Summary
この方法は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を有する多能性幹細胞由来心筋細胞を用いてサルコメア短縮を調べるために使用することができる。
Abstract
多能性幹細胞由来心筋細胞(PSC-CM)は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞(ES/iPS)細胞の両方から生成することができる。これらの細胞は、心疾患のモデリングのための有望な情報源を提供する。心筋症のサルコメア短縮は、成人型心筋細胞と共に疾患の型を調べるために使用される標準的な生理学的評価の1つである。しかし、これらの細胞は位相対比顕微鏡では見えないサルコメアを未発達にしているので、利用可能な方法はPSC-CMの収縮性を評価するのに適切ではない。この問題に対処し、PSC-CMでサルコメア短縮を行うために、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質および蛍光ライブイメージングを使用した。細いZ線とM線は、それぞれ両端とサルコメアの中心に存在する。z-ラインタンパク質は、αアクチニン(ACTN2)、テレトニン(TCAP)、アクチン関連LIMタンパク質(PDLIM3)、および1つのM線タンパク質であるミオメシン-2(Myom2))を蛍光タンパク質でタグ付けしました。これらのタグ付きタンパク質は、内因性対立アレスからノックインまたはアデノ関連ウイルス(AAV)から発現することができる。ここでは、マウスとヒト多能性幹細胞を心筋細胞に分化し、AAVを産生し、ライブイメージングを行い、分析する方法を紹介します。また、PSC-CMのパターン培養用ポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプの製造方法についても説明し、蛍光タグ付きタンパク質によるサルコメア短縮の解析を容易にします。サルコメアの短縮を評価するために、拍動細胞のタイムラプス画像を電気刺激(0.5〜1Hz)下で高フレームレート(毎秒50〜100フレーム)で記録した。細胞収縮の過程でサルコメアの長さを分析するために、記録されたタイムラプス画像はImageJ / FijiのプラグインであるSarcOptiMに施されました。我々の戦略は、PSC-CMにおける心疾患のフェノタイプを調査するための簡単なプラットフォームを提供する。
Introduction
心血管疾患は、世界的に死亡率の主な原因である1と心筋症は、心臓関連死の第三の原因を表す2.心筋症は、心臓の筋肉に影響を与える疾患の集合群です。近年のiPS細胞の誘導多能性幹細胞の開発と、iPS細胞の心筋細胞(PSC-CM)に向けた指向分化が開かれて、心筋症のインビトロモデルとして患者ゲノムを用いた心筋細胞を研究する扉が開かれています。これらの細胞は、心疾患の病態生理を理解し、その分子機構を解明し、異なる治療候補3を試験するために使用することができる。多大な関心があり、したがって、患者由来のiPS細胞が生成されている(例えば、肥大性心筋症[HCM]4、5、不整脈性右心室心筋症[ARVC]6、拡張型心筋症[DCM]7、およびミトコンドリア関連心筋症8、9)。心筋症の特徴の1つはサルコメアの機能不全と破壊であるため、サルコメア機能を均一に測定する有効なツールが必要です。
サルコメア短縮は、サルコメア機能および動物モデルおよびヒトに由来する成体心筋細胞の収縮性を評価するために最も広く使用されている技術である。サルコメア短縮を行うためには、位相コントラスト下で見えるよく発達したサルコメアが必要である。しかしながら、インビトロディスプレイ培養されたPSC-CMは、未発達で組織化されていないサルコメアを培養し、したがって、サルコメア短縮10を適切に測定するために使用することができない。PSC-CMの収縮性を適切に評価するこの難しさは、インビトロで心臓機能を評価するためのプラットフォームとしての使用を妨げる。PSC-CMの収縮性を間接的に評価するために、原子間力顕微鏡、マイクロポストアレイ、トラクションフォース顕微鏡、およびインピーダンス測定が、これらの細胞がそれらの周囲に及ぼす運動の影響を測定するために使用されてきた。実際の細胞運動のより洗練された、より侵襲性の低いビデオ顕微鏡記録(例えば、SONYからのSI8000)は、それらの収縮性を評価するために使用することができるが、しかし、この方法はサルコメア運動または力発生動態14を直接測定しない。
PSC-CMのサルコメア運動を直接測定するために、サルコメアタンパク質への蛍光タグ付けなどの新しいアプローチが出現しています。例えば、Lifeactは、サルコメア運動15,16を測定するために糸状アクチン(F-actin)にラベルを付けるために使用される。遺伝子組み換えiPS細胞は、サルコメアタンパク質(例えば、αアクチニン[ACTN2]およびミオメシン-2[MYOM2])を蛍光タンパク質17、18、19によってタグ付けするためのもう一つの選択肢である。
本論文では、Myom2-TagRFP(マウス胚性幹細胞[ES]細胞)およびACTN2-mCherry(ヒトiPS細胞)を用いてサルコメア短縮を測定するためのタイムラプスイメージングを行う方法について述べた。我々はまた、パターン化された文化がサルコメアのアライメントを促進することを示す。さらに、患者由来のiPS細胞に広く応用できるアデノ関連ウイルス(AAV)を用いたサルコメア標識の代替方法について述べています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. マウス多能性幹細胞の分化
- マウスES細胞のメンテナンス
- メンテナンス培地:50mLのウシ胎児血清(FBS)、L-アラニン-L-グルタミン5mL、非必須アミノ酸5mL(NEAA)、100mMナトリウムピルビン酸ナトリウム、55mM 2-メルカプトエタノールの909 μlを450 mLの最小必須培地(GMEM)に混合します。補充白血病阻害因子(LIF)、CHIR-99021、PD0325901を最終濃度1000 U/mL、1μM、3μMでそれぞれ補充します。0.22 μmフィルターを介して培地を殺菌します。
- FBS培地:55mLのFBS、L-アラニン-L-グルタミン5.5mL、ピルビン酸ナトリウム5.5mL、NEAA5 mLから500mLのダルベッコの変性イーグルミディアム(DMEM)高グルコースを混合します。0.22 μmフィルターを通して培地を濾過して滅菌します。
- 培養SMM18マウスES細胞では、TagRFPが前述の18のように、維持培地中のゼラチン化された6cm皿上のMyom2遺伝子座にノックされた。2~3日ごとに通路。
- 無血清分化(SFD)培地の調製
- Basal SFD:ハムのF-12の250 mL、イスコーブの修正ダルベッコ培地(IMDM)の750 mL、B27サプリメントからビタミンAを差し引いた10 mLを混ぜて、 N2サプリメントの5 mL、L-アラニン-L-グルタミンの10 mL、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の10%のウシ血清アルブミンの5 mL、ペニシリンおよびストレプトマイシンの10 mL(10,000 U/mL)。0.22 μmのストレーナーを通してフィルターを切り取り、殺菌する。
- アスコルビン酸を蒸留水に5mg/mLで溶解し、0.22 μmのストレーナーを通して濾過して滅菌します。
- 1-チオグリセロールの13 μLを1 mLのIMDMに希釈します。本明細書において、この希釈された1-チオグリセロールをMTGと呼ぶ。
- 使用日に1mLの基底SFDに10μLのアスコルビン酸(5mg/mL)と3μLのMTGを加えます。本明細書において、この混合物を完全なSFDと呼ぶ。
- 0日目、分化のための胚体(EB)形成
- SMM18マウスES細胞を組換えトリプシン様プロテアーゼ(rトリプシン)で収穫し、細胞を数えます。
- 遠心分離5 x 105細胞を300 x gで4°Cで3分間、完全なSFDの10 mLで再懸濁し、10cmのペトリ皿に播種する。細胞を37°Cで5%CO2で50時間培養した。
- 分化2日目
- アクチビンA、ヒト血管内皮増殖因子(hVEGF)、および骨形態形成タンパク質4(BMP4)を加えて、それぞれ5ng/mL、5 ng/mL、および1.9ng/mLの最終濃度でSFDを完了する。
注:BMP4濃度はBMP4のロットによって異なる場合があります。新しいロットを使用する前に小規模試験でいくつかの濃度をテストし、心臓分化のための最良の濃度を決定します。 - ペトリ皿から15mLチューブに、遠心分離機を50~100 x gで4°Cで3分間転送します。
- 一方、手順1.4.1で調製した培地をペトリ皿に加えて、残りのEBが乾燥するのを保護します。
- 上清を15 mLチューブから吸引し、ペトリ皿の中の培地でEBを再懸濁し、EB溶液を皿に戻します。その後、37°Cで5%CO2の46時間の培養を行います。
- アクチビンA、ヒト血管内皮増殖因子(hVEGF)、および骨形態形成タンパク質4(BMP4)を加えて、それぞれ5ng/mL、5 ng/mL、および1.9ng/mLの最終濃度でSFDを完了する。
- 分化4日目
- ゼラチン化し、10cmの組織培養処理皿を、0.1%のゼラチンの5〜10mLで少なくとも5分間培養した。細胞を播種する直前にゼラチンを吸引する。
- 培地を準備する:塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF10、およびhVEGFを混合して、それぞれ5 ng/mL、25 ng/mL、および5 ng/mLの最終濃度でSFDを完了する。10cmの皿の場合は、10 mLを準備します。
- ペトリ皿から15mLチューブに細胞を移す。ペトリ皿にPBSの5mLを加え、数回洗浄し、残りの細胞を収集するために15mLチューブに移します。50〜100 x gで遠心分離機、 4 °C、 3 分.
- 吸気上清、rトリプシン1 mLを加え、37°Cで3分間インキュベートする。
- 渦は短時間でEJBの解化を行い、9 mLのFBS培地を加え、再び渦を加え、細胞を数える。
- 遠心分離機1.5 x 107細胞を300xgで、4°Cで3分間、ステップ1.4.2で調製した培地で再懸濁し、ゼラチン化皿に播種する。37°C、5%CO2で2日間インキュベートする。
注: 7 日目または 8 日目までに、PSC-CM の広範な拍動が観察されます。
- 分化日7および9の薬物選択:分化の7日目と9日目に非心筋細胞を排除するために、プロマイシン(最終濃度で2μg/mL)で培地を再供給する。
注:SMM18の親のラインはsyNP4マウスES細胞であり、NCX1プロモーター駆動のピューロマイシン耐性遺伝子20を収容する。 - 10日目、将来の実験のために再プレート
- ガラス底培養プレートまたはポリマーカバースリップを含む35mmのイメージング皿に0.1%ゼラチンをコーティングします。成熟を高めるには、ラミニン-511 E8フラグメント(LN511-E8)を1 μg/cm2 で室温18で30〜60分間コーティングします。PSC-CMを特定のパターンで培養するには、ポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプを準備するためのステップ4と5を参照してください。
- SMM18 PSC-CMを収穫するには、PBSで皿を2回洗い、1mLのrTrypsinを塗布し、37°Cで3分間インキュベートします。
- 10%FBS培地の9 mLのセルを収集し、セルを中断し、カウントします。24ウェルプレートの1つのウェルまたは35mmイメージング皿の250,000-500,000細胞の1つのウェルに50,000-100,000細胞で細胞をプレートします。
- 遠心分離機は十分な数の細胞(300xg、3分)を有し、FBS(最終濃度10%)を補充した完全なSFDで細胞を再懸濁する。
- 一晩インキュベートし、培養培地を変更して、ピューロマイシンでSFDを完了する。
- 14日目から、Myom2-RFPが顕著になる21-28日目まで、完全なSFDで週に2〜3回培養培地を変更する。蛍光タグ付きサルコメアタンパク質のAAVベースのトランスダクションについては、ステップ3をご参照ください。
2. ヒト多能性幹細胞の分化
- 分化メディアの作成
- RPMI+B27-Ins: 500 mLの RPMI 1640培地、10 mLの B27 マイナスインスリン、および 5.25 mL の L-アラニン-L-グルタミンを混合します。
- RPMI+B27+イン:500 mLのRPMI、10 mLのB27サプリメント、および5.25 mLのL-アラニン-L-グルタミンを混合する。
- ヒトiPS細胞の維持
- ヒトiPS細胞を週2回、LN511-E8でAK02Nを用いて、いくつかの修正を加えた以前に公表された方法に従う。
- rトリプシンの3分の処置で細胞を収穫し、10%FBS媒体に集める。細胞と遠心分離機を300xgで4°Cで3分間カウントします。 シード 75,000-125,000 細胞は、6 ウェルプレートの 1 ウェルプレートに 2 mL の AK02N を付加し、LN511-E8 と Y27632 を最終濃度の 0.5 μg/mL (0.1 μg/cm2)および 10 μM で補いました。
- 37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、翌日の培地を補助なしで2 mLのAK02Nに交換してください。2~3日ごとにメディアを交換し、3~4日ごとに通過します。
- 日-4:差別化前に再プレート
- 6ウェルプレートに0.5 μg/cm2のLN511-E8をPBSで希釈してコーティングします。次いで、室温で37°Cで30分間、5%CO2または1時間インキュベートする。細胞を播種する直前に吸引コーティング液。
- ステップ 2.2.2 のように rTrypsin でヒト iPS 細胞を収穫し、セルを数えます。
- 遠心分離機1.25 x 105 細胞は、300 x gの6ウェルプレートのウェルを4°Cで3分間、2mLで再懸濁し、LN511-E8(最終濃度0.5 μg/mLまたは0.1 μg/cm 2)およびY27632(10μM)を補うAK02Nの2mLで再中断する。
- 吸引コーティング溶液は、コーティングされたプレートに再懸濁された細胞を種子、及び37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
- 日 -3 および -1: AK02N の 2 mL で媒体を交換します。
- 0日目:分化を開始するために、培地をCHIR99021(最終濃度6μM)で補充したRPMI+B27-Insの2mLに交換してください。
- 2日目:培地を2mLのRPMI+B27-Insに交換し、WntC59(最終濃度2μM)をウェルあたりに置き換えます。
- 4日目:培地をウェルあたりRPMI +B27-Insの2mLに交換してください。
- 7日目と9日目:培地を2mLのRPMI+B27+Insに置き換え、PSC-CMを選択的に培養する場合は、培地を1ウェルあたりピューロマイシン(最終濃度10μg/mL)に置き換えます。
注:本研究で使用されるACTN2-mCherryラインは、内部リボソームエントリーサイト(IRES)、TNNT2遺伝子の3′非翻訳領域(UTR)に挿入されたピューロマイシン耐性遺伝子のカセットを有し、ACTN2のストップコドンを置き換えるmCherryを有する。ノックインなしで心筋細胞を浄化するには、手順3と4を参照してください。 - 10日目:将来の実験のための再プレート
- 35 mmのイメージング皿に、0.5~1 μg/cm2 のLN511-E8を0.1%ゼラチンで希釈したポリマーカバースリップをコーティングします。長期生存率のために室温で2〜4時間インキュベートする。希望するパターンでPSC-CMを培養するには、PDMSスタンプの準備手順4と5を参照してください。
- ヒトのPSC-CMを収穫するには、PBSで皿を2回洗い、1ウェルあたり1mLのrTrypsinを塗布し、37°Cで3分間インキュベートする。
- 10%FBS培地の4mLで細胞を収集し、セルを中断し、カウントします。プレート 250,000-500,000 細胞あたり 35 mm イメージング皿。
- 遠心分離機は4°Cで3分間3分間300xgの細胞を十分に数え、RPMI+B27+Insでピューロマイシン(10 μg/mL)で再懸濁し、コーティングされた35mmイメージング皿のプレートを再中断します。
- 一晩インキュベート。翌朝、培養培地をRPMI+B27+Insに置き換え、ピューロマイシン(10 μg/mL)に置き換えます。
- 14日目から、イメージング用のRPMI+B27+Insで週2~3回培養培地を21~28日目まで変更する。蛍光タグ付きサルコメアタンパク質のAAVベースのトランスダクションについては、ステップ3をご参照ください。
3. アデノ関連ウイルスを用いたサルコメアの蛍光標識
- AAV生産前の準備
- 10 cmの組織培養プレート上にFBS(最終濃度10%)を加えたDMEM中のHEK293T細胞を維持します。パッセージ細胞は週に3回。
- ポリエチレニミン(PEI)を1mg/mLで調製する。ポリエチレニミンMAX 40000と40mLの超純水を50mg混合します。1 N NaOH を使用して pH を 7.0 に調整します。その後、超純水で最終体積を50 mLにし、0.22 μmのストレーナーを通してフィルターを行います。
- サルコメア標識遺伝子(例えば、TCAPまたはPDLIM3と緑色蛍光タンパク質(GFP)と融合)を用いてシャトルベクターを調製し、心臓トロポニンT(cTNT)22などの心筋細胞特異的プロモーターによって駆動する。
注:この例では、V163A、S202T、L221V23の突然変異を伴う単量体強化GFPを使用しました。
- 0日目、ヘック細胞を通過
- 細胞が合流に達すると、2.0 x 107 HEK293T細胞を10%FBSで20mLのDMEMを有する15cm組織培養プレートに通過させる。
- 1日目、トランスフェクション
- シャトルベクターの13.5 μg、pHelperの26 μg(アデノウイルスのベクトルコードE2A、E4、VA)、pRC6の16.5 μg(AAV2 RepおよびAAV6キャップ遺伝子をコードするベクター)、および1 mLのDMEMをピルビン酸ナトリウム(DMEM-Pyr)なしで混合する。
- 224 μLの PEI (1 mg/mL、ステップ 3.1.2 で調製) と 776 μL の DMEM-Pyr を混合します。
- プラスミド溶液とPEI溶液を室温で30分間混合してインキュベートします。
- ステップ3.2で調製したHEK293T細胞にプラスミド/PEI溶液を加えます。
- 2日目、中程度の変更
- トランスフェクション後24時間で、培地をDMEM-Pyrに変更する。培養細胞は7日目にAAVを収穫するまでである。AAVは、培養メディアにリリースされます。
- 7日目、最小精製法24を用いたAAV採取、濃縮、および緩衝液置換
- PBSで15分間、遠心性限外ろ過ユニット(100k分子量カットオフ[MWCO])をPBSで1%BSAの5mLでインキュベートします。次いで、2分間500xgで遠心分離機を500xgで、濾過し、残りの溶液の両方を吸引する。
- AAVを製造した15cm皿から新しい50mL円錐形管および遠心分離機(500 x g、5分)に媒体を移す。上清を0.45 μmのシリンジストレーナーでろ過し、細胞の破片を除去し、懸濁液を除き、限外ろ過ユニットに塗布します。
- 遠心分離機は90分間、または培養上清0.5〜1mLを濃縮するまで2000xgで。
- 濾液を吸引し、15mLのPBSを限外濾過ユニットに塗布する。
- 濃縮物が0.5〜1mLになるまで遠心分離を繰り返します。
- 3.5.4 と 3.5.5 を繰り返します。
- 濃縮AAVを新しい1.5mLチューブに移し、4°Cまたは-20°Cで保管してください。
注: AAV は P1 施設で使用できますが、現地の規則や規制に従ってください。AAVは、従来の方法でも製造できます。
- AAVのtiterの計算
- AAV 5 μL、DMEM-Pyr 195 μL、ベンゾネーゼ10 Uを混合し、37°Cで1時間インキュベートします。
- 200 μL のプロテナーゼ K バッファー (0.02 M トリス HCl および 1% SDS) と 5 μL のプロテイナーゼ K (20 mg/mL) を加え、37 °C で 1 時間インキュベートします。
- 25:24:1 フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液の400 μL、1分間のボルテックス、20,000 x gの遠心分離機を1分間慎重に準備します。
- 水相の200μLを新しい1.5mLチューブに移し、元のAAVゲノムの約半分を得ます。
- グリコーゲン(20 mg/mL)を1 μL加え、3 M CH3COONa(pH 5.2)と渦の20 μLに加えます。2-プロパノールの250 μLを100 μLのエタノールと渦を再び加えます。
- -80°Cで15分間インキュベートします。その後、4°Cで30分間20,000xgで遠心分離機。
- 吸気上清をチューブに70%エタノールを加えます。その後、20,000xgで遠心分離機、4°Cで5分間用いた。
- 吸気上清はペレットが透明になるまで上清と空気乾燥。
- トリス-エチレンジアミンテトラ酢酸(TE;pH 8.0)を200 μL添加して、AAVゲノムを解決します。その後、試料をTEで100倍に希釈する。
- TE で pAAV-CMV ベクターを 6.5 ng/μL にして標準を作成し、109 個 のベクターゲノム (vg)/μL を得ます。次に、TEで104 から108 までの一連の10倍希釈を行う。
- サンプルDNA(または標準)の1 μL、プライマー(5 μM)の0.4 μL、蒸留水の3.6 μL、SYBRグリーンマスターミックスの5 μLを混合します。ITRに位置するプライマーは、5'-GGAACCCCタグガッガガクト-3′および5'-CGGCCTCTGTGAGCGA-3'です。
- 60 sの場合は95°Cでの初期変性、15sの95°Cで変性の40サイクル、30sの60°Cでのアニールと延長、続いて融解曲線を使用してリアルタイムPCRを行います。
- 標準とCt値に基づいて、リアルタイムPCRマシンはサンプルの1μLのベクターゲノムのコピー数を提供します。元のAAV価を計算する:リアルタイムPCR(vg/μL)x 8 x 103 x 2で提供されるコピー数、AAVゲノム分離中の希釈因子として8 x 10 3、AAV(一本鎖)とプラスミド(二重鎖)の差率として2を挙げます。
- PSC-CMへの導入
- 余分な井戸や余分な皿でPSC-CMを数えます。
- PBSで50 μLを構成するためにAAV(1 x 104〜1 x 106 vg/cell)を希釈します。AAVを1 x104~1 x 106 vg/cellの多重性でPSC-CMに適用し、マウスおよびヒトPSC-CM用の対応する分化媒体にAAVを使用して3日間PSC-CMおよび培養PSC-CMに適用し、AAVなしで培地を培地に変更する。
- PSC-CMは、7日以上の転写後のライブセルイメージングに使用します。
4. [オプション] PsC-CM の AAV ベースの精製
- AAVの準備
- cTNTプロモーターの制御下でブラシシジン耐性遺伝子を発現するシャトルベクターを用いてステップ3に記載したAAVを調製する。
- iPS細胞の分化への導入
- ステップ2で説明したプロトコルの後の4日間、ヒトiPS細胞を分化し、余分なウェル内の細胞数を数えます。
- 4日目にメディアを交換した後、1 x 105 vg/cellのMOIでAAVをRPMI+B27-InsメディアのPSCを差別化します。
- 7日目にRPMI+B27+Insで培地をリフレッシュし、ブラストシジンを2.5-10 μg/mL追加します。
- 10日目に、PSC-CMは再プレートする準備ができています。
5. PDMSスタンプの作成
- コンピュータ支援設計(CAD)描画ソフトウェアを使用して、ストリップ間に10〜25μmの溝と一緒に200 μmストリップのデバイスパターンを設計します。
- マスクレスリソグラフィツールのUV光を使用して、AZP1350でコーティングされたクロムフォトマスクにデバイスのパターンを描きます。
- フォトマスク上のパターンを一連のポジティブフォトレジスト現像物(例えばクロム・エッチャント)で開発し、DI水でリンスする。
- 120°Cのホットプレート上のシリコンウエハーを15分間脱水します。
- ウエハーを室温まで冷却し、負のフォトレジストSU-8 3010をスピンコートし、スピンコート機を使用して30sで1500 rpmで10-20 μmの高さを作ります。
- メーカーのプロトコルに従ってホットプレート上の2つのステップでウエハーを柔らかく焼きます。
- ウエハを室温まで冷却した後、マスクアライナーにウエハを積み込みます。
- マスクアライナーを使用して、ウエハのマスクを位置合わせし、ウエハをUV光に露出します。
- 製造業者のプロトコルに従ってホットプレートの2つのステップでウエハーへの露出後のベークを行う。
- 一連のSU-8現像剤と2-プロパノールでウエハーを開発し、その後、窒素流でウエハを乾燥させます。
- ウェハーを適切なサイズのペトリ皿に移します。
- PDMSエラストマーとその硬化剤を比率10:1 w/wで混合し、ペトリ皿に注ぎます。
- すべての気泡が消えるまでデシケータでPDMSを脱ガスし、80°Cで2時間熱板上のPDMSを硬化させる。
- 硬化したPDMSをツイーツァーでマスターモールドから剥がし、その後PDMSスタンプとなる設計で部分を切り取ります。
注: 形状は正方形にできますが、八角形の形状はエッジでパターンをより適切に転送します。
6. 多能性幹細胞由来心筋細胞のパターン培養
- PDMSスタンプの表面から、修理テープを使ってほこりを取り除きます。
- 切手を70%エタノールに沈して滅菌します。次に、エアダスターを用いてスタンプの表面からエタノールを吹き飛ばします。
- PDMSスタンプの表面に0.5重量%2メタクリロイロエチルホスホリルコリン(MPC)ポリマー/エタノールの5-10 μLを塗布してください。
注: MPCポリマーの分布が不均一な場合、パターンが乱れてしまうことがあります。 - MPCポリマーが完全に乾燥するまで10〜30分インキュベートする。
- ガラス底培養プレートまたはポリマーカバースリップ付きの35mmイメージング皿のカバースリップにスタンプを接触させ、10分間スタンプに重量(例えば、AAAバッテリー)を置きます。
- 重量とスタンプを取り除く。次に、パターンが顕微鏡で転がされたことを確認する。
メモ:刻印されたプレート/皿は室温で1週間まで貯えることができる。 - プレス加工の井戸/皿をPBSで2回洗います。
- 2-4 μg/mLのPBSでLN511-E8を希釈し、0.5-1 μg/cm2でLN511-E8で皿をコーティングします。ヒトPSC-CMの場合、PBSの代わりに0.1%ゼラチン溶液でLN511-E8を希釈します。次いで、少なくとも1時間(最適に、4時間以上)インキュベートする。
- 前のセクションで説明したように、プレート セル。
7. 蛍光顕微鏡下でのサルコメアのタイムラプスイメージング
- 顕微鏡、関連するコンピュータ、および必要なすべての周辺機器をオンにして接続します。
- タイムラプスイメージングを実行するには、最高の倍率(100X対物レンズ、オイルエマーシオン)でタイムラプス画像をキャプチャします。
- ライブイメージング条件を選択します。良好な代表データを取得するには、最高のフレームレートに調整します(最小で20 msまたは50フレーム/秒を推奨)。シャッターを開けて、必要なビニング(4 X 4)と取得領域のトリミングを適用して、タイムラプスイメージング中の画像間の最短間隔を達成します。
注: 設定は、顕微鏡の構成によって異なる場合があります。カメラは高感度である必要があり、接続されたPCに十分に速くデータを転送することができます。この場合、カメラリンクでORCAフラッシュを使用しました。紡糸共焦点顕微鏡を試験し、毎秒400フレームで画像を取得しました。- [オプション]細胞の拍動速度が低い場合は、電界刺激によって細胞を呼び起こす。
- タイムラプス レコードを実行する
- タイムラプス画像の記録中に、画像フィールドがフォーカスを維持していることを確認します。
- タイムラプス画像を適切なフォルダに保存します。
8. イメージJ/フィジープラグイン SarcOptiM を使用したタイムラプスイメージングの分析
- 一連のタイムラプスイメージを ImageJ にロードします。オリンパスVSI形式の場合は、オリンパスビューアプラグインを介してファイルを開きます。
- 画像の明るさとコントラストを調整して、サルコメアパターンをはっきりと観察します(画像||を調整する明るさ/コントラスト)。
- SarcOptiM を開くには、[ その他のツール ] メニュー (>>) をクリックし 、[SarcOptiM]を選択します。
- ツールバーの Ctrl + Shift + P と1 μm ボタンを押して、ダイアログボックスの指示に従ってプログラムを調整します。
- サルコメアの領域を横切って線を引き、サルコメアの短縮を測定するために使用されます。
- ツールバーの シングルセル(AVI)を 押して、サルコメア短縮解析を開始します。代表的なデータは図 1 および 図 2に示されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ノックインPSC-CMレポーターラインを使用したサルコメア短縮測定。サルコメアラベルPSC-CMはサルコメア短縮を測定するために使用されました。ラインは内在性の場所からMyom2-RFPとACTN2-mCherryを表現します。TagRFPはMyom2に挿入され、M線に局地化するMタンパク質をコーディングし、mCherryはACTN2にノックインされ、αアクチニンをコーディングし、Z線18、25に局地する。タイムラプス画像を取得し、図1と2とムービー1-3に示すようにサルコメア短縮を決定するために使用されました。
PSC-CMの組織化されていないサルコメアを克服するために、特定のPDMSスタンプを使用して、ストライプパターンのPSC-CMを培養した。このパターン化培養は、非パターン領域で培養された細胞と比較して、細長い細胞形状およびより組織化されたサルコメアパターンを促進した(図2B および 2C)。この利点により、パターン化培養は細胞のより良い収縮を促進し、 映画2 および 3 および 図2Dに示すように滑らかなサルコメア長さプロファイルを提供した。
AAVベクターを用いたZ線タンパク質の蛍光タグ付け ノックインiPS細胞を発生させることなくPSC-CMのZ線を可視化するために、蛍光タグ付きZ線タンパク質をAAVトランスダクションを用いて発現させた。小型Z線タンパク質の2つ、テレトニン(TCAP)およびアクチン関連LIMタンパク質(PDLIM3)をGFPと共に、AAV6キャプシドを用いてタグ付けおよびパッケージ化した(図3A)。PSC-CMを分化して精製すると、AAVはPSC-CMに変換されました(図3B)。トランスデューシングされたPSC-CMは、早ければ3日後のPSC-CMに沿って肉体GFP信号を発現した(図3C および 3D)。典型的には、105 vg/cellのMOIでのAAVの導入は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を視覚化するのに十分であり、より高い力体は、全体的なGFP強度を増加させるが、細胞質へのGFPの非特異的局在化を引き起こす可能性がある。
AAVベクターを用いたPSC-CMの精製現在の方法は、PSC-CMのゲノム上に既にある薬物選択カセット(トランスジェニックまたはノックインラインのいずれか)に依存しています。しかし、患者由来のiPS細胞からこのようなラインを作り出すことは労働集約的である。AAVベクターがノックインを必要とせずに蛍光標識Z線タンパク質の発現を駆動することが実証されているように、我々は同様にノックインなしで精製方法を確立しようとしました(図4)。この実現のために、cTNTプロモーターの制御下でブラストシジン耐性遺伝子をコードする新しいAAVベクターが構築された(図4A)。AAV(MOI 105 vg/cell)を、4日目にヒトiPS細胞の分化に導入した。次いで、細胞を7日目から9日目の間に2.5-10 μg/mLのブラストシジン(細胞株ごとに適量化する必要がある)で処理した(図4B)。14日目のPSC-CMの純度は90%以上でした(図4C)。
図1:Myom2-TagRFP細胞株由来のマウスPSC-CMのサルコメア短縮A. マウス PSC-CM の分化のタイムライン。 B. 黄色いバーで示される測定領域を持つ異なる時間ポイントでサルコメアの短縮のための代表的な画像。スケールバー= 10 μm C. 1Hzで電気で刺激された心筋細胞の収縮中のサルコメア長さプロファイル。フレームレートは毎秒50フレームでした。画素サイズは0.26μmであった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:非パターン化およびパターン化培養におけるACTN2-mCherry細胞株由来のヒトPSC-CMのサルコメア短縮を示す代表的なデータ。A.ヒトPSC-CM分化のタイムライン。B.C.非パターン化培養で培養された心筋細胞は、組織化されていないサルコメアパターン(B)を示し、パターン化された培養はサルコメア(C)の良好なアライメントを促進する。黄色の棒で提示された領域を測定します。D.0.5 Hzおよび100フレーム/秒フレームレートでの電気刺激によって誘発される細胞収縮の間に得られる対応するサルコメアの長さのプロフィール。ピクセルサイズ= 0.26 μm、スケールバー = 10 μm。
図3:AAV導入後3日間のマウスPSC-CMA. サルコメア標識のためのAAVの模式ベクトルマップ。サルコメアタンパク質(対象遺伝子、GOI)はGly-Gly-Gly-Serリンカー(L)を用いてGFPに連結し、心臓トロポニンT(cTNT)プロモーターの制御下で発現する。 B. マウス PSC-CM 分化と AAV 伝達のタイムライン。 C. と D. Myom2-TagRFP細胞株から生成されたPSC-CMへの3日間のトランスダクションの後に、明確なサルコメアの局在化およびTCAP-GFP(C)およびPDLIM3-GFP(D)の対応するサルコメア長プロファイルを示す代表的な画像。スケールバー= 10 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ノックインのないヒトPSC-CMのブラストシジン精製
A. AAVの概略ベクターマップは、ブラストシジン耐性遺伝子カセット(BSR)がcTNTプロモーターに下流に挿入されるものである。 B. ヒトPSC-CMの分化、伝達、ブラストシジンの選択のタイムライン。 C. ヒトPSC-CMにおけるcTNT+細胞の割合を示す代表的なデータ(4日目に105 vg/cell AAV6を導入し、7日目と9日目に2.5μg/mLブラストシジンで処理した)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:Myom2-TagRFP細胞株から生成されたマウスPSC-CMの蛍光タイムラプス映像。RFPシグナルは、28日間のPSC-CM培養後にサルコメアパターンを示した。細胞は1Hzで電気で刺激されると同期的に拍動を示した。タイムラプス画像は100Xレンズで20ミリ秒ごとに取得しました。スケールバー= 5 μmこの映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画2:非パターン培養皿で培養したACTN2-mCherryを用いたヒトPSC-CMの蛍光タイムラプスビデオ。 パターン化されていない培養皿にACTN2-mCherryを発現するPSC-CMは、サルコメアの解体を示しただけでなく、サルコメア短縮を決定することが困難である波状収縮を示した。細胞は0.5Hzの電気で刺激され、画像は100Xレンズで10msごとに取得した。スケールバー= 10 μmこの映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画3:パターン化された培養皿で培養したACTN2-mCherryを用いたヒトPSC-CMの蛍光タイムラプスビデオ。パターン化培養はサルコメアのアライメントを促進し、細胞を棒状に強制した。この方法により、PSC-CMのサルコメア短縮がより容易に決定することができた。ビデオは、0.5 Hzの電気で細胞を刺激することによって得られました。フレームレートは 1 秒あたり 100 フレームでした。スケールバー= 10 μmこの映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足 CAD ファイル。 幅200μm(Stamp_200x10.dxf)、25μm(Stamp_200x25.dxf)、50μm(Stamp_200x50.dxf)のストリップと溝を持つスタンプを作成するためのCADファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PSC-CMは、心臓病をモデル化し、薬物の効果をテストするためのインビトロプラットフォームとして利用される大きな可能性を秘めています。ただし、PSC-CM 関数を評価する正確で統一された方法を最初に確立する必要があります。機能検査の大部分はPSC-CMで働き、例えば、電気生理学、カルシウム過渡性、および代謝26、および最初の患者由来のPSC-CM試験の1つは、長いQT症候群27についてであった。しかし、心筋細胞の最も重要な機能の1つである収縮性は、まだ評価が困難である。成体心筋細胞では、サルコメアの短縮が広く使用されています。対照的に、PSC-CMの未発達で組織化されていないサルコメアのために、サルコメア短縮のための標準的な方法はこれらの細胞では機能しません。そこで、蛍光性サルコメアタンパク質を用いたPSC-CMのサルコメア短縮を調べる代替方法を発表しました。実証されているように、蛍光タンパク質と融合したMライン(MYOM2)またはZ線(ACTN2、TCAP、およびPDLIM3)に局在するタンパク質を使用することができます。また、蛍光タグ付きタンパク質は、内在性遺伝子またはAAVから発現できることを示しています。AAVは、あらゆるタイプの患者由来PSC-CMに適用できるため、内在性遺伝子座よりも蛍光タグ付きタンパク質を発現する柔軟性が高まります。対照的に、内因性の遺伝子からタンパク質を発現することは、サルコメア機能に対する影響が少なく、遺伝子の発現レベルが厳しく調節され、PSC-CM18の成熟をモニタリングするためにも使用することができる。
Myom2-TagRFP、ACTN2-mCherry、および Lifeact は、サルコメア短縮16,18,19を調べるために用いられたものの、これらのタンパク質がサルコメア機能を妨げるかどうかはまだ不明である。最近、Lifeactはアクチン組織と細胞形態28を妨害すると報告された。また、融合パターン(すなわち、標的タンパク質のN項またはC項におけるGFP融合部位)もサルコメア機能29に影響することにも注意することが重要である。したがって、広く使用される前に、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質がサルコメア機能を妨げるかどうか、およびインビトロ、インビボ、および/または成人心筋細胞でタンパク質とタンパク質の相互作用が起こるかどうかを徹底的に評価することが重要です。蛍光タグ付きサルコメアタンパク質のこのレパートリーは、将来のタンパク質工学の選択肢(すなわち、サルコメアタンパク質を局在化シグナルのみに短縮する)の出発点となります。タグ付けするタンパク質を選択することは、成功へのもう一つの鍵です。我々は、GFPで別のZ線タンパク質をタグ付けしたが、このタンパク質はサルコメアに局地的に局地化するのではなく、細胞質分布のみを示した。ライブイメージングの場合、例えばタグ付きタンパク質が不安定な場合、シグナルレベルが低くなるなど、タンパク質の安定性も役割を果たす可能性があります。また、蛍光タンパク質の光安定性も重要であり、不安定なタンパク質シグナルはイメージング中に容易に消光されます。
記載以外の方法を用いてPSC-CMの収縮性を調べるために、PSC-CMによって発生する力の間接的な測定(例えば、マイクロポストアレイ、トラクション力顕微鏡)または運動(例えば、SI8000を用いた高解像度運動検出)11、12、13、14を用いることができる。我々の方法は、これらの方法または色素ベースの作用電位/カルシウム過渡的測定と組み合わせることができます。この組み合わせアプローチは、疾患が患者由来PSC-CMにおける機能不全を引き起こす方法に関するさらなる情報を提供するかもしれない。
PSC-CMにおけるサルコメア短縮の課題の1つは、直線的に動く良いサルコメアを見つけることであり、そうでなければ、細胞はサルコメア検出のために容易にラインから外れ、不安定なサルコメア短縮結果を引き起こす可能性がある。ここでは、PDMSスタンプで生成されたパターン化された培養物を使用すると、より安定した直線的なサルコメア運動を提供する可能性があることを示す。パターン化培養は、サルコメア機能にとって重要なPSC-CM16の成熟を支持することも知られている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
H.U.はこの原稿に関する特許を出願しています。
Acknowledgments
Jichi医科大学再生医療部門のラボメンバーの皆さん、有益な議論と技術支援を受けたい。本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)の助成金により支援されました。日本学術振興会(JSPS;日本循環学会(基礎研究助成)をH.U.に
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
