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Neuroscience

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

Published: August 11, 2021 doi: 10.3791/62127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 2
1Department of Medicine, School of Medicine, Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences, City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。

Abstract

モノアミン神経伝達物質は、多数の神経疾患と精神医学的疾患に関連付けられている.このような状態の動物モデルは、モノアミン神経伝達物質の放出および取り込みダイナミクスの変化を示している。電気生理学、高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)、イメージング、生体内ミクロジアル、光遺伝学、または放射能の使用などの技術的に複雑な方法は、モノアミン機能を研究するために必要とされる。ここで紹介する方法は、モノアミン放出を調べる組織ホルダーを含む48ウェルプレートを用いて急性脳スライス中のモノアミン放出を検出するための最適化された2段階のアプローチであり、モノアミン放出測定のための電気化学的検出(HPLC-ECD)と組み合わせた高性能液体クロマトグラフィーである。簡単に言えば、前頭前野、海馬、および側頭線を含む目的の領域を含むラット脳切片は、組織スライサーまたはビブラートームを用いて得られた。これらの関心領域は、脳全体から解剖され、酸素化された生理学的緩衝液中にインキュベートされた。実験時間を通じて、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイによって生存率を調べた。急性解剖された脳領域は、トランスポーター(アンフェタミン)を介してモノアミン放出を誘導することが知られている様々な薬物条件で、またはexocttic小胞体放出(KCl)の活性化を通じてインキュベートされた。インキュベーション後、上清中の放出物を収集し、HPLC-ECDシステムを介して分析した。ここで、基礎モノアミン放出は、急性脳スライスからHPLCによって検出される。このデータは、AMPHおよびKClがモノアミン放出を誘導することを示すインビボおよびインビトロの結果をサポートする。この方法は、モノアミン輸送体依存性放出に関連するメカニズムを研究するのに特に有用であり、迅速かつ低コストでモノアミン放出に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする機会を提供する。

Introduction

多くの神経疾患および精神疾患は、単アミン神経伝達物質(ドーパミン[DA]、セロトニン[5-HT]、ノルエピネフリン[NE])恒常性1,2,3の調節不全または不十分な維持に関連している。これらの状態は、うつ病1、2、統合失調症2、不安2、中毒4、更年期5、6,7、疼痛8、およびパーキンソン病3を含むが、これらに限定されない。例えば、更年期のいくつかのラットモデルは、海馬、前頭前野、線条体内のモノアミンの調節不全または減少が、更年期障害を経験している女性に見られるうつ病と認知機能の両方に関連している可能性があることを示している。これらのモデルにおけるモノアミンの調節異常はHPLC-ECDを用いて広範囲に検討されてきたが、この研究は測定された神経伝達物質の含有量と神経伝達物質の放出を区別しなかった5,6,7.モノアミンは、Ca2+依存性のvesicular release9を介して古典的に細胞外空間に放出され、それぞれの原形質膜再取り込みシステム(ドーパミントランスポーター、DAT;セロトニントランスポーター、SERT;ノルエピネフリントランスポーター、NET)10,11を介してリサイクルされる。逆に、アンフェタミン(AMPH)や3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン(MDMA)などの乱用薬がトランスポーターシステムを介してDAおよび5-HTをそれぞれ放出することが知られているため、これらのトランスポーターはモノアミンを放出または流出させ得ることを示唆している。.したがって、モノアミン放出ダイナミクスの適切な機械学的理解は、特定の標的薬物療法を開発するために重要である。

高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)18、生体内マイクロダイアルシス13、イメージング19、放射性標識モノアミン20のプレインキュベーション、光遺伝学、さらに最近では遺伝子組み換え蛍光センサーとフォトメトリクス21,22などのモノアミン放出を研究するために幅広い技術が採用されています。.FSCVおよび生体内マイクロ透析は、モノアミン放出の研究に使用される主要な技術である。FSCVは、急性脳スライスおよびin vivo23におけるDAを中心に刺激された興奮性放出を研究するために使用される。FSCVは電極を使用して放出を刺激または誘発するため、神経伝達物質放出の主な原因はCa2+依存性の小胞放出18、24、25、26、27、28、29、30、31である.生体内のミクロジアル症とHPLCを併用すると、関心のある脳領域に配置されたプローブを用いて細胞外神経伝達物質レベルの変化を測定する13,32。FSCVと同様に、生体内のミクロジアルシスに対する大きな制限は、神経伝達物質放出源の決定における困難である:Ca2+依存性の小胞放出またはトランスポーター依存性である。注目に値する、両方の方法は、モノアミン放出の直接測定を可能にする。光遺伝学の最近の進歩を通じて、研究は、絶妙な細胞型特異性21,22と短い時間スパンでの5-HTおよびDA放出の検出を実証する。しかし、これらの戦略は、複雑で高価な技術と機器を必要とし、間接的にモノアミン放出を測定し、特に受容体にモノアミン結合を介して。また、放射線標識モノアミンは、モノアミンのダイナミクスの研究にも使用されます。放射性標識モノアミンは、各モノアミントランスポーター20、33、34、35、36、37、38、39、40、一次ニューロン20、シナプトソーム33、39、41、異種細胞などの様々なモデルシステムにプリロードされ得る、42、および急性脳スライス43,44。しかし、放射能は実験者に潜在的な害をもたらし、トリチウム標識された検体は内因性モノアミンダイナミクス45,46を忠実に再現しない可能性がある。HPLC-ECDなどのオフライン検出法と組み合わせたスーパーフュージョンシステムは、複数の組織源からのモノアミンの検出を可能にしました。ここでは、このプロトコルは、急性脳スライスを使用して、内因性基底および刺激されたモノアミン放出を直接測定するための最適化された低コスト、シンプル、および正確な方法として提供される。

急性脳スライスは、主に生体内の解剖学的微小環境を維持し、無傷のシナプス47,48,49,50,51,52を維持するため、機械学的仮説をテストすることを可能にする。いくつかの研究では、急性脳スライスまたは切り刻まれた脳組織は、Ca2+媒介放出53,54,55,56を刺激するためにKClを使用したスーパーフュージョン技術と組み合わせて使用されてきた。超灌流システムは、モノアミンを含む神経伝達物質放出機構の分野の理解を進めるために重要であった。しかし、これらのシステムは比較的高価であり、組織分析に利用可能なチャンバーの数は4〜12の範囲です。これに対し、ここで提示する方法は安価であり、48の組織サンプルの測定を可能にし、そして96までの組織サンプルを使用するように精製され得る。48ウェルプレート内の各ウェルには、フィルターを使用して放出された製品を組織から分離する組織ホルダーが含まれ、放出されたモノアミンをHPLC-ECDによって収集して分析します。重要なことに、この方法は、モノアミン放出を調節する薬理学的薬剤による治療後に、前頭前野、海馬、および後方線条体などの異なる脳領域からの5-HT、DA、およびNE放出の同時測定を可能にする。これにより、実験者は、試験するサンプル数を増加させ、使用する動物の数を減らす安価なマルチウェルシステムを用いて複数の質問に答えることができる。

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Protocol

動物の取り扱いと組織の収集を含むすべての実験は、承認されたプロトコル201508873(UF)と1071(CCNY)に従って、フロリダ大学とニューヨーク市立動物の世話と使用委員会(IACUC)に従って行われました。試薬および緩衝液については 、補足ファイルを参照してください。

1. 急性ラット脳スライスを準備する

注:この実験では、成人雄ラット(250〜350g)を使用しました。しかし、このセットアップは、異なる発達点、雌ラット、および他の種のために機能する。マウスのようなより小さな動物を使用する場合、実験者は、条件ごとに異なる数の脳スライスまたはパンチを使用してプロトコルを最適化するように調整することができる。解剖バッファはバッファ1と呼ばれます。流出バッファーは、バッファー 2 と呼ばれます。

  1. 補足ファイルに記載されているとおりに、バッファー 1 を準備します。95%/5%(O2/CO2)を氷上で20分間泡立て、酸素で飽和バッファー1。バッファー1の50 mLを取り出し、小さなビーカーまたはペトリ皿で氷の上で冷やします。このバッファーは、急性収穫全脳を保持するために使用されます。.
  2. 1~2%のイオフルランで1匹または2匹の成虫ラット(250~350g)を麻酔し、ギロチンを使って切断し、脳を迅速に取り除きます。すぐにステップ1.1から容器の中の氷冷酸素化緩衝液1に脳を置く。
    注:イオブルランとギロチンが安全に使用されていることを確認してください。ヒュームフードの下にオープンイオブルラン。
  3. ビブラートメまたはコンプレトムを使用して、対象領域ごとに300μmのコロナ脳切片を切り取ります(図1)。バブリングバッファ1は、セクションが作成されている間に存在する必要があります。ステンレス製のヘラを使用して、慎重かつすぐに氷冷酸素化緩衝液1で満たされた新しいペトリ皿に脳スライスを移します(図2)。
  4. さらに、ラット脳atlas57を用いて慎重にスライスをガラススライド(図1G)に移動させることにより脳スライス(例えば、パンチ、切り出し)を解剖する。例えば、その暗い、縞状の構造に基づいて、側側線条体を識別し、皮質と独特の螺旋構造への近接性に基づいて海馬を識別します。左右半球は、制御スライスと実験スライスとして使用するために分離されてもよい(図2G-H)。ここで、後回線を2mmのパンチに更に解剖した(図1G)。
  5. 先端を切り落としたプラスチック転写ピペットを使用して、酸素バブリングで酸素化された氷冷バッファー1に浸した小さな容器にスライスまたは脳パンチを移します。これらの容器は、ステンレスメッシュ、またはバッファーで満たされた小さなペトリ皿(図1H)であってもよい。

2. 脳のスライスまたはパンチからの元生体内因性モノアミン放出

注:このセクションで使用されるデバイスは、48ウェルプレートと、カルボーゲンラインに接続されたインセットフィルタのない6つのマイクロ遠心分離フィルタユニットで構成された組織ホルダーで構成されています(図2)。ホルダーを作るためには、頑丈なプラスチック棒(例えば、セルスクレーパーから)を使用し、それにインセットフィルターなしでマイクロ遠心フィルターユニットをスーパー接着します。1~2日間乾燥させます。内因性モノアミン放出実験に要する時間およびアンフェタミン、フルオキセチンおよびコカインの濃度は、現在の文献および以前のプロトコル13,20,58に基づいている。

  1. 組織活性化
    1. ステップ1.1.5から流出チャンバーの各ウェルに脳組織を移し、一定の穏やかな泡立ちを伴う0.5-1 mLの酸素化緩衝液2のスライドウォーマーで37°Cで30〜50分間回復することを可能にする(図2B1)。
    2. このインキュベーションの間に、実験のために所望の濃度に薬剤を希釈する。すべての薬物は、バッファー 2 に溶解する必要があり、濃度は、現在の文献に基づいています。
  2. 最初のインキュベーション
    1. 脳組織を含む組織ホルダーを500 μLの酸素化緩衝液2を含むウェルに移動し、37°Cで20分間インキュベートします。 ホルダーに余分なバッファが入らなくなるまで、ウェルの端にあるホルダーをタップして、バッファを最小限から無くして転送します。
    2. モノアミントランスポーター阻害剤などの薬理学的薬剤を用いた実験では、酸素化緩衝液2で希釈した薬物で組織サンプルをインキュベートする(例えば、10μMフルオキセチン、40μMコカイン; 図2B2参照)。各ウェルの最終ボリュームは500 μLになります。
  3. 第二のインキュベーション
    1. 各薬剤の所望の濃度の有無にかかわらず500 μL合計緩衝液2を含む新しいウェルのセットにティッシュとホルダーを移動させる。余分なバッファが残っていないか確認してください。各ウェルは、実験条件のn = 1を表します。各実験条件は三重で行われる。
    2. 1つの井戸には酸素化された緩衝液2、次の10-30 μM AMPHが含まれ、最終井戸には10-30 μM AMPHとモノアミントランスポーター阻害剤が含まれています。各薬剤は、酸素化緩衝液2に溶解される。
    3. 薬物条件の500 μLで37°Cで20分間組織をインキュベートします。
      注:追加のウェルは、モノアミントランスポーター阻害剤の有無にかかわらず酸素化高K+ バッファ2を含む可能性があります。各薬剤を酸素化緩衝液2(500μL)に溶解します。
    4. 20分のこの第二のインキュベーションの間に、ステップ2.2.1の最初のインキュベーションからウェルから溶液を集め、1Nの過塩素酸またはリン酸の50 μLを含むマイクロ遠心チューブに移す(HPLCの種類に依存して、最終濃度0.1N)。サンプルの最終容積は550 μLです。
    5. 20分の2回目のインキュベーションの後、脳切片またはパンチを含む組織ホルダーを空の井戸に移動させ、氷の上のプレートを維持します。上清を1Nの過塩素酸またはリン酸の50μLを含むマイクロ遠心分離管に移します。サンプルの最終容積は550 μLです。
    6. 組織を含む各ウェルに氷冷緩衝液1の1mLを加える。小さなピンセットを使用して組織のすべてを収集し、きれいなマイクロ遠心チューブに転送します。
    7. 脳組織を用いたチューブを-80 °Cに維持する。 バッファ1の1mLを捨てます(図2B4)。
    8. マイクロ遠心分離機フィルターチューブ(0.22 μm)を2,500 x g で各インキュベーションから得たフィルター溶液。この濾液を使用して、電気化学的検出を伴うHPLCを用いてモノアミン含有量を決定します(図2B5)。

3. 組織の生存率

  1. MTTアッセイ
    注:この実験的なセットアップに関する重要な懸念は、組織が数時間59まで使用することができるように組織の生存率です。MTTアッセイ60,61は、実験の終わりまでに組織の生存率を決定するために使用される。このアッセイは、適切な代謝を有する生細胞による黄色のテトラゾリウム塩MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イイル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化)の紫色のフォルマザン結晶への変換に基づいています。
    1. 実験後は、組織サンプルの別々のグループを維持し、それらを2つのグループに分けます。
    2. トリトンX-100で37°Cで1基を20分間インキュベートし、コントロールとして緩衝液2に溶解する。トリトンX-100治療は細胞死をもたらす。第2群を緩衝2内に維持し、トリトンX-100(組織生存率制御)でインキュベートしない。
    3. 0.5 mg/mLの最終濃度に酸素化緩衝液2の両方のグループにMTT(PBSの5mg/mL、pH 7.4)を加えます。
    4. 組織サンプルを37°Cで20分間インキュベートし、PBSで洗浄し、SDS(10%、w/v)、DMF(25%、v/v)、水の混合物250μLを含むマイクロ遠心チューブに移し、フォルマザン結晶を溶解します。
    5. サンプルを24時間インキュベートする。
    6. チューブを10,000 x gで10分間遠心し、マイクロプレートリーダーを使用して562 nmおよび690 nmで上清(200 μL)の吸光度を測定します。組織生存率は次のように計算されます: (A562-A690)/組織重量.

4. モノアミンのHPLC分析

  1. 前のプロトコル13,44に従ってHPLC-ECDを用いて各実験条件からモノアミン放出を定量し、逆相カラムを用いた。
    1. 検出に必要な移動フェーズを準備します。これは、100 mMリン酸、100 mMクエン酸、0.1 mM EDTA-Na2、600 mg/Lオクタンスルホン酸、8%対/vアセトニトリル(最終pH 6.0)で構成されています。移動相の組成は、使用するHPLCおよびカラムの種類によって異なります。
    2. 電気化学検出器(2mmガラス状炭素電極)の電位を0.46Vに設定し、流量を0.05mL/minに設定します。
    3. 各サンプルの5 μLをロードし、自動注入および検出のためにHPLCに神経伝達物質標準を含む。各サンプルの添加量は、使用するHPLCの種類によって異なります。
    4. HPLCの実行が完了したら、所定のHPLC分析ソフトウェアを使用してクロマトグラフデータを取得および分析します。
    5. 各モノアミンから構成される標準的な曲線を使用してモノアミンの含有量を分析 (ドーパミン: DA, ノルエピネフリン: NE, セロトニン: 5-HT; 図2C)。結果のクロマトグラムを使用して、メーカーのガイドラインに基づいてカーブ(AUC)の下の領域を取得します。

5. タンパク質定量のための組織のライセートを準備する

  1. タンパク質アッセイ
    1. 脳切片/パンチを含む各マイクロ遠心分離管に氷冷リシスバッファーとプロテアーゼ阻害剤(0.1 g/1 mL)を加え、害虫ホモジナイザーを使用してホモジナイズします。マイクロ遠心チューブは、タンパク質の分解を防ぐために均質化しながら氷の上に維持する必要があります。
    2. 4 °Cで1時間、軽い回転で組織の均質化をインキュベートする。
    3. 遠心分離機組織は、4°Cで15分間16,000xgで均質化し、上清を回収する。
    4. 上清中のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン(BSA)を標準として定めます。
    5. 各脳サンプル中のモノアミン含有量を、脳組織の 250 μL で測定したタンパク質の総含量(μg)に正規化します。以下の式を使用して、nmolモノアミン/gタンパク質を決定します。df = 希釈係数。

Equation 1

6. 統計分析

  1. 一方向のANOVAを使用してモノアミン放出(nmol/g)を分析し、続いてシダックの多重比較テストを行い、ポストホック比較を行います。
  2. 独立したグループのための非対の学生の t検定を使用して組織の生存率を分析します(コントロール対1%Triton X-100)。
  3. すべての統計分析で、アルファレベルを 0.05 ≤に設定します。

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Representative Results

この技術は、内部組織ホルダーを備えた48ウェルプレートに基づく電気化学的検出を用いたHPLCを用いた内因性モノアミンの放出を測定するための脳スライスの使用を説明する。実験用セットアップは 図1 および 図2に示されている。最初に、実験の終わりまでに組織の生存率を確保するために、MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物、テトラゾール)アッセイを行った。機能的実験の後、急性脳スライスは代謝活性であり、細胞死の状態である1%Triton X-100でインキュベートされたものと比較して生存可能であり続ける(図3)。

急性,20分,AMPHを用いた海馬および前頭前野の脳切片の治療は,各モノアミンの細胞外レベルの有意な増加を誘発する(図4A,B)。AMPH(30 μM)は、海馬スライスおよび前頭前野スライスからの細胞外5-HTのレベルを220倍および64倍、細胞外NEを19倍および8倍、細胞外DAをそれぞれ8倍および7倍に増加させた。同様の実験は、選択的セロトニン再取り込み阻害剤であるフルオキセチン(10μM)の存在下で行われた。フルオキセチンによるSERTの阻害は、海馬と前頭前野の両方でAMPHによって誘発される細胞外5-HTの増加を防ぐ。対照的に、フルオキセチンは、同じ脳領域における細胞外DAまたはNEに対するAMPHの影響に影響を及ぼさない、SERTに対する選択性と一致する(図4A、B)。すべての実験条件を三重で行った。

2mmの後回り線条体パンチからのモノアミンの放出を次に測定した。AMPH(10 μM)による底線パンチの急性20分の治療は、基底レベルに対するDA(図4C)の細胞外レベルの35倍の増加を誘発する。DA検出は、この領域で以前に報告された5-HTおよびNEの低い基底レベルのために、側側線条体に焦点を当てた62,63.このように、AMPHは、AMPHによって誘導される細胞外DAレベルと比較して、細胞外5-HTの軽度の用量依存的増加を誘導する(データは示さない)。モノアミントランスポーターブロッカーであるコカイン(40μM)による後回線パンチのインキュベーションは、AMPHとのみインキュベートされたパンチと比較してAMPH誘導細胞外DAを有意に阻害した(図4C)。このデータは、AMPHがDAT16を介してDA流出を誘導したことを示す以前の知見をさらに支持する。

最後に、モノアミンの外発性放出を実証するために、脳切片をKCl(40 mM)でインキュベートした。細胞外KClの濃度を増加させ、40mMのKClでインキュベーションを介して膜脱分極を誘発し、対照条件に対して比較した場合にモノアミンの排泄性放出を誘導するのに十分である(図5)。フルオキセチンもコカインも、KCl膜脱分極によって誘導されるモノアミンの細胞外レベルの増加を妨げない。

Figure 1
図1:急性ラットの脳スライスと切片の準備.(A)ラット脳が脳マトリックスに配置されている。上方のカットは、視のチアズムの上部を表します。下切りは視床下部の基部の3mm後部である。海馬と線条体を取り除き、スライスする前に標本を圧縮物またはビブラートームにしっかりと接着する水平ベースを確保するためにカットを行った。(B-D)スーパー接着剤はステージの基部の周りに広がり、脳を接着し、すぐにアガロースで覆われ、アガロースは冷凍クランプ(D)を使用して固化した。(E-F)ラットの脳に300μmのスライスを作るために圧縮を使用し、使用するまでスライスを酸素化された緩衝液に入れた。(G)セクションをスライドに配置し、2mmの裏線条体のパンチを作りました。(G)側底線のパンチ(上)、海馬の切り抜き(中央)、皮質(下)の切り抜きは、機能実験を開始する前に酸素解離緩衝液中で4°Cに維持される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:流出実験のために設定された実験的な実験.(A)流出チャンバーは、48ウェル組織培養プレートとカルボーゲンラインに接続された組織ホルダートレイで構成されています。(B)組織活性化(B1)を有する内因性モノアミン流出実験の実験計画を示す図であって、モノアミントランスポーター阻害剤(B2)を伴う/無しの前インキュベーション、流出実験(B3)、および最終サンプル処理(B4-B5)が提示される。(C) 左側のパネルは、自動注入に備えてパーフューザ剤をHPLCにロードする実験者を描いています。右側のパネルは、モノアミン標準ピークを示す代表的なクロマトグラムを示しています。曲線下の領域(AUC)は、モノアミン標準および脳サンプルごとに測定されます。較正後、各脳サンプルについて測定されたAUCは、nM濃度に変換される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:急性脳スライスは実験の終わりまでに実行可能であった。 MTTアッセイを行い、組織の生存率を判定し、トリトンX-1001%と比較して、細胞死を誘導した。MTTアッセイの結果は、6時間の終わりまでに、組織サンプルがまだ実行可能であることを示した。結果はSEM(N=6)±平均で表されます。P < 0.0001、ペアになっていない t 検定。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:アンフェタミンは、海馬、前頭前野、および側頭線のパンチからの急性脳スライスにおけるモノアミン放出を誘導する。フルオキセチンは5-HT放出を有意に阻害するが、これらの領域におけるDAまたはNE放出に影響を及ぼさない。(C) 2mmのドーサル線条発パンチをコカイン(40 μM)またはAMPH(30 μM)でインキュベートした。AMPHはDA放出を刺激し、コカインによる前処理はAMPH誘導DA放出の有意な減少につながった。すべての測定は、タンパク質のnmol/gです。統計は、一方向の分散分析を表し、その後にシダックの多重比較検定を行います。結果はSEM(N=6)±平均で表されます。統計は、シダックの多重比較検定を持つ一方向の分散分析を表します (** p = 0.01, *** p = 0.001, **** p = 0.0001)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:細胞外K+が高い結果、膜脱分極を経てモノアミン放出が生じる。(A-B)KCl(40 mM)は、HPCおよびPFCにおける膜脱分極および3つのモノアミンの放出すべてを誘導する。両方の脳領域において、フルオキセチン(10μM)による前処理は、細胞外モノアミン放出に対するKClの影響に影響を及ぼさない。(C) KCl (40 mM) は、膜脱分極とDAの脱分化を陰角線で誘導し、コカイン(40 μM)による前処理は、DA放出に対するKClの影響を与えない。統計は、一方向の分散分析を表し、その後にシダックの多重比較検定を行います。結果はSEM(N=6)±平均で表されます。統計は、シダックの多重比較検定を使用した一方向の分散分析を表します (***p < 0.001、****p < 0.0001)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル: バッファーとソリューションのレシピ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

モノアミン放出測定は、異種細胞、神経細胞培養、脳シナプトソーム、エキソウビボ急性脳スライス、および動物全体で長年にわたって行われてきた13,20,41,42,58,64,65,66,67,68.このような調製物は、モノアミンが役割を果たす神経疾患および精神疾患のための新しい薬理学的薬剤の発見につながる可能性のある基本的な神経伝達物質放出機構を探求する神経科学の分野を可能にした。このような方法の広い使用にもかかわらず、特に放射性手順において、発生源および/または内因性モノアミン放出量に関して一定の制限がある。また、急性期の急性期の切片製剤は、電気生理学的、薬理学的、遺伝的、分子、免疫細胞化学、その他のアプローチと組み合わせて広く使用されてきた18,24,25,47,50,51,59,69,70彼らは組織アーキテクチャを維持し、神経活性とシナプス接続の両方を保持する。したがって、脳スライスは、異種系、一次培養ニューロン、シナプトソームなどの他のインビトロモデルと比較すると、例外的な利点を提供します。主に、これらのシステムがin vivo環境の多くの側面を再現できることが利点です。

電気生理学的、光遺伝学的、蛍光センサー、および電圧測定アプローチは、モノアミン放出、特にDAに関連するメカニズムを調べるために、絶妙な時間的および空間的分解能を提供する。しかし、これらのアプローチを使用するための基本的な前提は、ニューロンの電気的または光誘発刺激が古典的な、および十分に文書化されたカルシウム依存性神経伝達物質の興奮性の静脈放出を誘発することである18、21、22、24、27,30。これらのアプローチのより識別可能な制限の1つは、代替機構(すなわち、非潜水放出)を介して放出されるモノアミンがこれらの技術によって検出されないことである。放射線標識された神経伝達物質分子は、モノアミン放出を研究するためにも使用されてきたが、このアプローチは大きな制限がある。細胞または組織サンプルは、ネイティブ環境を忠実に再現しない標識された神経伝達物質の非生理的濃度をロードする20,42,46。興味深いことに, いくつかの研究は、内因性モノアミンリリース53,54,56を調べるためにスーパーフュージョンシステムにおける脳スライスの使用を文書化.しかし,これらの研究は放射性神経伝達物質を用い, そして、内因性神経伝達物質を調べるものは、神経伝達物質の放出を誘導するK+および非生理学的条件のみに焦点を当てる.

現在提示されている方法は、ネイティブ組織からのトランスポーター媒介モノアミン放出を調べるために使用することができる。これは、実験者が三角神経伝達物質の限界を克服することができます.さらに、このアプローチは、蛍光センサーや放射性標識モノアミンを使用する場合の間接的な測定ではなく、モノアミンの直接検出を通じて、内因性モノアミン放出をより正確に測定する簡単な設定を提供します。アンフェタミンは、前頭前野71、後側線条体56,72、および海馬39脳領域におけるモノアミン輸送剤放出剤として機能することは十分に確立されている。これらの知見は、この48ウェルプレートシステムを用いて確認された。さらに、この方法は、HPLC-ECDを用いた全モノアミン含有量を測定する現在使用されている方法の補足となるが、モノアミン放出5,6,7を調べていない可能性がある。この方法は、電気化学的検出と組み合わせたHPLCを用いた急性脳スライスからのモノアミンの内因性放出を測定するように設計された新規のエレータを提供する。

この方法を用いる間、脳組織が劣化を防ぐために実験中に酸素化緩衝液中で冷たく保たれていることが重要です。さらに、モノアミンの分解を防ぐために、使用する組織がパルジリンを含む緩衝液内で活性化することが重要です。また、実験者はこの方法の複数の側面をトラブルシューティングしなければならない場合がある。まず、動物の発達的なタイムポイントまたは種に応じて、より小さいまたはより大きなセクションを作成するか、または条件ごとに多かれ少なかれセクション、スライス、またはパンチを使用する必要があります。第二に、関心のある脳領域に応じて、各神経伝達物質の量が変化する。第三に、注意すると酸素の一貫したバブリングを確保することが重要であるが、実験者は、これが井戸から組織の偶発的な除去につながる可能性があるため、余分な酸素化を提供しないように注意する必要があります。最後に、さまざまなタイプのHPLCデバイスと異なる分離カラムがあるので、実験者は、どのデバイスまたはカラムが実験に最適かを文献に基づいて決定する必要があります。

この方法は、内因性モノアミンの放出に関する元生体データを迅速かつ正確に取得する能力を実験者に提供するが、留意しなければならない制限がある。これはex vivoアプローチであるため、ネットワークと接続が切断されるため、スライスやパンチは無傷のシステムを代表していません。このアプローチのもう一つの重要な制限は、時間的な欠如であり、モノアミン放出としての空間分解能は、分の時間スケールで測定され、放出部位の集団から測定される。今後のアプローチの改良により、時間と空間の解像度を最適化できる可能性があります。さらに、リリース イベントに関連するメカニズムも検証します。現在の方法の妥当性を実証した後、将来の実験では、モノアミン放出につながる分子事象を解剖する必要があります。追加の実験には、Ca2+フリーの流出バッファー、および追加のコントロールとしての静脈放出の選択的阻害剤が含まれる。モノアミンとその輸送体の地域分布は3つの独立したイベントなので、将来の実験では、さまざまな薬物条件がより短いまたはより長いインキュベーション時間を必要とする可能性があるため、より広範な薬理学とタイムコース研究を組み込む必要があります。例えば、使用される局所分布または組織の種類に基づいて、さらなる実験は、それぞれ、デシプラミン、フルオキセチン、およびGBR12909のようなNET、SERT、またはDATに対してより特異的な薬理学的ブロッカーを使用し得る。さらに、実験中も組織は生存可能であったが、実験者は、プロセス全体の期間中にモノアミン輸送体機能が影響を受けた可能性を排除することができない。この方法に必要な装置は低コストですが、高価なHPLC-ECDにアクセスする必要があります。多くの人が現在、共同使用のためにHPLC-E6にアクセスしているので、これはコア施設によって軽減される可能性があります。このような制限にもかかわらず、現在の方法は、モノアミン放出を調査するためにさらに操作することができる基本的な手順を提供する。

一般に、この方法は、異なる脳領域からのex vivo急性脳スライスを使用して、成体げっ歯類ニューロンからのモノアミンの同時放出を評価するための、シンプルで高いスループットと低コストの2段階の手順を提供する。理想的には、この方法はin vivoプロトコルと組み合わせることができ、それは実験者が動物福祉の「3つのRs」(交換、削減、および改良)で推奨されるように、インビボモデルで必要な動物の数を減らすことを可能にする予備的なデータを提供する。したがって、モノアミン恒常性における脱規則に伴う状態の治療のための新しい薬理学的薬剤を発見することを目的として、潜在的に治療分子のスクリーニングのためにこのex vivoプラットフォームを実施することが可能である。

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Disclosures

著者は開示を持っていません。

Acknowledgments

この作品は、フォンデサイト開始基金N 11191049をJ.A.P.に付与し、NIHはG.E.TにDA038598を付与することによって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 Well plate NA NA Assay
Acetonitrile Fischer Scientific A998-1 Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous Sigma Aldrich C1016 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software Anetc
Citric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
D-(+)-Glucose Sigma 1002608421 Dissection Buffer
DMF Sigma Aldrich D4551 MTT Assay
EDTA-Na2 Sigma Aldrich Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad Software, Inc Statistical Analysis
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Lysis buffer
HEPES Sigma Aldrich H3375 Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric Anetc HPLC, LC-EC system
HPLC Amuza HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid Sigma Aldrich A5960 Dissection Buffer
Magnesium Sulfate Sigma 7487-88-9 KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree Millipore C7554 Assay - 6 to fit in 48 well plate
MTT Thermo Fisher M6494 MTT Assay
Nanosep VWR 29300-606 Assay; protein assay
Octanesulfonic acid Sigma Aldrich V800010 Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate Sigma Aldrich P8013 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
Potassium Chloride Sigma 12636 KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic Sigma 1001655559 KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z Precissonary Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P2714 Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 Dissection Buffer
Sodium Chloride Sigma S3014 KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma Aldrich L3771 Lysis buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 MTT Assay / Lysis buffer

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神経科学、問題174、モノアミン放出、急性脳スライス、モノアミン、ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン、神経伝達
急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ
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Pino, J. A., Awadallah, N., Norris,… More

Pino, J. A., Awadallah, N., Norris, A. M., Torres, G. E. A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (174), e62127, doi:10.3791/62127 (2021).

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