Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering av självmonterade vaskulariserade mänskliga hudekvivalenter

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62125
Automatic Translation
1, 1
1Departments of Bioengineering, University of California

Summary

Målet med detta protokoll är att beskriva generering och volymetrisk analys av vascularized mänskliga huden motsvarigheter med hjälp av tillgängliga och enkla tekniker för långsiktig kultur. I möjligaste mån beskrivs logiken för steg för att ge forskare möjlighet att anpassa utifrån sina forskningsbehov.

Abstract

Mänskliga hudekvivalenter (HSE) är vävnadskonstruerade konstruktioner som modellerar epidermala och dermala komponenter i mänsklig hud. Dessa modeller har använts för att studera hudutveckling, sårläkning och ympningstekniker. Många HSEs fortsätter att sakna vaskulatur och analyseras dessutom genom post-culture histologiska sektionering som begränsar volymetrisk bedömning av strukturen. Presenteras här är ett enkelt protokoll som använder tillgängliga material för att generera vascularized mänskliga hud motsvarigheter (VHSE); ytterligare beskrivs är volymetrisk avbildning och kvantifiering tekniker av dessa konstruktioner. Kort, VHSEs är konstruerade i 12 brunn kulturinsatser där dermal och epidermal celler sås i råtta svans kollagen typ I gel. Dermal kupén består av fibroblast och endotelceller spridda över hela kollagengelen. Epidermalt utrymme består av keratinocyter (hudepitela celler) som skiljer vid luft-vätskegränssnittet. Viktigt är att dessa metoder är anpassningsbara baserat på forskarens behov, med resultat som visar VHSE-generation med två olika fibroblastcelltyper: mänskliga dermala fibroblaster (hDF) och mänskliga lungfibroblaster (IMR90s). VHSEs utvecklades, avbildas genom confocal mikroskopi och volymetriskt analyseras med hjälp av beräkningsprogram vid 4- och 8-veckors tidspunkter. En optimerad process för att fixa, fläcka, bild och tydliga VHSEs för volymetrisk undersökning beskrivs. Denna omfattande modell, avbildning och analystekniker är lätt anpassningsbara till de specifika forskningsbehoven hos enskilda laboratorier med eller utan tidigare HSE-erfarenhet.

Introduction

Människans hud utför många viktiga biologiska funktioner inklusive att fungera som en immun / mekanisk barriär, reglera kroppstemperaturen, delta i vätskeretention och sensoriskaroller 1,2,3,4. Anatomiskt är huden det största organet i människokroppen och består av tre huvudskikt (epidermis, dermis och hypodermis) och har ett komplext system av stromala, vaskulära, körtelformade och immuna / nervsystemet komponenter förutom epidermal celler. Epidermis består av fyra lager av celler som kontinuerligt förnyas för att upprätthålla barriärfunktionen och andra strukturer av inhemsk hud (dvs. svett och talgkörtlar, naglar)3. Hudfysiologi är viktigt i immunfunktion, sårläkning, cancerbiologi och andra områden, vilket leder forskare att använda ett brett spektrum av modeller, från in vitro monokulturer till in vivo djurmodeller. Djurmodeller erbjuder förmågan att studera den fulla komplexiteten i hudens fysiologi, men vanliga djurmodeller som möss har betydande fysiologiska skillnader jämfört med människor5. Dessa begränsningar, och den ökade kostnaden för djurmodeller, har fått många forskare att fokusera på att utveckla in vitro-modeller som närmare återspeglar fysiologin hos mänsklig hud1,6. Av dessa är en av de enklare modelltyperna den mänskliga epidermala motsvarigheten (HEE; även kallad halvtjockleks hudmodeller) som endast består av epidermala keratinocyter på en acellulär dermal matris, men fånga epidermal differentiering och stratifiering sett i vivo. Med detta på detta kallas modeller som innehåller hud- och epidermala komponenter (keratinocyter och fibroblaster) ofta mänskliga hudekvivalenter (HSE), hudmodeller med full tjocklek eller organotypiska hudkonstruktioner (OSC). Kortfattat genereras dessa modeller genom att kapsla in hudceller i gelmatriser och så epidermala celler ovanpå. Epidermal differentiering och stratifiering kan sedan uppnås via specialiserade medier och luftexponering7. Hudekvivalenter har oftast genererats genom självmonteringstekniker med hudgeler av kollagentyp I (antingen av råttsvans eller nötkreaturshudursprung)1,8, men liknande modeller har införlivat andra matriskomponenter som fibrin9,10, fibroblast härledd11,12, cadaveric de-epidermized membran13,14,15,16, kommersiellt tillgängliga geler och andra1,12,13,17,18,19. För närvarande finns det hudekvivalenter kommersiellt tillgängliga (som tidigaregranskats 1,2). Dessa är dock främst utvecklade för terapeutiska ändamål och kan inte enkelt anpassas till specifika forskningsfrågor.

HSE har tillämpats i studier av sårläkning, ympning, toxikologi och hudsjukdom / utveckling11,12,13,16,8,20,21,22,23. Även om 3D-kulturen mer omfattande modellerar funktioner av mänsklig vävnad jämfört med 2D-kulturer24,möjliggör införandet av olika celltyper som mer exakt återspeglar in vivo-populationen studier av cellcellskoordinering i komplexavävnader 24,25,26. De flesta HSE inkluderar endast dermala fibroblaster och epidermala keratinocyter27, även om in vivo hudmiljön innehåller många andra celltyper. Nyligen genomförda studier har börjat inkludera fler cellpopulationer; dessa inkluderar endotelceller i vaskulatur10,28,29,30,31,32,33,34,adipocyter i subkutanvävnad 35,36,nervkomponenter19,21, stamceller27,37,38,immunceller10,39,40,41,42,och andra sjukdoms- / cancerspecifika modeller16,40,43,44,45,46,47. Särskilt viktigt bland dessa är vaskulatur; medan vissa HSE inkluderar vaskulär celler, totalt sett saknar de fortfarande omfattande kapillärelement med anslutning över hela dermis10,29 , utökad in vitro stabilitet28, och lämplig fartygstäthet. Vidare utvärderas HSE-modeller vanligtvis genom histologiska sektioner efter kulturen som begränsar analysen av HSE: s tredimensionella struktur. Tredimensionell analys möjliggör volymetrisk bedömning av vaskulär densitet48,49 samt regional variation av epidermal tjocklek och differentiering.

Även om HSE är en av de vanligaste organotypiska modellerna, finns det många tekniska utmaningar med att generera dessa konstruktioner inklusive identifiering av lämplig extracellulär matris och celltäthet, medierecept, korrekta luft flytande gränssnitt förfaranden och post-culture analys. Medan HEE- och HSE-modeller har publicerat protokoll finns det inte heller något detaljerat protokoll som innehåller dermal vaskulatur och volymetrisk avbildning snarare än histologisk analys. Detta arbete presenterar ett tillgängligt protokoll för kulturen av vascularized människahudekvivalenter (VHSE) från främst reklamfilm cellinjer. Detta protokoll är skrivet för att vara lätt anpassningsbart, vilket möjliggör rak anpassning till olika celltyper och forskningsbehov. För tillgänglighets-, tillgänglighets- och kostnadsintressets intresse prioriterades användningen av enkla produkter och produktionstekniker framför användningen av kommersiellt tillgängliga produkter. Vidare beskrivs enkla volymetriska avbildnings- och kvantifieringsmetoder som möjliggör bedömning av VHSE: s tredimensionella struktur. Genom att översätta detta förfarande till ett robust och tillgängligt protokoll kan icke-specialiserade forskare tillämpa dessa viktiga modeller inom individanpassad medicin, kärlvävnadsteknik, transplantatutveckling och läkemedelsutvärdering.

Protocol

1. Förberedelse för 3D-kultur

  1. Förbered råttsvans kollagen lager vid 8 mg/ml, med hjälp av etableradeprotokoll 50,51,52. Alternativt kan råttsvans kollagen köpas från leverantörer (se materiallista) vid lämpliga koncentrationer.
    OBS: Kollagen kan beredas eller köpas i olika koncentrationer i intervallet 3-10 mg/ml, eller högre50,51,52. Beräkningarna i protokollet förutsätter en koncentration på 8 mg/ml men kan justeras utifrån forskarens behov.
  2. Expandera cellinjer: Endotel- och fibroblastceller måste vara redo för sådd i början av 3D-kollagendermal komponentgenerering (steg 2). Keratinocyter måste vara redo på dag 7 av 3D-kulturen. En komplett VHSE-konstruktion kräver 7,5 x10 5 endotelceller; 7,5 x 104 fibroblaster; och 1,7 x 105 keratinocyter för produktion (tabell 1).
    OBS: Dessa densiteter är lämpliga för 12-brunnsstorlek permeabla vävnadskulturinsatser eller motsvarande. Celltäthet och format kan skalas upp eller ner baserat på forskarens behov. För att klargöra, denna mängd endotel och fibroblast celler kommer att så 1-3 dermal komponenter, medan varje epidermal komponent kräver 1,7 x 105 keratinocyter.
  3. Utför all cellcentrifugering i detta protokoll i 5 min vid 300 x g, men detta kan minskas för mer bräckliga celltyper.

2. Generering av 3D-kollagendermal komponent

OBS: Steg 2 är en tidskänslig procedur och måste slutföras i en inställning. Det rekommenderas att slutföra en kvalitetskontroll av kollagenbeståndet för att säkerställa korrekt gelering och homogenitet innan du börjar dermal komponent sådd, se felsökning i diskussion.

  1. Acellulär kollagenskiktsberedning och sådd
    1. Förbered två 1,7 ml-kapade mikrocentrifugrör, ett för acellulärt stöd och ett för cellulär dermis. Mängder som ges i detta steg kommer att förbereda 1 ml 3 mg/ml kollagen (målkollagekoncentration), tillräckligt för (3) 12-brunns VHSEs. Ekvationer listas om justering är nödvändig. Både volym och densitet kan skalas utifrån forskarens behov (gemensamma referensnummer anges i tabell 2).
    2. Tillsätt 100 μL kulturkvalitet 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (ett rör ger 3 VHSE) och tillsätt 8,6 μL 1 N NaOH. Placera täckta rör på våt is för att kyla i minst 10 minuter.
      Cs = Kollagen lagerkoncentration
      Vf = Slutlig volym kollagen behövs
      Ct = Koncentration av kollagen
      Vs = Volym av lagerkollage som är nödvändig för önskad mängd (Vf)
      Vpbs = Volym på 10X PBS som behövs för målkollagekoncentration (Ct)
      VNaOH = Volym på 1N NaOH behövs för Ct
      V-media = Medievolym, samtalsavstängning eller ddH2O behövs för Ct
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
    3. Förbered 1000 och 250 μL pipetter med positiv deplacement för användning och ställ åt sidan. Eftersom senare steg är tidskänsliga är det bekvämt att ladda pipettspetsar och ställa in volymer (375 μL respektive 125 μL). Ställ dessutom in en normal 1000 μL pipett för 516 μL.
      OBS: Pipetter med positiv deplacement kan vid behov ersättas med vanliga pipetter, men på grund av kollagenets höga viskositet och tids-/temperaturkänsligheten för detta förfarande rekommenderas positiva deplacementpipetter för att ge konsekventa såddresultat. Om du använder vanliga pipetter, använd långsamma rörelser.
    4. Förbered odlingskär välplattor: Använd sterila tångar för att placera tre 12-brunns kulturinsatser i en steril 12-brunns vävnadskulturplatta, placera i mittenkolonnerna.
    5. Ange kalla medier som är lämpliga för fibroblast och endotelcellstyper.
    6. Efter kylning av kapsejsade rör, placera ett rör (för acellulärt stöd) på ett rack med innehållet synligt. Lämna det andra röret (för cellulära läderhudar) på is.
    7. Ta bort 8 mg/ml kollagenlager från kylning och lägg det på våtis.
      OBS: Använd inte frysis eller -20 °C bänkkylare, eftersom detta fryser kollagenet.
    8. Tillsätt 516 μL media och tillsätt omedelbart 375 μL kallt kollagen med hjälp av 1000 μL pipett med positiv deplacement. Dispensera kollagen i lösningen (inte på sidan av röret). Ta omedelbart bort den tomma pipettspetsen och byt till den beredda 250 μL-pipetten för positiv deplacement som ska blandas.
      1. Blanda snabbt men försiktigt för att förhindra bubbelbildning, ta inte bort spetsen från lösningen, om möjligt. Blanda tills lösningen är av homogen färg, vilket vanligtvis tar ca 5 pipettcykler eller 10 s (om du använder media med fenolrött blir färgen ljusare och enhetlig). Vid blandning, var noga med att dra från olika positioner av röret (botten och toppen) för enhetlig blandning.
        OBS: Detta kan utföras med 516 μL cellkulturvatten eller annan cellkulturklassad vätska, men fenolrött av de flesta medier är en bra indikator på blandningen. Använd antingen fibroblast eller endotel media som användes för 2D-expansioner.
    9. Sprid omedelbart 125 μL acellulärt kollagen på membranet i var och en av de tre 12-brunnskulturinsatserna. För att säkerställa enhetlig täckning av den acellulära kollagengelen, rocka skålen; Om det inte skapar enhetlig membrantäckning, använd pipettspetsen för att i huvudsak måla membranet genom att försiktigt sprida kollagen runt; undvik att trycka på membranet. Gelation börjar nästan omedelbart; utföra detta steg snabbt för att säkerställa jämn täckning.
      OBS: Det kommer att finnas överskott av acellulärt kollagen. Volymen kan dock minskas, förbereder mindre än 1 ml kollagen suspension kan resultera i svårigheter att blanda lösningen och otillräcklig gelering.
    10. Flytta omedelbart 12-brunnsplattan till en 37 °C cellkulturinkubator för att låta den gel i minst 20 min (acellulärt kollagen kan gel längre om det behövs; under denna geleringstid, fortsätt till steg 2.2). Ta bort kollagenfjädringen från isen och placera tillbaka i kylning (kollagenet är mest stabilt vid 4 °C).
  2. Cellfjädring & såddberedning
    OBS: För kulturtidslinjen för detta protokoll motsvarar detta Submersion Day 1 (SD1)
    1. Under gelering av acellulära kollagen stöd, trypsinize och räkna endotel och fibroblast cellinjer.
    2. Suspendera 7,5 x 105 endotelceller och 7,5 x 104 fibroblaster i 258 μL av deras respektive medier och kombinera cellupphängningar för att skapa en 516 μL alikvot. Håll cellupphängningen på våt is tills den används.
    3. Förbered 1000 och 250 μL pipetter med positiv deplacement för användning och ställ åt sidan. Eftersom senare steg är tidskänsliga är det bekvämt att ladda pipettspetsar och ställa in volymer (375 μL respektive 250 μL). Ställ dessutom in en normal 1000 μL pipett för 516 μL.
  3. Cellbelastad kollagenfröning av dermala fack
    1. Efter gelationsperioden, ta bort 12 brunnsplattan av acellulärt kollagen från inkubatorn.
      OBS: Om detta kollagen inte är gelled efter 30 min, fortsätt inte proceduren eftersom det sannolikt var ett misstag under sådd eller kollagen beståndet kan ha ett problem (se felsökning i diskussion).
    2. Ta bort det 1,7 ml kapade röret från våt is (innehåller 10x PBS och NaOH). Placera röret i ett rack så att innehållet är synligt. Lossa/öppna alla lock (cellfjädring, kallt rör).
    3. Ta bort lagerkolagen (8 mg/ml) från 4 °C kylning och placera det på våt is. Lämna locket öppet.
    4. Tillsätt 516 μL kyld cellfjädring i det kalla täckta röret. Använd 1000 μL pipett med positiv deplacement för att omedelbart pipett 375 μL kall kollagenlösning direkt i lösningen av det kapade röret.
    5. För ut allt kollagen från pipetten i röret och kassera pipettspetsen med positiv deplacement. Byt omedelbart till 250 μL pipett med positiv deplacement och blanda kollagenlösningen.
    6. Blanda kollagenlösningen som färdigställd tidigare (snabbt men försiktigt för att förhindra bubbelbildning), ta inte bort spetsen från gelen om möjligt. Blanda tills lösningen är homogen (ca 5 pipettcykler eller 10 s). Vid blandning, var noga med att dra från olika positioner av röret (botten och toppen) för enhetlig blandning.
    7. När den har blandats, överför omedelbart 250 μL cellulär kollagenlösning till de acellulära kollagenstöden i var och en av de tre 12-brunnskulturinsatserna. För att säkerställa en enhetlig täckning av det acellulära kollagenstödet, gunga skålen och/eller använd pipetten för positiv deplacement för att försiktigt flytta runt det nysådda cellulära kollagenet utan att störa det acellulära skiktet.
    8. Flytta omedelbart 12-brunnsplattan till 37 °C cellkulturinkubator för att låta den gel i minst 30 min. Placera kollagenet i kylning vid 4 °C efter användning.
    9. Efter 30 minuters geltid, luta försiktigt plattan för att bedöma gelationen. Se till att kollagenet stelnat.
    10. Tillsätt 500 μL respektive 1000 μL blandningsmedier (halv endotel och hälften fibroblastunderhållsmedier) i skärets övre kammare respektive nedre kammare (ovantill först, sedan nedtill för att förhindra att hydrostatiskt tryck trycker upp kollagen). Tillsätt media långsamt till sidan av brunnen, inte direkt på kollagengelen, för att minimera störningar i kollagenet.
      1. Se till att kollagengelen är nedsänkt, tillsätt mer media om det behövs. Placera brunnsplattan i cellinkubatorn för inkubation över natten. I detta skede innehåller media 10% FBS; Det normala underhållsmedierna för varje cellinje (tidslinje och schematiskt enligt figur 1,A).
        OBS: Media i hela VHSE-kulturen kan anpassas för anpassade celltyper; viss optimering kan vara nödvändig.
  4. Medieförändring under nedsänkning dag 2 (SD2)
    1. Ändra 10% FBS-media i VHSE-brunnar till 5% FBS halvfibroblast, halv endotelmedia kompletterat med 100 μg/ml L-askorbinsyra. Tillsätt 500 μL till kulturinsatsens övre kammare vid sidan av brunnen (tillsätt försiktigt till sidoväggen för att minimera störningar i kollagenet) och tillsätt 1000 μL till nedre kammaren.
    2. Förnya media varannan dag (SD4 och SD6) tills nedsänkningsdag 7 (SD7).
    3. Använd en manuell pipett för att ta bort media från brunnarna. Att använda en aspirator är möjligt men kan leda till skador eller förstörelse av konstruktionen.
      OBS: L-askorbinsyra måste vara färsk var 2-3 dagar (den oxiderar i lösning för att producera väteperoxid således, vilket inducerar oxidativ stress och så småningom cellulära skador53). Således måste media ändras var 2-3 dagar från SD2 till slutet av VHSE-kulturen eftersom L-askorbinsyra är närvarande. Det är lättast att göra ett lager av media och lägga till en nylagad mängd L-askorbinsyra till ett media alikvot varje utfodringsdag. Använd kulturklassat vatten eller media som lösningsmedel och fram tillsätta färsk L-askorbinsyra vid 100 mg/ml. L-askorbinsyra stimulerar kollagensyntesen genom fibroblaster i lämplig takt och främjar kollagenstabilitet54,55,56; det minskar också endotelpermeabilitet och upprätthåller kärlväggens integritet56,57 och bidrar dessutom till epidermal barriärbildning6,58.

