11), 865-870 (2012).
  82. Thakoersing, V. S., Gooris, G. S., Mulder, A., Rietveld, M., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  83. Bouwstra, J. A., Groenink, H. W. W., Kempenaar, J. A., Romeijn, S. G., Ponec, M. Water distribution and natural moisturizer factor content in human skin equivalents are regulated by environmental relative humidity. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 378-388 (2008).
  84. Thakoersing, V. S., van Smeden, J., Mulder, A. A., Vreeken, R. J., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Increased Presence of Monounsaturated Fatty Acids in the Stratum Corneum of Human Skin Equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  85. Smola, H., Thiekötter, G., Fusenig, N. Mutual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction. The Journal of Cell Biology. 122 (2), 417 (1993).
  86. Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal Human Primary Fibroblasts Undergo Apoptosis in Three-Dimensional Contractile Collagen Gels. Journal of Investigative Dermatology. 110 (2), 153-157 (1998).
  87. Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-Term Culture of Fibroblasts in Contracted Collagen Gels: Effects on Cell Growth and Biosynthetic Activity. Journal of Investigative Dermatology. 93 (6), 792-798 (1989).
  88. Smith, L. E., Bonesi, M., Smallwood, R., Matcher, S. J., MacNeil, S. Using swept-source optical coherence tomography to monitor the formation of neo-epidermis in tissue-engineered skin. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4 (8), 652-658 (2010).
  89. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Park, H., Cense, B., De Boer, J. F. Birefringence measurements in human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography. Biomed Opt. 2 (2), 287-291 (2004).
  90. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Hyle Park, B., Cense, B., de Boer, J. F. Advances in Optical Coherence Tomography Imaging for Dermatology. Journal of Investigative Dermatology. 123 (3), 458-463 (2004).
  91. Yeh, A. T., Kao, B., Jung, W. G., Chen, Z., Nelson, J. S., Tromberg, B. J. Imaging wound healing using optical coherence tomography and multiphoton microscopy in an in vitro skin-equivalent tissue model. Journal of Biomedical Optics. 9 (2), 9 (2004).
  92. Derr, K., et al. Fully Three-Dimensional Bioprinted Skin Equivalent Contructs with Validated Morphology and Barrier Funtion. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  93. Park, B. H., de Boer, J. F. Polarization Sensitive Optical Coherence Tomography. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , 1055-1101 (2015).
  94. Batheja, P., Song, Y., Wertz, P., Michniak-Kohn, B. Effects of Growth Conditions on the Barrier Properties of a Human Skin Equivalent. Pharmaceutical Research. 26 (7), 1689-1700 (2009).
  95. Dos Santos, M., Metral, E., Boher, A., Rousselle, P., Thepot, A., Damour, O. In vitro 3-D model based on extending time of culture for studying chronological epidermis aging. Matrix Biology. 47, 85-97 (2015).

Tags

Bioengineering Utgave 168 vevsteknikk vaskulær vevsteknikk hudekvivalent hudregenerering sårreparasjon volumetrisk avbildning full tykkelse hud
Generering av selvmonterte vaskulære menneskelige hudekvivalenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, M. M., Morgan, J. T.… More

Sanchez, M. M., Morgan, J. T. Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents. J. Vis. Exp. (168), e62125, doi:10.3791/62125 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter