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Neuroscience

तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में अंतर्जात Monoamine रिलीज के माप के लिए एक प्लेट आधारित परख

Published: August 11, 2021 doi: 10.3791/62127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 2
1Department of Medicine, School of Medicine, Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences, City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यह विधि तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके अंतर्जात मोनोमाइन रिलीज का पता लगाने के लिए एक सरल तकनीक का परिचय देती है। सेटअप मोनोमाइन रिलीज के लिए एक ऊतक धारक युक्त एक 48-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करता है। जारी मोनोमाइन का विश्लेषण HPLC द्वारा इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के साथ युग्मित किया जाता है। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक दवा की खोज के लिए एक स्क्रीनिंग विधि प्रदान करती है।

Abstract

मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर कई न्यूरोलॉजिकल और मनोवैज्ञानिक बीमारियों से जुड़े हुए हैं। इस तरह की स्थितियों के पशु मॉडल ने मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और अपटेक गतिशीलता में परिवर्तन दिखाया है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, फास्ट स्कैन चक्रीय वोल्टमेट्री (एफएससीवी), इमेजिंग, विवो माइक्रोडायलिसिस, ऑप्टोजेनेटिक्स, या रेडियोधर्मिता के उपयोग जैसे तकनीकी रूप से जटिल तरीकों को मोनोमाइन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। यहां प्रस्तुत विधि मोनोमाइन रिलीज की जांच के लिए ऊतक धारकों वाले 48-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करके तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में मोनोमाइन रिलीज का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित दो-चरणीय दृष्टिकोण है, और मोनोमाइन रिलीज माप के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन (एचपीएलसी-ईसीडी) के साथ मिलकर उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी। संक्षेप में, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय स्ट्रिएटम सहित रुचि के क्षेत्रों वाले चूहे के मस्तिष्क वर्गों को ऊतक स्लाइसर या वाइब्रेटोम का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। ब्याज के इन क्षेत्रों को पूरे मस्तिष्क से विच्छेदित किया गया था और एक ऑक्सीजन युक्त शारीरिक बफर में इनक्यूबेट किया गया था। व्यवहार्यता प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम भर में जांच की गई थी, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी) परख द्वारा. तीव्र रूप से विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों को अलग-अलग दवा की स्थितियों में इनक्यूबेट किया गया था जो ट्रांसपोर्टर (एम्फ़ैटेमिन) के माध्यम से या एक्सोसाइटोटिक वेसिकुलर रिलीज (केसीएल) के सक्रियण के माध्यम से मोनोमाइन रिलीज को प्रेरित करने के लिए जाने जाते हैं। इनक्यूबेशन बाद, supernatant में जारी उत्पादों को एकत्र किया गया और एक HPLC-ECD प्रणाली के माध्यम से विश्लेषण किया गया। यहां, बेसल मोनोमाइन रिलीज तीव्र मस्तिष्क स्लाइस से एचपीएलसी द्वारा पता लगाया जाता है। यह डेटा विवो और इन विट्रो परिणामों में पिछले का समर्थन करता है जो दिखाता है कि AMPH और KCl मोनोमाइन रिलीज को प्रेरित करते हैं। यह विधि मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर-निर्भर रिलीज से जुड़े तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है और तेजी से और कम लागत वाले तरीके से मोनोमाइन रिलीज को प्रभावित करने वाले यौगिकों को स्क्रीन करने का अवसर प्रदान करती है।

Introduction

न्यूरोलॉजिकल और मनोवैज्ञानिक रोगों की एक बहुतायत मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर (डोपामाइन [डीए], सेरोटोनिन [5-एचटी], नॉरपेनेफ्रिन [एनई]) होमियोस्टैसिस 1,2,3 के असंतुलन या अपर्याप्त रखरखाव से जुड़ी हुई है। इन स्थितियों में शामिल हैं, लेकिन अवसाद 1,2, सिज़ोफ्रेनिया 2, चिंता 2, लत 4, रजोनिवृत्ति 5,6,7, दर्द 8, और पार्किंसंस रोग 3 तक सीमित नहीं हैं। उदाहरण के लिए, रजोनिवृत्ति के कई चूहे मॉडलों से पता चला है कि हिप्पोकैम्पस, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स और स्ट्रिएटम के भीतर मोनोमाइन की विकृति या कमी अवसाद और संज्ञानात्मक गिरावट दोनों से जुड़ी हो सकती है, जो रजोनिवृत्ति का अनुभव करने वाली महिलाओं में देखी जाती है। इन मॉडलों में मोनोमाइन्स के विनियमन की बड़े पैमाने पर एचपीएलसी-ईसीडी का उपयोग करके जांच की गई है, हालांकि अध्ययनों ने मापा न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री बनाम न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 5,6,7 के बीच भेदभाव नहीं किया है। Monoamines शास्त्रीय रूप से Ca2 + - निर्भर vesicular release9 के माध्यम से extracellular अंतरिक्ष में जारी कर रहे हैं, और उनके संबंधित प्लाज्मा झिल्ली पुन: अपटेक प्रणाली (डोपामाइन ट्रांसपोर्टर, DAT; सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर, SERT; नॉरपेनेफ्रिन ट्रांसपोर्टर, नेट) 10,11 के माध्यम से वापस पुनर्नवीनीकरण कर रहे हैं। इसके विपरीत, डेटा से पता चलता है कि ये ट्रांसपोर्टर मोनोमाइन को जारी करने या एफीलैक्स करने में सक्षम हैं, क्योंकि एम्फ़ैटेमिन (एएमपीएच) और 3,4-मेथिलेनेडियोक्सीमेथेमफेटामाइन (एमडीएमए) जैसे दुरुपयोग की दवाओं को क्रमशः डीए और 5-एचटी जारी करने के लिए जाना जाता है, क्रमशः उनके ट्रांसपोर्टर सिस्टम 12,13,14,15,16,17 के माध्यम से। . इस प्रकार, मोनोमाइन रिलीज गतिशीलता की एक उचित यांत्रिक समझ विशिष्ट और लक्षित फार्माकोथेरेपी विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला को मोनोमाइन रिलीज का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है जैसे फास्ट स्कैन चक्रीय वोल्टमेट्री (एफएससीवी) 18, विवो माइक्रोडायलिसिस 13, इमेजिंग 19, रेडियोलेबल मोनोमाइन्स 20 के साथ प्रीइनक्यूबेशन, ऑप्टोजेनेटिक्स, और हाल ही में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट सेंसर और फोटोमेट्री 21,22 . एफएससीवी और विवो माइक्रोडायलिसिस में मोनोमाइन रिलीज का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्राथमिक तकनीकें हैं। FSCV का उपयोग मुख्य रूप से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में और vivo23 में डीए के उत्तेजित एक्सोसाइटोटिक रिलीज का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। क्योंकि FSCV इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए उत्तेजित या रिलीज पैदा करता है, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज का प्राथमिक स्रोत Ca2 + निर्भर vesicular रिलीज 18,24,25,26,27,28,29,30,31 है . विवो माइक्रोडायलिसिस में एचपीएलसी के साथ मिलकर ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र में रखी गई जांच का उपयोग करके एक्स्ट्रासेल्युलर न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में परिवर्तन को मापता है13,32। एफएससीवी के समान, विवो माइक्रोडायलिसिस में एक प्रमुख सीमा न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के स्रोत को निर्धारित करने में कठिनाई है: Ca2 + निर्भर वेसिकुलर रिलीज या ट्रांसपोर्टर निर्भर। उल्लेखनीय है, दोनों विधियां मोनोमाइन रिलीज के प्रत्यक्ष माप के लिए अनुमति देती हैं। ऑप्टोजेनेटिक्स की हालिया प्रगति के माध्यम से, अनुसंधान उत्कृष्ट सेल-प्रकार की विशिष्टता 21,22 के साथ एक छोटे से समय में 5-एचटी और डीए रिलीज का पता लगाने का प्रदर्शन करता है। हालांकि, इन रणनीतियों को जटिल और महंगी तकनीकों और उपकरणों की आवश्यकता होती है, और अप्रत्यक्ष रूप से मोनोमाइन रिलीज को मापते हैं, विशेष रूप से रिसेप्टर्स के लिए मोनोमाइन बाइंडिंग के माध्यम से। इसके अलावा, रेडियोलेबल मोनोमाइन का उपयोग मोनोमाइन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। रेडियोलेबल मोनोमाइन को विभिन्न मॉडल प्रणालियों में प्रीलोडेड किया जा सकता है जैसे कि हेटरोलॉगस कोशिकाएं प्रत्येक मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर 20,33,34,35,36,37,38,39,40, प्राथमिक न्यूरॉन्स 20, synaptosomes33,39,41, 42, और तीव्र मस्तिष्क स्लाइस43,44। हालांकि, रेडियोधर्मिता प्रयोगकर्ता को संभावित नुकसान पहुंचाती है, और ट्रिटियम-लेबल वाले एनालिस्ट्स अंतर्जात मोनोमाइन गतिशीलता 45,46 को ईमानदारी से पुनरावृत्ति नहीं कर सकते हैं। HPLC-ECD जैसे ऑफ-लाइन डिटेक्शन विधियों के साथ संयुक्त सुपरफ्यूजन सिस्टम ने कई ऊतक स्रोतों से मोनोमाइन का पता लगाने की अनुमति दी है। यहां, यह प्रोटोकॉल सीधे अंतर्जात बेसल और उत्तेजित मोनोमाइन रिलीज को मापने के लिए तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके एक अनुकूलित और कम लागत, सरल और सटीक विधि के रूप में प्रदान करता है।

तीव्र मस्तिष्क स्लाइस यंत्रवत परिकल्पनाओं के परीक्षण के लिए अनुमति देते हैं, मुख्य रूप से क्योंकि वे विवो संरचनात्मक माइक्रोएन्वायरमेंट में संरक्षित करते हैं, और बरकरार synapses47,48,49,50,51,52 बनाए रखते हैं। कुछ अध्ययनों में, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस या कटे हुए मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग केसीएल का उपयोग करके एक सुपरफ्यूजन तकनीक के साथ संयोजन के रूप में किया गया है ताकि Ca2 + मध्यस्थता रिलीज 53,54,55,56 को उत्तेजित किया जा सके। सुपरफ्यूजन सिस्टम न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज तंत्र के क्षेत्र की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रहा है, जिसमें मोनोमाइन भी शामिल हैं। हालांकि, ये प्रणालियां अपेक्षाकृत महंगी हैं, और ऊतक विश्लेषण के लिए उपलब्ध कक्षों की संख्या 4-12 तक है। इसकी तुलना में, यहां प्रस्तुत विधि सस्ती है, 48 ऊतक नमूनों के माप की अनुमति देती है, और 96 ऊतक नमूनों का उपयोग करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है। 48-अच्छी तरह से प्लेट के भीतर प्रत्येक अच्छी तरह से ऊतक धारक होते हैं जो ऊतक से जारी उत्पाद को अलग करने के लिए फिल्टर का उपयोग करते हैं, और जारी मोनोमाइन को फिर एचपीएलसी-ईसीडी द्वारा एकत्र और विश्लेषण किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय स्ट्रिएटम से 5-एचटी, डीए और एनई रिलीज के एक साथ माप की अनुमति देती है, जो औषधीय एजेंटों के साथ उपचार के बाद मोनोमाइन रिलीज को संशोधित करती है। इस प्रकार, प्रयोगकर्ता एक सस्ती बहु-अच्छी तरह से प्रणाली का उपयोग करके कई सवालों के जवाब दे सकता है जो परीक्षण किए गए नमूनों की संख्या को बढ़ाता है और इस प्रकार उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करता है।

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Protocol

पशु हैंडलिंग और ऊतक संग्रह सहित सभी प्रयोगों को फ्लोरिडा विश्वविद्यालय और सिटी कॉलेज ऑफ न्यूयॉर्क इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) के अनुसार किया गया था, जो अनुमोदित प्रोटोकॉल 201508873 (यूएफ) और 1071 (सीसीएनवाई) का पालन करता है। अभिकर्मकों और बफर के लिए कृपया अनुपूरक फ़ाइल देखें।

1. तीव्र चूहे मस्तिष्क स्लाइस तैयार

नोट: इस प्रयोग में वयस्क नर चूहों (250-350 ग्राम) का उपयोग किया गया था। हालांकि, यह सेट अप विभिन्न विकास ता्मक बिंदुओं, मादा चूहों और अन्य प्रजातियों के लिए कार्यात्मक है। यदि एक छोटे जानवर का उपयोग कर रहे हैं, जैसे कि चूहों, प्रयोगकर्ता प्रति शर्त मस्तिष्क स्लाइस या घूंसे की एक अलग संख्या का उपयोग करके प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए समायोजित कर सकता है। विच्छेदन बफर को बफर 1 के रूप में संदर्भित किया जाएगा; एफीलैक्स बफर को बफर 2 के रूप में संदर्भित किया जाएगा।

  1. अनुपूरक फ़ाइल में उल्लिखित के रूप में बफ़र 1 तैयार करें। बर्फ पर 20 मिनट के लिए 95% / 5% (O2 / CO2) के साथ bubbling द्वारा ऑक्सीजन के साथ बफर 1 संतृप्त करें। बफर 1 के 50 मिलीलीटर निकालें, और एक छोटे से बीकर या पेट्री डिश में बर्फ पर ठंडा करें। इस बफर का उपयोग तीव्र रूप से काटे गए पूरे मस्तिष्क को पकड़ने के लिए किया जाता है।
  2. एक या दो वयस्क चूहों (250-350 ग्राम) को 1% -2% आइसोफ्लुरान के साथ एनेस्थेटिक करें, उन्हें गिलोटिन का उपयोग करके नष्ट कर दें, और तेजी से उनके दिमाग को हटा दें। तुरंत चरण 1.1 से कंटेनर में बर्फ-ठंडे ऑक्सीजन युक्त बफर 1 में मस्तिष्क को रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि isoflurane और guillotine सुरक्षित रूप से उपयोग किया जाता है। एक धुएं हुड के नीचे खुला isoflurane.
  3. एक वाइब्रेटोम या संपीड़ित का उपयोग करके, ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र से 300 μm कोरोनल मस्तिष्क वर्गों को काटें (चित्रा 1)। Bubbling बफ़र 1 मौजूद होना चाहिए, जबकि वर्गों को बनाया जा रहा है. एक स्टेनलेस स्टील स्पैटुला का उपयोग करते हुए, ध्यान से और तुरंत मस्तिष्क स्लाइस को बर्फ-ठंडे ऑक्सीजन युक्त बफर 1 (चित्रा 2) से भरे एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  4. आगे मस्तिष्क स्लाइस (जैसे, घूंसे, कट आउट) को विच्छेदन करें, चूहे के मस्तिष्क एटलस 57 का उपयोग करके स्लाइस को सावधानीपूर्वक ग्लास स्लाइड (चित्रा 1 जी) में ले जाकर। उदाहरण के लिए, पृष्ठीय स्ट्रिएटम को इसकी अंधेरे, धारीदार संरचना के आधार पर पहचानें, और कॉर्टेक्स और अद्वितीय सर्पिल संरचना के निकटता के आधार पर हिप्पोकैम्पस की पहचान करें। दाएं और बाएं गोलार्धों को नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्लाइस के रूप में उपयोग करने के लिए अलग किया जा सकता है (आंकड़े 2 जी - एच)। यहां, पृष्ठीय स्ट्रिएटम को आगे 2 मिमी घूंसे (चित्रा 1 जी) में विच्छेदित किया गया था।
  5. टिप कट ऑफ के साथ एक प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करना, ऑक्सीजन बुदबुदाने के साथ ऑक्सीजन युक्त बर्फ-ठंडे बफर 1 में डूबे छोटे कंटेनरों में स्लाइस या मस्तिष्क के घूंसे को स्थानांतरित करना। ये कंटेनर स्टेनलेस स्टील जाल, या बफर (चित्रा 1 एच) से भरे छोटे पेट्री व्यंजन हो सकते हैं।

2. पूर्व विवो अंतर्जात monoamine मस्तिष्क स्लाइस या घूंसे से रिलीज

नोट: इस अनुभाग के लिए उपयोग किए जाने वाले डिवाइस में एक 48-वेल प्लेट और एक ऊतक धारक होता है जो कार्बोजन लाइन (चित्रा 2) से जुड़े इनसेट-फ़िल्टर के बिना छह माइक्रोसेंट्रीफ्यूज फ़िल्टर इकाइयों से बना होता है। धारक बनाने के लिए, एक मजबूत प्लास्टिक रॉड (उदाहरण के लिए, एक सेल स्क्रैपर से) का उपयोग करें और इसे इनसेट-फिल्टर के बिना माइक्रोसेंट्रिफ्यूज फ़िल्टर इकाइयों को सुपर गोंद करें। इसे 1-2 दिनों के लिए सूखने दें। अंतर्जात मोनोमाइन रिलीज प्रयोग और एम्फ़ैटेमिन, फ्लुओक्सेटीन और कोकीन की सांद्रता के लिए आवश्यक समय वर्तमान साहित्य और पिछले प्रोटोकॉल 13,20,58 पर आधारित है।

  1. ऊतक सक्रियण
    1. चरण 1.1.5 से मस्तिष्क के ऊतकों को एफिलेक्स चैंबर के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें और ऑक्सीजन युक्त बफर 2 के 0.5-1 मिलीलीटर में एक स्लाइड गर्म पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-50 मिनट के लिए वसूली की अनुमति दें, निरंतर, कोमल बुदबुदाते हुए (चित्रा 2बी 1)।
    2. इस इनक्यूबेशन के दौरान, प्रयोग के लिए वांछित एकाग्रता के लिए दवाओं को पतला करें। सभी दवाओं को बफर 2 में भंग किया जाना चाहिए, और सांद्रता वर्तमान साहित्य पर आधारित है।
  2. प्रथम इनक्यूबेशन
    1. मस्तिष्क के ऊतकों के साथ ऊतक धारक को ऑक्सीजन युक्त बफर 2 के 500 μL वाले कुओं में ले जाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि कम से कम कोई बफर को अच्छी तरह से किनारे पर धारक दोहन द्वारा ले जाया जाता है जब तक कि कोई अतिरिक्त बफर धारक में नहीं है।
    2. मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर इनहिबिटर जैसे औषधीय एजेंटों के साथ प्रयोगों में, ऑक्सीजन युक्त बफर 2 में पतला दवाओं के साथ ऊतक के नमूनों को इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 10 μM Fluoxetine, 40 μM कोकीन; चित्रा 2B2 देखें)। प्रत्येक कुएं में अंतिम मात्रा 500 μL होगी।
  3. दूसरा इनक्यूबेशन
    1. ऊतक के साथ धारक को प्रत्येक दवा की वांछित एकाग्रता के साथ या बिना 500 μL कुल बफर 2 युक्त कुओं के एक नए सेट पर ले जाएं। सुनिश्चित करें कि कोई अतिरिक्त बफर बचा हुआ नहीं है। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रयोगात्मक परिस्थितियों के लिए एक n = 1 का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति को तीन प्रतियों में किया जाता है।
    2. एक अच्छी तरह से एक ऑक्सीजन युक्त बफर 2, अगले 10-30 μM AMPH शामिल हैं, और अंतिम अच्छी तरह से 10-30 μM AMPH प्लस monoamine ट्रांसपोर्टर अवरोधक शामिल हैं। प्रत्येक दवा ऑक्सीजन युक्त बफर 2 में भंग हो जाती है।
    3. दवा की स्थिति के 500 μL के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऊतक इनक्यूबेट करें।
      नोट: अतिरिक्त कुओं में मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर इनहिबिटर के साथ या उसके बिना एक ऑक्सीजन युक्त उच्च K + बफर 2 शामिल हो सकता है। ऑक्सीजन युक्त बफर 2 (500 μL) में प्रत्येक दवा को भंग करें।
    4. 20 मिनट के इस दूसरे इनक्यूबेशन के दौरान, चरण 2.2.1 में पहले इनक्यूबेशन से कुओं से समाधान एकत्र करें और 1 एन परक्लोरिक एसिड या फॉस्फोरिक एसिड के 50 μL युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें (HPLC के प्रकार पर निर्भर, अंतिम एकाग्रता 0.1 N)। नमूने की अंतिम मात्रा 550 μL होगी। बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को बनाए रखें, और ट्यूबों को # 1 लेबल करें।
    5. 20 मिनट के दूसरे इनक्यूबेशन के बाद, ऊतक धारक को मस्तिष्क के वर्गों या घूंसे के साथ एक खाली कुएं में ले जाएं और बर्फ पर प्लेट बनाए रखें। supernatant को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एन परक्लोरिक एसिड या फॉस्फोरिक एसिड के 50 μL होते हैं। नमूने की अंतिम मात्रा 550 μL होगी। बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब बनाए रखें, और ट्यूबों को # 2 लेबल करें।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त ऊतक के लिए बर्फ-ठंडा बफर 1 के 1 मिलीलीटर जोड़ें। छोटे चिमटी का उपयोग कर ऊतक के सभी ले लीजिए, और microcentrifuge ट्यूबों को साफ करने के लिए स्थानांतरण।
    7. -80 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क के ऊतकों के साथ ट्यूबों को बनाए रखें। बफ़र 1 (चित्र 2B4) के 1 mL को छोड़ दें।
    8. प्रत्येक इनक्यूबेशन से प्राप्त फ़िल्टर समाधान माइक्रोसेंट्रीफ्यूज फ़िल्टर ट्यूब (0.22 μm) का उपयोग करके 2min के लिए 2,500 x g पर। इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन (चित्रा 2B5) के साथ HPLC का उपयोग करके मोनोमाइन सामग्री निर्धारित करने के लिए फ़िल्टर का उपयोग करें।

3. ऊतक व्यवहार्यता

  1. एमटीटी परख
    नोट: इस प्रयोगात्मक सेटअप के बारे में एक महत्वपूर्ण चिंता ऊतक व्यवहार्यता है क्योंकि ऊतक का उपयोग कई घंटों तक किया जा सकता है59। एक एमटीटी परख60,61 प्रयोग के अंत तक ऊतक व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह परख पीले tetrazolium नमक एमटीटी (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) के रूपांतरण पर आधारित है बैंगनी formazan क्रिस्टल पर्याप्त चयापचय के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं द्वारा.
    1. प्रयोग के बाद ऊतक के नमूनों का एक अलग समूह बनाए रखता है और उन्हें दो समूहों में विभाजित करता है।
    2. ट्राइटन एक्स -100 (1%) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक समूह को इनक्यूबेट करें, जो बफर 2 में एक नियंत्रण के रूप में भंग हो गया है। ट्राइटन एक्स -100 उपचार के परिणामस्वरूप कोशिका मृत्यु होती है। बफ़र 2 में दूसरे समूह को बनाए रखें, और Triton X-100 (ऊतक व्यवहार्यता नियंत्रण) में इनक्यूबेट न करें।
    3. 0.5 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए ऑक्सीजन युक्त बफर 2 में दोनों समूहों में एमटीटी (पीबीएस में स्टॉक समाधान 5 मिलीग्राम / एमएल, पीएच 7.4) जोड़ें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऊतक के नमूनों को इनक्यूबेट करें, पीबीएस के साथ धोएं, और एसडीएस (10%, डब्ल्यू / वी), डीएमएफ (25%, वी / वी) के मिश्रण के 250 μL युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और फॉर्माज़न क्रिस्टल को भंग करने के लिए पानी।
    5. 24 घंटे के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    6. 10 मिनट के लिए 10,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 562 एनएम और 690 एनएम पर supernatant (200 μL) के अवशोषण को मापें। ऊतक व्यवहार्यता की गणना निम्नानुसार की जाती है: (A562-A690)/ऊतक वजन।

4. मोनोमाइन के HPLC विश्लेषण

  1. एक रिवर्स चरण कॉलम का उपयोग करके पिछले प्रोटोकॉल 13,44 के अनुसार एचपीएलसी-ईसीडी का उपयोग करके प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति से मोनोमाइन रिलीज को मापें।
    1. पता लगाने के लिए आवश्यक मोबाइल चरण तैयार करें। इसमें 100 mM फॉस्फोरिक एसिड, 100 mM साइट्रिक एसिड, 0.1 mM EDTA-Na2, 600 mg/ L ऑक्टेनसल्फोनिक एसिड, 8% v / v acetonitrile (अंतिम pH 6.0) शामिल हैं। मोबाइल चरण की संरचना HPLC और उपयोग किए गए कॉलम के प्रकार पर निर्भर करती है।
    2. इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्टर (2 मिमी ग्लासी कार्बन इलेक्ट्रोड, ) की क्षमता को 0.46 वी पर सेट करें, और प्रवाह दर को 0.05 एमएल / मिनट पर सेट करें।
    3. प्रत्येक नमूने के 5 μL लोड, autoinjection और पता लगाने के लिए HPLC में न्यूरोट्रांसमीटर मानकों सहित. जोड़े गए प्रत्येक नमूने की मात्रा HPLC के उपयोग के प्रकार पर निर्भर करती है।
    4. एक बार HPLC रन पूरा कर लिया है, तो दिए गए HPLC विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग क्रोमेटोग्राफ डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए करें।
    5. प्रत्येक मोनोमाइन (डोपामाइन: डीए, नॉरपेनेफ्रिन: एनई, और सेरोटोनिन: 5-एचटी) से बने एक मानक वक्र का उपयोग करके मोनोमाइन सामग्री का विश्लेषण करें; चित्रा 2C)। निर्माता के दिशानिर्देशों के आधार पर वक्र (AUC) के तहत क्षेत्र प्राप्त करने के लिए परिणामी क्रोमैटोग्राम का उपयोग करें।

5. प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए ऊतक lysates तैयार करना

  1. प्रोटीन परख
    1. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बर्फ-कोल्ड लाइसिस बफर प्लस प्रोटीज इनहिबिटर (0.1 ग्राम / 1 एमएल) जोड़ें जिसमें मस्तिष्क अनुभाग / घूंसे होते हैं और एक पेस्टल होमोजेनाइज़र का उपयोग करके होमोजेनाइज़ करते हैं। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को बर्फ पर बनाए रखा जाना चाहिए, जबकि प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए homogenizing।
    2. प्रकाश रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ऊतक होमोजेनेट्स को इनक्यूबेट करें।
    3. सेंट्रीफ्यूज ऊतक 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 x g पर homogenates और supernatant को ठीक करते हैं।
    4. एक मानक के रूप में गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ, supernatants में प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
    5. प्रोटीन (μg) की कुल सामग्री के लिए प्रत्येक मस्तिष्क के नमूने में मोनोमाइन सामग्री को सामान्य करें, जो मस्तिष्क के ऊतकों के 250 μL में मापा जाता है। nmol monoamine / g प्रोटीन निर्धारित करने के लिए नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग करें। df = तनुकरण कारक।

Equation 1

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एक तरफा एनोवा का उपयोग करके मोनोमाइन रिलीज (एनएमओएल / जी) का विश्लेषण करें, इसके बाद पोस्ट-हॉक तुलना के लिए सिदक के कई तुलना परीक्षण किए गए।
  2. स्वतंत्र समूहों के लिए एक Unpaired छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके ऊतक व्यवहार्यता का विश्लेषण करें (नियंत्रण बनाम 1% ट्राइटन एक्स -100)।
  3. सभी सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए, अल्फा स्तर को 0.05 ≤ पर सेट करें।

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Representative Results

यह तकनीक एक आंतरिक ऊतक धारक के साथ 48-अच्छी तरह से प्लेट में आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के साथ एचपीएलसी का उपयोग करके अंतर्जात मोनोमाइन की रिहाई को मापने के लिए मस्तिष्क स्लाइस के उपयोग का वर्णन करती है। प्रयोगात्मक सेट अप को चित्र 1 और चित्र 2 में दर्शाया गया है। प्रारंभ में, प्रयोग के अंत तक ऊतक व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, एक एमटीटी (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड, एक टेट्राज़ोल) परख प्रदर्शन किया गया था। कार्यात्मक प्रयोगों के बाद, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस चयापचय रूप से सक्रिय होते हैं और उन लोगों की तुलना में व्यवहार्य रहते हैं जो 1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ इनक्यूबेट किए जाते हैं, जो सेल मृत्यु की स्थिति है (चित्रा 3)।

तीव्र, 20 मिनट, एएमपीएच के साथ हिप्पोकैम्पस और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स मस्तिष्क वर्गों का उपचार प्रत्येक मोनोमाइन (चित्रा 4 ए, बी) के बाह्य कोशिकीय स्तरों में महत्वपूर्ण वृद्धि को प्रेरित करता है। AMPH (30 μM) ने हिप्पोकैम्पल स्लाइस और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स स्लाइस से एक्स्ट्रासेल्युलर 5-एचटी के स्तर को 220-गुना और 64-गुना, एक्स्ट्रासेल्युलर एनई को 19-गुना और 8-गुना, और एक्स्ट्रासेल्युलर डीए को क्रमशः 8-गुना और 7-गुना तक बढ़ा दिया। इसी तरह के प्रयोगों को फ्लुओक्सेटिन (10 μM) की उपस्थिति में किया गया था, जो एक चयनात्मक-सेरोटोनिन रीपटेक अवरोधक था। फ्लुओक्सेटीन के साथ SERT का निषेध हिप्पोकैम्पस और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स दोनों में AMPH द्वारा प्रेरित एक्स्ट्रासेल्युलर 5-HT की वृद्धि को रोकता है। इसके विपरीत, फ्लुओक्सेटीन एक ही मस्तिष्क क्षेत्रों में एक्स्ट्रासेल्युलर डीए या एनई पर एएमपीएच के प्रभाव को प्रभावित नहीं करता है, जो एसईआरटी (चित्रा 4 ए, बी) के लिए इसकी चयनात्मकता के अनुरूप है। सभी प्रयोगात्मक स्थितियों को तीन प्रतियों में निष्पादित किया गया था।

2 मिमी पृष्ठीय स्ट्रिएटम घूंसे से मोनोमाइन की रिहाई को अगले मापा गया था। तीव्र, 20 मिनट, AMPH (10 μM) के साथ पृष्ठीय striatum घूंसे का उपचार बेसल स्तरों पर डीए (चित्रा 4 C) के बाह्य कोशिकीय स्तरों में 35 गुना वृद्धि को प्रेरित करता है। डीए का पता लगाने पृष्ठीय striatum में 5-HT और NE के निचले बेसल स्तर के कारण ध्यान केंद्रित किया गया था जो पहले इस क्षेत्र में रिपोर्ट किया गया था62,63. इस प्रकार, एएमपीएच एएमपीएच द्वारा प्रेरित एक्स्ट्रासेल्युलर डीए स्तरों की तुलना में एएमपीएच (डेटा नहीं दिखाया गया है) की तुलना में एक्स्ट्रासेल्युलर 5-एचटी में एक मामूली खुराक-निर्भर वृद्धि को प्रेरित करता है। कोकीन (40 μM), एक मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर अवरोधक के साथ पृष्ठीय striatum घूंसे के इनक्यूबेशन, AMPH-प्रेरित extracellular DA का एक महत्वपूर्ण निषेध के परिणामस्वरूप जब पूरी तरह से AMPH (चित्रा 4C) के साथ incubated घूंसे की तुलना में। यह डेटा आगे पिछले निष्कर्षों का समर्थन करता है जो यह दर्शाता है कि एएमपीएच ने DAT16 के माध्यम से डीए एफीलेक्स को प्रेरित किया।

अंत में, मोनोमाइन की एक्सोसाइटोटिक रिलीज को प्रदर्शित करने के लिए, मस्तिष्क वर्गों को केसीएल (40 एमएम) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। KCl के 40 mM के साथ इनक्यूबेशन के माध्यम से झिल्ली विध्रुवीकरण को उत्पन्न करने के लिए extracellular KCl की एकाग्रता में वृद्धि नियंत्रण स्थितियों (चित्रा 5) के खिलाफ तुलना में monoamines के एक्सोसाइटोटिक रिलीज को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। न तो फ्लुओक्सेटीन और न ही कोकीन केसीएल झिल्ली विध्रुवीकरण द्वारा प्रेरित मोनोमाइन के बाह्य कोशिकीय स्तरों में वृद्धि को अवरुद्ध करता है।

Figure 1
चित्र 1: तीव्र चूहे के मस्तिष्क का टुकड़ा और विभाजन की तैयारी। (A) एक चूहे के मस्तिष्क को मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखा जाता है। एक बेहतर कट ऑप्टिक चियासम के शीर्ष को दर्शाता है; अवर कटौती हाइपोथैलेमस के आधार के 3 मिमी पीछे है। हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम को हटाने के लिए कटौती की गई थी, और स्लाइसिंग से पहले नमूने को संपीड़ित या वाइब्रेटोम को सुरक्षित रूप से गोंद करने के लिए एक क्षैतिज आधार सुनिश्चित करने के लिए। (B-D) सुपर गोंद को मंच के आधार के चारों ओर फैलाया गया था, दिमाग पर चिपकाया गया था, तुरंत एगारोज़ के साथ कवर किया गया था, और एगरोज को जमे हुए क्लैंप का उपयोग करके ठोस किया गया था (डी)। (E-F) चूहे के मस्तिष्क के लिए 300 μm स्लाइस बनाने के लिए एक संपीड़ित का उपयोग किया गया था, और स्लाइस को उपयोग तक ऑक्सीजन युक्त बफर में रखा गया था। (जी) अनुभागों को स्लाइड पर रखा गया था और पृष्ठीय स्ट्रिएटम के 2 मिमी घूंसे बनाए गए थे। (जी) पृष्ठीय स्ट्रिएटम (शीर्ष), हिप्पोकैम्पस (मध्य) के कट-आउट, और कॉर्टेक्स (नीचे) के कट-आउट को कार्यात्मक प्रयोगों को शुरू करने से पहले ऑक्सीजन युक्त विच्छेदन बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एफिलेक्स प्रयोग के लिए प्रयोगात्मक सेट अप। (ए) एफिलेक्स चैंबर में एक 48-वेल टिश्यू कल्चर प्लेट और कार्बोजन लाइन से जुड़ी एक ऊतक धारक ट्रे होती है। (बी) अंतर्जात मोनोमाइन एफीलैक्स प्रयोग के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन को दर्शाने वाला एक आरेख जिसमें ऊतक सक्रियण (बी 1), मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर इनहिबिटर (बी 2), एफीलैक्स प्रयोग (बी 3) के साथ / बिना पूर्व-इनक्यूबेशन, और अंतिम नमूना प्रसंस्करण प्रस्तुत किए जाते हैं (बी 4-बी 5)। (सी) बाएं हाथ के पैनल में ऑटो-इंजेक्शन की तैयारी में एचपीएलसी में परफुसेट लोड करने वाले एक प्रयोगकर्ता को दर्शाया गया है। दाएं हाथ का पैनल एक प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम दिखाता है जो मोनोमाइन मानक चोटियों को दर्शाता है। वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र को प्रत्येक मोनोमाइन मानक और मस्तिष्क के नमूनों के लिए मापा जाता है। अंशांकन के बाद, प्रत्येक मस्तिष्क के नमूने के लिए मापा गया एयूसी एनएम एकाग्रता में परिवर्तित हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रयोग के अंत तक तीव्र मस्तिष्क स्लाइस व्यवहार्य थे। एक एमटीटी परख ऊतक व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया गया था और Triton X-100 1% की तुलना में, जो कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है। एमटीटी परख के परिणाम से पता चला है कि 6 ज के अंत तक, ऊतक के नमूने अभी भी व्यवहार्य थे। परिणामों को SEM (N = 6) के माध्य ± रूप में व्यक्त किया जाता है। पी < 0.0001, unpaired टी परीक्षण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एम्फ़ैटेमिन हिप्पोकैम्पस, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स और पृष्ठीय स्ट्रिएटम के घूंसे से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में मोनोमाइन रिलीज को प्रेरित करता है। (ए-बी) हिप्पोकैम्पल और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स स्लाइस 30 μM AMPH में इनक्यूबेट किए गए स्लाइस के परिणामस्वरूप 5-HT, DA और NE रिलीज में महत्वपूर्ण वृद्धि होती है। फ्लुओक्सेटीन 5-एचटी रिलीज को काफी रोकता है, लेकिन इन क्षेत्रों में डीए या एनई रिलीज पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। (सी) 2 मिमी पृष्ठीय स्ट्रिएटम पंचों को कोकीन (40 μM) या AMPH (30 μM) में इनक्यूबेट किया गया था। AMPH प्रेरित डीए रिलीज और कोकीन के साथ pretreatment AMPH प्रेरित डीए रिलीज की एक महत्वपूर्ण कमी के लिए नेतृत्व किया. सभी माप प्रोटीन के nmol / g में हैं। आँकड़े एक तरफा एनोवा का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसके बाद सिदक के कई तुलना परीक्षण होते हैं। परिणामों को SEM (N = 6) के माध्य ± रूप में व्यक्त किया जाता है। आँकड़े Sidak के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ एक तरफा ANOVA का प्रतिनिधित्व करते हैं (** p = 0.01, *** p = 0.001, **** p = 0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: झिल्ली विध्रुवीकरण के माध्यम से मोनोमाइन रिलीज में उच्च एक्स्ट्रासेल्युलर के + परिणाम। (A-B) KCl (40 mM) झिल्ली विध्रुवीकरण और HPC और PFC में सभी तीन monoamines की रिहाई को प्रेरित करता है। दोनों मस्तिष्क क्षेत्रों में, fluoxetine (10 μM) के साथ pretreatment बाह्य कोशिकीय मोनोमाइन रिलीज पर KCl के प्रभाव को प्रभावित नहीं करता है। (सी) KCl (40 mM) झिल्ली विध्रुवीकरण और पृष्ठीय striatum में डीए की रिहाई को प्रेरित करता है, और कोकीन (40 μM) के साथ pretreatment डीए रिलीज पर KCl के प्रभाव को प्रभावित नहीं करता है। आँकड़े एक तरफा एनोवा का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसके बाद सिदक के कई तुलना परीक्षण होते हैं। परिणामों को SEM (N = 6) के माध्य ± रूप में व्यक्त किया जाता है। आँकड़े Sidak के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ एक तरफा ANOVA का प्रतिनिधित्व करते हैं (***p < 0.001, ****p < 0.0001). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मोनोमाइन रिलीज माप कई प्रणालियों जैसे हेटरोलॉगस कोशिकाओं, न्यूरोनल संस्कृतियों, मस्तिष्क synaptosomes, पूर्व विवो तीव्र मस्तिष्क स्लाइस, और पूरे जानवरों में वर्षों से किया गया है13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . इस तरह की तैयारी ने तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र को बुनियादी न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज तंत्र का पता लगाने की अनुमति दी है जो न्यूरोलॉजिकल और मनोवैज्ञानिक विकारों के लिए उपन्यास औषधीय एजेंटों की खोज का कारण बन सकता है जहां मोनोमाइन एक भूमिका निभाते हैं। इस तरह के तरीकों के व्यापक उपयोग के बावजूद, स्रोत और / या अंतर्जात मोनोमाइन रिलीज की मात्रा के बारे में कुछ सीमाएं हैं, विशेष रूप से रेडियोधर्मी प्रक्रियाओं में। इसके अलावा, पूर्व विवो तीव्र मस्तिष्क स्लाइस तैयारी व्यापक रूप से electrophysiological, औषधीय, आनुवंशिक, आणविक, immunocytochemical और अन्य दृष्टिकोण18,24,25,47,50,51,59,69,70 के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया है , जैसा कि वे ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करते हैं, और न्यूरोनल गतिविधि और सिनैप्टिक कनेक्शन दोनों को बनाए रखते हैं। इस प्रकार, मस्तिष्क स्लाइस असाधारण लाभ प्रदान करते हैं जब अन्य इन विट्रो मॉडल जैसे कि हेटरोलॉगस सिस्टम, प्राथमिक सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और सिनैप्टोसोम के साथ तुलना की जाती है। मोटे तौर पर, उनका लाभ यह है कि ये प्रणालियां विवो वातावरण में कई पहलुओं को पुन: पेश कर सकती हैं।

Electrophysiological, optogenetic, फ्लोरोसेंट सेंसर, और वोल्टामेट्रिक दृष्टिकोण मोनोमाइन रिलीज, विशेष रूप से डीए से जुड़े तंत्र की जांच करने के लिए अति सुंदर अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं। हालांकि, इन दृष्टिकोणों के उपयोग के लिए मूल आधार यह है कि न्यूरॉन्स की विद्युत या प्रकाश-प्रेरित उत्तेजना क्लासिक को प्रेरित करती है, और न्यूरोट्रांसमीटर 18,21,22,24,27,30 की अच्छी तरह से प्रलेखित कैल्शियम-निर्भर एक्सोसाइटोटिक वेसिकुलर रिलीज। इन दृष्टिकोणों की अधिक स्पष्ट सीमाओं में से एक यह है कि वैकल्पिक तंत्र (यानी, गैर-वेसिकुलर रिलीज) के माध्यम से जारी मोनोमाइन्स इन तकनीकों द्वारा पता नहीं लगाए जाते हैं। रेडियोलेबल न्यूरोट्रांसमीटर अणुओं का उपयोग मोनोमाइन रिलीज का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है, लेकिन इस दृष्टिकोण की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। कोशिकाओं या ऊतक के नमूनों को लेबल किए गए न्यूरोट्रांसमीटर की गैर-शारीरिक सांद्रता के साथ लोड किया जाता है जो देशी वातावरण को ईमानदारी से याद नहीं करते हैं20,42,46। दिलचस्प बात यह है कि कुछ अध्ययनों में अंतर्जात मोनोमाइन रिलीज 53,54,56 की जांच करने के लिए सुपरफ्यूजन सिस्टम में मस्तिष्क स्लाइस के उपयोग का दस्तावेजीकरण किया गया है। हालांकि, ये अध्ययन रेडियोधर्मी न्यूरोट्रांसमीटर का उपयोग करते हैं, और जो अंतर्जात न्यूरोट्रांसमीटर की जांच करते हैं, वे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज को प्रेरित करने के लिए केवल के + और गैर-शारीरिक स्थितियों पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

वर्तमान में प्रस्तुत विधि का उपयोग देशी ऊतक से ट्रांसपोर्टर-मध्यस्थता मोनोमाइन रिलीज की जांच करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रयोगकर्ता को ट्रिटिएटेड न्यूरोट्रांसमीटर की सीमाओं को दूर करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट सेंसर या रेडियोलेबल मोनोमाइन का उपयोग करते समय अप्रत्यक्ष माप के बजाय मोनोमाइन का प्रत्यक्ष पता लगाने के माध्यम से अंतर्जात मोनोमाइन रिलीज को अधिक सटीक रूप से मापने के लिए एक सरल सेटअप प्रदान करता है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि एम्फ़ैटेमिन प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स 71, पृष्ठीय स्ट्रिएटम 56,72 और हिप्पोकैम्पल 39 मस्तिष्क क्षेत्रों में एक मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर रिलीज एजेंट के रूप में कार्य करता है। इन निष्कर्षों की पुष्टि इस 48-वेल प्लेट सिस्टम का उपयोग करके की गई थी। इसके अतिरिक्त, यह विधि वर्तमान में उपयोग की जाने वाली विधियों के लिए एक पूरक साबित हो सकती है जो एचपीएलसी-ईसीडी का उपयोग करके कुल मोनोमाइन सामग्री को मापते हैं लेकिन मोनोमाइन रिलीज 5,6,7 की जांच नहीं की है। यह विधि एक उपन्यास एरेटर प्रदान करती है जिसे एचपीएलसी का उपयोग करके तीव्र मस्तिष्क स्लाइस से मोनोमाइन की अंतर्जात रिहाई को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के साथ युग्मित है।

इस विधि का उपयोग करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि मस्तिष्क के ऊतकों को गिरावट को रोकने के लिए प्रयोग के दौरान ऑक्सीजन युक्त बफर में ठंडा रखा जाता है। इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण है कि उपयोग किए जाने वाले ऊतकों को मोनोमाइन गिरावट को रोकने के लिए पैरजीलाइन युक्त बफर में सक्रिय किया जाता है। इसके अलावा, प्रयोगकर्ता को इस विधि के कई पहलुओं का समस्या निवारण करना पड़ सकता है। सबसे पहले, जानवर के विकासात्मक समय बिंदु या प्रजातियों के आधार पर, किसी को छोटे या बड़े वर्गों को बनाने या प्रति शर्त अधिक या कम वर्गों, स्लाइस, या घूंसे का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है। दूसरा, ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर, प्रत्येक न्यूरोट्रांसमीटर की अलग-अलग मात्रा होगी। तीसरा, जबकि नोट किए जाने पर ऑक्सीजन के लगातार बुदबुदाने को सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है, प्रयोगकर्ता को अतिरिक्त ऑक्सीकरण प्रदान नहीं करने के लिए सावधान रहना चाहिए क्योंकि इससे कुएं से ऊतक को आकस्मिक रूप से हटा दिया जा सकता है। अंत में, जैसा कि विभिन्न प्रकार के एचपीएलसी उपकरण और विभिन्न पृथक्करण स्तंभ हैं, प्रयोगकर्ता को साहित्य के आधार पर यह निर्धारित करना होगा कि कौन सा उपकरण या कॉलम उनके प्रयोग के लिए सबसे अच्छा काम करेगा।

यद्यपि यह विधि प्रयोगकर्ता को अंतर्जात मोनोमाइन की रिहाई के बारे में पूर्व-विवो डेटा को जल्दी और सटीक रूप से प्राप्त करने की क्षमता प्रदान करती है, लेकिन ऐसी सीमाएं हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। चूंकि यह एक पूर्व विवो दृष्टिकोण है, नेटवर्क और कनेक्शन काट दिए जाते हैं, इस प्रकार स्लाइस या घूंसे एक बरकरार प्रणाली के प्रतिनिधि नहीं हैं। इस दृष्टिकोण की एक और महत्वपूर्ण सीमा अस्थायी की कमी है, और स्थानिक संकल्प के रूप में मोनोमाइन रिलीज को मिनटों के समय पैमाने पर मापा जाता है, और रिलीज साइटों की आबादी से। दृष्टिकोण का भविष्य का शोधन समय और स्थान संकल्प के अनुकूलन की अनुमति दे सकता है। अतिरिक्त प्रयोग रिलीज घटनाओं से जुड़े तंत्र की भी जांच करेंगे। वर्तमान विधि की वैधता का प्रदर्शन करने के बाद, भविष्य के प्रयोगों को मोनोमाइन रिलीज के लिए अग्रणी आणविक घटनाओं को विच्छेदित करने की आवश्यकता होगी। अतिरिक्त प्रयोगों में Ca2 + मुक्त एफीलेक्स बफर, और अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में वेसिकुलर रिलीज के चयनात्मक अवरोधक शामिल होंगे। चूंकि मोनोमाइन और उनके ट्रांसपोर्टरों का क्षेत्रीय वितरण तीन स्वतंत्र घटनाएं हैं, भविष्य के प्रयोगों में अधिक व्यापक फार्माकोलॉजी और एक समय-पाठ्यक्रम अध्ययन शामिल होना चाहिए, क्योंकि विभिन्न दवाओं की स्थिति में कम या लंबे समय तक इनक्यूबेशन बार की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, क्षेत्रीय वितरण या उपयोग किए जाने वाले ऊतक के प्रकार के आधार पर, आगे के प्रयोगों में नेट, एसईआरटी, या डीएटी के लिए अधिक विशिष्ट औषधीय अवरोधकों का उपयोग किया जा सकता है जैसे कि डेसिप्रामाइन, फ्लुओक्सेटीन, और जीबीआर 12909, क्रमशः। इसके अलावा, हालांकि पूरे प्रयोग के दौरान ऊतक व्यवहार्य रहा, प्रयोगकर्ता इस संभावना को खारिज करने में असमर्थ है कि पूरी प्रक्रिया की अवधि के दौरान मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर फ़ंक्शन प्रभावित हो सकता है। इस विधि के लिए आवश्यक उपकरण कम लागत वाला है, हालांकि, एक महंगे एचपीएलसी-ईसीडी तक पहुंच की आवश्यकता है। इसे मुख्य सुविधाओं द्वारा कम किया जा सकता है, क्योंकि वर्तमान में कई लोगों के पास सांप्रदायिक उपयोग के लिए एचपीएलसी-ईसीडी तक पहुंच है। ऐसी सीमाओं के बावजूद, वर्तमान विधि एक मौलिक प्रक्रिया प्रदान करती है, जिसे मोनोमाइन रिलीज की जांच करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है।

सामान्य तौर पर, यह विधि विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से पूर्व विवो तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके वयस्क कृंतक न्यूरॉन्स से मोनोमाइन की एक साथ रिहाई का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल, उच्च थ्रूपुट और कम लागत वाली दो-चरणीय प्रक्रिया प्रदान करती है। आदर्श रूप से, इस विधि को विवो प्रोटोकॉल में जोड़ा जा सकता है, और यह प्रारंभिक डेटा प्रदान करता है, इस प्रकार प्रयोगकर्ता को विवो मॉडल में आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने की अनुमति देता है, जैसा कि पशु कल्याण के "तीन रुपये" (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) में अनुशंसित है। इस प्रकार, मोनोमाइन होमोस्टैसिस में विनियमन से जुड़ी स्थितियों के उपचार के लिए उपन्यास औषधीय एजेंटों की खोज के लक्ष्य के साथ संभावित चिकित्सीय अणुओं की स्क्रीनिंग के लिए इस पूर्व विवो प्लेटफ़ॉर्म को लागू करना संभव है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को अनुदान Fondecyt दीक्षा निधि एन जे.ए.पी. और एनआईएच अनुदान DA038598 को G.E.T. के लिए 11191049 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 Well plate NA NA Assay
Acetonitrile Fischer Scientific A998-1 Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous Sigma Aldrich C1016 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software Anetc
Citric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
D-(+)-Glucose Sigma 1002608421 Dissection Buffer
DMF Sigma Aldrich D4551 MTT Assay
EDTA-Na2 Sigma Aldrich Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad Software, Inc Statistical Analysis
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Lysis buffer
HEPES Sigma Aldrich H3375 Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric Anetc HPLC, LC-EC system
HPLC Amuza HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid Sigma Aldrich A5960 Dissection Buffer
Magnesium Sulfate Sigma 7487-88-9 KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree Millipore C7554 Assay - 6 to fit in 48 well plate
MTT Thermo Fisher M6494 MTT Assay
Nanosep VWR 29300-606 Assay; protein assay
Octanesulfonic acid Sigma Aldrich V800010 Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate Sigma Aldrich P8013 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
Potassium Chloride Sigma 12636 KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic Sigma 1001655559 KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z Precissonary Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P2714 Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 Dissection Buffer
Sodium Chloride Sigma S3014 KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma Aldrich L3771 Lysis buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 MTT Assay / Lysis buffer

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References

  1. Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
  2. Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. Medical Clinics of North America. 85 (3), 559-577 (2001).
  3. Barone, P. Neurotransmission in Parkinson's disease: beyond dopamine. European Journal of Neurology. 17 (3), 364-376 (2010).
  4. Howell, L. L., Kimmel, H. L. Monoamine transporters and psychostimulant addiction. Biochemical Pharmacology. 75 (1), 196-217 (2008).
  5. Kirshner, Z. Z., et al. Impact of estrogen receptor agonists and model of menopause on enzymes involved in brain metabolism, acetyl-CoA production and cholinergic function. Life Sciences. 256, 117975 (2020).
  6. Long, T., et al. Comparison of transitional vs surgical menopause on monoamine and amino acid levels in the rat brain. Molecular and Cellular Endocrinology. 476, 139-147 (2018).
  7. Long, T., et al. Estradiol and selective estrogen receptor agonists differentially affect brain monoamines and amino acids levels in transitional and surgical menopausal rat models. Molecular and Cellular Endocrinology. 496, 110533 (2019).
  8. Burke, N. N., et al. Enhanced nociceptive responding in two rat models of depression is associated with alterations in monoamine levels in discrete brain regions. Neuroscience. 171 (4), 1300-1313 (2010).
  9. Lane, J. D., Aprison, M. H. Calciumm-dependent release of endogenous serotonin, dopamine and norepinephrine from nerve endings. Life Sciences. 20 (4), 665-671 (1977).
  10. Ramamoorthy, S., Shippenberg, T. S., Jayanthi, L. D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacology and Therapeutics. 129 (2), 220-238 (2011).
  11. Torres, G. E., Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (1), 13-25 (2003).
  12. Hilber, B., et al. Serotonin-transporter mediated efflux: A pharmacological analysis of amphetamines and non-amphetamines. Neuropharmacology. 49 (6), 811-819 (2005).
  13. Mauna, J. C., et al. G protein βγ subunits play a critical role in the actions of amphetamine. Translational Psychiatry. 9 (1), 81 (2019).
  14. Sitte, H. H., Freissmuth, M. Amphetamines, new psychoactive drugs and the monoamine transporter cycle. Trends in Pharmacological Sciences. 36 (1), 41-50 (2015).
  15. Johnson, L. A., Guptaroy, B., Lund, D., Shamban, S., Gnegy, M. E. Regulation of amphetamine-stimulated dopamine efflux by protein kinase C β. Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 10914-10919 (2005).
  16. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3495-3500 (2005).
  17. Kantor, L., Hewlett, G. H. K., Gnegy, M. E. Enhanced amphetamine- and K+ -mediated dopamine release in rat striatum after repeated amphetamine: differential requirements for Ca 2+ - and calmodulin-dependent phosphorylation and synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 3801-3808 (2018).
  18. Brodnik, Z. D., et al. Susceptibility to traumatic stress sensitizes the dopaminergic response to cocaine and increases motivation for cocaine. Neuropharmacology. 125, 295-307 (2017).
  19. Henke, A., et al. Toward serotonin fluorescent false neurotransmitters: development of fluorescent dual serotonin and vesicular monoamine transporter substrates for visualizing serotonin neurons. ACS Chemical Neuroscience. 9 (5), 925-934 (2018).
  20. Garcia-Olivares, J., et al. Gβγ subunit activation promotes dopamine efflux through the dopamine transporter. Molecular Psychiatry. 22 (12), 1673-1679 (2017).
  21. Xiao, N., Privman, E., Venton, B. J. Optogenetic control of serotonin and dopamine release in Drosophila larvae. ACS Chemical Neuroscience. 5 (8), 666-673 (2014).
  22. Bass, C. E., et al. Optogenetic control of striatal dopamine release in rats. Journal of Neurochemistry. 114 (5), 1344-1352 (2010).
  23. Stamford, J. A. Fast cyclic voltammetry: measuring transmitter release in "real time". Journal of Neuroscience Methods. 34 (1-3), 67-72 (1990).
  24. Brodnik, Z. D., Ferris, M. J., Jones, S. R., España, R. A. Reinforcing doses of intravenous cocaine produce only modest dopamine uptake inhibition. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 281-289 (2017).
  25. Brodnik, Z. D., España, R. A. Dopamine uptake dynamics are preserved under isoflurane anesthesia. Neuroscience Letters. 606, 129-134 (2015).
  26. Ferris, M. J., Calipari, E. S., Yorgason, J. T., Jones, S. R. Examining the complex regulation and drug-induced plasticity of dopamine release and uptake using voltammetry in brain slices. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 693-703 (2013).
  27. Siciliano, C. A., Calipari, E. S., Ferris, M. J., Jones, S. R. Biphasic mechanisms of amphetamine action at the dopamine terminal. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (16), 5575-5582 (2014).
  28. Rice, M. E., et al. Direct monitoring of dopamine and 5-HT release in substantia nigra and ventral tegmental area in vitro. Experimental Brain Research. 100 (3), 395-406 (1994).
  29. Bunin, M. A., Prioleau, C., Mailman, R. B., Wightman, R. M. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1077-1087 (1998).
  30. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
  31. Park, J., Bhimani, R. V., Bass, C. E. In vivo electrochemical measurements of norepinephrine in the brain: current status and remaining challenges. Journal of the Electrochemical Society. 165 (12), 3051-3056 (2018).
  32. Butcher, S. P., Fairbrother, I. S., Kelly, J. S., Arbuthnott, G. W. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 50 (2), 346-355 (1988).
  33. Garcia-Olivares, J., et al. Inhibition of dopamine transporter activity by G protein βγ subunits. PLoS One. 8 (3), 1-9 (2013).
  34. Carneiro, A. M. D., Blakely, R. D. Serotonin-, protein kinase C-, and Hic-5-associated redistribution of the platelet serotonin transporter. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24769-24780 (2006).
  35. Rajamanickam, J., et al. Akt-mediated regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporter function, cell-surface expression and phosphorylation. The Biochemical Journal. 468 (1), 177-190 (2015).
  36. Egaña, L. A., et al. Physical and functional interaction between the dopamine transporter and the synaptic vesicle protein synaptogyrin-3. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (14), 4592-4604 (2009).
  37. Guptaroy, B., Fraser, R., Desai, A., Zhang, M., Gnegy, M. E. Site-directed mutations near transmembrane domain 1 alter conformation and function of norepinephrine and dopamine transporters. Molecular Pharmacology. 79 (3), 520-532 (2011).
  38. Ordway, G. A., et al. Norepinephrine transporter function and desipramine: Residual drug effects versus short-term regulation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 217-225 (2005).
  39. Steinkellner, T., et al. Amphetamine action at the cocaine- and antidepressant-sensitive serotonin transporter is modulated by CaMKII. Journal of Neuroscience. 35 (21), 8258-8271 (2015).
  40. Guptaroy, B., et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Molecular Pharmacology. 75 (3), 514-524 (2009).
  41. Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42 (10), 1940-1949 (2017).
  42. Aquino-Miranda, G., Escamilla-Sánchez, J., González-Pantoja, R., Bueno-Nava, A., Arias-Montaño, J. -A. Histamine H3 receptor activation inhibits dopamine synthesis but not release or uptake in rat nucleus accumbens. Neuropharmacology. 106, 91-101 (2016).
  43. Reddy, I. A., et al. Glucagon-like peptide 1 receptor activation regulates cocaine actions and dopamine homeostasis in the lateral septum by decreasing arachidonic acid levels. Translational Psychiatry. 6 (5), 809 (2016).
  44. Koutzoumis, D. N., et al. Alterations of the gut microbiota with antibiotics protects dopamine neuron loss and improve motor deficits in a pharmacological rodent model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 325, 113159 (2020).
  45. Herdon, H., Strupish, J., Nahorski, S. R. Differences between the release of radiolabelled and endogenous dopamine from superfused rat brain slices: Effects of depolarizing stimuli, amphetamine and synthesis inhibition. Brain Research. 348 (2), 309-320 (1985).
  46. Thongsaard, W., Kendall, D. A., Bennett, G. W., Marsden, C. A. A simple method for measuring dopamine release from rat brain slices. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 37 (3), 143-148 (1997).
  47. Dorris, D. M., Hauser, C. A., Minnehan, C. E., Meitzen, J. An aerator for brain slice experiments in individual cell culture plate wells. Journal of Neuroscience Methods. 238, 1-10 (2014).
  48. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  49. Papouin, T., Haydon, P. Obtaining acute brain slices. BIO-PROTOCOL. 8 (2), 477-491 (2018).
  50. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
  51. Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. Journal of Neurochemistry. 13 (12), 1333-1343 (1966).
  52. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 4-10 (2014).
  53. Kako, H., Fukumoto, S., Kobayashi, Y., Yokogoshi, H. Effects of direct exposure of green odour components on dopamine release from rat brain striatal slices and PC12 cells. Brain Research Bulletin. 75 (5), 706-712 (2008).
  54. McBride, W. J., Murphy, J. M., Lumeng, L., Li, T. -K. Effects of ethanol on monoamine and amino acid release from cerebral cortical slices of the alcohol-preferring P line of rats. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 10 (2), 205-208 (1986).
  55. Chen, J. C., Turiak, G., Galler, J., Volicer, L. Effect of prenatal malnutrition on release of monoamines from hippocampal slices. Life Sciences. 57 (16), 1467-1475 (1995).
  56. Becker, J. B., Castañeda, E., Robinson, T. E., Beer, M. E. A simple in vitro technique to measure the release of endogenous dopamine and dihydroxyphenylacetic acid from striatal tissue using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Neuroscience Methods. 11 (1), 19-28 (1984).
  57. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. London. (2007).
  58. Dailey, J. W., Reith, M. E. A., Steidley, K. R., Milbrandt, J. C., Jobe, P. C. Carbamazepine-induced release of serotonin from rat hippocampus in vitro. Epilepsia. 39 (10), 1054-1063 (1998).
  59. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309 (2014).
  60. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice-A model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), (2012).
  61. Rönicke, R., et al. AB mediated diminution of MTT reduction - An artefact of single cell culture. PLoS One. 3 (9), (2008).
  62. Ihalainen, J. A., Riekkinen, P., Feenstra, M. G. P. Comparison of dopamine and noradrenaline release in mouse prefrontal cortex, striatum and hippocampus using microdialysis. Neuroscience Letters. 277 (2), 71-74 (1999).
  63. Richards, D. A., Obrenovitch, T. P., Symon, L., Curzon, G. Extracellular dopamine and serotonin in the rat striatum during transient ischaemia of different severities: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 60 (1), 128-136 (1993).
  64. Fog, J. U., et al. Calmodulin kinase II interacts with the dopamine transporter C terminus to regulate amphetamine-induced reverse transport. Neuron. 51 (4), 417-429 (2006).
  65. Balázsa, T., Bíró, J., Gullai, N., Ledent, C., Sperlágh, B. CB1-cannabinoid receptors are involved in the modulation of non-synaptic [3H]serotonin release from the rat hippocampus. Neurochemistry International. 52 (1), 95-102 (2008).
  66. Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 282 (1), 262-270 (1997).
  67. Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Molecular and Cellular Neuroscience. 39 (2), 211-217 (2008).
  68. Bowyer, J. F., et al. Interactions of MK-801 with glutamate-, glutamine- and methamphetamine-evoked release of [3H]dopamine from striatal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 257 (1), 262-270 (1991).
  69. Perszyk, R. E., et al. GluN2D-containing N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic transmission in hippocampal interneurons and regulate interneuron activity. Molecular Pharmacology. 90 (6), 689-702 (2016).
  70. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 4029-4034 (1998).
  71. Jedema, H. P., Narendran, R., Bradberry, C. W. Amphetamine-induced release of dopamine in primate prefrontal cortex and striatum: striking differences in magnitude and timecourse. Journal of Neurochemistry. 130, 490-497 (2014).
  72. Buchmayer, F., et al. Amphetamine actions at the serotonin transporter rely on the availability of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11642-11647 (2013).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 174 monoamine रिलीज तीव्र मस्तिष्क स्लाइस monoamines डोपामाइन नॉरपेनेफ्रिन सेरोटोनिन न्यूरोट्रांसमिशन
तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में अंतर्जात Monoamine रिलीज के माप के लिए एक प्लेट आधारित परख
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Pino, J. A., Awadallah, N., Norris,… More

Pino, J. A., Awadallah, N., Norris, A. M., Torres, G. E. A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (174), e62127, doi:10.3791/62127 (2021).

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