3. Sådd av epidermal komponent och stratifiering induktion

  1. Nedsänkning dag 7 (SD7): frö keratinocyter
    OBS: Frö keratinocyter för att fastställa epidermis på SD7. Denna tidpunkt kan flyttas baserat på forskarens behov. Varaktigheten av nedsänkningskultur utan keratinocyter bör inte överstiga 9 dagar, eftersom en längre nedsänkning ofta leder till ökad dermal sammandragning. Om sammandragning sker före SD7 rekommenderas att förkorta nedsänkningsperioden till 5 dagar och frö epidermis på SD5. Optimera nedsänkningsperioden efter behov för specifika experiment (se felsökning i diskussion).
    1. Kultur keratinocyter (N/TERT-120,59 eller andra lämpliga celler) till deras confluency gräns innan trypsinization och sådd på VHSEs. För N/TERT-1-celler bör sammanflödet inte signifikant överstiga 30% för att förhindra osökt differentiering av keratinocyter i 2D-kultur59. För andra lämpliga cellinjer, såsom primära humana epidermala keratinocyter, används en sammanflödesgräns på 75-80% i allmänhet60.
    2. Efter trypsinisering, räkna och suspendera 510 000 celler i 600 μL human hudekvivalenter (HSE) Differentieringsmedier kompletterade med 5% FBS (Tabell 1).
      OBS: 510 000 celler i 600 μL tillåter 170 000 celler/konstruktion vid sådd av 200 μL per konstruktion (3 VHSE).
    3. Använd en manuell pipett, samla och kassera media som för närvarande finns i botten och översta kammaren för varje konstruktionsbrunn. Var noga med att samla så mycket media som möjligt. Samla upp media som kan fastna direkt under det genomsläppliga membranet genom att försiktigt placera pipettspetsen under odlingsinsatsmembranet och tillfälligt slå ut insatsen på plats. Media kan ha fastnat på grund av ytspänning. Se till att skären sitter platt i sina brunnar innan du fortsätter. Att använda en aspirator är möjligt men kan leda till skador eller förstörelse av konstruktionen.
    4. Tillsätt 1 ml HSE-media kompletterat med 5% FBS till den nedre kammaren i varje brunn. Tillsätt sedan 200 μL cellfjädring till den övre kammaren i varje brunn. Frö direkt på dermala konstruktionsytan. Låt keratinocyter nöja sig med 2 h i inkubatorn.
    5. Två h efter sådd av keratinocyterna, tillsätt försiktigt 300 μL HSE-media kompletterat med 5% FBS till den övre kammaren i varje konstruktionsbrunn; långsamt pipett media på sidan av kulturinsatsen. Ladda media i den övre kammaren mycket noggrant för att inte störa sedimenterade keratinocyter som kanske inte har klivit tätt mot den underliggande kollagengelen ännu.
    6. När du har laddat mediet placerar du tillbaka konstruktionen i inkubatorn.
  2. Nedsänkningsdag 8/9 (SD8 eller SD9)
    1. Utgör HSE-media kompletterat med 1% FBS och 100 μg/mL L-askorbinsyra.
    2. Ta bort media från både de övre och nedre kamrarna med en manuell pipetor.
    3. Tillsätt först 500 μL-media i den övre kammaren och sedan 1 ml i den nedre kammaren. (Det här steget kan göras på SD8 eller SD9)
  3. Nedsänkningsdag 9/10 (SD9 eller SD10, detta bör vara dagen efter steg 3.2)
    1. Sminka serumfria HSE-differentieringsmedier med 100 μg/ml L-askorbinsyra.
    2. Ta bort media från både de övre och nedre kamrarna med en manuell pipetor.
    3. Ladda 500 μL i den övre kammaren och 1 ml i den nedre kammaren.
  4. Luft-flytande gränssnitt dag 1 (ALI1)
    OBS: ALI utförs dagen efter steg 3.3.
    1. Lyft varje konstruktion till luft-flytande gränssnitt (ALI) genom att endast avlägsna medieavfall från den övre kammaren. Använd en manuell pipett för att komma så nära epidermalskiktet som möjligt utan att röra eller skada det.
    2. Luta plattan något i olika vinklar för att samla in mediet. Ta bort så mycket media som möjligt i det här steget. Tillsätt cirka 2 ml sterilt vatten till de omgivande brunnarna i plattan för att upprätthålla jämn fuktighet; hålla brunnarna fyllda med vatten i hela kulturen.
    3. Kontrollera plattan några timmar senare för att se till att keratinocyterna fortfarande är vid det luft-flytande gränssnittet. Om det finns media i den övre kammaren ta bort det. Håll reda på hur mycket media som tas bort för varje VHSE-brunn (Den ursprungliga volymen av övre och nedre kammare (1500 μL) - media borttaget = en bra utgångspunkt för ALI-utfodring).
      OBS: VHSEs kräver inte nödvändigtvis samma medienivå för lufthiss; vanligtvis om VHSEs sås ihop behöver de ungefär samma medienivå för luftlyft, men så är inte alltid fallet. Justera volymerna efter behov för att bibehålla ALI men se till att medienivåerna inte är så låga att VHSEs torkar ut. Det är säkrare att vara försiktig och ta bort små mediemängder dagligen tills en balans mellan luftlyft och hydrering har uppfyllts.
  5. ALI dag 2 (ALI2)
    1. Från och med nu får endast serumfria HSE-medier kompletteras med 100 μg/ml L-askorbinsyra. Byt media på ALI Dag 2 (ALI2). Om det finns media i den övre kammaren tar du bort det och lägger till det till mängden borttagna media som spelats in tidigare. Beräkna den medievolym som behövs med hjälp av ekvationen i föregående steg. Till exempel: Om 200 μL media togs bort från den övre kammaren ska du lägga till 1300 μL för att fastställa ALI (som 1500 μL - 200 μL = 1300 μL)
    2. Använd volymen som beräknas för att laddas i bottenkammaren i varje brunn och placera sedan plattan tillbaka i cellinkubatorn. Håll koll på den volym som används per dag. Vid användning av de rekommenderade kollagenmängderna i 12-brunnskulturinsatser faller det vanliga intervallet av ALI-värden mellan 750 μL och 1300 μL. Vanligtvis minskar volymen över odlingsmognad och blir konsekvent runt vecka 2/3 av ALI. Beroende på kulturspecifikationerna kan detta tal ändras och optimeras (enligt beskrivningen i 3.4.2 - 4.1).

4. Rutinmässigt underhåll av vaskulär mänsklig hudekvivalent

  1. Från ALI dag 3 (ALI3) till odlingsslutpunkt: Förnya media i den nedre kammaren var 2-3 dagar med serumfria HSE-medier med 100 μg/ml L-askorbinsyra. Fortsätt att justera och spåra den medienivå som behövs i den nedre kammaren för ALI enligt beskrivningen i steg 3.5.2.
  2. Eftersom epidermalytan måste hålla kontakten med luften, kontrollera och justera medienivån dagligen tills konsekventa ALI-nivåer har fastställts. Det epidermala skiktet ska se hydratiserat ut, inte torrt, men det bör inte finnas media som slås ovanpå konstruktionen. Kulturer med 8 veckors ALI har gett den mest konsekventa morfologin och uttrycket; Beroende på ansökan kan dock kulturer på 4 till 12 veckor vara lämpliga. Kulturtiden för olika cell- och kulturförhållanden kan behöva optimeras.
    OBS: Att byta media måndag, onsdag, fredag är en bra praxis. VHSEs är friska under helgen, men media bör ändras tidigt på måndag och sent på fredag. Efter att helt ha slutfört steg 1-4 är generationen av en VHSE klar. Steg 5-änden av protokollet är valfria bearbetnings- och avbildningstekniker som har optimerats för den här typen av 3D-konstruktion.

5. Fixering och permeabilisering av 3D-konstruktioner

OBS: Steg 5 har optimerats för bildtekniker som är specifika för denna 3D-konstruktion som beskrivs i resten av protokollet. Följande steg är inte nödvändiga för att generera en VHSE.

  1. Fixering/permeabilisering
    1. Ta försiktigt bort alla medier från övre och nedre kamrarna i varje brunn vid kulturperiodens slutpunkt.
      OBS: Epidermalskiktet är möjligen bräckligt, hantera med försiktighet och omrör inte epidermis med aggressiv pipetting.
    2. Tillsätt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 6.9) till den övre kammarväggen (inte direkt på konstruktionen) och sedan till den nedre kammaren för att förfixera varje konstruktion. Tillsätt 1 ml per kammare och exponera i 5 min vid rumstemperatur.
      VARNING: PFA är farligt och bör hanteras varsamt och lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), inklusive ögonskydd.
    3. Ta bort 4% PFA-lösning efter 5 min och tillsätt 0,5% Triton X 100 i 4% PFA-lösning till de övre och nedre kamrarna enligt beskrivningen i föregående steg. Exponera i 1 timme vid rumstemperatur; VHSE-konstruktion kräver inte en steril miljö från och med nu.
    4. Efter 1 timme, ta försiktigt bort permeabiliserings- / fixeringslösningen från båda kamrarna och tvätta provet 3 gånger med 1x PBS.
    5. Förvara prover i PBS i kylning vid 4 °C eller fläcka omedelbart. För att lagra proverna, linda in skålen i en plastfolie och sedan folie för att minimera avdunstning och ljusexponering
      OBS: Pauspunkt - Efter fixering och permeabilisering kan denna procedur pausas eftersom proverna är stabila i flera veckor om de bereds enligt steg 5.1.5. Alternativt kan färgning (enligt beskrivningen i steg 6) slutföras omedelbart efter steg 5.

6. Immunofluorescerande färgning av 3D-konstruktioner

  1. Konstruera förberedelse
    OBS: VHSEs färgar väl när de separeras från poröst membran i odlingsinsatsen; separation från membranet är också nödvändigt för obstruktion av avbildning och möjliggör minskade volymer för färgning.
    1. För att förbereda konstruktionen för immunofluorescerande färgning, vänd ett skär upp och ner och placera det över brunnen på brunnsplattan (om VHSE faller, kommer det att falla i brunnen med PBS) (Kompletterande figur 1A).
    2. Stabilisera insatsen med en hand över brunnen samtidigt som du använder fina spetstångar och/eller en precisionskniv för att skära ungefär hälften av skärmembranets omkrets. Skär så nära plasthöljet som möjligt med en skonsam hand för att förhindra skador på VHSE-konstruktionen.
    3. Använd de fina spetstångarna, ta tag i kanten på den skurna membranluckan och skala försiktigt det porösa membranet från insatsen samt VHSE-konstruktionen. Gör detta mycket noggrant och långsamt för att förhindra skador på VHSE-konstruktionsstrukturen. Om VHSE-konstruktionen separerar lätt bör den falla in i brunnen nedan, om den fastnar på sidan av kammaren, använd sedan de fina spetstångarna eller en liten scoopula för att flytta den till brunnen. Var mycket uppmärksam på epidermalskiktet eftersom det vanligtvis är bräckligt(kompletterande figur 1A).
      OBS: Ibland lossnar membranet inte lätt eller lossnar i bitar, om detta händer använd verktygen för att försiktigt dra isär membranet och VHSE-konstruktionen. Se till att VHSEs inte torkar ut under denna process genom att doppa i PBS, om det behövs.
    4. När VHSE är i brunnen, kassera eventuella återstående delar av insatsmembranet och håll kulturinsatshuset i varje brunn för att hålla VHSEs i nedsänkt position under färgning.
  2. Färgning
    OBS: Färgning och tillhörande hantering/manipulering och tvättar bör utföras så försiktigt som möjligt eftersom VHSEs kan vara bräckliga. Om delar av epidermis lyfter kan bitarna färgas separat; övre lagren av epidermis är bräckliga och går igenom naturlig desquamation4, men för analys är det viktigt att upprätthålla integriteten så mycket som möjligt.
    1. Förbered de valda primära antikroppsfläckarna i 700 μL blockeringsbuffert per konstruktionsbrunn (vanligtvis kan alla primära antikroppar vara i samma färglösning, men detta bör bekräftas för nya antikroppar). 700 μL fungerar för 12-brunnsstorlek, men kan justeras för andra odlingsformat. Rekommenderade koncentrationer av primära och sekundära antikroppar med blockerande buffertrecept ges i tabell 3 (optimering kan krävas).
    2. Ta bort eventuell PBS från brunnen med en manuell pipett, var noga med att pipettera bort från VHSEs (eftersom VHSEs flyter rekommenderas inte vakuumambition).
    3. Tillsätt den primära fläcklösningen till varje brunn och placera odlingsinsatshuset i brunnen för att hålla VHSE nedsänkt i vätska (Kompletterande figur 1B). Linda brunnsplattan med plastfolie. Folie och fläck i 48 timmar i 4 °C kylning utan omrörning eller gungning (gungning kan skada VHSE-konstruktionen).
    4. Efter 48 timmar bereda sekundära antikroppar och kemiska fläckar i 700 μL blockeringsbuffert (per brunn).
    5. Ta bort odlingsinsatshuset och den primära fläcklösningen och tvätta med 1x PBS, 3x i 5 minuter innan du lägger till den sekundära fläcklösningen. Placera kulturinsättningshuset tillbaka i brunnen för att hålla VHSE-konstruktionen nedsänkt(kompletterande figur 1B). Exponera i 48 timmar i 4 °C kylning utan omrörning eller gungning.
    6. Efter 48 h exponering, ta bort fläcklösningen med en manuell pipetor och tvätta försiktigt 3x med PBS; Rör inte pipettvätska rakt på VHSE eftersom de kan vara bräckliga. Återfukta med överskott PBS och placera kulturinsatshuset tillbaka i brunnen för att hålla VHSE nedsänkt och hydratiserad under lagring (lagra genom att linda in plastfolie och folie för att minimera avdunstning och ljusexponering)
  3. Clearing (tillval & terminal)
    OBS: Röjning är valfritt för avbildning. Om det är klart bör det göras efter färgning/avbildning provet helt eftersom röjning förhindrar ytterligare färgning, kan ändra fluorforprestanda och kan skada VHSE-strukturen. Flera vävnadsrensningsmetoderfinns 49,61,62 och kan optimeras för specifika projekt. Metylsalicylat clearing, beskrivs nedan, är både enkel och effektiv för VHSE. Följande röjningsteknik måste slutföras i glasbehållare och pipettspetsarna måste vara glas eller polypropylen (polystyren löses upp i kontakt med metylsalicylat). Slutför alla clearingprocedurer i ett välventilerat område eller rökhuv.
    1. Tillsätt 100% metanol till en liten grund glasbehållare (petriskålar i glas fungerar bra). Använd minsta möjliga behållare som passar konstruktionen (för att minimera reagensavfall).
    2. Ta bort konstruktionen från brunnsplattan med tång/skopa (Kompletterande figur 1C) och placera den i den metanolfyllda behållaren. Tillsätt mer metanol om konstruktionen inte är nedsänkt.
    3. Torka ut VHSE-konstruktionen i metanol i 3 x 10 min nedsänkningar; helt ersätta metanol efter varje nedsänkning och omedelbart ta bort metanol efter det sista badet. Under denna procedur kan konstruktionen bli mer ogenomskinlig och krympa något.
      OBS: Dessa varaktigheter och upprepningar har optimerats men metanol och följande metylsalicylatprocedurer kan behöva anpassas, beroende på det specifika odlingsformatet och fläckarna.
    4. Omedelbart efter avlägsnande av metanol, tillsätt metylsalicylat och sänk ner VHSE i 5 x 5 min nedsänkningar. Byt ut reagenset helt efter varje nedsänkning och lämna VHSE i den 5: e nedsänkningslösningen för lagring. Under denna procedur blir konstruktionen transparent.
    5. Avbilda konstruktionen eller förvara vid 4 °C. Efter klarering, slutför all avbildning så snart som möjligt, eftersom fluorforerna kan försämras i metylsalicylat inom några dagar. Röjning gör att konstruktionerna blir spröda och den utökade lagringen, även om den inte rekommenderas, behöver en regelbunden kontroll för att säkerställa att det finns en tillräcklig mängd metylsalicylat.

7. Konfokal avbildning av 3D-konstruktioner

OBS: Avbildning genom mjukpapperskulturplast ger inte samma bildkvalitet som avbildning genom täckglas, denna metod beskriver tillverkning av en anpassad glasbottenbrunn för att förhindra torkning under konfokal avbildning. Vanligtvis är detta tillräckligt för minst 3 h avbildning.

  1. Två dagar före avbildning: förbereda polydimethylsiloxane (PDMS)
    1. Förbered PDMS48,63,64 vid en föreslagen koncentration av [9:1], bas: tvärlänk. Förbered 30 g PDMS totalt: 27 g baskomponent och 3 g tvärlänk. Placera alla rena blandningskärl på en vågbalans och tjära vågen. Tillsätt basen (27 g) och tillsätt sedan tvärlänken (3 g) för att uppnå totalt 30 g. Lägg alltid till bas före korslänk.
    2. Rör om lösningen kraftigt i minst 4 minuter; detta kommer att skapa små bubblor. Häll PDMS i en 100 mm Petri-skål efter tillräcklig blandning eller liknande platt bottenvärmebeständig behållare.
    3. Avgasa PDMS i en vakuumkammare tills alla bubblor från blandning försvinner och PDMS är klart. Släpp vakuumet långsamt och ta bort PDMS (långsamt). Placera skålen i en ugn för att härda över natten (50-60 °C); se till att skålen sitter platt för PDMS att bota jämnt.
      OBS: Efter härdning bör PDMS vara klart och ytan ska vara jämn och inte klibbig (klibbighet kan indikera otillräcklig blandning).
  2. En dag före avbildning: PDMS välpreparering
    1. Använd en stålslags- eller handhållen precisionskniv, stansa eller skär ut en cirkulär brunn från PDMS-arket som är förberett i 7.1. Brunnen ska vara ungefär lika stor som VHSE-konstruktionen. Klipp en fyrkantig patch runt den cirkulära brunnen för att skapa en enda PDMS-brunn. Den beredda PDMS-mängden på 30 g bör ge minst fyra anpassade brunnar.
      PDMS-brunnen måste vara nära storleken på VHSE-konstruktionen. Det måste begränsa provrörelsen under avbildningen. Flera brunnar kan tillverkas samtidigt och lagras på obestämd tid i en ren behållare.
    2. Använd ett glaslock av liknande storlek som PDMS-brunnen, tillsätt cyanoakrylatlim (t.ex. superlim) till PDMS bottenyta (den släta ytan som var i kontakt med Petri-skålen) och smeta jämnt med en engångspipettspets. Centrera och tryck PDMS väl på glaset samtidigt som du lämnar ett tydligt glasfönster i den stansade cirkeln (se till att limet inte smutsas över visningsfönstret).
      OBS: Om tillgängligt är plasmabindning av PDMS till täckglaset ett alternativ65,66,67.
    3. Låt limet torka i flera timmar, eller över natten, innan du använder det. Dessa kan återanvändas tills de bryts från normalt slitage.
      OBS: Det rekommenderas inte att färga proverna i det limmade PDMS som används väl för avbildning. Dessa brunnar håller vätska i flera timmar men kan läcka under längre färgning.
  3. VHSE-avbildning
    OBS: Om avbildningen är otydlig använder du PBS som bildlösning. Om du avbildar med godkända prover, använd metylsalicylat (eller den valda clearinglösningen) som avbildningslösning.
    1. Tillsätt några droppar bildlösning i PDMS-brunnen och kontrollera om det finns en läcka , reparera den med en punkt / utstryk av cyanoakrylat superlim eller använd en annan brunn).
    2. Förvara avbildningslösningen i PDMS väl när du lägger till VHSE. Använd skopa eller finspetstångar (Kompletterande figur 1C), ta bort konstruktionen från 12-brunnsplattan och placera i PDMS-brunnen på glaslocket. Placera konstruktion med intresseorienteringen vänd mot målet. För att till exempel avbilda epidermis med ett inverterat mikroskop, se till att epidermis är vänd nedåt, mot glaset.
      1. Alternativt, för ett upprätt mikroskop, vänd epidermis upp. Nedanstående bildbehandlingsprocedurer beskrivs för ett inverterat mikroskop, men kan lätt anpassas för en upprätt.
        OBS: Var försiktig när du manipulerar VHSE för att undvika skador. Överför över brunnsplattan om VHSE faller. En böjd, platt spets scoopula är det enklaste sättet att överföra konstruktionen(kompletterande figur 1C).
    3. Se till att provet sitter platt i brunnen och att inga delar av epidermis eller dermis viks under provet. Om vikning sker, manipulera försiktigt provet med tång eller en scoopula; att lägga till extra bildlösning tillfälligt för att flyta VHSE kan hjälpa den att räta ut. Vikning eller rynkning av provet kan ses med ögat eller med hjälp av mikroskopet.
    4. Fyll brunnen med bildlösning, använd precis tillräckligt med vätska för att hålla provet hydratiserat; för mycket vätska kommer att flyta provet, vilket resulterar i rörelse under avbildning. Konstruktionen ska sitta på glasvisningsfönstret; test för rörelse genom att luta PDMS-brunnen. Om det finns rörelse, ta bort lite vätska; tillsätt och ta bort vätskedroppe klokt tills rörelsen stannar.
    5. Placera en glasrutschbana över brunnen för att minimera avdunstning under avbildning( Kompletterande figur 1D). För längre bildsessioner, kontrollera provet ofta för att säkerställa rätt vätskenivåer. Om den är tillgänglig kan en fuktad kammare under avbildning användas (även om det vanligtvis inte är nödvändigt).
    6. Placera provet på mikroskopstadiet och bilden genom glaslocksfönstret (Kompletterande figur 1D). Denna teknik möjliggör minst 3 h kontinuerlig konfokal avbildning, men återfuktningen av provet bör kontrolleras regelbundet, med avbildningslösning tillagd vid behov.
      OBS: Om provet rensas kommer metylsalicylat att bryta ner limet med tiden. Limbindningen som PDMS kan appliceras på ny plats mellan bildkörningar. eller provet kan överföras till nya brunnar regelbundet. I brunnar med plasmabindning kommer detta inte att vara ett problem.
    7. Efter avbildning, flyta provet med bildvätska så mycket som möjligt i brunnen. Använd en scoopula eller finspetstång för att överföra provet till dess lagringsbrunn. Utför överföringen över en brunnsplatta om provet faller.
    8. Varje PDMS-brunn och toppglaslock kan återanmörjas tills de går sönder. Rengör bottenglaset före avbildning, både inuti och utanför brunnen. Kontrollera alltid om det finns läckor och reparera med lim vid behov innan du återankar det.
    9. Lagra prover enligt beskrivningen i steg 6.3.6 och tillsätt PBS med några månaders mellanrum för att underhålla; Om proverna rensas, förvara i glas med metylsalicylat och kontrollera nivåerna regelbundet. Rensade prover kan försämras snabbt (inom några dagar) och bör avbildas så snart som möjligt.

Representative Results

Här presenteras ett protokoll för generering av in vitro vascularized mänskliga hud motsvarigheter (VHSE) med telomerase omvänd transkriptas (TERT) odödliga keratinocyter (N/TERT-120,59),vuxna mänskliga dermal fibroblaster (hDF) och mänskliga mikrovaskulära endotelceller (HMEC-1) (Figur 1). Dessutom framhävs den anpassningsbara karaktären av detta protokoll genom att också visa VHSE-generation och stabilitet när man använder allmänt tillgängliga lungfibroblaster (IMR90) istället för hDF. Genereringen av VHSE slutförs i steg 1-4, medan steg 5-7 är valfria slutpunktsbearbetnings- och bildteknik som har optimerats för dessa VHSE:er. Det är viktigt att notera att VHSEs kan bearbetas enligt specifika forskningsfrågor och steg 5-7 krävs inte för att generera konstruktionen. Volumetric imaging, analys och 3D renderingar slutfördes för att visa en volymetrisk analysmetod. Dessa volymetriska konstruktionsberednings- och bildframställningsprotokoll bevarar VHSE-strukturen på både mikroskopiska och makroskopiska nivåer, vilket möjliggör omfattande 3D-analys.

