Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

نظام في المختبر لقياس فعالية الجلطات من الهستوتريبوسي ودواء لاتيك

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

يتم تطوير الولادة اللتيتيكية بمساعدة Histotripsy أو lysotripsy لعلاج تجلط الأوردة العميقة. يتم تقديم إجراء في المختبر هنا لتقييم فعالية هذا العلاج المركب. وتناقش البروتوكولات الرئيسية لنموذج الجلطة، والتوجيه الصورة، وتقييم فعالية العلاج.

Abstract

تجلط الأوردة العميقة (DVT) هو مصدر قلق صحي عالمي. النهج الأساسي لتحقيق إعادة اركان الأوعية للانسدادات الحرجة هو الجلاطات الموجهة بالقسطرة (CDT). للتخفيف من الآثار الجانبية الكاوية ووقت العلاج الطويل المرتبط ب CDT ، يتم تطوير نهج بديلة ومواكبة. أحد هذه النهج هو histotripsy ، وهو علاج بالموجات فوق الصوتية مركزة ل ablate الأنسجة عبر نواة سحابة فقاعة. وقد أظهرت الدراسات ما قبل السريرية التآزر القوي بين الهستوتريبس والجلطات لتدهور الجلطة. يحدد هذا التقرير طريقة على سطح المقعد لتقييم فعالية العلاج بالجلطات بمساعدة الهستوتريبوسي، أو الlysotripsy.

تم إدخال الجلطات المصنعة من الدم الوريدي البشري الطازج إلى قناة تدفق تحاكي أبعادها وخصائصها الميكانيكية الوريدية. تم تغلغل القناة مع البلازما ومنشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة المتشنجة اللتيكية. تم توليد غيوم فقاعة في الجلطة مع مصدر الموجات فوق الصوتية مركزة مصممة لعلاج الجلطات الوريدية الفخذية. واستخدمت المواقع الآلية لترجمة التركيز المصدر على طول الجلطة. في كل موقع إنساق، تم تسجيل الانبعاثات الصوتية من سحابة الفقاعة بشكل سلبي، وتم تشكيلها لتوليد صور التجويف السلبية. وشملت مقاييس لقياس فعالية العلاج فقدان كتلة الجلطة (فعالية العلاج الشاملة)، وتركيزات د-ديمر (انحلال الفيبرينو) والهيموغلوبين (انحلال الدم) في اليرفوسات. هناك قيود على هذا التصميم في المختبر، بما في ذلك عدم وجود وسائل لتقييم الآثار الجانبية في الجسم الحي أو التغيرات الديناميكية في معدل التدفق كما يس جلطة. بشكل عام ، يوفر الإعداد طريقة فعالة لتقييم فعالية الاستراتيجيات القائمة على الهستوتريبس لعلاج DVT.

Introduction

تجلط الدم هو حالة تكوين الجلطة في وعاء دموي صحي يعيق الدورة الدموية1،2. الجلطات الوريدية لديها تكلفة الرعاية الصحية السنوية من 7-10 مليار دولار، مع 375،000-425،000 حالة في الولايات المتحدة3. الانسداد الرئوي هو انسداد الشريان الرئوي وهو أخطر نتيجة للجلطات الوريدية. المصدر الرئيسي للانسداد الرئوي هو خثرة الأوردة العميقة ، في المقام الأول من الأجزاء الوريدية iliofemoral4،5،6. تجلط الأوردة العميقة (DVT) له تتمة متأصلة إلى جانب انسداد الرئة ، مع مضاعفات طويلة الأجل تؤدي إلى الألم والتورم وتقرحات الساق وبتر الأطراف7و8و9. بالنسبة للعقبات الحرجة ، تعد الجلاطات الموجهة للقسطرة (CDT) هي نهج الخط الأمامي لإعادة تهيئةالأوعية 10. تعتمد نتيجة CDT على عدد من العوامل ، بما في ذلك عمر الجلطة ، والموقع ، والحجم ، والتركيب ، والمسببات ، وفئة خطر المريض11. وعلاوة على ذلك، يرتبط CDT مع تلف الأوعية الدموية، والالتهابات، ومضاعفات النزيف، والعلاج لفترة طويلة10. تهدف أجهزة الجيل التالي إلى الجمع بين استئصال الجلطات الميكانيكية والجلطات (أي استئصال الجلطات الدوائية)12و13. استخدام هذه الأجهزة خفض الجرعة الليكية مما يؤدي إلى انخفاض مضاعفات النزيف, وتقصير وقت العلاج12,13,14 بالمقارنة مع CDT. هذه الأجهزة لا تزال تحتفظ بقضايا الآثار الجانبية النزفية وإزالة غير مكتملة من thrombi المزمن15. وبالتالي هناك حاجة إلى استراتيجية المساعد التي يمكن إزالة الجلطة تماما مع مضاعفات النزيف أقل.

أحد النهج المحتملة هو العلاج الجلطات بمساعدة histotripsy، ويشار إليها باسم lysotripsy. Histotripsy هو طريقة العلاج غير الغازية التي تستخدم الموجات فوق الصوتية مركزة لنوى فقاعة الغيوم في الأنسجة16. يتم إنشاء نشاط فقاعة ليس عن طريق نواة خارجية، ولكن عن طريق تطبيق نبضات الموجات فوق الصوتية مع التوتر الكافي لتنشيط النوى الجوهرية للأنسجة، بما في ذلك جلطة17،18. التذبذب الميكانيكي للسحابة فقاعة يضفي سلالة على الجلطة، وتفكك الهيكل إلى حطام الخلية19. Histotripsy فقاعة النشاط يوفر تدهور فعال للجلطات الدموية تراجع وغير المسترجعة سواء في الجسم الحي وفي المختبر20,21,22. وقد أظهرت الدراسات السابقة23,24 أن الجمع بين الهستوتريبوسي والأنسجة المؤتلفة lytic من نوع المنشط البلازمينوجين (RT-PA) يزيد بشكل كبير من فعالية العلاج بالمقارنة مع الليك وحدها أو histotripsy وحدها. من المفترض أن آليتين أساسيتين مرتبطتين بنشاط فقاعة الهستوتريبسي مسؤولتان عن تحسين فعالية العلاج: 1) زيادة انحلال الألياف الليفية بسبب الولادة اللائية المعززة ، و 2) انحلال الدم لخلايا الدم الحمراء داخل الجلطة. يتكون الجزء الأكبر من كتلة الجلطة من خلايا الدم الحمراء24، وبالتالي ، فإن تتبع تدهور كريات الدم الحمراء هو بديل جيد لاجتثاث العينة. ومن المرجح أيضا أن تتفكك عناصر الجلطة المتشكلة الأخرى تحت نشاط فقاعة الهستوتريبس ولكن لا يتم النظر فيها في هذا البروتوكول.

هنا ، يتم تحديد نهج benchtop لعلاج DVT في المختبر مع lysotripsy. يصف البروتوكول معلمات التشغيل الحرجة لمصدر الهستوتريبس، وتقييم فعالية العلاج، وتوجيه الصورة. ويشمل البروتوكول تصميم قناة تدفق لمحاكاة شريحة وريدية iliofemoral وتصنيع جلطات الدم البشرية الكاملة. يحدد الإجراء التجريبي تحديد موقع مصدر الهستوتريبسي ومجموعة التصوير لتحقيق التعرض الهستوتريبسي على طول الجلطة الموضوعة في قناة التدفق. يتم تعريف معلمات التساين ذات الصلة لتحقيق اضطراب الجلطة وتقليل نشاط الفقاعة خارج الهدف. ويتضح استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية لتوجيه وتقييم نشاط فقاعة24. وترد مقاييس لقياس فعالية العلاج مثل فقدان كتلة الجلطة، د-ديمر (انحلال الفيبرينو)، والهيموغلوبين (انحلال الدم)23،24،25،26،27. بشكل عام ، توفر الدراسة وسيلة فعالة لتنفيذ وتقييم فعالية اليسوتريبس لعلاج DVT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

للنتائج المعروضة هنا، تم سحب الدم البشري الوريدي لتشكيل الجلطات بعد موافقة مجلس المراجعة الداخلية المحلية (IRB # 19-1300) والموافقة المستنيرة الخطية المقدمة من المتبرعين المتطوعين24. يحدد هذا القسم بروتوكول تصميم لتقييم فعالية اليسوتريب. ويستند البروتوكول على عمل سابق لبولينوآخرون.

1. جلطة النمذجة

ملاحظة: إعداد الجلطات في غضون 2 أسابيع ولكن أكثر من 3 أيام قبل يوم التجربة لضمان الاستقرار جلطة وتحقيق أقصى قدر من التراجع28. إعداد الجلطة بعد موافقة مجلس المراجعة المؤسسية المحلية.

  1. إعداد بوروسيليكات باستور ماصة لتخزين الدم (انظر جدول المواد لمواصفات ماصة). وتستخدم أنابيب Borosilicate بسبب الطبيعة الهيدروفيلية للمادة التي تعزز تنشيط الصفائح الدموية وتراجع جلطة29. ختم غيض من ماصة عن طريق التدفئة على الموقد بونسن.
  2. رسم دماء بشرية وريدية جديدة. Aliquot مجموع الدم المسحوبة في 2 مل زيادات لكل جلطة المطلوب. نقل كل 2 مل aliquot إلى ماصة باستور واحد.
    ملاحظة: تنفيذ الخطوة 1.2 في غضون 3 دقائق تقريبا من سحب الدم بحيث لا تجلط الدم قبل نقل إلى ماصة. أيضا، تأكد من أن المتبرع المتطوع ليس على أي أدوية قد تغير سلسلة التخثر (مثل مميعات الدم أو مثبطات الصفائح الدموية).
  3. احتضان aliquots الدم داخل ماصة (يساوي عدد الجلطات المطلوبة) في حمام مائي لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.
  4. تخزين ماصة لمدة لا تقل عن 3 أيام في 4 درجة مئوية للسماح للتراجع عن الجلطات28. كما تراجع الجلطات، وسوف يلاحظ المصل تتراكم في الجزء العلوي من الجلطة داخل ماصة. استجابة RT-PA من الجلطات لا تزال مستقرة لمدة 2 أسابيع بعد التراجع28.

2. إعداد خزان المياه

  1. ملء خزان المياه مع المياه التناضح العكسي. خط السطح السفلي للدبابات مع مادة امتصاص الصوتية للحد من انعكاس العلاج أو التصوير النبضات بالموجات فوق الصوتية. استخدام نظام معالجة المياه لdgas وتصفية المياه لتقليل نواة فقاعة.
    ملاحظة: طريقة واحدة لتصفية المياه باستخدام عامل تصفية مضمن. يتم إعطاء مواصفات الحقيبة المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية في جدول المواد.
  2. ضع عنصرين للتدفئة في السطح السفلي للخزان. سخني الماء إلى 37.3 درجة مئوية لتحقيق أقصى نشاط إنزيمي lytic30.
  3. إعداد قناة تدفق كما هو موضح في الشكل 1A. تتكون قناة التدفق من أنابيب ، وعاء نموذجي مع خصائص مادية وهندسية ممثلة للوريد iliofemoral ، وخزان للبلازما ، وحقنة على الطرف الأكبر من الخزان (جدول المواد). يتم توصيل المحاقن بمضخة لتنظيم التدفق عبر القناة أثناء التجربة.
  4. غمر قناة التدفق يدويا في خزان المياه لجلب القناة إلى درجة الحرارة الفسيولوجية أثناء مرحلة إزالة الغاز / التصفية / التدفئة (الخطوتان 2.1 و 2.2).

3. إعداد البلازما وخليط RT-PA

  1. قبل يوم التجربة
    ملاحظة: عند تخزينها في -80 درجة مئوية، البلازما مستقرة لمدة 2.5 سنة على الأقل31 و RT-PA مستقرة لمدة 7 سنوات على الأقل32. لذلك، تنفيذ الخطوة 3.1 في أي وقت خلال هذه الفترات لضمان استقرار المكونين.
    1. تمييع RT-PA التي تم الحصول عليها من الشركة المصنعة في شكل مسحوق إلى 1 ملغم / مل في الماء العقيم.
    2. Aliquot 100 ميكرولتر من المخفف RT-PA في أنابيب الطرد المركزي 0.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    3. Aliquot 35 مل من الإنسان الطازج المجمدة نوع O البلازما في أنابيب الطرد المركزي 50 مل. تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية.
  2. في يوم التجربة
    1. استرداد أليكوتس البلازما من الثلاجة. استرداد العديد من aliquots كما عدد من الجلطات ليتم اختبارها في ذلك اليوم. تزج aliquots المجمدة في حمام مائي في 37 درجة مئوية لذوبان (~ 10 دقيقة).
    2. بمجرد إذابة البلازما، صبها في كوب يتم شطفه ثلاث مرة بالماء فائق النبور. تغطية طفيفة فم الكأس مع رقائق الألومنيوم لمنع التلوث ووضع الكأس في حمام الماء. السماح احباط لتكون فضفاضة بما فيه الكفاية للسماح للهواء للاتصال البلازما.
    3. السماح توازن البلازما في 37 درجة مئوية للضغط الجوي لمدة 2 ساعة على الأقل.
    4. أخرج قنينات RT-PA المجمدة وضعها على الجليد حتى الحاجة، مع قارورة واحدة لكل تجربة تشغيل.
    5. جعل agarose هلام منخفضة (2٪) في قارورة 50 مل، عن طريق حل الآغاروز في المياه فائقة البور. اختر الكمية الإجمالية من محلول الآغاروز بحيث يتوفر ما يقرب من 2 مل لكل عينة يتم تحليلها. سخني المحلول في قارورة في ميكروويف حتى يصبح شمبانيا. تأمين قارورة مع غطاء المسمار للماء على ذلك. غمر القارورة في حمام الماء جنبا إلى جنب مع البلازما.
      ملاحظة: تضمن هذه الخطوة توفر الآغاروز لتأمين شرائح الجلطة المكشوفة لتحليل الأنسجة بعد التكشير الهستوتريبوسي.

4. إعداد مصدر histotripsy ومجموعة التصوير

  1. تأكد من إمكانية التحكم في المواضع الآلية من بيئة وقت التشغيل في نظام برمجة أساسي، باستخدام الاتجاهات والأوامر المقدمة من الشركة المصنعة. تحقق من أن محركات النظام متصلة بالمنفذ المناسب للكمبيوتر مع بيئة وقت التشغيل.
  2. جبل مصدر histotripsy على نظام تحديد المواقع الآلية كما هو مبين في الشكل 1B.
  3. قم بتوصيل مصدر الهستوتريبنسي بالإلكترونيات الدافعة (مثل مكبر الصوت ومولد الوظائف) عبر الموصلات المناسبة (مثل كابلات BNC) كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة.
    ملاحظة: تأكد من أنه يمكن التحكم في الالكترونيات القيادة من مصدر histotripsy عبر بيئة وقت التشغيل المستخدمة في الخطوة 4.1.
  4. تغطية مجموعة التصوير مع غطاء التحقيق ولصق الصفيف متحد المحور في فتحة مصدر histotripsy كما هو مبين في الشكل 2. تأكد من فهم اتجاه الطائرة التصوير بالنسبة إلى اتجاه مصدر histotripsy.
  5. قم بتوصيل صفيف التصوير بنظام المسح بالموجات فوق الصوتية. تأكد من أن هذا النظام يمكن التحكم في تشغيل وتشغيل صفيف التصوير، وجمع بيانات التصوير، وفقا للأوامر المقدمة من قبل الشركة المصنعة للماسح الضوئي.
  6. غمر المصدر histotripsy / مجموعة التصوير في الخزان في حين degassing كما هو مبين في الشكل 1A. إزالة بلطف أي فقاعات الهواء باستخدام حقنة من سطح مصدر histotripsy أو مجموعة التصوير.
    ملاحظة: تزج مصدر histotripsy ومجموعة التصوير تماما في الماء قبل العملية. تجنب لمس سطح مصدر الهستوتريبسي.
  7. الحصول على صور الوضع B بمعدل 20 إطارا في الثانية باستخدام صفيف التصوير والأوامر المضمنة للماسح الضوئي. ضبط نافذة التصوير لضمان التصور من التركيز من مصدر histotripsy في هذه الصور في الوقت الحقيقي.
    ملاحظة: من المفترض أن أبعاد المنطقة المحورية للمصدر العلاجي معروفة.
  8. تعيين معلمات التشغيل لمصدر histotripsy، بما في ذلك التردد الأساسي (على سبيل المثال، 1.5 ميغاهرتز)، وتردد تكرار النبض (على سبيل المثال، 20-100 هرتز)، ومدة النبض (على سبيل المثال، 1-20 دورة لكل نبضة)، والعدد الإجمالي للبقول لكل موقع (على سبيل المثال، 100-2000)18و23و24و33. تعديل هذه المعلمات إذا لم يتحقق تحلل تجلط كافية أو إذا كان النشاط فقاعة يمتد إلى ما وراء تجويف السفينة نموذج. لتعيين هذه المعلمات، استخدم البروتوكول الذي توفره الشركة المصنعة للمصدر أو استخدم منصة برمجة يمكنها الاتصال بالمصدر (الخطوة 4.3).
  9. باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة أو منصة البرمجة المستخدمة في الخطوة 4.8، تشغيل مصدر histotripsy في المعلمات مجموعة في المياه degassed فقط، دون أي عرقلة في البيئة المحيطة بها. زيادة الجهد المطبق على مصدر histotripsy حتى يتم تشكيل سحابة فقاعة.
  10. باستخدام التصوير في الوقت الحقيقي للخطوة 4.7، قم بضبط موضع صفيف التصوير داخل فتحة محول الكونفوجال حتى تقع سحابة الفقاعة تقريبا في وسط نافذة الصورة. سحابة الفقاعة هي منطقة بكسل hyperechoic في الطائرة التصوير (الشكل 3). تشديد مسامير لعقد مجموعة التصوير بقوة في افتتاح محول.
    ملاحظة: إذا تمت محاذاة الصفيف بشكل صحيح، يجب أن يكون موضع azimuthal سحابة الفقاعة تقريبا في 0 مم في مستوى التصوير. قد تظهر مجموعة التصوير قليلا من السطح الداخلي لمصدر العلاج ، وبالتالي قد يختلف موضع نطاق سحابة الفقاعة عن البعد البؤري للمصدر.
  11. تحديد موقع سحابة الفقاعة في مستوى التصوير. تعيين التركيز من مصدر histotripsy كمركز سحابة فقاعة (الشكل 3).
  12. سجل الموقع البؤري المكتشف (الخطوة 4.11) في إطار التصوير(الشكل 3). وهناك طريقة ممكنة لوضع علامة على الموضع البؤري هو وضع مؤشر لملاحظة الموقع في إطار التصوير ، إذا كان متاحا مع منصة التصوير.
  13. وقف الرنانة وتعيين الجهد المطبق على مصدر histotripsy إلى 0 V.

5. إعداد جلطة

  1. إزالة الجلطة من ماصة عن طريق قطع نهاية مختومة مع كماشة. دع الجلطة تنزلق إلى طبق بيتري جنبا إلى جنب مع المصل. إذا لم تطرد الجلطة، فاضغط بلطف من الطرف الآخر من المصصة عن طريق تدفق ملحي لإزالة الجلطة.
  2. قطع الجلطة إلى 1 سم طول باستخدام مشرط، تهدف إلى قطعة موحدة من المركز (أي، بعيدا عن أجزاء من الجلطة التي تشكلت في الجزء العلوي أو السفلي من ماصة).
  3. استخدمي مسحة تنظيف لمسح مقطع قطع الجلطة برفق لإزالة السوائل الزائدة.
  4. باستخدام ملاقط، ضع قسم الجلطة برفق على مقياس الوزن وسجل الوزن.
  5. رفع قناة التدفق يدويا من خزان المياه وإزالة السفينة النموذجية من قناة التدفق.
  6. ضع الجلطة في وعاء النموذج باستخدام ملاقط وإرفاق السفينة النموذجية مرة أخرى بقناة التدفق.
    ملاحظة: يمكن وضع قضيب نايلون داخل السفينة النموذجية لمنع الجلطة من التحرك في المصب بسبب التدفق.
  7. خفض قناة التدفق إلى الخزان بطريقة أن نهاية قريبة من المرحلة بالنسبة للخزان منخفضة بالمقارنة مع الجانب البعيدة. الصيد من المرحلة بهذه الطريقة يمنع محاصرة فقاعات في السفينة نموذج عندما يتم رسم البلازما من خلال قناة تدفق في الخطوة 6.1.
  8. أضف 30 مل من البلازما إلى الخزان باستخدام ماصة وراقب درجة الحرارة حتى تصل إلى 36 درجة مئوية على الأقل.
  9. استخدام ماصة للاستغناء عن RT-PA (80.4 ميكروغرام في 30 مل من البلازما, 2.68 ميكروغرام / مل) في خزان البلازما. تحريك البلازما مع ماصة لضمان توزيع RT-PA موحدة داخل الخزان.

6. فتيلة قناة تدفق

  1. رسم البلازما في قناة تدفق من الخزان عن طريق مضخة حقنة حتى البلازما يملأ السفينة نموذج.
    ملاحظة: إذا لم يتم تدفق الجلطة مع قضيب النايلون، استخدم مضخة قصيرة توجه في 60 مل / دقيقة في محاولة لإجبار البلازما المصب الجلطة أو رسم يدويا من خلال الحقنة. الحد من كمية البلازما المسحوبة في هذه العملية أو إعادة ملء الخزان باستخدام البلازما / RT-PA إضافية لضمان 30 مل من الحل في قناة التدفق.
  2. باستخدام المواضع الآلية، قم بمحاذاة صفيف التصوير الموازي لطول الجلطة باستخدام برنامج التصوير النصي (الخطوة 4.7). المحاذاة المتوازية تمكن المستخدم من ضمان بصريا الموضع السليم للتجلط وعدم وجود فقاعات داخل السفينة نموذج.
  3. قم بتسوية وعاء النموذج يدويا وبصرا لضمان عدم وجود فقاعات هوائية باستخدام نافذة التصوير (الخطوة 4.7).

7. إجراء التجربة

  1. العلاج قبل العلاج
    ملاحظة: هذه الخطوة هي لتخطيط مسار المصدر histotripsy / مجموعة التصوير للتعرض histotripsy موحدة على طول جلطة.
    1. قم بمحاذاة صفيف التصوير باستخدام المواضع الآلية بحيث تكون مستوي التصوير موازيا للمقطع العرضي للجلطة (أي عمودي على الاتجاه الموضح في الخطوة 6.2).
    2. تحت التوجيه عبر نافذة التصوير (الخطوة 4.7)، نقل مصدر الهستوتريبسي إلى الطرف القريب من الجلطة نسبة إلى الخزان باستخدام المواقع الآلية. عند هذه النقطة، ضبط موقف مصدر histotripsy بحيث نقطة محورية ملحوظ في الخطوة 4.12 محاذاة مع مركز الجلطة.
    3. تحديد مسار الرنانة على طول الجلطة. لتحديد هذا المسار، حدد ثلاث نقاط طريق على طول الجلطة (أي مواقع المحركات حيث يتم احتواء نشاط فقاعة الهستوتريبس داخل الجلطة) بزيادات 5 مم. محاذاة نقاط الطريق بحيث يكون الحركة الإجمالية لمصدر الهستوتريبسي على طول المسار متبقة مع تدفق في النظام (أي أن نقطة الطريق الأولى هي في الطرف الأقرب من الجلطة بالنسبة للخزان ، ونقطة الطريق الثالثة هي في الموضع البعيدة بالنسبة للخزان).
    4. قبل وضع اللمسات الأخيرة على كل نقطة اتجاه، نبضات اختبار النار من مصدر الهستوتريبسي مع نفس معلمات التسجم مثل الخطوة 4.8 ولكن تقليل التعرض الكلي لنبضات مجموع 10. ضبط موقف مصدر histotripsy باستخدام الموضعيات الآلية إذا لزم الأمر، لاحتواء نشاط فقاعة داخل الجلطة.
    5. عند كل نقطة، احفظ المواضع الحركية باستخدام الأوامر التي توفرها الشركة المصنعة، على غرار الخطوة 4.1.
  2. العلاج
    ملاحظة: تحدد هذه الخطوة الإجراء لعلاج الجلطة بطولها وفقا للمسار المحدد في خطوة ما قبل العلاج.
    1. تشغيل مضخة حقنة في 0.65 مل / دقيقة وانتظر الغضروف المفصلي للبلازما للتحرك. هذا معدل تدفق يحاكي انسداد شبه كامل من الأوعية الدموية iliofemoral24،34.
    2. إعادة تحديد المسار الذي تم إنشاؤه في الخطوة 7.1.3 مع خطوات متوسطة بين نقاط الطريق المحددة بحجم خطوة ثابت (على سبيل المثال، 0.5 مم). يتم اختيار حجم الخطوة ليكون أصغر من نصف عرض المنطقة البؤرية كما يقاس على طول الجلطة (الاتجاه الارتفاعي لمجموعة التصوير). نقل مصدر histotripsy باستخدام المواقع الآلية في كل موقع مسار مع معلمات التساوق المحددة في الخطوة 4.8.
    3. رصد / نشاط فقاعة الصورة أثناء تطبيق نبض histotripsy في كل موقع المسار باستخدام إطار التصوير (الخطوة 4.7). مركز الصورة على التركيز histotripsy مع أبعاد الصورة التي تغطي 15 ملم في السمت والمدى. قبل تطبيق نبض histotripsy في كل موقع، والحصول على صورة وضع B لتوفير التصور للجلطة ونموذج السفينة، من خلال إنشاء سيناريو في منصة البرمجة. تأكد من أن البرنامج النصي يؤسس الاتصال مع الماسح الضوئي باستخدام أوامر الشركة المصنعة.
    4. أثناء تطبيق نبض histotripsy، تنفيذ اقتناء الانبعاثات الصوتية في السيناريو في الخطوة 7.2.3 لتشكيل صور التجويف السلبي بعد مخصص35. الحصول على صورة واحدة التجويف السلبي بعد كل 10 نبضات العلاج. تطبيق تعويض كسب الوقت شقة من 50 في 8 أعماق تدريجية حتى نهاية عمق التصوير. اختيار حجم نافذة اقتناء مناسبة بحيث يتم التقاط إشارة كاملة من جلطة مع الحد الأدنى من فقدان الطاقة بسبب النوافذ35.
    5. إذا كانت السحب الفقاعة خارج الهدف موجودة، قم بضبط موضع المحول في الموقع مع الموضعيات الآلية.
      ملاحظة: مراقبة مشغلات غاب عن صفيف التصوير. ضبط عدد مجموعات بيانات التصوير المكتسبة لضمان اكتمال تخزين البيانات قبل التشغيل اللاحق.

8. إجراء ما بعد التجربة

  1. رفع يدويا السفينة نموذج للخروج من خزان المياه لاستنزاف perfusate عن طريق الجاذبية. تأكد من الحفاظ على قناة تدفق تعادل لمنع الجلطة من التحرك المصب والخروج من السفينة نموذج أثناء استنزاف.
  2. جمع perfusate كامل لمزيد من التحليل في كوب صغير (الشكل 4A) عن طريق رسم محلول البلازما من قناة تدفق من خلال مضخة حقنة بمعدل تدفق منخفض جدا.
  3. قطع السفينة نموذج وإزالة الجلطة. إذا لزم الأمر، حقن كمية صغيرة من المالحة في وعاء نموذج لطرد بلطف الجلطة.
  4. مسح الجلطة مماثلة للخطوة 1.2.3. وزن الجلطة على مقياس الوزن لتقييم فقدان كتلة الجلطة.
  5. لتحليل محتوى D-dimer، أضف 100 ملغ من حمض أمينوكابرويك إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق يليه 1 مل من البيرفوسات، واخلط جيدا باستخدام ماصة. إجراء اختبار اللاتكس المناعي turbidimetric لقياس مد دي ديتر داخل العينة36.
  6. لتقييم انحلال الهيمولي، أضف 1 مل من التشوه إلى أنابيب الطرد المركزي وتدور بسرعة 610 × جم (3500 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق. اجمع 0.5 مل من الناموست الفائق (ركز) مع 0.5 مل من محلول درابكينز ودع الخليط يستريح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. نقل 200 ميكرولتر إلى لوحات البئر، كما هو مبين في الشكل 4B. استخدام قارئ لوحة لقراءة امتصاص في 540 نانومتر، الشكل 4C (Drabkins المقايسة37).
  7. تقييم الأنسجة
    1. قطع قسم من وسط جلطة من حوالي 2-3 ملم في الطول مع مشرط.
    2. أضف المقطع إلى شريط كاسيت. الحفاظ على اتجاه القسم بالنسبة إلى اتجاه انتشار نبض الهستوتريبسي.
    3. إضافة 2 مل من محلول agarose gelling منخفضة أعدت في الخطوة 3.2.5 في كاسيت لإصلاح الجلطة في مكان.
    4. إصلاح العينة في 10٪ الفورماتين لمدة 24 ساعة. وضع العينة في 70٪ الكحول بعد 24 ح وأداء معيار hemotoxylin-eosinتلطيخ 38.

9. تحليل صورة التجويف السلبي

  1. معالجة الإشارات المكتسبة من صفيف التصوير أثناء الإثارة histotripsy (الخطوة 7.2.4) باستخدام خوارزمية تستند إلى شعاع كابونقوية 39 لخلق صورة من الانبعاثات الصوتية التي تولدها سحابة فقاعة في كل موقع العلاج.
    ملاحظة: لإنشاء صور كمية، اتبع الخطوات الموضحة في هاوورثوآخرون. وإلا، يجب أن تمثل كل قيمة بكسل في الصورة الطاقة الصوتية سحابة فقاعة النسبية (وحدات من V2)في كل موقع المقابلة.
  2. قطع صورة الوضع B التي تم طلها في الخطوات 7.2.3 للتمييز بين وحدات البكسل التي تمثل الجلطة ووعاء النموذج.
  3. شارك في تسجيل صورة التجويف السلبي مع صورة وضع B كما هو موضح في الشكل 5B. تلخيص الطاقة الصوتية داخل الجلطة خلال فترة التعرض35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسلط البروتوكول المبين في هذه الدراسة الضوء على تفاصيل نمذجة الجلطة الوريدية ، والlysotripsy لتعطيل الجلطة ، والتصوير بالموجات فوق الصوتية في إعداد المختبر ل DVT. يوضح الإجراء المعتمد الخطوات اللازمة لتقييم اضطراب الجلطة بسبب الآثار المشتركة لنشاط سحابة الفقاعة rt-PA والهستوتريب. تم تصميم إعداد سطح المقعد لمحاكاة خصائص الوريد الوريدي الوريدي. الشكل 1A يظهر سفينة نموذجية لها خصائص الصوتية والميكاميكاتية والهندسية للوريد iliofemoral. يتم وضع الجلطة داخل السفينة النموذجية لمحاكاة خثرة انسداد جزئيا. يتم تغلغل الجلطة بالبلازما وrt-PA المستمدة من خزان بمعدل 0.65 مل/دقيقة. هذا المعدل يتسق مع معدل التدفق البطيء في سفينة34شديدة الانسداد.

محول مركز بشكل بيضاوي من التردد الأساسي 1.5 ميغاهرتز مع محور رئيسي 9 سم، محور ثانوي 7 سم، وطول بؤري 6 سم(الشكل 2A)مثبت على نظام تحديد المواقع كما هو مذكور في الشكل 1B. مجموعة التصوير مغطاة هلام الموجات فوق الصوتية وغطاء اللاتكس (الشكل 2B، C) شنت متحد المحور مع محول كما هو مبين في الشكل 1A عن طريق فتحة في وسط مصدر histotripsy. واستخدمت المواضع الآلية لترجمة محول العلاج / مجموعة التصوير على طول الجلطة داخل السفينة النموذجية(الشكل 1). عند تطبيق الجهد الكافي على مصدر الهستوتريباسي ، يتم إنشاء سحابة فقاعة في المنطقة المحورية للمحول وتصورها عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية ، كما هو موضح في الشكل 3. يتم تعريف الموضع البؤري على أنه مركز سحابة الفقاعة باستخدام مستوى التصوير (الخطوات 4.10-4.11).

يظهر الشكل 4A ال perfusates التي تم جمعها لاثنين من حالات العلاج المختلفة. الكأس المسمى بالتحكم يحتوي على تخثر يتعرض للبلازما وحدها. الكأس الثاني المسمى كما تعامل يحتوي على perfusate من الجلطة المعالجة lysotripsy. وتستخدم perfusates التي تم جمعها لتقييم الهيموغلوبين (متري انحلال الدم) وD-dimer (متري من انحلال الفيبرينو) المحتوى من خلال المقايسات على النحو المحدد في البروتوكول. يشير الفرق في لون التشوه إلى التباين في تركيز الهيموغلوبين ، والذي يمكن قياسه كميا عن طريق الامتصاص البصري. يمكن تحديد العلاقة بين قيمة الامتصاص وتركيز الهيموجلوبين من خلال منحنى المعايرة. يتم وضع حلول مع محتوى الهيموغلوبين المعروفة تتراوح بين 0 (قياس فارغ) إلى 180 ملغ / مل في لوحة البئر ويتم تحديد الامتصاص في ثلاثة نسخ باستخدام قارئ لوحة (الشكل 4B، C). قد يختلف الحد الأعلى للامتصاص لقارئ اللوحة وقد لا يكون معروفا مسبقا لصنع الحلول في لوحة البئر. على هذا النحو، يتم إجراء تركيزات الهيموغلوبين تصل إلى 180 ملغم / مل في لوحة البئر، الشكل 4B. ومع ذلك، فإن قارئ لوحة المستخدمة هنا يمكن قراءة امتصاص لتركيزات تصل إلى 23 ملغم / مل فقط، الشكل 4C.

ويبين الشكل 5 ألف تصورا للجلطة داخل السفينة النموذجية عن طريق التصوير ب الوضع قبل التعرض للتهيستوتريب كما هو محدد في الخطوة 7-2-3. يتم الحصول على هذه الصورة لتحديد موقف جلطة لتجزئة صورة التجويف السلبي. يظهر الشكل 5B صورة التجويف السلبية المسجلة بشكل مشترك مع صورة الوضع B التي تم الحصول عليها قبل التعرض لهستوتريبس. هذا الرقم يؤكد أن يتم احتواء الطاقة الصوتية في المقام الأول داخل الجلطة أثناء التعرض histotripsy.

ويشار إلى اضطراب جلطة نموذجية بسبب histotripsy والليتيك في الشكل 6. الشكل 6A, B تظهر غير المعالجة وlysotripsy صور الجلطة المعالجة, على التوالي. بالنسبة للعينات المعرضة للتجويف الهستوتريب ، يقتصر التعطيل في المقام الأول على مركز الجلطة ، بما يتفق مع المواقع الملاحظة لنشاط الفقاعة التي يتم تتبعها مع التصوير السلبي للتجويف(الشكل 5B). ومع ذلك ، مع إضافة الليك ، يحدث فقدان الكتلة أيضا في المناطق الأقرب إلى محيط الجلطة. ومن المفترض أن هذه الخسارة الجماعية الإضافية يرجع إلى تحسين خلط السوائل من الليك تحت نشاط فقاعة. خلط السوائل يزيد من توزيع وعمق الاختراق من اللتيك في الجلطة. منذ lytic هو المسؤول عن انحلال الفيبرينو40، وزيادة فقدان الكتلة. يمكن قياس انحلال الفيبرينو قياسا كميا عن طريق قياس محتوى D-dimer في التشوه41.

Figure 1
الشكل 1: الإعداد التجريبي للlysotripsy من جلطة دموية بشرية. (أ)مكونات الإعداد هي (1) مصدر الهستوتريبسي المركزة مع الهندسة البيضاوية، (2) صفيف التصوير المغطى اللاتكس، (3) نموذج السفينة تعلق على قناة التدفق، (4) قناة تدفق، (5) خزان، (6) مواد امتصاص الصوتية، (7) عنصر التدفئة، و (8) خزان المياه مليئة مياه التناضح العكسي ديجاسسيدسخين. البعد السمت من الطائرة التصوير عمودي على أبعاد الارتفاع والمدى (في الصفحة). (ب) المصدر histotripsy شنت على نظام تحديد المواقع الآلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مصدر الموجات فوق الصوتية ومكونات التصوير. صور التكبير الفردية من (أ) المصدر histotripsy مركزة، (ب) مجموعة التصوير، و (C) مجموعة التصوير مع هلام الموجات فوق الصوتية وغطاء اللاتكس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:سحابة فقاعة Histotripsy تصور باستخدام مجموعة التصوير. يتم إنشاء سحابة فقاعة في المنطقة المحورية لمصدر histotripsy وصورت باستخدام مجموعة التصوير. يتم حفظ التركيز المعين ، الذي يظهر كعرض ، لتخطيط العلاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:تم إطلاق القياس الكمي للهيموجلوبين بسبب تحلل الجلطة. (A)عينات Perfusate التي تم جمعها بعد دراسة التحكم مع البلازما وحدها (لا توجد تحلل أو lytic) ، وذراع العلاج ، والهستوتريبسي (على سبيل المثال ، 35 ميجا باسكال ذروة الضغط السلبي ، ومدة نبض الدورة 5 ، والتردد الأساسي 1.5 ميغاهرتز) ، و 2.68 ميكروغرام / مل التعرض اللليتيك. (ب)لوحة جيدا تحتوي على تخفيف تركيزات الهيموغلوبين المعروفة تتراوح بين 180 ملغم / مل (الصف العلوي، الزاوية اليسرى) إلى 0 ملغم / مل (الصف السفلي، الزاوية اليمنى). يشير رأس السهم نحو تقليل تركيز الهيموجلوبين. (ج)وتستخدم هذه العينات لإنشاء منحنى قياسي لقياس الهيموغلوبين المنتجة بسبب التعرض histotripsy عن طريق قياس الطيف. يتم الحصول على منحنى امتصاص لتركيزات الهيموغلوبين تتراوح بين 0 إلى 23 ملغم / مل بسبب محدودية قارئ اللوحة في تحليل تركيزات أعلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور الجلطة أثناء العلاج. (أ) صورة الوضع B المكتسبة قبل بدء نبض العلاج تظهر موضع الجلطة داخل وعاء النموذج. (ب)التصور اللاحق لانبعاثات الطاقة الصوتية المحسوبة من التصوير التجويف السلبي المبين في خريطة اللون الساخنة المسجلة مع صورة وضع B للجلطة المكتسبة قبل تطبيق نبض الهستوتريبسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6:الأنسجة من الجلطة الاجتثاث تحت ظروف العلاج المختلفة. (أ) السيطرة على جلطة دون علاج. (ب)الجلطة المعالجة بالليسوتريبسي (على سبيل المثال، 35 ميجا باسكال ذروة الضغط السلبي، مدة نبض دورة واحدة، تردد أساسي 1.5 ميغاهرتز). تم نشر النبض الهستوتريبسي من أعلى إلى أسفل في هذه الصورة. يتم تعريف مسار مصدر الهستوتريبنسي على طول الجلطة (أي عمودي على مستوى الصورة المعروضة هنا) في الخطوة 7.2.3. حجم الميكروجراف 2 مم. لاحظ أن درجة اضطراب الجلطة التي تحققت هنا سيتم تخفيضها مقارنة بمخططات التكشير ذات المدة الأطول للنبض24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويقدم البروتوكول المقترح نموذجا لتحديد فعالية العلاج من اليسوتريبس. 10- وفي حين نوقشت التفاصيل الرئيسية، هناك جوانب حاسمة معينة ينبغي النظر فيها لنجاح هذا البروتوكول. النشاط الأنزيمي من RT-PA لديه الاعتماد على درجة حرارة أرهينيوس30. درجة الحرارة هي أيضا عامل مساهم في سرعة الصوت في الماء والأنسجة، والاختلافات في درجة الحرارة يمكن أن يسبب تغييرات طفيفة في هندسة المنطقة المحورية. وبالتالي، ينبغي تنظيم درجة حرارة المياه بعناية عند 37 درجة مئوية. جرعة RT-PA المستخدمة في البروتوكول (2.68 ميكروغرام / مل) تتفق مع تلك المستخدمة سريريا لاستراتيجيات استئصال الجلطات الدوائية الأخرى42. في الخطوة 5.8، يتم نقل 30 مل من البلازما إلى الخزان في حين لوحظ أن 35 مل من اليكوت في الخطوة 3.1.3. هذه البلازما إضافية حسابات لفقدان في البلازما بسبب التبخر على مدى ساعات عندما تدفأ إلى 37 درجة مئوية للتوازن إلى الضغط الجوي.

البعد البؤري، وعرض الفتحة، وتواتر محول العلاج تملي حجم وعمق المنطقة المحورية. لذلك ، يجب اختيار المحول بحيث تتوافق هذه الخصائص مع قطر وعمق السفينة المستهدفة (مثل الوريد الفخذي: 2-4 سم في العمق و 0.6-1.2 سم في القطر)43. يقتصر مدى الاستئصال الميكانيكي على مدى سحابة الفقاعة. وهكذا، فهم دور معلمات الرنانة تلعب في تعديل السلوك سحابة فقاعة histotripsy أمر بالغ الأهمية33،44،45. وينبغي أيضا اختيار تواتر وقوة المجال الصوتي مع أهمية التوهين بسبب المواد المتوسطة والوسيطة (مثل السفينة النموذجية). ولضمان حبس نشاط الفقاعات مع السفينة المستهدفة، ينبغي اختيار نافذة تصوير مناسبة لرصد المنطقة المحورية. وينبغي اختيار معلمات التشغيل للمحول لتجنب الآثار المستهدفة مع تعظيم تعطيل الجلطة الميكانيكية. في هذا البروتوكول، اعتبر فقدان الكتلة مقياسا أساسيا لفعالية العلاج. وقد لوحظت زيادات في فقدان الكتلة كما يتم زيادة ذروة الضغط السلبي أو مدة نبض histotripsy24,46, مع الحد الأقصى لفقدان الكتلة لوحظ من 94٪. وجود جلطة المتبقية للأسلحة العلاج التحقيق يسهل مقارنة الفعالية العلاجية. ومع ذلك ، يمكن أيضا وضع مخططات التسجم لضمان الإزالة الكاملة للثرومبوس.

يجب أن تكون المقاومة الصوتية (حوالي 1.58 MRayl47،48)والخصائص الهندسية (0.6-1.2 سم في القطر43)للسفينة النموذجية ممثلة للمزلف الوريدي الوريدي iliofemoral (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). بوليديميثيلسيلوكسينا وبولي يوريثين هي بعض المواد الأخرى المناسبة لنموذج النظام الوريدي على أساس خصائصها acousto الميكانيكية. في الخطوة 7 ، من المهم إزالة جميع فقاعات الهواء من السفينة النموذجية لتجنب حماية الجلطة من التعرض للهستوتريب. بالنسبة لوعاء نموذجي من المواد الكارهة للماء ، قد تتشكل سحب الفقاعة بشكل تفضيلي بالقرب من جدار السفينة بدلا من مركز الجلطة. لذلك ، يجب أن يتم الرصد المستمر لسحابة الفقاعة أثناء العلاج عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية ، ويجب إعادة وضع المحول إذا لزم الأمر. وينبغي إجراء دراسات تجريبية لتحديد معلمات التسخير الهستوتريبسي (مثل مدة النبض وضغط الذروة) التي تحقق اضطراب الجلطة المقصود النهائي.

يتم استخدام صفيف التصوير لالتقاط صور الوضع B وصور التجويف السلبية لتصور العلاج وتحديد نشاط الفقاعة. يسمح التصوير ب الوضع التصور من السفينة نموذج وتجلط الدم، والتصوير التجويف السلبي يقيس طاقة نشاط فقاعة المرتبطة استئصال جلطة24،49. يجب أن يتوافق عرض النطاق الترددي لصفيف التصوير مع نشاط سحابة الفقاعة المرغوب مع نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء. للحصول على إشارات النطاق العريض البحتة المرتبطة بانهيار القصور الذاتي للفقاعات داخل السحابة ، يجب ألا يتزامن عرض النطاق الترددي للصفيف مع التردد الأساسي للمحول50،51. نبضات Histotripsy هي غير خطية للغاية52، ومن المرجح أن التوافقيات من التردد الأساسي ستكون موجودة في الإشارة المستلمة. وينبغي برمجة نظام التصوير لتشغيل على أساس الوقت المعروف لرحلة نبض histotripsy من المصدر إلى منطقة الاتصال لضمان جمع بيانات التصوير التجويف السلبي الكامل في جميع أنحاء التشنيح. وينبغي بعد ذلك معالجة هذه الإشارات في مرحلة ما بعد مخصصة كما نوقش في الخطوتين 7-2-3 و 9 من البروتوكول.

وتجدر الإشارة إلى أن كمية انحلال الدم حساسة للتعامل مع الجلطة. لذلك ، يجب توخي الحذر لتقليل الضرر الذي لحق بالجلطة قبل العلاج. لضمان القابلية للتكرار، يجب أن تكون نمذجة الجلطة (الخطوة 1) ووقت ما قبل العلاج (الخطوتين 6 و7.1) هي نفسها بالنسبة لجميع الجلطات المعالجة بالتعرض للهيستوتريبس أو بدونه. في مرحلة ما بعد العلاج من تقييم انحلال النحل ، تجدر الإشارة إلى أن البلازما لديها امتصاص خاص بها. لذلك، ينبغي تشكيل الذوبان المستخدم لتشكيل منحنيات قياسية (مثل الامتصاص البصري مقابل الهيموغلوبين) باستخدام نفس السائل المستخدم مثل التشوه في قناة التدفق (على سبيل المثال، في هذه الدراسة، استخدمت البلازما كمزهول لتشكيل منحنيات قياسية).

يهدف هذا البروتوكول إلى توفير إعداد على مقاعد البدلاء لقياس فعالية الإصابة بالليستريبسي لعلاج جلطات الدم البشرية الكاملة. هناك بعض القيود التي تنشأ بسبب الطبيعة المختبرية للاقامة. الجلطات الحادة المستخدمة لهذا البروتوكول تتكون أساسا من خلايا الدم الحمراء والفيبرين، مما يجعل نهج lysotripsy فعالة لDVT. ومع ذلك، قد تتطور المراحل اللاحقة من الجلطة شبكة الكولاجين قاسية53 التي قد تقاوم العلاج lysotripsy بسبب طبيعة الفيبرين محددة من RT-PA. عند العلاج في الجسم الحي ، فإن نقطة النهاية السريرية الأساسية لفعالية العلاج هي استعادة التدفق. كان فقدان الكتلة مقياسا أساسيا لفعالية العلاج في بروتوكول المختبر الموصوف هنا. على الرغم من عدم تقييم التدفق في هذا البروتوكول ، يمكن دمج تصوير دوبلر اللون بالإضافة إلى ذلك جنبا إلى جنب مع التصوير التجويف السلبي في الخطوة 7.2.4 لمراقبة استعادة التدفق. يستخدم الإعداد في هذا البروتوكول معدل تدفق ثابت، يحاكي معدل التدفق في وعاء شديد الانسداد، أثناء العلاج بأكمله في الخطوة 7.2. في الجسم الحي، سيزداد تدفق الأوعية الدموية مع تفكك الجلطة أثناء العلاج. إجهاد القص إضافية المرتبطة زيادة تدفق سوف تبرز ملف تدهور جلطة54. في الجسم الحي خارج الهدف لا يمكن التأكد من الآثار في هذا الإعداد، مثل النزيف بسبب الإدارة النظامية منlytic 55،تلف جدار السفينة أو vasospasm بسبب نشاط سحابةفقاعة 22. تحد الطبيعة المختبرية لهذه الدراسة أيضا من القدرة على تقييم النتائج طويلة الأجل، مثل رسغ الأوعية أو إعادة التجلط بعد العلاج. إدارة الليك في هذه الدراسة تحاكي الجلطة الجهازية ، في حين أن اللحاقيات الموجهة بالقسطرة هي التدخل المفضل للتجلط الوريدي7،14. يمكن أن يؤثر توهين الأنسجة على مجال الهستوتريبسي وجودة التصوير في دراسات الجسم الحي ، في حين أن المسار الصوتي هنا هو في المقام الأول من خلال المياه غير المغص. معالجة بيانات انبعاثات التجويف باستخدام شعاع Capon القوي (الخطوة 9 من البروتوكول) مكلف حسابيا وأجري خارج الخط للتحليل اللاحق. ويمكن تشغيل أجهزة إعادة تشكيل الحزم الأخرى (مثل التأخير والمبلغ35 أو الطيف الزاوي56)بدلا من ذلك لتوفير التغذية المرتدة في الوقت الحقيقي، وإن كان ذلك مع انخفاض دقة النطاق.

باختصار، يقدم هذا البروتوكول نهجا غير جراحي لتحقيق انحلال الأوردة العميقة للجلطات الدموية البشرية. يضع البروتوكول إجراء مناسبا وسهل التكرار لنمذجة جلطات الدم ، وعلاجها بالتصوير الlysotripsy ، والتصوير المتزامن أثناء العلاج. ويمكن مواصلة استخدام خطوات البروتوكول تحديد توليد سحابة فقاعة histotripsy، وتخطيط العلاج، والتوجيه الصورة للتحقيق في العلاجات المختبرية من ورم الثدي، ورم البنكرياس، وتضخم البروستاتا حميدة، حيث ثبت أن الهستوتريبيسي لتكون أكثر فعالية بالمقارنة مع الإجراءات القياسية57،58. يمكن تعميم استخدام RT-PA في هذا البروتوكول على الأدوية الأخرى أو ناقلات الأدوية التي تستخدم لعلاج مثل هذه الأورام ، جنبا إلى جنب مع الهستوتريبس لزيادة فعالية اللتيك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، غرانت R01HL13334. ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور كيفن هاوورث على مساعدته في فحص درابكين والدكتور فيكتور بولين على دعمه في تصميم البروتوكول. كما يشكر المؤلفون الدكتور آدم ماكسويل على توجيهاته بشأن تصميم المصدر الهستوتريبي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 172، الهستوتريبسي، التحلل، انحلال الدم، انحلال الدم، تجلط الأوردة العميقة، التصوير التجويف السلبي، الموجات فوق الصوتية المركزة، التجويف الصوتي
نظام في المختبر لقياس فعالية الجلطات من الهستوتريبوسي ودواء لاتيك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter