Summary
Denna metod introducerar en enkel teknik för detektion av endogen monoaminfrisättning med hjälp av akuta hjärnskivor. Inställningarna använder en 48-brunnsplatta som innehåller en vävnadshållare för monoaminfrisättning. Frisläppt monoamin analyseras av HPLC i kombination med elektrokemisk detektion. Dessutom ger denna teknik en screeningmetod för läkemedelsupptäckt.
Abstract
Monoamin signalsubstanser är associerade med många neurologiska och psykiatriska sjukdomar. Djurmodeller av sådana tillstånd har visat förändringar i monoamin neurotransmittor release och upptag dynamik. Tekniskt komplexa metoder som elektrofysiologi, snabbskanning cyklisk voltammetri (FSCV), avbildning, in vivo mikrodialys, optogenetik eller användning av radioaktivitet krävs för att studera monoaminfunktion. Metoden som presenteras här är en optimerad tvåstegsmetod för att upptäcka monoaminfrisättning i akuta hjärnskivor med hjälp av en 48-välplatta som innehåller vävnadshållare för att undersöka monoaminfrisättning och högpresterande vätskekromatografi i kombination med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) för monoaminfrisättningsmätning. Kortfattat erhölls rått hjärnavsnitt som innehåller regioner av intresse, inklusive prefrontal cortex, hippocampus och dorsal striatum med hjälp av en vävnadsdelare eller vibratom. Dessa regioner av intresse dissekerades från hela hjärnan och inkuberades i en syresatt fysiologisk buffert. Livskraften undersöktes under hela den experimentella tidskursen, med 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analys. De akut dissekerade hjärnregionerna inkuberades i olika läkemedelsförhållanden som är kända för att inducera monoaminfrisättning genom transportören (amfetamin) eller genom aktivering av exocytotisk vesikulär frisättning (KCl). Efter inkubation samlades de frigjorda produkterna i supernatanten in och analyserades genom ett HPLC-ECD-system. Här detekteras basal monoaminfrisättning av HPLC från akuta hjärnskivor. Dessa data stöder tidigare in vivo- och in vitro-resultat som visar att AMPH och KCl inducerar monoaminfrisättning. Denna metod är särskilt användbar för att studera mekanismer i samband med monoamin transportörberoende frisättning och ger en möjlighet att screena föreningar som påverkar monoamin release på ett snabbt och billigt sätt.
Introduction
En mängd neurologiska och psykiatriska sjukdomar är associerade med dysregulation eller otillräckligt underhåll av monoamin signalsubstansen (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homeostas1,2,3. Dessa tillstånd inkluderar, men är inte begränsade till, depression1,2, schizofreni2, ångest2, missbruk4, klimakteriet5,6,7, smärta8 och Parkinsons sjukdom3. Till exempel har flera råttmodeller av klimakteriet visat att dysregulation eller minskning av monoaminer inom hippocampus, prefrontal cortex och striatum kan vara förknippade med både depression och kognitiv nedgång, vilket ses hos kvinnor som upplever klimakteriet. Dysregulation av monoaminer i dessa modeller har undersökts utförligt med hplc-ECD, även om studierna inte diskriminerade mellan uppmätt signalsubstansinnehåll jämfört med neurotransmittor release5,6,7. Monoaminer frigörs klassiskt i det extracellulära utrymmet genom Ca2 +-beroende vesikulär frisättning9, och återvinns tillbaka genom deras respektive plasmamembranåterupptagssystem (dopamintransportör, DAT; serotonintransportör, SERT; noradrenalintransportör, NET)10,11. Omvänt tyder data på att dessa transportörer kan frigöra eller effluxmonaminer, eftersom droger av missbruk som amf och 3,4-Metylendioximetamfetamin (MDMA) är kända för att släppa DA respektive 5-HT, genom sina transportsystem12,13,14,15,16,17 . Således är en korrekt mekanistisk förståelse av monoamin release dynamik avgörande för att utveckla specifika och riktade farmakoterapier.
Ett brett spektrum av tekniker har använts för att studera monoaminfrisättning som Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo microdialys13, imaging19, preincubation med radiomärkta monoaminer20, optogenetik och mer nyligen genetiskt kodade fluorescerande sensorer och fotometri21,22 . FSCV och in vivo mikrodialys är de primära teknikerna som används för att studera monoaminfrisättning. FSCV används för att studera stimulerad exocytotisk frisättning av, främst, DA i akuta hjärnskivor och in vivo23. Eftersom FSCV använder elektroder för att stimulera eller framkalla frisättning är den primära källan till frisättning av signalsubstansen Ca2+-beroende vesikulär frisättning18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialys i kombination med HPLC mäter förändringar i extracellulära signalsubstansnivåer med hjälp av en sond placerad i ett hjärnområde av intresse13,32. I likhet med FSCV är en stor begränsning av in vivo mikrodialys svårigheten att bestämma källan till neurotransmittor release: Ca2 + beroende vesikulär frisättning eller transportör beroende. Anmärkningsvärt, båda metoderna möjliggör direkt mätning av monoaminfrisättning. Genom den senaste utvecklingen av optogenetik visar forskning upptäckt av 5-HT och DA-frisättning på kort tid med utsökt celltyps specificitet21,22. Dessa strategier kräver dock komplexa och kostsamma tekniker och utrustning, och indirekt mäta monoaminfrisättning, särskilt genom monoaminbindning till receptorer. Vidare används radiomärkta monoaminer också för att studera monoamindynamik. Radiomärkta monoaminer kan förinstalleras i olika modellsystem såsom heterologa celler som överuttrycker varje monoamintransportör20,33,34,35,36,37,38,39,40, primära nervceller20, synaptosomer33,39,41, 42, och akut hjärnskivor43,44. Radioaktivitet utgör dock potentiell skada för experimenteraren, och de tritiummärkta analyterna får inte troget rekapitulera endogen monoamindynamik45,46. Superfusionssystem i kombination med off-line detektionsmetoder såsom HPLC-ECD har gjort det möjligt att detektion av monoaminer från flera vävnadskällor. Här ger detta protokoll som en optimerad och billig, enkel och exakt metod med hjälp av akuta hjärnskivor för att direkt mäta endogen basal och stimulerad monoaminfrisättning.
Akuta hjärnskivor gör det möjligt att testa mekanistiska hypoteser, främst eftersom de bevarar in vivo anatomisk mikromiljö och upprätthåller intakt synapser47,48,49,50,51,52. I några studier har akuta hjärnskivor eller hackad hjärnvävnad använts tillsammans med en superfusionsteknik med KCl för att stimulera Ca2 + medierad frisättning53,54,55,56. Superfusionssystem har varit avgörande för att främja fältets förståelse av signalsubstansens frisättningsmekanismer, inklusive monoaminer. Dessa system är dock relativt dyra, och antalet kammare som är tillgängliga för vävnadsanalys varierar från 4-12. I jämförelse är metoden som presenteras här billig, tillåter mätning av 48 vävnadsprover och kan förfinas för att använda upp till 96 vävnadsprover. Varje brunn inom 48-brunnsplattan innehåller vävnadshållare som använder filter för att separera den frigjorda produkten från vävnaden, och frigjorda monoaminer samlas sedan in och analyseras av HPLC-ECD. Viktigt är att denna metod möjliggör samtidig mätning av 5-HT, DA och NE frisättning från olika hjärnområden såsom prefrontal cortex, hippocampus och dorsala striatum efter behandling med farmakologiska medel som modulerar monoamin release. Således kan experimenteraren svara på flera frågor med hjälp av ett billigt flerbrunnssystem som ökar antalet testade prover och därmed minskar antalet djur som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment, inklusive djurhantering och vävnadsinsamling, utfördes i enlighet med University of Florida och City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), enligt det godkända protokollet 201508873 (UF) och 1071 (CCNY). För reagenser och buffert, se tilläggsfilen.
1. Förbered akuta råtthjärnskivor
OBS: I detta experiment användes vuxna hanråttor (250-350 g). Denna uppsättning är dock funktionell för olika utvecklingspunkter, honråttor och andra arter. Om du använder ett mindre djur, till exempel möss, kan experimenteraren justera för att optimera protokollet genom att använda ett annat antal hjärnskivor eller stansar per tillstånd. Dissekeringsbufferten kallas buffert 1. utflödesbuffert kommer att kallas buffert 2.
- Förbered buffert 1 som nämns i tilläggsfilen. Mätta Buffert 1 med syre genom att bubbla med 95%/5% (O2/CO2) i 20 min på is. Ta bort 50 ml buffert 1 och kyl på is i en liten bägare eller en Petriskål. Denna buffert används för att hålla den akut skördade hela hjärnan.
- Bedöva en eller två vuxna råttor (250-350 g) med 1%-2% isofluran, halshugga dem med en giljotin och snabbt ta bort deras hjärnor. Placera omedelbart hjärnan i iskall syresatt buffert 1 i behållaren från steg 1.1.
OBS: Se till att isofluran och giljotin används på ett säkert sätt. Öppna isofluran under en rökhuv. - Med hjälp av en vibratom eller compresstom skär du 300 μm koronalhjärnsektioner från varje intresseregion (figur 1). Bubblande buffert 1 måste finnas medan sektioner tillverkas. Med hjälp av en spatel i rostfritt stål överför du försiktigt och omedelbart hjärnskivor till en ny Petri-skål fylld med iskall syresatt buffert 1 (figur 2).
- Dissekera hjärnskivor (t.ex. stansar, klippa ut) genom att försiktigt flytta skivorna till glasglasglas (figur 1G) med hjälp av råtthjärnatlas57. Identifiera till exempel dorsala striatum baserat på dess mörka, strimmiga struktur och identifiera hippocampus baserat på dess närhet till cortex och unik spiralstruktur. Höger och vänster halvklot kan separeras för att användas som kontroll- och experimentella segment (figurerna 2G - H). Här dissekerades dorsala striatum ytterligare i 2 mm stansar (figur 1G).
- Använd en plastöverföringspipetter med spetsen avskuren, överför skivor eller hjärnslag till små behållare nedsänkta i syresatt iskall buffert 1 med syre bubblande. Dessa behållare kan vara rostfria nät eller små Petri-rätter fyllda med buffert (figur 1H).
2. Ex-vivo endogen monoaminfrisättning från hjärnskivor eller stansar
OBS: Den anordning som används för detta avsnitt består av en 48-brunnsplatta och en vävnadshållare tillverkad av sex mikrocentrifugefilterenheter utan infälld filter ansluten till en karogenlinje (figur 2). För att göra hållaren, använd en robust plaststav (t.ex. från en cellskrot) och superlimma mikrocentrifugefilterenheterna utan infälld filter till den. Låt det torka i 1-2 dagar. Den tid som krävs för det endogena monoaminfrisättningsexperimentet och koncentrationerna av amfetamin, fluoxetin och kokain baseras på aktuell litteratur och tidigare protokoll13,20,58.
-
Aktivering av vävnad
- Överför hjärnvävnaden från steg 1.1.5 till varje brunn i effluxkammaren och tillåt återhämtning i 30-50 min vid 37 °C på en skjutvärmare i 0,5-1 ml syresatt buffert 2, med konstant, mjukt bubblande (figur 2B1).
- Under denna inkubation spädde drogerna till önskad koncentration för experimentet. Alla läkemedel måste lösas upp i buffert 2, och koncentrationerna baseras på den aktuella litteraturen.
-
Första inkubationen
- Flytta vävnadshållaren med hjärnvävnad till brunnar som innehåller 500 μL syresatt buffert 2 och inkubera i 20 min vid 37 °C. Se till att minimal till ingen buffert transporteras över genom att knacka på hållaren på brunnens kant tills ingen överskottsbuffert finns i hållaren.
- I experiment med farmakologiska medel såsom monoamintransportörhämmare, inkubera vävnadsproverna med de läkemedel som späds ut i syresatt buffert 2 (t.ex. 10 μM fluoxetin, 40 μM kokain; se figur 2B2). Den slutliga volymen i varje brunn kommer att vara 500 μL.
-
Andra inkubationen
- Flytta hållaren med vävnaden till en ny uppsättning brunnar som innehåller 500 μL total buffert 2 med eller utan önskad koncentration av varje läkemedel. Se till att det inte finns någon överflödig buffert kvar. Varje brunn representerar en n = 1 för experimentella tillstånd. Varje experimentellt tillstånd utförs i tre exemplar.
- En brunn innehåller en syresatt buffert 2, nästa 10-30 μM AMPH, och den slutliga brunnen innehåller 10-30 μM AMPH plus monoamintransportörhämmare. Varje läkemedel löses upp i syresatt buffert 2.
- Inkubera vävnaden i 20 minuter vid 37 °C med 500 μL av läkemedelssjukdomen.
OBS: Ytterligare brunnar kan inkludera en syresatt hög K + buffert 2 med eller utan monoamintransportörhämmarna. Lös upp varje läkemedel i den syresatta bufferten 2 (500 μL). - Under denna andra inkubation på 20 min, samla upp lösningen från brunnarna från den första inkubationen i steg 2.2.1 och överför till mikrocentrifugerör som innehåller 50 μL 1 N perklorsyra eller fosforsyra (beroende på typen av HPLC, slutlig koncentration 0,1 N). Den slutliga volymen av provet kommer att vara 550 μL. Underhåll mikrocentrifugerör på is och märka rören #1.
- Efter den andra inkubationen på 20 min, flytta vävnadshållaren med hjärnsektioner eller slag till en tom brunn och underhåll plattan på is. Överför supernatanten till mikrocentrifugerör som innehåller 50 μL 1 N perklorsyra eller fosforsyra. Den slutliga volymen av provet blir 550 μL. Underhåll mikrocentrifugerör på is och märka rören #2.
- Tillsätt 1 ml iskall buffert 1 till varje brunn som innehåller vävnad. Samla all vävnad med små pincett och överför till rena mikrocentrifugerör.
- Underhåll rör med hjärnvävnad vid -80 °C. Kassera 1 ml buffert 1 (figur 2B4).
- Filterlösningar som erhålls från varje inkubation med hjälp av mikrocentrifugefilterrör (0,22 μm) vid 2 500 x g i 2min. Använd filtratet för att bestämma monoaminhalten med hjälp av HPLC med elektrokemisk detektion (figur 2B5).
3. Vävnads livskraft
- MTT-analys
OBS: Ett betydande problem med denna experimentella inställning är vävnads livskraft eftersom vävnaden kan användas i upp till flera timmar59. En MTT-analys60,61 används för att bestämma vävnadens livskraft i slutet av experimentet. Denna analys är baserad på omvandlingen av det gula tetrazoliumsaltet MTT (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) till lila formazankristaller av livskraftiga celler med tillräcklig metabolism.- Efter experimentet upprätthåller en separat grupp vävnadsprover och delar upp dem i två grupper.
- Inkubera en grupp i 20 minuter vid 37 °C i Triton X-100 (1%) upplöst i buffert 2 som en kontroll. Triton X-100 behandling resulterar i celldöd. Behåll den andra gruppen i buffert 2 och inkubera inte i Triton X-100 (vävnadsviabilitetskontroll).
- Tillsätt MTT (stamlösning 5 mg/ml i PBS, pH 7,4) till båda grupperna i den syresatta buffert 2 till en slutlig koncentration på 0,5 mg/ml.
- Inkubera vävnadsproverna i 20 minuter vid 37 °C, tvätta med PBS och överför till mikrocentrifugerör som innehåller 250 μL av en blandning av SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) och vatten för att lösa upp formazankristallerna.
- Inkubera proverna i 24 timmar.
- Centrifugera rören vid 10 000 x g i 10 minuter och mät supernatantens absorbans (200 μL) vid 562 nm och 690 nm med hjälp av en mikroplatta. Vävnadens livskraft beräknas på följande sätt: (A562-A690)/vävnadsvikt.
4. HPLC-analys av monoaminer
- Kvantifiera monoaminutsläpp från varje försöks tillstånd med HPLC-ECD enligt tidigare protokoll13,44, med hjälp av en kolumn i omvänd fas.
- Förbered den mobila fasen som krävs för detektering. Detta består av 100 mM fosforsyra, 100 mM citronsyra, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L oktansulfonsyra, 8% v/v acetonitril (slutligt pH 6,0). Sammansättningen av den mobila fasen är beroende av vilken typ av HPLC och kolumn som används.
- Ställ in den elektrokemiska detektorns potential (2 mm glasaktig kolelektrod) till 0,46 V och ställ in flödet till 0,05 ml/min.
- Ladda 5 μL av varje prov, inklusive neurotransmittorstandarder i HPLC för autoinjektion och detektion. Mängden av varje prov som tillsätts beror på vilken typ av HPLC som används.
- När HPLC har slutfört körningen använder du den angivna HPLC-analysprogramvaran för att hämta och analysera kromatografdata.
- Analysera monoaminhalten med hjälp av en standardkurva som består av varje monoamin (dopamin: DA, noradrenalin: NE, och Serotonin: 5-HT; Figur 2C). Använd de resulterande kromatogrammen för att erhålla området under kurvan (AUC) baserat på tillverkarens riktlinjer.
5. Förbereda vävnadslystna för proteinkvantifiering
-
Proteinanalys
- Tillsätt iskall lysbuffert plus proteashämmare (0,1 g/1 ml) till varje mikrocentrifugerör som innehåller hjärnsektioner/stansar och homogenisera med hjälp av en pestle homogenisator. Mikrocentrifugerören måste bibehållas på is samtidigt som de homogeniseras för att förhindra proteinnedbrytning.
- Inkubera vävnadshomogenat i 1 h vid 4 °C med lätt rotation.
- Centrifugvävnad homogenat vid 16 000 x g i 15 minuter vid 4 °C och återvinn supernatanten.
- Bestäm proteinkoncentrationen i supernatanterna, med bovint serumalbumin (BSA) som standard.
- Normalisera monoaminhalten i varje hjärnprov till det totala proteininnehållet (μg) mätt i 250 μL hjärnvävnad som lyses. Använd nedanstående formel för att bestämma nmolmonoamin/g-proteinet. df = utspädningsfaktor.
6. Statistisk analys
- Analysera monoaminfrisättning (nmol/g) med enkelriktad ANOVA följt av Sidaks multipla jämförelsetest för post-hoc-jämförelser.
- Analysera vävnadsviabilitet med hjälp av en Unpaired Students t-test för oberoende grupper (Control vs. 1% Triton X-100).
- För alla statistiska analyser, ställ in alfanivån till ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna teknik beskriver användningen av hjärnan skivor för att mäta frisättningen av endogena monoaminer med HPLC med elektrokemisk detektion baserad i en 48-väl platta med en inre vävnad hållare. Experimentell uppsättning visas i figur 1 och figur 2. Inledningsvis, för att säkerställa vävnad livskraft i slutet av experimentet, utfördes en MTT (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid, en tetrazol) analys. Efter funktionella experiment är de akuta hjärnskivorna metaboliskt aktiva och förblir livskraftiga jämfört med de som inkuberas med 1% Triton X-100, ett tillstånd av celldöd (figur 3).
Akut, 20 min, behandling av hippocampal och prefrontal cortex hjärnsektioner med AMPH inducerar en betydande ökning av de extracellulära nivåerna av varje monoamin (figur 4A, B). AMPH (30 μM) ökade nivån av extracellulär 5-HT från hippocampal skivor och prefrontal cortex skivor med 220-faldig och 64-faldig, extracellulär NE med 19-faldig och 8-faldig, och extracellulär DA med 8-faldig respektive 7-faldig. Liknande experiment utfördes i närvaro av fluoxetin (10 μM), en selektiv-serotoninåterupptagshämmare. Hämning av SERT med fluoxetin förhindrar ökningen av extracellulär 5-HT inducerad av AMPH i både hippocampus och prefrontal cortex. Fluoxetin påverkar däremot inte effekten av AMPH på extracellulär DA eller NE i samma hjärnområden, i överensstämmelse med dess selektivitet för SERT (figur 4A, B). Alla experimentella villkor utfördes i tre exemplar.
Frisättningen av monoaminer från 2 mm dorsala striatum stansar mättes nästa. Akut, 20 min, behandling av dorsala striatumslag med AMPH (10 μM) inducerar en 35-faldig ökning av de extracellulära nivåerna av DA (figur 4C) över basala nivåer. DA detektion var fokuserad i dorsala striatum på grund av att de lägre basala nivåerna av 5-HT och NE tidigare rapporterats i denna region62,63. AMPH inducerar således en mindre dosberoende ökning av extracellulär 5- HT jämfört med extracellulära DA-nivåer som induceras av AMPH (data visas inte). Inkubation av dorsala striatumslag med kokain (40 μM), en monoamintransportör blockerare, resulterade i en betydande hämning av AMPH-inducerad extracellulär DA jämfört med stansar inkuberas enbart med AMPH (figur 4C). Dessa data stöder ytterligare tidigare resultat som tyder på att AMPH inducerade DA efflux genom DAT16.
Slutligen, för att påvisa exocytotisk frisättning av monoaminer, hjärnavsnitt inkuberades med KCl (40 mM). Att öka koncentrationen av extracellulär KCl för att framkalla membrandepolarisering via inkubation med 40 mM KCl är tillräckligt för att inducera exocytotisk frisättning av monoaminer jämfört med kontrollförhållanden (figur 5). Varken fluoxetin eller kokain blockerar ökningen av de extracellulära nivåerna av monoaminer som induceras av KCl membran depolarisering.
Bild 1: Akut råtthjärnskiva och sektionsberedning. (A) En råtthjärna placeras i en hjärnmatris. Ett överlägset snitt betecknar toppen av den optiska chiasmen; det sämre snittet är 3 mm bakre av hypotalamus botten. Nedskärningar gjordes för att ta bort hippocampus och striatum, och för att säkerställa en horisontell bas för att limma provet till compresstomen eller vibratomen säkert före skivning. (B-D) Superlim spreds runt basen av scenen, hjärnor limmades på, omedelbart täckt med agaros, och agarosen stelnade med hjälp av den frusna klämman i (D). (E-F) En kompresstom användes för att göra 300 μm skivor för råtthjärnan, och skivor placerades i syresatt buffert fram till användning. (G) Sektioner placerades på en rutschkana och 2 mm slag av dorsal striatum gjordes. (G) Stansar av dorsala striatum (överst), utskärningar av hippocampus (mitten) och utskärningar av cortex (botten) bibehålls vid 4 °C i syresatt dissekeringsbuffert innan funktionella experiment påbörjas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Experimentellt inrättat för utflödesexperiment. (A) Utflödeskammaren består av en 48-väl mjukpappersodlingsplatta och en vävnadshållare bricka ansluten till karogenlinjen. B) Ett diagram som visar den experimentella utformningen för det endogena monoaminutflödesexperimentet där vävnadsaktiveringen (B1), preinkubation med/utan monoamintransportörhämmare (B2), effluxexperimentet (B3) och den slutliga provbehandlingen presenteras (B4-B5). (C) Den vänstra panelen föreställer en experimenterare som laddar perfusatet i HPLC som förberedelse för automatisk injektion. Den högra panelen visar ett representativt kromatogram som betecknar monoaminstandardtopparna. Området under kurvan (AUC) mäts för varje monoaminstandard och hjärnprover. Efter kalibrering omvandlas AUC mätt för varje hjärnprov till nM-koncentration. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Akuta hjärnskivor var livskraftiga i slutet av experimentet. En MTT-analys utfördes för att bestämma vävnadens livskraft och jämfördes med Triton X-100 1%, vilket inducerar celldöd. Resultatet av MTT-analysen visade att vävnadsproverna fortfarande var livskraftiga i slutet av 6 timmar. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SEM (N = 6). P < 0,0001, oparat t-test . Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Amfetamin inducerar monoaminfrisättning i akuta hjärnskivor från hippocampus, prefrontal cortex och stansar av dorsala striatum. (A-B) Hippocampal och prefrontal cortex skivor inkuberas i 30 μM AMPH resulterar i en betydande ökning av 5-HT, DA och NE release. Fluoxetin hämmar signifikant frisättningen av 5 HT, men har ingen inverkan på DA- eller NE-frisättningen i dessa regioner. C) 2 mm dorsala striatumslag inkuberades i kokain (40 μM) eller AMPH (30 μM). AMPH stimulerade DA release och förbehandling med kokain ledde till en betydande minskning av AMPH inducerad DA release. Alla mätningar är i nmol/g protein. Statistiken representerar en enkelriktad ANOVA följt av Sidaks multipla jämförelsetest. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SEM (N = 6). Statistiken representerar en enkelriktad ANOVA med Sidaks multipla jämförelsetest (** p = 0,01, *** p = 0,001, **** p = 0,0001). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Hög extracellulär K+ resulterar i monoaminfrisättning genom membrandepolarisering. (A-B) KCl (40 mM) inducerar membrandepolarisering och frisättning av alla tre monoaminer i HPC och PFC. (C) KCl (40 mM) inducerar membrandepolarisering och frisättning av DA i dorsal striatum, och förbehandling med kokain (40 μM) påverkar inte effekten av KCl på DA-frisättning. Statistiken representerar en enkelriktad ANOVA följt av Sidaks multipla jämförelsetest. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SEM (N = 6). Statistiken representerar en enkelriktad ANOVA med Sidaks multipla jämförelsetest (***p < 0,001, ****p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande fil: Recept för buffertar och lösningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monoaminfrisättningsmätningar har utförts i flera år i ett antal system som heterologa celler, neuronala kulturer, hjärnsynaptosomer, ex vivo akuta hjärnskivor och hela djur13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . Sådana preparat har gjort det möjligt för neurovetenskap att utforska grundläggande neurotransmittor release mekanismer som kan leda till upptäckten av nya farmakologiska medel för neurologiska och psykiatriska störningar där monoaminer spelar en roll. Trots den omfattande användningen av sådana metoder finns det vissa begränsningar när det gäller källan och/eller mängden endogen monoaminutsläpp, särskilt i radioaktiva förfaranden. Dessutom har ex vivo-preparat av akut hjärnskivor använts i stor utsträckning tillsammans med elektrofysiologiska, farmakologiska, genetiska, molekylära, immunocytokemiska och andra metoder18,24,25,47,50,51,59,69,70 , eftersom de bevarar vävnadsarkitekturen och behåller både neuronal aktivitet och synaptiska anslutningar. Således erbjuder hjärnskivor exceptionella fördelar jämfört med andra in vitro-modeller som heterologa system, primära odlade nervceller och synaptosomer. Till stor del är deras fördel att dessa system kan reproducera många aspekter av in vivo-miljön.
Elektrofysiologiska, optogenetic, fluorescerande sensorer och voltametriska metoder erbjuder utsökt tidsmässiga och rumsliga upplösning för att undersöka mekanismer som är associerade med monoamin release, särskilt DA. Den grundläggande förutsättningen för användningen av dessa metoder är dock att elektrisk eller ljusinducerad stimulering av nervceller inducerar den klassiska och väldokumenterade kalciumberoende exocytotiska vesikulära frisättningen av neurotransmittorer18,21,22,24,27,30. En av de mer märkbara begränsningarna i dessa metoder är att monoaminer som frigörs via alternativa mekanismer (dvs. icke-vesikulär frisättning) inte detekteras av dessa tekniker. Radiomärkta signalsubstansmolekyler har också använts för att studera monoaminfrisättning, men detta tillvägagångssätt har betydande begränsningar. Celler eller vävnadsprover är laddade med icke-fysiologiska koncentrationer av märkta signalsubstanser som inte troget rekapitulerar den inhemska miljön20,42,46. Intressant nog dokumenterar några studier användningen av hjärnskivor i superfusionssystem för att undersöka endogen monoaminfrisättning53,54,56. Emellertid, dessa studier använder radioaktiva signalsubstanser, och de som undersöker den endogena signalsubstansen fokuserar endast på K + och icke-fysiologiska villkor för att inducera signalsubstans frisättning.
Den för närvarande presenterade metoden kan användas för att undersöka transportör-medierad monoamin release från inhemska vävnad. Detta gör det möjligt för experimenteraren att övervinna begränsningarna hos tritiated signalsubstanser. Dessutom ger detta tillvägagångssätt en enkel inställning för att mäta endogen monoamin release mer exakt genom en direkt detektion av monoaminer snarare än indirekt mätning vid användning av fluorescerande sensorer eller radiomärkt monoamin. Det är väl etablerat att amfetamin fungerar som en monoamin transportör release agent i prefrontal cortex71, dorsala striatum56,72 och hippocampal39 hjärnan regioner. Dessa resultat bekräftades med hjälp av detta 48-brunnsplåtsystem. Dessutom kan denna metod visa sig vara ett komplement till de metoder som för närvarande används och som mäter den totala monoaminhalten med hplc-ECD men som inte har undersökt monoaminfrisättning5,6,7. Denna metod ger en ny luftare utformad för att mäta den endogena frisättningen av monoaminer från akuta hjärnskivor med HPLC i kombination med elektrokemisk detektion.
När du använder denna metod är det viktigt att hjärnvävnaderna hålls kalla i syresatt buffert under experimentet för att förhindra försämring. Dessutom är det viktigt att de vävnader som används aktiveras i en buffert som innehåller pargylin för att förhindra monoaminnedbrytning. Dessutom kan experimenteraren behöva felsöka flera aspekter av den här metoden. För det första, beroende på djurets utvecklingstidpunkt eller art, kan man behöva skapa mindre eller större sektioner eller använda mer eller mindre sektioner, skivor eller stansar per tillstånd. För det andra, beroende på hjärnregionen av intresse, kommer det att finnas olika mängder av varje neurotransmittor. För det tredje, även om det är viktigt att säkerställa konsekvent bubblande syre när det noteras, måste experimenteraren vara försiktig så att den inte ger överskott av syresättning eftersom detta kan leda till oavsiktligt avlägsnande av vävnad från brunnen. Slutligen, eftersom det finns olika typer av HPLC-enheter och olika separationskolumner, måste experimenteraren, baserat på litteraturen, bestämma vilken enhet eller kolumn som skulle fungera bäst för deras experiment.
Även om denna metod ger experimenteraren möjlighet att snabbt och exakt få ex-vivo-data om frisättning av endogena monoaminer, finns det begränsningar som måste hållas i åtanke. Eftersom detta är en ex vivo-metod skärs nätverk och anslutningar av, vilket innebär att segmenten eller stansarna inte är representativa för ett intakt system. En annan viktig begränsning av detta tillvägagångssätt är bristen på tidsmässiga och rumslig upplösning som monoamin release mäts i en tidsskala av minuter och från en population av release platser. Framtida förfining av metoden kan möjliggöra en optimering av tids- och rymdupplösning. Ytterligare experiment kommer också att undersöka mekanismerna i samband med releasehändelser. Efter att ha visat giltigheten av den nuvarande metoden kommer framtida experiment att kräva att dissekera de molekylära händelser som leder till monoaminfrisättning. Ytterligare experiment kommer att inkludera Ca2+-fri effluxbuffert och selektiva hämmare av vesikulär frisättning som ytterligare kontroller. Eftersom den regionala fördelningen av monoaminerna och deras transportörer är tre oberoende händelser, måste framtida experiment omfatta mer omfattande farmakologi och en tidsstudie, eftersom olika läkemedelsförhållanden kan kräva kortare eller längre inkubationstider. Till exempel, baserat på regional distribution eller typ av vävnad som används, kan ytterligare experiment använda mer specifika farmakologiska blockerare för NET, SERT eller DAT såsom desipramin, fluoxetin respektive GBR12909. Vidare, även om vävnaden förblev livskraftig under hela experimentet, kan experimenteraren inte utesluta möjligheten att monoamin transportör funktion kan ha påverkats under hela processen. Den utrustning som krävs för denna metod är billig, men det finns ett behov av att ha tillgång till ett dyrt HPLC-ECD. Detta kan mildras av kärnanläggningar, eftersom många för närvarande har tillgång till HPLC-ECD för gemensamt bruk. Trots sådana begränsningar ger den nuvarande metoden ett grundläggande förfarande, som kan manipuleras ytterligare för att undersöka monoaminfrisättning.
I allmänhet ger denna metod en enkel, hög genomströmning och billig tvåstegsprocedur för att utvärdera samtidig frisättning av monoaminer från vuxna gnagare nervceller med hjälp av ex vivo akuta hjärnskivor från olika hjärnregioner. Helst kan denna metod kombineras med in vivo-protokoll, och den ger preliminära data som gör det möjligt för experimenteraren att minska antalet djur som krävs i in vivo-modeller, som rekommenderas i "tre Rs" (Ersättning, minskning och förfining) av djurens välbefinnande. Således är det möjligt att genomföra denna ex vivo-plattform för screening av potentiellt terapeutiska molekyler med målet att upptäcka nya farmakologiska medel för behandling av tillstånd i samband med avregleringar i monoaminhomeostas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag Fondecyt Initiation Fund N 11191049 till J.A.P. och NIH-bidrag DA038598 till G.E.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 Well plate | NA | NA | Assay |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
| Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Clarity Software | Anetc | ||
| Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
| HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
| Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
| Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
| Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
References
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. Medical Clinics of North America. 85 (3), 559-577 (2001).
- Barone, P. Neurotransmission in Parkinson's disease: beyond dopamine. European Journal of Neurology. 17 (3), 364-376 (2010).
- Howell, L. L., Kimmel, H. L. Monoamine transporters and psychostimulant addiction. Biochemical Pharmacology. 75 (1), 196-217 (2008).
- Kirshner, Z. Z., et al. Impact of estrogen receptor agonists and model of menopause on enzymes involved in brain metabolism, acetyl-CoA production and cholinergic function. Life Sciences. 256, 117975 (2020).
- Long, T., et al. Comparison of transitional vs surgical menopause on monoamine and amino acid levels in the rat brain. Molecular and Cellular Endocrinology. 476, 139-147 (2018).
- Long, T., et al. Estradiol and selective estrogen receptor agonists differentially affect brain monoamines and amino acids levels in transitional and surgical menopausal rat models. Molecular and Cellular Endocrinology. 496, 110533 (2019).
- Burke, N. N., et al. Enhanced nociceptive responding in two rat models of depression is associated with alterations in monoamine levels in discrete brain regions. Neuroscience. 171 (4), 1300-1313 (2010).
- Lane, J. D., Aprison, M. H. Calciumm-dependent release of endogenous serotonin, dopamine and norepinephrine from nerve endings. Life Sciences. 20 (4), 665-671 (1977).
- Ramamoorthy, S., Shippenberg, T. S., Jayanthi, L. D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacology and Therapeutics. 129 (2), 220-238 (2011).
- Torres, G. E., Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (1), 13-25 (2003).
- Hilber, B., et al. Serotonin-transporter mediated efflux: A pharmacological analysis of amphetamines and non-amphetamines. Neuropharmacology. 49 (6), 811-819 (2005).
- Mauna, J. C., et al. G protein βγ subunits play a critical role in the actions of amphetamine. Translational Psychiatry. 9 (1), 81 (2019).
- Sitte, H. H., Freissmuth, M. Amphetamines, new psychoactive drugs and the monoamine transporter cycle. Trends in Pharmacological Sciences. 36 (1), 41-50 (2015).
- Johnson, L. A., Guptaroy, B., Lund, D., Shamban, S., Gnegy, M. E. Regulation of amphetamine-stimulated dopamine efflux by protein kinase C β. Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 10914-10919 (2005).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3495-3500 (2005).
- Kantor, L., Hewlett, G. H. K., Gnegy, M. E. Enhanced amphetamine- and K+ -mediated dopamine release in rat striatum after repeated amphetamine: differential requirements for Ca 2+ - and calmodulin-dependent phosphorylation and synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 3801-3808 (2018).
- Brodnik, Z. D., et al. Susceptibility to traumatic stress sensitizes the dopaminergic response to cocaine and increases motivation for cocaine. Neuropharmacology. 125, 295-307 (2017).
- Henke, A., et al. Toward serotonin fluorescent false neurotransmitters: development of fluorescent dual serotonin and vesicular monoamine transporter substrates for visualizing serotonin neurons. ACS Chemical Neuroscience. 9 (5), 925-934 (2018).
- Garcia-Olivares, J., et al. Gβγ subunit activation promotes dopamine efflux through the dopamine transporter. Molecular Psychiatry. 22 (12), 1673-1679 (2017).
- Xiao, N., Privman, E., Venton, B. J. Optogenetic control of serotonin and dopamine release in Drosophila larvae. ACS Chemical Neuroscience. 5 (8), 666-673 (2014).
- Bass, C. E., et al. Optogenetic control of striatal dopamine release in rats. Journal of Neurochemistry. 114 (5), 1344-1352 (2010).
- Stamford, J. A. Fast cyclic voltammetry: measuring transmitter release in "real time". Journal of Neuroscience Methods. 34 (1-3), 67-72 (1990).
- Brodnik, Z. D., Ferris, M. J., Jones, S. R., España, R. A. Reinforcing doses of intravenous cocaine produce only modest dopamine uptake inhibition. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 281-289 (2017).
- Brodnik, Z. D., España, R. A. Dopamine uptake dynamics are preserved under isoflurane anesthesia. Neuroscience Letters. 606, 129-134 (2015).
- Ferris, M. J., Calipari, E. S., Yorgason, J. T., Jones, S. R. Examining the complex regulation and drug-induced plasticity of dopamine release and uptake using voltammetry in brain slices. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 693-703 (2013).
- Siciliano, C. A., Calipari, E. S., Ferris, M. J., Jones, S. R. Biphasic mechanisms of amphetamine action at the dopamine terminal. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (16), 5575-5582 (2014).
- Rice, M. E., et al. Direct monitoring of dopamine and 5-HT release in substantia nigra and ventral tegmental area in vitro. Experimental Brain Research. 100 (3), 395-406 (1994).
- Bunin, M. A., Prioleau, C., Mailman, R. B., Wightman, R. M. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Park, J., Bhimani, R. V., Bass, C. E. In vivo electrochemical measurements of norepinephrine in the brain: current status and remaining challenges. Journal of the Electrochemical Society. 165 (12), 3051-3056 (2018).
- Butcher, S. P., Fairbrother, I. S., Kelly, J. S., Arbuthnott, G. W. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 50 (2), 346-355 (1988).
- Garcia-Olivares, J., et al. Inhibition of dopamine transporter activity by G protein βγ subunits. PLoS One. 8 (3), 1-9 (2013).
- Carneiro, A. M. D., Blakely, R. D. Serotonin-, protein kinase C-, and Hic-5-associated redistribution of the platelet serotonin transporter. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24769-24780 (2006).
- Rajamanickam, J., et al. Akt-mediated regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporter function, cell-surface expression and phosphorylation. The Biochemical Journal. 468 (1), 177-190 (2015).
- Egaña, L. A., et al. Physical and functional interaction between the dopamine transporter and the synaptic vesicle protein synaptogyrin-3. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (14), 4592-4604 (2009).
- Guptaroy, B., Fraser, R., Desai, A., Zhang, M., Gnegy, M. E. Site-directed mutations near transmembrane domain 1 alter conformation and function of norepinephrine and dopamine transporters. Molecular Pharmacology. 79 (3), 520-532 (2011).
- Ordway, G. A., et al. Norepinephrine transporter function and desipramine: Residual drug effects versus short-term regulation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 217-225 (2005).
- Steinkellner, T., et al. Amphetamine action at the cocaine- and antidepressant-sensitive serotonin transporter is modulated by CaMKII. Journal of Neuroscience. 35 (21), 8258-8271 (2015).
- Guptaroy, B., et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Molecular Pharmacology. 75 (3), 514-524 (2009).
- Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42 (10), 1940-1949 (2017).
- Aquino-Miranda, G., Escamilla-Sánchez, J., González-Pantoja, R., Bueno-Nava, A., Arias-Montaño, J. -A. Histamine H3 receptor activation inhibits dopamine synthesis but not release or uptake in rat nucleus accumbens. Neuropharmacology. 106, 91-101 (2016).
- Reddy, I. A., et al. Glucagon-like peptide 1 receptor activation regulates cocaine actions and dopamine homeostasis in the lateral septum by decreasing arachidonic acid levels. Translational Psychiatry. 6 (5), 809 (2016).
- Koutzoumis, D. N., et al. Alterations of the gut microbiota with antibiotics protects dopamine neuron loss and improve motor deficits in a pharmacological rodent model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 325, 113159 (2020).
- Herdon, H., Strupish, J., Nahorski, S. R. Differences between the release of radiolabelled and endogenous dopamine from superfused rat brain slices: Effects of depolarizing stimuli, amphetamine and synthesis inhibition. Brain Research. 348 (2), 309-320 (1985).
- Thongsaard, W., Kendall, D. A., Bennett, G. W., Marsden, C. A. A simple method for measuring dopamine release from rat brain slices. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 37 (3), 143-148 (1997).
- Dorris, D. M., Hauser, C. A., Minnehan, C. E., Meitzen, J. An aerator for brain slice experiments in individual cell culture plate wells. Journal of Neuroscience Methods. 238, 1-10 (2014).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Papouin, T., Haydon, P.
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. Journal of Neurochemistry. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Buskila, Y., et al.
- Kako, H., Fukumoto, S., Kobayashi, Y., Yokogoshi, H. Effects of direct exposure of green odour components on dopamine release from rat brain striatal slices and PC12 cells. Brain Research Bulletin. 75 (5), 706-712 (2008).
- McBride, W. J., Murphy, J. M., Lumeng, L., Li, T. -K. Effects of ethanol on monoamine and amino acid release from cerebral cortical slices of the alcohol-preferring P line of rats. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 10 (2), 205-208 (1986).
- Chen, J. C., Turiak, G., Galler, J., Volicer, L. Effect of prenatal malnutrition on release of monoamines from hippocampal slices. Life Sciences. 57 (16), 1467-1475 (1995).
- Becker, J. B., Castañeda, E., Robinson, T. E., Beer, M. E. A simple in vitro technique to measure the release of endogenous dopamine and dihydroxyphenylacetic acid from striatal tissue using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Neuroscience Methods. 11 (1), 19-28 (1984).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. London. (2007).
- Dailey, J. W., Reith, M. E. A., Steidley, K. R., Milbrandt, J. C., Jobe, P. C. Carbamazepine-induced release of serotonin from rat hippocampus in vitro. Epilepsia. 39 (10), 1054-1063 (1998).
- Buskila, Y., et al.
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice-A model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Rönicke, R., et al. AB mediated diminution of MTT reduction - An artefact of single cell culture. PLoS One. 3 (9), (2008).
- Ihalainen, J. A., Riekkinen, P., Feenstra, M. G. P. Comparison of dopamine and noradrenaline release in mouse prefrontal cortex, striatum and hippocampus using microdialysis. Neuroscience Letters. 277 (2), 71-74 (1999).
- Richards, D. A., Obrenovitch, T. P., Symon, L., Curzon, G. Extracellular dopamine and serotonin in the rat striatum during transient ischaemia of different severities: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 60 (1), 128-136 (1993).
- Fog, J. U., et al. Calmodulin kinase II interacts with the dopamine transporter C terminus to regulate amphetamine-induced reverse transport. Neuron. 51 (4), 417-429 (2006).
- Balázsa, T., Bíró, J., Gullai, N., Ledent, C., Sperlágh, B. CB1-cannabinoid receptors are involved in the modulation of non-synaptic [3H]serotonin release from the rat hippocampus. Neurochemistry International. 52 (1), 95-102 (2008).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 282 (1), 262-270 (1997).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Molecular and Cellular Neuroscience. 39 (2), 211-217 (2008).
- Bowyer, J. F., et al. Interactions of MK-801 with glutamate-, glutamine- and methamphetamine-evoked release of [3H]dopamine from striatal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 257 (1), 262-270 (1991).
- Perszyk, R. E., et al. GluN2D-containing N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic transmission in hippocampal interneurons and regulate interneuron activity. Molecular Pharmacology. 90 (6), 689-702 (2016).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 4029-4034 (1998).
- Jedema, H. P., Narendran, R., Bradberry, C. W. Amphetamine-induced release of dopamine in primate prefrontal cortex and striatum: striking differences in magnitude and timecourse. Journal of Neurochemistry. 130, 490-497 (2014).
- Buchmayer, F., et al. Amphetamine actions at the serotonin transporter rely on the availability of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11642-11647 (2013).