Karakterisering av epidermis och dermis visar lämpliga immunofluorescerande markörer för mänsklig hud i VHSE-konstruktionerna(figur 2,3). Cytokeratin 10 (CK10) är en tidig differentiering keratinocyte markör som vanligtvis markerar alla suprabasala lager i huden ekvivalenter18,30,68 ( Figur2). Involukrin och filaggrin är sena differentieringsmarkörer i keratinocyter och markerar de översta suprabasala skikten i hudekvivalenter12,30,68,69 ( Figur2). Ett långrött fluorescerande kärnfärgämne (se materialförteckning) användes för att markera atomkärnor i både epidermis och dermis, med överste IV som markerar dermis vaskulatur (figur 2, figur 3, figur 4). Epidermal källarmembran (BM) komponenter uttrycks inte alltid korrekt i HSE kulturer15,16; och Col IV färgning av BM observeras inte konsekvent med hjälp av detta protokoll. Forskningsfokuserade BM-komponenter och struktur skulle dra nytta av ytterligare medie-, cell- och bildoptimering14.

Även om konfokal avbildning genom huvuddelen av VHSE kulturer ofta ger högupplösta bilder som är tillräckliga för beräknings analys av dermis och epidermis, den beskrivna clearingmetoden möjliggör djupare vävnad imaging. Clearing förbättrar konfokalt laserpenetrationsdjup, och effektiv avbildning i VHSEs kan uppnås till över 1 mm för rensade prover (jämfört med ~ 250 μm för oklar). Den beskrivna clearingtekniken (metanoldehydrering och metylsalicylat) matchar tillräckligt brytningsindexet i hela VHSE-provvävnaden61. Clearing av VHSE möjliggör enkel avbildning genom hela konstruktionen utan manipulering (t.ex. omorientering av konstruktionen för att avbilda dermis och epidermis separat), (figur 3).

Volymetriska bilder möjliggör generering av 3D-rendering för att kartlägga vaskulaturen i varje konstruktion (figur 4). Kortfattat togs konfokala bilduppsättningar i dermal till epidermal orientering av flera undervolymer av VHSEs för att upptäcka Kollagen IV-fläck (märkning av kärlväggar) och atomkärnor (markerade med ett långt rött fluorescerande kärnfärgämne). Bildstaplar laddas i beräkningsprogram (se materiallista)och en anpassad algoritm (baserat på dessa källor 48,70,71,72,73,74,75) används för 3D-rendering och kvantifiering enligt beskrivningen tidigare48. Denna algoritm segmenterar automatiskt kärlkomponenten baserat på Col IV-fläcken. Den volymetriska segmenteringen skickas till en skelettiseringsalgoritm baserad på snabb marsch75,76,77. Skelettisering finner det definitiva centret för varje kol IV-märkt kärl och de resulterande uppgifterna kan användas för att beräkna kärrdiameter samt kärlfraktion (figur 4). Widefield fluorescerande mikroskopi är ett tillgängligt alternativ om laserskanningsmikroskopi inte är tillgänglig; Kärlnätverket och epidermis kan avbildas med bredfälts fluorescerande mikroskopi (Kompletterande figur 2). Tredimensionell kvantifiering är möjlig med hjälp av widefield imaging av VHSEs snarare än laser scanning mikroskopi, även om det kan kräva mer filtrering och dekonvolution av bilder på grund av out-of-plane ljus.

Figure 1
Figur 1: Schematisk tidslinje för vascularized mänsklig hud motsvarande generation. A) Visar progression av VHSE-modellen från 1) dermalt komponentsådd, 2) keratinocyt sådd på dermalkomponenten, 3) epitelstratifiering via luftvätska gränssnitt och kultur underhåll. Bearbetning efter odling och volymetrisk avbildning kan utföras vid kulturens slutpunkt. B) Kamerabilder av hDF VHSE makrostruktur i kulturinsatserna vid deras kultur slutpunkt, 8 veckor. Olika nivåer av sammandragning är normala för VHSE; sammandragning kan minskas som protokollet beskriver. (1 & 2) Mindre kontrakterade prover. (3 & 4) Mer kontrakterade prover ger fortfarande rätt hudelement. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Epidermal karakterisering via immunofluorescerande markörer. Alla bilder togs av VHSEs vid 8wk kultur tidspunkt via confocal mikroskopi. Motsvarande färgningsmetoder beskrivs i protokoll steg 6. Det finns lämpliga epitelmarkörer i både hDF VHSEs (vänster kolumn) och IMR90 VHSEs (höger kolumn). Involucrin och Filaggrin är sena differentieringsmarkörer av keratinocyter och visar att epidermis är helt stratifierad i båda VHSE-typerna. Cytokeratin 10 är en tidig differentieringsmarkör som identifierar suprabasala lager i VHSEs. Atomkärnor visas i orthogonala vyer i gult. En face och orthogonal max projektionsbilder återges via beräkningsprogram; Bilder skalas individuellt med bakgrundssubtraktion och medianfiltrering för tydlighet. Skalstänger är 100 μm. (Primära och sekundära antikroppar med internt blockerande buffertrecept anges i tabell 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Jämförelse av oklara kontra rensade VHSE. Denna VHSE genererades med IMR90s och bilder togs vid 4wk kultur tidspunkt via confocal mikroskopi. Kollagen IV visas i cyan; Atomkärnor visas i magenta; magenta i den rensade 3D-renderingen representerar konsolidering av atomkärnor i det epidermala skiktet i VHSE. Den oklara VHSE-bilden är ett exempel på laserdämpning i tjockare VHSE-konstruktioner, genom röjning (metanol och metylsallakylat) kan hela konstruktionen avbildas med liten/ingen laserdämpning från konstruktionens dermala sida. Bildinställningar inklusive laser linje, förstärkning och pinhole sänktes för rensade VHSE för att minska övermättnad. Röjning och avbildning slutfördes enligt beskrivningen i steg 6 & 7 i protokollet. Orthogonal max projektionsbilder och 3D-rendering slutfördes med beräkningsprogram, 3D-rendering genererades från rensade konstruktionsbilder. Bilder skalas individuellt med bakgrundssubtraktion och medianfiltrering för tydlighet. Skalstänger är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Tredimensionell analys av vaskulatur inom VHSE. Volymetriska bilder tagna via konfokal mikroskopi möjliggör vaskulär parameter kvantifiering vid kultur slutpunkter genom beräkningsbild analys. Från VHSE-undervolymer, detektion av Kollagen IV fläck (cyan) markerar endotelväggar av vaskulatur och möjliggör segmentering av vaskulär baserat på kollagen IV plats; segmenteringsdata skelettiseras sedan och mitten av varje kärl hittas (magenta). Exempel på 3D-skelettisering visas i 4 veckor och 8 veckor IMR90 VHSE-prover, oklarerade. Resulterande data från en IMR90 VHSE-experimentuppsättning användes för att beräkna kärlets diametrar och kärlfraktionerna för fyra delvolymer (varje 250 μm i z-riktningen) inom varje konstruktion, data var genomsnittliga per VHSE och ytterligare genomsnittliga per kulturtidpunkt. Dessa data visar vaskulär nätverk homeostas som sträcker sig över 4 och 8 veckor kultur varaktigheter med diametrar relevanta för in vivo mänskliga huden78, och vaskulär fraktion inom samma ordning som in vivo mänskliga huden79 (Vaskulär fraktion i kollagen konstruktioner har visat sig varaanpassningsbara 48 och kan optimeras ytterligare för ökade värden). Data representeras som ± standardfelmedelvärde (S.E.M); n = 3 för varje tidspunkt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

media Komponenter
Mänsklig Dermal Fibroblast cellinje (hDF) DMEM HG
5% Fetala nötkreatur serum (FBS)
1% Penicillin/Streptomycin (P/S)
IMR90 Fibroblast cellinje DMEM/HAMS F12 50:50
10% FBS
1% P/S
HMEC-1 Endotelcelllinje MCDB131 Basmedium
10% FBS
1% P/S
L-glutamin [10 mM]
Epidermal tillväxtfaktor (EGF) [10 ng/ml]
Hydrokortison [10 μg/ml]
N/TERT-1 Keratinocyte cellinje K-SFM-mediebas
1% P/S
Bovint hypofysextrakt (BPE) [25 μg/ml], från K-SFM tilläggssats
Epidermal tillväxtfaktor (EGF) [0,2 ng/ml], från K-SFM tillägg kit
CaCl2 [0,3 mM]
Human Hudekvivalent (HSE) differentiering 3:1 DMEM: Hams F12
1% P/S
0,5 μM hydrokortison
0,5 μM Isoproterenol
0,5 μg/ml insulin

Tabell 1: Medierecept. Medierecept för 2D-kultur av mänskliga dermal fibroblaster, IMR90 fibroblaster, HMEC-1 och N/TERT-1 keratinocyter ges. Dessa recept användes för att expandera cellinjer innan VHSEs genererades. Human hudekvivalent (HSE) differentieringsmedier används för att generera VHSE; Ett basrecept ges, under delar av nedsänkningskulturen och stratifieringsinduktionen bör avsmalnande mängder FBS läggas till enligt beskrivningen i protokoll steg 3. HSE recept baserat på dessa källor11,80.

Kollagenlagerkoncentration (Cs) : 8 mg/ml
Önskad volym (Vf): 1 Ml
Normalisera NaOH-justering*: 1 X
*Varje parti kollagen måste testas för att bestämma hur mycket NaOH som behövs för att ställa in pH 7 - 7,4
Önskad kollagenkoncentration (mg/ml)
2 3 4 5
10X PBS (Vpbs) 0.1 0.1 0.1 0.1
Kollagenbuljong (V) 0.25 0.375 0.5 0.625
1N NaOH (VNaOH) 0.00575 0.008625 0.0115 0.014375
Media (Vmedia) 0.64425 0.516375 0.3885 0.260625

Tabell 2: Referenstabell för kollagenberäkning. Referenstabellen ger allmänt önskade kollagenkoncentrationer beräknade med en koncentration av kollagenlager på 8 mg/ml och en önskad slutlig volym på 1 ml. alla värden är i ml. De ekvationer som används för att beräkna dessa belopp anges i protokoll steg 2.2. Det är viktigt att kontrollera pH för varje kollagenlager; Vid behov bör NaOH-belopp läggas till för att uppnå pH 7 - 7,4 (efter pbs, naoh, kollagenlager läggs media till). Protokollet har optimerats för VHSEs med hjälp av en 3 mg/ mL kollagenkoncentration; förändringar i kollagenkoncentrationen kan vara nödvändiga för olika cellinjer/önskade slutresultat48.

Primär antikropp källa koncentration använda
Filaggrin (AKH1) mus monoklonal IgG Santa Cruz;
sc-66192 (200 μg/ml)		 [1:250] Sen differentieringsmarkör15
Involucrin kanin polyklonal IgG Proteintech;
55328-1-AP (30 μg/150 μL)		 [1:250] Sen terminal differentieringsmarkör15
Cytokeratin 10 (DE-K10) mus IgG, supernatant Santa Cruz;
sc-52318		 [1:350] Suprabasal epidermal markör14,36,59
Kollagen IV kanin polyklonal Proteintech;
55131-1-AP		 [1:500] Endotel vaskulär vägg67
DRAQ 7 Cellsignalering; 7406 (0,3 mM) [1:250] Kärnmarkör
Sekundär antikropp källa koncentration använda
Get Anti-Rabbit IgG DyLight™ 488 Konjugerad Invitrogen; 35552 (1 mg/ml) [1:500] Kollagen IV sekundärt
Anti-Rabbit IgG (H&L) (GOAT) Antikroppar, DyLight™ 549 Konjugerad Rockland immunokemikalier; 611-142-002 [1:500] Involucrin sekundär
Get antimus IgG (H&L), DyLight™ 488 Thermo Scientific; 35502 (1 mg/ml) [1:500] Filaggrin eller Cytokeratin 10 sekundär
BLOCKERINGSBUFFERT (500 ml)
reagens belopp
ddH2O (ddH2O) 450 ml
10 x PBS 50 ml
Bovint serumalbumin (BSA) 5 g
Interpolering 20 0,5 ml
Kallt vatten FiskGelatin 1 g
Natriumazid (10% natriumazid i diH2O) 5 ml (0,1 % slutlig koncentration)

Tabell 3: Primära och sekundära antikroppar med blockerande buffertrecept. De listade antikropparna och kemiska fläckarna användes för färgning som visas i figur 2, figur 3, figur 4. Färgningen slutfördes enligt protokoll steg 6 med hjälp av det blockerande buffertreceptet som listas här. Vissa optimeringar av färgningskoncentrationerna och varaktigheten kan krävas beroende på de valda kulturteknikerna och cellinjerna.

Kompletterande tabell 1: Förkortningslista. Förkortningslistan ingår för läsarens bekvämlighet. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande figur 1: Tekniskt stöd till VHSE för hantering. Hantering av VHSEs är utmanande, särskilt under fixering, bearbetning och färgning. A-D motsvarar instruktioner i steg 5-7. A visar den tekniska hanteringen av att ta bort det porösa membranet från en odlingsinsats för att säkerställa korrekt färgning. B visar hur man håller varje VHSE nedsänkt under färgning och lagring. C visar det säkraste och enklaste sättet att flytta konstruktioner till PDMS bildbrunnar. D visar en VHSE som sitter i en PDMS-bildbrunn: PDMS-brunnen är limmad på en glasrutschbana på botten, vilket skapar ett fönster för avbildning, en glasbild placeras ovanpå för att upprätthålla luftfuktigheten genom långa bildkörningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2:Standardmikroskopi med bred fluorescens kan användas för att bedöma VHSE. Widefield imaging kan användas för volymetrisk avbildning för rutinbedömning när laserskanningsmikroskopi inte är tillgänglig. Som ett exempel visas avbildning av VHSEs från både de apatiska och basolaterala aspekterna som en ansikte och orthogonal (Ortho.) maximala projektioner. - Jag ärinte så bra på dethär. Epidermisen avbildades med hjälp av involucrin och atomkärnor som markörer. - Jag ärinte så bra på dethär. Dermal vaskulatur avbildades med kollagen IV som markör. Bilder subtraheras i bakgrunden för tydlighetens skull. Out-of-plane ljus leder till "streaking" eller "flare" artefakter som är uppenbara i orthogonal vyer. Widefield imaging kan användas för kvantifiering men kan kräva mer bildbehandling. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Detta protokoll har visat en enkel och repeterbar metod för generering av VHSEs och deras tredimensionella analys. Viktigt är att denna metod förlitar sig på få specialiserade tekniker eller utrustningsdelar, vilket gör den tillgänglig för en rad laboratorier. Vidare kan celltyper ersättas med begränsade ändringar i protokollet, vilket gör det möjligt för forskare att anpassa detta protokoll till sina specifika behov.

Korrekt kollagengelering är ett utmanande steg för att etablera hudkultur. Speciellt vid användning av råa preparat utan rening kan spårföroreningar påverka geleringsprocessen. För att säkerställa konsekvens bör grupper av experiment utföras med samma kollagenlager som kommer att användas för VHSE-generering. Vidare bör gelationen helst ske vid ett pH-läge på 7-7,4, och spårföroreningar kan flytta pH. Innan du använder något kollagenlager bör en övning acellulär gel göras vid önskad koncentration och pH bör mätas före gelering. Slutföra denna kollagenkvalitetskontroll innan du börjar dermal komponent sådd kommer att identifiera problemen med korrekt gelering och kollagen homogenitet innan du ställer in ett komplett experiment. I stället för att så acellulärt kollagen direkt på en odlingsinsats, så lite kollagen på en pH-remsa som utvärderar hela pH-skalan och verifiera ett pH-fel på 7-7,4. Gelering kan utvärderas genom att applicera en droppe av kollagengellösningen på en täcklip eller vävnadskultur plastbrunnsplatta (en brunnsplatta rekommenderas för att simulera de begränsade sidorna av en odlingsinsats). Efter geleringstiden ska kollagenet vara fast, dvs det ska inte flöda när plattan lutas. Under faskontrastmikroskopi ska kollagenet se homogent och tydligt ut. Enstaka bubblor från kollagen sådd är normala men stora amorfa blobbar av ogenomskinliga kollagen i den klara gelén indikerar ett problem-sannolikt på grund av otillräcklig blandning, fel pH och/eller underlåtenhet att hålla kollagen kylt under blandning.

Cellfrömängderna och mediet kan justeras. I protokollet ovan har de inkapslade cellmängderna optimerats för en 12-brunnsinsats vid 7,5 x 104 fibroblaster och 7, 5 x 105 endotelceller per ml kollagen med 1,7 x 105 keratinocyter sådda ovanpå hudkonstruktionen. Celltätheten har optimerats för detta VHSE-protokoll baserat på förstudierna och den tidigare forskningen som undersökte 3D vaskulär nätverksgenerering i olika kollagenkoncentrationer48 och HSE generation22,80,81. I liknande system är de publicerade endotelcelltätheterna 1,0 x 106 celler/ml kollagen48; fibroblastkoncentrationerna varierar ofta från 0,4 x 105 celler/ml kollagen22,28,82 till 1 x 105 celler/ml kollagen8,58,83,84,85; och keratinocytkoncentrationerna varierar från 0,5 x 105 [celler/cm2]80 till 1 x 105 [celler/cm2]8. Celltätheten kan optimeras för specifika celler och forskningsfråga. Tredimensionella kulturer med kontraktila celler, såsom fibroblaster, kan dra ihop sig vilket leder till livskraftsminskning och kulturförlust86,87. Preliminära experiment bör slutföras för att testa sammandragning av hudfacket (som kan uppstå med mer dermala celler, mer kontraktila hudceller, längre nedsänkningskulturer eller mjukare matriser) och för att testa epidermal yttäckning. Dessutom kan antalet dagar i nedsänkning och frekvensen av avsmalning av seruminnehållet också anpassas om överdriven dermal sammandragning sker eller en annan frekvens av keratinocyttäckning krävs. Till exempel, om sammandragning märks under perioden av hudsänkning eller medan keratinocyter etablerar en ytmonalayer, rör sig snabbare genom serum avsmalningsprocessen och höja VHSEs till ALI kan bidra till att förhindra ytterligare sammandragning. På samma sätt, om keratinocyte täckning inte är idealisk, ändra antalet dagar som VHSE är nedsänkt utan serum kan bidra till att öka epidermal monolayer täckning och mildra sammandragningen eftersom serum lämnas ut. Förändringar i celltäthet eller andra förslag ovan måste optimeras för de specifika kulturerna och forskningsmålen.

För att fastställa en korrekt stratifiering av epidermis under perioden för luftvätskans gränssnitt (ALI) är det viktigt att regelbundet kontrollera och bibehålla vätskenivåerna i varje brunn så att ALI och lämplig hydrering av varje konstruktion hålls under hela odlingslängden. Medienivåerna bör kontrolleras och spåras dagligen tills konsekventa ALI-nivåer har fastställts. Epidermalskiktet ska se hydratiserat ut, inte torrt, men det bör inte finnas pooler av media på konstruktionen. Under ALI kommer konstruktionen att utveckla en ogenomskinlig vit/ gul färg som är normal. Epidermala skiktet kommer sannolikt att utvecklas ojämnt. Vanligtvis lutas VHSEs på grund av kollagensådd eller dermal sammandragning. Det är också normalt att observera en högre epidermal del i mitten av konstruktionen i mindre konstruktioner (24 brunnsstorlek) och en åsformation runt omkretsen av VHSE i 12 brunnsstorlek. Sammandragning av konstruktionerna13 kan ändra dessa topografiska formationer och/eller inte observeras alls.

Färgning och avbildning av VHSEs introducerar mekanisk manipulering till VHSEs. Det är mycket viktigt att planera och begränsa manipuleringen av varje kultur. När manipulering är nödvändig, håll skonsamma rörelser när du tar bort VHSEs från skärmembranen, när du lägger till färgnings- eller tvättlösningar på konstruktionsytan och när du tar bort och ersätter VHSEs i deras lagrings-/bildframställningsbrunnar under bildberedningen. Specifikt kan de apatiska lagren av epidermal komponenten vara bräckliga och riskerar att sloughing av de basala epidermala lagren. Apatiska lager av epidermis är bräckliga och går igenom desquamation även i inhemskvävnad 4, men för noggrann analys av epidermal struktur är det viktigt att minimera skador eller förlust. Om epidermala lager lyfter av konstruktionen kan de avbildas separat. De basala lagren av epidermis är sannolikt fortfarande fästa vid dermis medan delar av de apatiska lagren kan lossna. För visualisering av epidermis är en kärnfläck till hjälp för att observera detta eftersom täta atomkärnor är ett kännetecken för lägre och mellersta lager av epidermis.

Konfokal avbildning av VHSE efter fixering har diskuterats i protokollet, men det är också möjligt att avbilda VHSEs i hela kulturen via upprätt baserad optisk koherenstomografi (OCT)88,89,90,91,92,93. VHSE är tillräckligt stabila för att tåla avbildning utan inkubation eller befuktning i minst två timmar utan märkbara effekter. Eftersom OCT är etikettfri och icke-invasiv är det möjligt att spåra epidermal tjocklek under mognad. Andra icke-invasiva bildframställningsmetoder kan sannolikt också användas.

Volymetrisk avbildning av de kombinerade dermala och epidermala strukturerna kan vara utmanande på grund av laserdämpning djupare i VHSE. Detta kan mildras genom att avbilda konstruktionen i två riktningar, från epidermalsidan (figur 1) och från den dermala sidan (figur 2), vilket möjliggör god upplösning av dermala kärlstrukturer och epidermis. Dessutom kan provet rensas, vilket möjliggör volymetriska bilder av hela strukturen med minimal dämpning. Flera clearingmetoder försöktes, men metanol/metylsalicylatmetoden som beskrivs gav de bästa resultaten. Forskare som är intresserade av att optimera andra clearingmetoder riktas mot dessa recensioner49,61,62. Om det rensas föreslås att provet avbildas helt före röjning, eftersom metoden kan skada fluorforerna och/eller strukturen. Vidare bör avbildningen slutföras så snart som möjligt efter röjning, eftersom fluorescensen kan blekna inom några dagar.

För enkelhet och tillgänglighet använde detta protokoll de enklaste medieblandningarna som finns i tidigare litteratur11,80. Även om det finns många fördelar med att använda enkla medieblandningar, är begränsningarna i detta val också erkända. Andra grupper har studerat effekterna av specifika mediekomponenter på epidermal och dermal hälsa och funnit att andra medietillsatser94, såsom externa fria fettsyror / lipider, förbättrar epidermis hornlagrets stratum corneum och förbättrar hudbarriärfunktionen. Även om våra immunofluorescerande markörer visar lämplig differentiering och stratifiering i epidermis, beroende på de studier som utförs, kan ytterligare medieoptimering behövas. Vidare gjordes inte en omfattande analys av epidermal BM vid utvärderingen av de VHSEs som presenteras här. BM: s integritet är en viktig indikation på hudekvivalenter; olika grupper har forskat om kulturens varaktighet och dess effekt påBM-märkningar 95 samt analys av fibroblastnärvaro och adderade tillväxtfaktoreffekter på BM-uttryck14. Det är viktigt att notera att analysen av BM-komponenten bör utvärderas och optimeras när protokollet används.

I detta protokoll beskrivs ett förfarande för VHSE generation, visar resultat efter 8 veckor på ALI. VHSE kulturer har odlats upp till 12 veckor på ALI utan märkbar förändring eller förlust av livskraft, och det är möjligt att de kan vara livskraftiga längre. Viktigt är att detta protokoll är lätt anpassningsbart till allmänt tillgängliga celltyper, vilket framgår av ersättning av dermal fibroblaster med IMR90 lungfibroblaster. Beroende på forskarens behov och tillgängliga resurser kan celltyperna och medieblandningarna på kulturen justeras, även om mer olika celltyper kan kräva medieoptimering. Sammanfattningsvis är dessa förfaranden avsedda att ge klarhet om VHSEs kultur för studier av hudbiologi och sjukdom. För att maximera tillgängligheten utvecklades protokollet så enkelt och robust med hjälp av gemensam utrustning, cellinjer och reagenser som ett minimalt effektivt tillvägagångssätt som kan anpassas ytterligare till forskningsstudiers specifika behov.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr. Jim Rheinwald59 och Dr Ellen H. van den Bogaard20 för deras generösa gåva av N / TERT cellinjer. Detta arbete stöddes av American Heart Association (19IPLOI34760636).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N NaOH Fisher Chemical S318-100 (Dilute from Lab stock)
4% Paraformaldehyde ACROS Organics #41678-5000, Lot # B0143461 Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9
Autoclaved forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
CaCl2 Fisher bioreagents Cat # BP510-250, Lot # 190231 Rnase, Dnase, Protease-Free
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) ATCC CRL-3243 SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult ATCC PCS-201-012 Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) ATCC CCL-186 Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.
Centrifuge Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (standard lab equipment)
Computational Software MATLAB MATLAB 2020a MathWorks, Natick, MA.
Confocal Microscope Leica TCS SPEII confocal Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.
Cover Glass (22 x 22) Fisher Scientific 12-545F 0.13-0.17 mm No.1 Thickness
Cyanoacrylate super glue or silicone grease Glue Masters #THI0102 Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred
DMEM media base Corning; Mediatech, Inc REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
DMEM/F-12 50/50 Corning; Mediatech, Inc REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethanol Decon Labs #V1101 (standard lab reagent)
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered
Fine tip forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 Made up in 0.1% BSA in PBS
Hydrocortisone Alpha Easar Lot # 5002F2A made up in DMSO
Insulin (human) Peprotech Lot # 9352621
Inverted Light/Phase Contrast Microscope VWR 76317-470 (standard lab equipment)
Isoproterenol Alfa Aesar #AAJ6178806 DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%
Keratinocyte-SFM (1x) media base Gibco; Life Technologies Corporation REF #: 10724-011; Lot # 2085518 Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium
L-Ascorbic Acid Fisher Chemical Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt
L-glutamine (solid) Fisher Bioreagents CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder
MCDB 131 media base Gen Depot CM034-050, Lot # 03062021 MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered
Metal punches Sona Enterprises (SE) 791LP, 12PC Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2".
Methanol Fisher Chemical CAS # 67-56-1 (optional). For clearing dehydration step.
Methyl Salicylate Fisher Chemical O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 (optional). For clearing.
Microtubes, 1.7 mL Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics Cat # 24-282; Lot # 19467 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free
PBS, 10x Culture grade or autoclaved APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium Genesee Scientific Corporation Ref # 25-508; Lot # 07171015
PBS, 1x non-Culture grade APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. 
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 15140-122, Lot # 2199839 Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)
Petri Dish, glass, small Corning PYREX 316060 (optional). To be used as a clearing container
Petri Dishes, 100 mm Fisher Scientific FB0875713 Use for making up PDMS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning GMID 02065622, Batch # H04719H035 Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)
Dow Corning GMID 02065622, Batch # H047JC4003 DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S Sterilized capillaries and pistons
Round tipped scoopula (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging
Supplements for Keratinocyte-SFM media Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 37000-015, Lot # 2154180 Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size Corning; Costar REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057 Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, 
Tissue Culture Plates, 12 well size Greiner Bio-one; CellStar Cat # 665 180; Lot # E18103QT 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area Genesee Scientific Corporation Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene
Triton x 100 Ricca Chemical Company Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 Wetting agent
Trypsin 0.25% Corning; Mediatech, Inc Ref # 25-053-CI 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate
Type 1 Collagen isolated from Rat tail Pel-Freez Biologicals 56054-1 Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)
Vaccum chamber, benchtop Bel-Art F42010-0000 (standard lab equipment)
Handheld Precision knife X-Acto X3311 (X-Acto knife optional if purchased steel punches)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojic, M., et al. Skin tissue engineering 3. Biomaterials for Skin Repair and Regeneration. , 59 (2019).
  2. Shevchenko, R. V., James, S. L., James, S. E. A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction. Journal of The Royal Society Interface. 7 (43), 229-258 (2010).
  3. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and Physiology of the Skin. Journal of the Dermatology Nurses' Association. 3 (4), (2011).
  4. McGrath, J. A., Eady, R. A. J., Pope, F. M. Anatomy and organization of human skin. Rook's textbook of dermatology. 10, 9781444317633 (2004).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue Engineered Human Skin Equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), (2012).
  7. Oh, J. W., Hsi, T. -C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. The Journal of investigative dermatology. 133 (11), 1-4 (2013).
  8. El-Ghalbzouri, A., Gibbs, S., Lamme, E., Van Blitterswijk, C. A., Ponec, M. Effect of fibroblasts on epidermal regeneration. British Journal of Dermatology. 147 (2), 230-243 (2002).
  9. Sun, T., Haycock, J., MacNeil, S. In situ image analysis of interactions between normal human keratinocytes and fibroblasts cultured in three-dimensional fibrin gels. Biomaterials. 27 (18), 3459-3465 (2006).
  10. Kreimendahl, F., et al. Macrophages significantly enhance wound healing in a vascularized skin model. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1340-1350 (2019).
  11. El Ghalbzouri, A., Commandeur, S., Rietveld, M. H., Mulder, A. A., Willemze, R. Replacement of animal-derived collagen matrix by human fibroblast-derived dermal matrix for human skin equivalent products. Biomaterials. 30 (1), 71-78 (2009).
  12. Roger, M., et al. Bioengineering the microanatomy of human skin. Journal of Anatomy. 234, 438-455 (2019).
  13. Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-Dimensional Tissue Models of Normal and Diseased Skin. Current Protocols in Cell Biology. 41 (1), 1-17 (2008).
  14. El Ghalbzouri, A., Jonkman, M. F., Dijkman, R., Ponec, M. Basement Membrane Reconstruction in Human Skin Equivalents Is Regulated by Fibroblasts and/or Exogenously Activated Keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 124 (1), 79-86 (2005).
  15. Pruniéras, M., Régnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
  16. Ali, N., Hosseini, M., Vainio, S., Taieb, A., Cario-André, M., Rezvani, H. R. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  17. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69-70, 81-102 (2014).
  18. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by chitosan modulated dermal matrices. PLOS ONE. 12 (3), 0174478 (2017).
  19. Vidal, S. E. L., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Abbott, R. D., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. 3D biomaterial matrix to support long term, full thickness, immuno-competent human skin equivalents with nervous system components. Organoids and Ex Vivo Tissue On-Chip Technologies. 198, 194-203 (2019).
  20. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838 (2017).
  21. Lebonvallet, N., et al. Effects of the re-innervation of organotypic skin explants on the epidermis. Experimental Dermatology. 21 (2), 156-158 (2011).
  22. Van Drongelen, V., et al. Barrier Properties of an N/TERT-Based Human Skin Equivalent. Tissue Engineering Part A. 20 (21-22), 3041-3049 (2014).
  23. Hensler, S., Kühlbach, C., Parente, J. D., Krüger-Ziolek, S., Möller, K., Müller, M. Establishment and initial characterization of a simple 3D organotypic wound healing model. , Available from: https://opus.hs-furtwangen.de/frontdoor/index/index/docld/4852 (2018).
  24. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5), 240-249 (2013).
  25. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  26. Amelian, A., Wasilewska, K., Megias, D., Winnicka, K. Application of standard cell cultures and 3D in vitro tissue models as an effective tool in drug design and development. Pharmacological Reports. 69 (5), 861-870 (2017).
  27. Lu, W., et al. Mixture of Fibroblasts and Adipose Tissue-Derived Stem Cells Can Improve Epidermal Morphogenesis of Tissue-Engineered Skin. Cells Tissues Organs. 195 (3), 197-206 (2012).
  28. Marino, D., Luginbühl, J., Scola, S., Meuli, M., Reichmann, E. Bioengineering Dermo-Epidermal Skin Grafts with Blood and Lymphatic Capillaries. Science Translational Medicine. 6 (221), 221 (2014).
  29. Martins-Green, M., Li, Q. -J., Yao, M. A new generation organ culture arising from cross-talk between multiple primary human cell types. The FASEB Journal. 19 (2), 222-224 (2004).
  30. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. -W. 3D Cell Printing of Perfusable Vascularized Human Skin Equivalent Composed of Epidermis, Dermis, and Hypodermis for Better Structural Recapitulation of Native Skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019 (2019).
  31. Baltazar, T., et al. 3D bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 26 (5-6), 227-238 (2019).
  32. Klar, A. S., et al. Tissue-engineered dermo-epidermal skin grafts prevascularized with adipose-derived cells. Biomaterials. 35 (19), 5065-5078 (2014).
  33. Grebenyuk, S., Ranga, A. Engineering Organoid Vascularization. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  34. Black, A. F., Berthod, F., L'heureux, N., Germain, L., Auger, F. A. In vitro reconstruction of a human capillary-like network in a tissue-engineered skin equivalent. The FASEB Journal. 12 (13), 1331-1340 (1998).
  35. Huber, B., Link, A., Linke, K., Gehrke, S. A., Winnefeld, M., Kluger, P. J. Integration of Mature Adipocytes to Build-Up a Functional Three-Layered Full-Skin Equivalent. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (8), 756-764 (2016).
  36. Monfort, A., Soriano-Navarro, M., García-Verdugo, J. M., Izeta, A. Production of human tissue-engineered skin trilayer on a plasma-based hypodermis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 7 (6), 479-490 (2013).
  37. Shamis, Y., et al. Fibroblasts derived from human embryonic stem cells direct development and repair of 3D human skin equivalents. Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 10 (2011).
  38. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
  39. Chau, D. Y. S., Johnson, C., MacNeil, S., Haycock, J. W., Ghaemmaghami, A. M. The development of a 3D immunocompetent model of human skin. Biofabrication. 5 (3), 035011 (2013).
  40. Vanden Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between Keratinocytes and T Cells in a 3D Microenvironment: A Model to Study Inflammatory Skin Diseases. Journal of Investigative Dermatology. 134 (3), 719-727 (2014).
  41. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating Macrophages into Organotypic Co-Cultures: A 3D In Vitro Model to Study Tumor-Associated Macrophages. PLOS ONE. 7 (7), 40058 (2012).
  42. Ouwehand, K., Spiekstra, S. W., Waaijman, T., Scheper, R. J., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Technical Advance: Langerhans cells derived from a human cell line in a full-thickness skin equivalent undergo allergen-induced maturation and migration. Journal of Leukocyte Biology. 90 (5), 1027-1033 (2011).
  43. Weinmüllner, R., et al. Organotypic human skin culture models constructed with senescent fibroblasts show hallmarks of skin aging. npj Aging and Mechanisms of Disease. 6 (1), 4 (2020).
  44. Barker, C. L., et al. The Development and Characterization of an In Vitro Model of Psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 892-901 (2004).
  45. Larcher, F., Espada, J., Díaz-Ley, B., Jaén, P., Juarranz, A., Quintanilla, M. New Experimental Models of Skin Homeostasis and Diseases. Actas Dermo-Sifiliográficas (English Edition). 106 (1), 17-28 (2015).
  46. Varkey, M., Ding, J., Tredget, E. E. Fibrotic Remodeling of Tissue-Engineered Skin with Deep Dermal Fibroblasts Is Reduced by Keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 716-727 (2013).
  47. Moulin, V. J. Reconstitution of skin fibrosis development using a tissue engineering approach. Methods in Molecular Biology. 961, Clifton, N.J. 287-303 (2013).
  48. Morgan, J. T., Shirazi, J., Comber, E. M., Eschenburg, C., Gleghorn, J. P. Fabrication of centimeter-scale and geometrically arbitrary vascular networks using in vitro self-assembly. Biomaterials. 189, 37-47 (2019).
  49. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 1-8 (2016).
  50. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  51. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature Protocols. 1, 2753 (2007).
  52. Bornstein, M. B. Reconstituted rat-tail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  53. Clément, M. -V., Ramalingam, J., Long, L. H., Halliwell, B. The In Vitro Cytotoxicity of Ascorbate Depends on the Culture Medium Used to Perform the Assay and Involves Hydrogen Peroxide. Antioxidants & Redox Signaling. 3 (1), 157-163 (2001).
  54. Tajima, S., Pinnell, S. R. Ascorbic acid preferentially enhances type I and III collagen gene transcription in human skin fibroblasts. Journal of Dermatological Science. 11 (3), 250-253 (1996).
  55. Murad, S., Tajima, S., Johnson, G. R., Sivarajah, A., Pinnell, S. R. Collagen Synthesis in Cultured Human Skin Fibroblasts: Effect of Ascorbic Acid and Its Analogs. Journal of Investigative Dermatology. 81 (2), 158-162 (1983).
  56. Villacorta, L., Azzi, A., Zingg, J. -M. Regulatory role of vitamins E and C on extracellular matrix components of the vascular system. Vitamin E: An Overview of Major Research Directions. 28 (5), 507-537 (2007).
  57. Ashino, H., et al. Novel Function of Ascorbic Acid as an Angiostatic Factor. Angiogenesis. 6 (4), 259-269 (2003).
  58. Ponec, M., et al. The Formation of Competent Barrier Lipids in Reconstructed Human Epidermis Requires the Presence of Vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  59. Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
  60. Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. Journal of visualized experiments: JoVE. (130), e56863 (2017).
  61. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  62. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  63. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  64. Ng, J. M. K., Gitlin, I., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. ELECTROPHORESIS. 23 (20), 3461-3473 (2002).
  65. Eddings, M. A., Johnson, M. A., Gale, B. K. Determining the optimal PDMS-PDMS bonding technique for microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (6), 067001 (2008).
  66. Markov, D. A., Lillie, E. M., Garbett, S. P., McCawley, L. J. Variation in diffusion of gases through PDMS due to plasma surface treatment and storage conditions. Biomedical microdevices. 16 (1), 91-96 (2014).
  67. Katzenberg, F. Plasma-bonding of poly(dimethylsiloxane) to glass. e-Polymers. 5 (1), (2005).
  68. El Ghalbzouri, A., Lamme, E., Ponec, M. Crucial role of fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis. Cell and Tissue Research. 310 (2), 189-199 (2002).
  69. Kanitakis, J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin. European journal of dermatology: EJD. 12 (4), 390-399 (2002).
  70. Kroon, D. -J. Hessian based Frangi Vesselness filter. MATLAB Central File Exchange. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/24409-hessian-based-frangi-vesselness-filter (2010).
  71. Jerman, T., Pernuš, F., Likar, B. Špiclin Enhancement of Vascular Structures in 3D and 2D Angiographic Images. IEEE Transactions on Medical Imaging. 35 (9), 2107-2118 (2016).
  72. Kovesi, P. Phase Preserving Denoising of Images. signal. 4, 6 (1999).
  73. Vincent, L. Morphological grayscale reconstruction in image analysis: applications and efficient algorithms. IEEE Transactions on Image Processing. 2 (2), 176-201 (1993).
  74. Xie, L., et al. Quantitative susceptibility mapping of kidney inflammation and fibrosis in type 1 angiotensin receptor-deficient mice. NMR in Biomedicine. 26 (12), 1853-1863 (2013).
  75. Van Uitert, R., Bitter, I. Subvoxel precise skeletons of volumetric data based on fast marching methods. Medical Physics. 34 (2), 627-638 (2007).
  76. Sethian, J. A. A fast marching level set method for monotonically advancing fronts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1591-1595 (1996).
  77. Sethian, J. A. Fast Marching Methods. SIAM Review. 41 (2), 199-235 (1999).
  78. Braverman, I. M. The Cutaneous Microcirculation. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 3-9 (2000).
  79. Men, S. J., Chen, C. -L., Wei, W., Lai, T. -Y., Song, S. Z., Wang, R. K. Repeatability of vessel density measurement in human skin by OCT-based microangiography. Skin research and technology: official journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (4), 607-612 (2017).
  80. Commandeur, S., Ho, S. H., de Gruijl, F. R., Willemze, R., Tensen, C. P., El Ghalbzouri, A. Functional characterization of cancer-associated fibroblasts of human cutaneous squamous cell carcinoma. Experimental Dermatology. 20 (9), 737-742 (2011).
  81. Thakoersing, V. S., Danso, M. O., Mulder, A., Gooris, G., Ghalbzouri, A. E., Bouwstra, J. A. Nature versus nurture: does human skin maintain its stratum corneum lipid properties in vitro. Experimental Dermatology. 21 (11), 865-870 (2012).
  82. Thakoersing, V. S., Gooris, G. S., Mulder, A., Rietveld, M., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  83. Bouwstra, J. A., Groenink, H. W. W., Kempenaar, J. A., Romeijn, S. G., Ponec, M. Water distribution and natural moisturizer factor content in human skin equivalents are regulated by environmental relative humidity. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 378-388 (2008).
  84. Thakoersing, V. S., van Smeden, J., Mulder, A. A., Vreeken, R. J., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Increased Presence of Monounsaturated Fatty Acids in the Stratum Corneum of Human Skin Equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  85. Smola, H., Thiekötter, G., Fusenig, N. Mutual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction. The Journal of Cell Biology. 122 (2), 417 (1993).
  86. Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal Human Primary Fibroblasts Undergo Apoptosis in Three-Dimensional Contractile Collagen Gels. Journal of Investigative Dermatology. 110 (2), 153-157 (1998).
  87. Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-Term Culture of Fibroblasts in Contracted Collagen Gels: Effects on Cell Growth and Biosynthetic Activity. Journal of Investigative Dermatology. 93 (6), 792-798 (1989).
  88. Smith, L. E., Bonesi, M., Smallwood, R., Matcher, S. J., MacNeil, S. Using swept-source optical coherence tomography to monitor the formation of neo-epidermis in tissue-engineered skin. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4 (8), 652-658 (2010).
  89. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Park, H., Cense, B., De Boer, J. F. Birefringence measurements in human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography. Biomed Opt. 2 (2), 287-291 (2004).
  90. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Hyle Park, B., Cense, B., de Boer, J. F. Advances in Optical Coherence Tomography Imaging for Dermatology. Journal of Investigative Dermatology. 123 (3), 458-463 (2004).
  91. Yeh, A. T., Kao, B., Jung, W. G., Chen, Z., Nelson, J. S., Tromberg, B. J. Imaging wound healing using optical coherence tomography and multiphoton microscopy in an in vitro skin-equivalent tissue model. Journal of Biomedical Optics. 9 (2), 9 (2004).
  92. Derr, K., et al. Fully Three-Dimensional Bioprinted Skin Equivalent Contructs with Validated Morphology and Barrier Funtion. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  93. Park, B. H., de Boer, J. F. Polarization Sensitive Optical Coherence Tomography. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , 1055-1101 (2015).
  94. Batheja, P., Song, Y., Wertz, P., Michniak-Kohn, B. Effects of Growth Conditions on the Barrier Properties of a Human Skin Equivalent. Pharmaceutical Research. 26 (7), 1689-1700 (2009).
  95. Dos Santos, M., Metral, E., Boher, A., Rousselle, P., Thepot, A., Damour, O. In vitro 3-D model based on extending time of culture for studying chronological epidermis aging. Matrix Biology. 47, 85-97 (2015).

Tags

Bioengineering Utgåva 168 vävnadsteknik kärlvävnadsteknik hudekvivalenter hudregenerering sårreparation volymetrisk avbildning hud med full tjocklek
Generering av självmonterade vaskulariserade mänskliga hudekvivalenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, M. M., Morgan, J. T.… More

Sanchez, M. M., Morgan, J. T. Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents. J. Vis. Exp. (168), e62125, doi:10.3791/62125 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter