Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Et In vitro-system til at måle den trombolytiske effekt af histotripsi og et lytisk lægemiddel

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

Histotripsi-aided lytic levering eller lysotripsi er under udvikling til behandling af dyb venetrombose. En in vitro-procedure præsenteres her for at vurdere effekten af denne kombinationsbehandling. Nøgleprotokoller for blodpropmodellen, billedvejledningen og vurderingen af behandlingseffektiviteten diskuteres.

Abstract

Dyb venetrombose (DVT) er et globalt sundhedsmæssigt problem. Den primære tilgang til at opnå recanalisering af fartøjer for kritiske forhindringer er kateterstyret trombolytika (CDT). For at afbøde kaustiske bivirkninger og den lange behandlingstid forbundet med CDT, adjuvans og alternative tilgange er under udvikling. En sådan tilgang er histotripsi, en fokuseret ultralydsbehandling for at ablate væv via bobleskynukleation. Prækliniske undersøgelser har vist stærk synergi mellem histotripsi og trombolytika for blodprop nedbrydning. Denne rapport skitserer en bordplade metode til at vurdere effekten af histotripsi-aided trombolytisk behandling, eller lysotripsi.

Blodpropper fremstillet af frisk humant venøs blod blev indført i en flowkanal, hvis dimensioner og acousto-mekaniske egenskaber efterligner en iliofemoralsk vene. Kanalen var gennemsyret af plasma og lytic rekombinant væv-type plasminogen aktivator. Bobleskyer blev genereret i blodproppen med en fokuseret ultralydskilde designet til behandling af lårvenvenøse blodpropper. Motoriserede positioners blev brugt til at oversætte kilden fokus langs blodproppen længde. På hvert insonationssted blev akustiske emissioner fra bobleskyen passivt registreret og stråleformet for at generere passive kavitationsbilleder. Målinger til måling af behandlingseffekten omfattede blodprop massetab (samlet behandlingseffekt) og koncentrationerne af D-dimer (fibrinolyse) og hæmoglobin (hæmolyse) i perfusat. Der er begrænsninger for denne in vitro design, herunder manglende midler til at vurdere in vivo bivirkninger eller dynamiske ændringer i strømningshastighed som blodproppen lyses. Samlet set giver opsætningen en effektiv metode til at vurdere effekten af histotripsi-baserede strategier til behandling af DVT.

Introduction

Trombose er tilstanden af blodprop dannelse i en ellers sund blodkar, der hindrer omsætning1,2. Venøs tromboemboli har en årlig sundhedsudgifter på $7-10 milliarder, med 375,000-425,000 tilfælde i USA3. Lungeemboli er obstruktion af lungepulsåren og er den mest alvorlige konsekvens af venøs tromboemboli. Den primære kilde til lungeobstruktion er dyb vene thrombi, primært fra iliofemoral venøse segmenter4,5,6. Dyb venetrombose (DVT) har iboende følgevirkninger udover lungeobstruktioner, med langsigtede komplikationer, der resulterer i smerte, hævelse, bensår og amputationer aflemmerne 7,8,9. For kritiske forhindringer, kateter rettet trombolytics (CDT) er frontlinjen tilgang til fartøj recanalization10. Resultatet af CDT afhænger af en række faktorer, herunder trombe alder, placering, størrelse, sammensætning, ætiologi, og patientrisiko kategori11. Desuden er CDT forbundet med vaskulær skade, infektioner, blødningskomplikationer og lang behandlingstid10. Næste generations enheder har til formål at kombinere mekanisk trombektomi med trombolytika (dvs. farmakkomesisk trombektomi)12,13. Brugen af disse enheder sænker den lytiske dosis, hvilket fører til reducerede blødningskomplikationer, og forkortede behandlingstiden12,13,14 sammenlignet med CDT. Disse enheder stadig bevare problemer med hæmoragiske bivirkninger og ufuldstændig fjernelse af kronisk thrombi15. En adjuvans strategi er derfor nødvendig, der kan fjerne tromben helt med lavere blødning komplikationer.

En potentiel tilgang er histotripsi-aided trombolytisk behandling, benævnt lysotripsi. Histotripsi er en ikke-invasiv behandling modalitet, der bruger fokuseret ultralyd til at nukleate boble skyer i væv16. Bobleaktivitet genereres ikke via eksogene kerner, men ved anvendelse af ultralydsimpulser med tilstrækkelig spænding til at aktivere kerner iboende væv, herunder blodprop17,18. Den mekaniske svingning af bobleskyen giver stammen til blodproppen og opløser strukturen i acellulære snavs19. Histotripsi boble aktivitet giver effektiv nedbrydning af tilbagetrukne og unretracted blodpropper både in vivo og in vitro20,21,22. Tidligere undersøgelser har23,24 påvist, at kombinationen af histotripsi og lytic rekombinant vævstype plasminogen aktivator (rt-PA) øger behandlingseffektiviteten (rt-PA) betydeligt i forhold til lytic alene eller histotripsi alene. Det er en hypotese, at to primære mekanismer forbundet med histotripsi boble aktivitet er ansvarlige for den forbedrede behandling effekt: 1) øget fibrinolyse på grund af øget lytic levering, og 2) hæmolyse af røde blodlegemer i blodproppen. Hovedparten af blodproppen består af røde blodlegemer24, og derfor er sporing af erythrocyt nedbrydning en god surrogat for ablation af prøven. Andre dannede blodprop elementer er også sandsynligvis opløst under histotripsi boble aktivitet, men er ikke taget i betragtning i denne protokol.

Her er en bordplade tilgang til behandling af DVT in vitro med lysotripsi skitseret. Protokollen beskriver kritiske driftsparametre for histotripsikilden, vurdering af behandlingseffekt og billedvejledning. Protokollen omfatter designe en flow kanal til at efterligne en iliofemoral venøs segment og fremstilling af humane fuldblodspropper. Den eksperimentelle procedure skitserer placeringen af histotripsi kilde og billeddannelse array for at opnå histotripsi eksponering langs blodproppen placeret i flowkanalen. Relevante insonationsparametre for at opnå blodpropforstyrrelser og minimere off-target bobleaktivitet defineres. Brugen af ultralydsscanning til vejledning og vurdering af bobleaktivitet er illustreret24. Målinger til kvantificering af behandlingseffekten, såsom massetab af blodpropper, D-dimer (fibrinolyse) og hæmoglobin (hæmolyse) er skitseret23,24,25,26,27. Samlet set giver undersøgelsen et effektivt middel til at udføre og vurdere effekten af lysotripsi til behandling af DVT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For de resultater, der præsenteres her, venøse humane blod blev trukket til at danne blodpropper efter godkendelse fra den lokale interne review board (IRB # 19-1300) og skriftligt informeret samtykke fra frivillige donorer24. I dette afsnit skitseres en designprotokol til vurdering af lysotripsieffekten. Protokollen er baseret på et tidligere værk af Bollen et al.24.

1. Clot modellering

BEMÆRK: Forbered blodpropper inden for 2 uger, men mere end 3 dage før dagen for forsøget for at sikre størknet stabilitet og maksimere tilbagetrækning28. Forbered blodproppen efter godkendelse fra lokale institutionelle review board.

  1. Forbered borosilicate Pasteur pipette til opbevaring af blodet (se Materialetabel for specifikationer for pipetten). Borosilicatrør anvendes på grund af den hydrofile karakter af det materiale, der fremmer blodpladeaktivering og clot tilbagetrækning29. Forsegl spidsen af pipetten via opvarmning over en Bunsen brænder.
  2. Tegn frisk menneske venøs blod. Aliquot det samlede blod trukket i 2 mL intervaller pr ønskede blodprop. Overfør hver 2 mL aliquot til en Pasteur pipette.
    BEMÆRK: Udfør trin 1.2 inden for ca. 3 min. blodprøve, så blodet ikke størkner, før det overføres til pipetter. Sørg også for, at den frivillige donor ikke er på nogen medicin, der kan ændre koagulationskaskaden (f.eks. blodfortyndende medicin eller blodpladehæmmere).
  3. Inkuberes blod aliquots i pipetterne (svarende til antallet af blodpropper, der kræves) i et vandbad i 3 timer ved 37 °C.
  4. Rørberne opbevares i mindst 3 dage ved 4 °C for at muliggøre tilbagetrækning af blodpropper28. Når blodpropperne trækker sig tilbage, vil serum blive observeret for at akkumulere øverst på blodproppen i pipetten. Rt-PA-respons af blodpropper forbliver stabil i 2 uger efter tilbagetrækning28.

2. Forberedelse af vandtanke

  1. Fyld vandtanken med omvendt osmosevand. Line den nederste overflade af tanken med en akustisk absorberende materiale til at reducere afspejling af terapi eller billeddannelse ultralyd pulser. Brug et vandhåndteringssystem til at afgas og filtrere vandet for at minimere boblekerner.
    BEMÆRK: En måde at filtrere vandet på er ved hjælp af et indbygget filter. Specifikationerne for den pose , der anvendes til fremstilling af de repræsentative resultater, er angivet i materialetabellen.
  2. Placer to varmeelementer på tankens nederste overflade. Opvarm vandet til 37,3 °C for at opnå den maksimale lytiske enzymatiske aktivitet30.
  3. Konfigurere en flowkanal som vist i figur 1A. Flowkanalen består af slanger, et modelbeholder med materiale og geometriske egenskaber, der er repræsentative for en iliofemoralsk vene, et reservoir til plasma og en sprøjte i den distaleste ende af reservoiret (Materialetabel). Sprøjten er forbundet til en pumpe for at regulere et flow gennem kanalen under eksperimentet.
  4. Dyk manuelt strømningskanalen ned i vandtanken for at bringe kanalen til fysiologisk temperatur under afgasnings-/filtrerings-/opvarmningsfasen (trin 2.1 og 2.2).

3. Fremstilling af plasma- og rt-PA-blanding

  1. Før eksperiment dag
    BEMÆRK: Når plasmaet opbevares ved -80 °C, er det stabilt i mindst 2,5 år31, og rt-PA er stabilt i mindst 7 år32. Udfør derfor trin 3.1 når som helst inden for disse perioder for at sikre stabiliteten af de to komponenter.
    1. Fortynd den rt-PA, der er fremstillet af en producent i pulverform, til 1 mg/mL i sterilt vand.
    2. Aliquot 100 μL fortyndet rt-PA i 0,5 mL centrifugerør og opbevar dem ved -80 °C.
    3. Aliquot 35 mL af human friskfrosset type O plasma i 50 mL centrifuge rør. Rør ved -80 °C.
  2. På forsøgsdagen
    1. Hent plasma aliquots fra fryseren. Hent lige så mange aliquots som antallet af blodpropper, der skal testes den dag. Fordyb de frosne aliquots i et vandbad ved 37 °C for at tø op (~ 10 min).
    2. Når plasmaet er optøet, hæld det i et bægerglas, der er triply skylles med ultrapure vand. Dæk let bægerglasets mund med aluminiumsfolie for at forhindre forurening og placere bægeret i vandbadet. Lad folien være løs nok til, at luften kan komme i kontakt med plasmaet.
    3. Lad plasma ekvilibrere ved 37 °C til atmosfærisk tryk i mindst 2 timer.
    4. Tag de frosne rt-PA hætteglas og sted på is, indtil det er nødvendigt, med et hætteglas for hvert eksperiment køre.
    5. Lav lav gelering agarose (2%) i en 50 mL kolbe, ved at opløse agarose i ultrapure vand. Vælg den samlede mængde agaroseopløsning, så der er ca. 2 mL til rådighed for hver prøve, der skal analyseres. Varm opløsningen i kolbe i en mikrobølgeovn, indtil boblende. Fastgør kolben med et vandtæt skruelåg på. Dyk kolben ned i vandbadet ved siden af plasmaet.
      BEMÆRK: Dette trin sikrer, at agarose er tilgængelig for at sikre eksponerede blodpropsegmenter til histologianalyse efter histotripsi insonation.

4. Opsætning af histotripsy kilde og billeddannelse array

  1. Sørg for, at de motoriserede positioner kan styres fra kørselsmiljøet på en programmeringsplatform ved hjælp af anvisninger og kommandoer fra producenten. Kontroller, at systemets motorer er tilsluttet computerens relevante port med kørselsmiljøet.
  2. Monter histotripsykilden på det motoriserede positioneringssystem som vist i figur 1B.
  3. Tilslut histotripsikilden til dens drivende elektronik (f.eks. effektforstærker og funktionsgenerator) via de relevante stik (f.eks. BNC-kabler) som angivet af producenten.
    BEMÆRK: Sørg for, at hanstripsikildes køreelektronik kan styres via det kørselsmiljø, der blev brugt i trin 4.1.
  4. Dæk billeddannelse array med en sonde dække og anbringe array koaksially i blænden af histotripsy kilde som vist i figur 2. Sørg for at forstå retningen af billedplanet i forhold til histotripsikildens orientering.
  5. Tilslut billeddannelsessystemet til et ultralydsscanningssystem. Sørg for, at dette system kan styre driften og udløsningen af billedmatrixen, og indsamle billeddata i henhold til de kommandoer, der leveres af scannerproducenten.
  6. Dyk ned histotripsy kilde / billeddannelse array i tanken, mens afgasning som vist i figur 1A. Fjern forsigtigt eventuelle luftbobler ved hjælp af en sprøjte fra overfladen af histotripsikilden eller billeddannelsesmatrixen.
    BEMÆRK: Sænk histotripsikilden og billeddannelsesmatrixen helt i vand før drift. Undgå at røre overfladen af histotripsy kilde.
  7. Hent B-tilstandsbilleder med en hastighed på 20 billeder i sekundet ved hjælp af billedmatrixen og scannerens indbyggede kommandoer. Juster billedbehandlingsvinduet for at sikre visualisering af fokus for histotripsy-kilden i disse realtidsbilleder.
    BEMÆRK: Det antages, at dimensionerne af fokusområdet i den terapeutiske kilde er kendt.
  8. Angiv driftsparametrene for histotripsikilden, herunder grundlæggende frekvens (f.eks. 1,5 MHz), pulsgentagelsesfrekvens (f.eks. 20-100 Hz), pulsvarighed (f.eks. 1-20 cyklusser pr. puls) og det samlede antal pulser pr. placering (f.eks. 100-2.000)18,23,24,33. Rediger disse parametre, hvis der ikke opnås tilstrækkelig blodprop lysis, eller hvis bobleaktiviteten strækker sig ud over modelbeholderens lumen. Hvis du vil angive disse parametre, skal du bruge den protokol, der leveres af producenten af kilden, eller bruge en programmeringsplatform, der kan kommunikere med kilden (trin 4.3).
  9. Kør kun histotripsykilden ved de indstillede parametre i afgasset vand uden hindring i det omgivende miljø ved hjælp af producentens protokol eller programmeringsplatform, der blev brugt i trin 4.8. Forøg spændingen anvendes på histotripsy kilde, indtil en boble sky er dannet.
  10. Ved hjælp af realtidsbilleddannelsen af trin 4.7 skal du justere billedmatrixens position inde i den konfokale transduceråbning, indtil bobleskyen er placeret ca. i midten af billedvinduet. Bobleskyen er det område af hyperechoic pixels i billedplanet (Figur 3). Stram skruerne for at holde billeddannelsesmatrixen fast i transduceråbningen.
    BEMÆRK: Hvis arrayet er justeret korrekt, skal azimuthalpositionen af bobleskyen være ca. 0 mm i billedplanet. Billeddannelse array kan projicere lidt fra den indre overflade af terapi kilde, og derfor området position boblen sky kan afvige fra brændvidde af kilden.
  11. Identificer bobleskyens placering i billedplanet. Tildel fokus for histotripsykilden som centrum for bobleskyen (Figur 3).
  12. Registrer den fundne brændpunkt (trin 4.11) i billedvinduet (Figur 3). En mulig måde at markere brændpunktet på er at placere en markør for at notere placeringen i billedvinduet, hvis den er tilgængelig med billedplatformen.
  13. Ophør insonation og indstille spændingen anvendes til histotripsy kilde til 0 V.

5. Tilberedning af blodprop

  1. Fjern blodproppen fra pipetten ved at skære den forseglede ende med tænger. Lad blodproppen glide ind i en petriskål sammen med serumet. Hvis blodproppen ikke løsnes, skal du forsigtigt lægge tryk fra den anden ende af pipetten via saltvandsskyl for at fjerne blodproppen.
  2. Skær blodproppen til 1 cm længde ved hjælp af en skalpel, der sigter mod et ensartet stykke fra midten (dvs. væk fra dele af blodproppen dannet øverst eller nederst i pipetten).
  3. Brug en rengøringsstørk til at blotlægge den afskårne del af blodproppen forsigtigt for at fjerne overskydende væske.
  4. Brug pincet, placere blodproppen sektion forsigtigt på en vægt og registrere vægten.
  5. Løft manuelt strømningskanalen ud af vandtanken, og fjern modelbeholderen fra strømningskanalen.
  6. Anbring blodproppen i modelbeholderen ved hjælp af pincet, og fastgør modelbeholderen igen til strømningskanalen.
    BEMÆRK: En nylonstang kan placeres i modelbeholderen for at forhindre blodproppen i at bevæge sig nedstrøms på grund af strømmen.
  7. Sænk strømningskanalen ind i tanken på en sådan måde, at den proksimale ende af scenen i forhold til reservoiret er lav sammenlignet med den distale side. Lystfiskeriet på denne måde forhindrer fangst af bobler i modelbeholderen, når plasma trækkes gennem flowkanalen i trin 6.1.
  8. Der tilsættes 30 mL plasma til beholderen ved hjælp af en pipette, og temperaturen overvåges, indtil den når mindst 36 °C.
  9. Brug en pipette til at dispensere rt-PA (80,4 μg i 30 mL plasma, 2,68 μg/mL) i plasmabeholderen. Rør plasmaet med pipetten for at sikre en ensartet rt-PA-fordeling i reservoiret.

6. Priming af flowkanalen

  1. Træk plasma ind i strømningskanalen fra beholderen via sprøjtepumpen, indtil plasmaet fylder modelbeholderen.
    BEMÆRK: Hvis blodproppen ikke flugter med nylonstangen, skal du bruge korte pumpetræk ved 60 mL/min til at forsøge at tvinge plasmaet nedstrøms blodproppen eller manuelt trække gennem sprøjten. Begræns mængden af plasma, der trækkes i denne proces, eller genopfyld beholderen ved hjælp af yderligere plasma/rt-PA for at sikre 30 mL opløsning i flowkanalen.
  2. Juster billedmatrixen parallelt med blodproppens længde ved hjælp af billedscriptet (trin 4.7) ved hjælp af de motoriserede positioners. Den parallelle justering gør det muligt for brugeren visuelt at sikre korrekt placering af blodproppen og fravær af bobler inde i modelbeholderen.
  3. Plan modelbeholderen manuelt og visuelt sikre, at der ikke er luftbobler til stede ved hjælp af billedvinduet (trin 4.7).

7. Forsøgsprocedure

  1. Forbehandling
    BEMÆRK: Dette trin er at planlægge en vej for histotripsi kilde / billeddannelse array for ensartet histotripsi eksponering langs blodprop længde.
    1. Juster billedmatrixen ved hjælp af de motoriserede positioner, således at billedplanet er parallelt med koppens tværsnit (dvs. vinkelret på den retning, der er beskrevet i trin 6.2).
    2. Under vejledning via billeddannelsesvinduet (trin 4.7) flyttes histotripsikilden til den proksimale ende af blodproppen i forhold til reservoiret ved hjælp af de motoriserede positioner. På dette tidspunkt skal du justere histotripsikildepositionen, så det markerede fokuspunkt i trin 4.12 flugter med midten af blodproppen.
    3. Bestem insonationsstien langs blodproppens længde. For at definere denne vej skal du indstille tre vejpunkter langs koppens længde (dvs. placeringen af de motorer, hvor histotripsiboaktiviteten er indeholdt i blodproppen) i intervaller på 5 mm. Juster waypoints sådan, at den samlede bevægelse af histotripsy kilde langs stien er forgrad med flow i systemet (dvs. den første waypoint er i den mest proksimale ende af blodproppen i forhold til reservoiret, og den tredje waypoint er i distal position i forhold til reservoiret).
    4. Før du afslutter hvert waypoint, brand test pulser fra histotripsy kilde med de samme insonation parametre som trin 4,8, men reducere den samlede eksponering til 10 samlede pulser. Juster placeringen af histotripsikilden ved hjælp af de motoriserede positioners, hvis det er nødvendigt, for at indeholde bobleaktivitet i blodproppen.
    5. Gem motorpositionerne ved hjælp af de kommandoer, som producenten stiller til rådighed, i lighed med trin 4.1.
  2. Behandling
    BEMÆRK: Dette trin definerer proceduren for behandling af blodproppen langs dens længde i henhold til den vej, der er defineret i forbehandlingstrinnet.
    1. Kør sprøjtepumpen ved 0,65 mL/min og vent på, at plasmaets menisk bevæger sig. Denne strømningshastighed efterligner en næsten total okklusion af den iliofemoralske vaskulatur24,34.
    2. Interpoler stien, der blev oprettet i trin 7.1.3, med mellemtrin mellem de etablerede vejpunkter med en fast trinstørrelse (f.eks. 0,5 mm). Trinstørrelsen vælges til at være mindre end halvdelen af brændviddens bredde målt langs blodproppens længde (billeddannelsesretningen). Flyt histotripsykilden ved hjælp af motoriserede positioner på hvert stisted med insonationsparametre defineret i trin 4.8.
    3. Monitor/billedbobleaktivitet under påføring af histotripsipulsen på hvert stisted ved hjælp af billedvinduet (trin 4.7). Centrer billedet på histotripsi fokus med billedet dimensioner, der dækker 15 mm i azimuth og rækkevidde. Før anvendelsen af histotripsy puls på hvert sted, erhverve en B-mode billede til at give visualisering af blodprop og model fartøj, ved at skabe et script i en programmeringsplatform. Kontroller, at scriptet etablerer kommunikation med scanneren ved hjælp af producentens kommandoer.
    4. Under anvendelsen af histotripsi puls, gennemføre erhvervelsen af akustiske emissioner i scriptet i trin 7.2.3 til at danne passive kavitation billeder post hoc35. Erhverve en passiv kavitation billede efter hver 10 behandling pulser. Anvend en flad tid gevinst kompensation på 50 på 8 trinvise dybder indtil slutningen af billeddannelse dybde. Vælg en passende anskaffelsesvinduesstørrelse, så hele signalet fra blodproppen opfanges med et minimalt energitab på grund af vindue35.
    5. Hvis der er off-target bobleskyer til stede, skal du justere transducerpositionen på stedet med de motoriserede positioner.
      BEMÆRK: Overvåg efter ubesvarede udløsere af billedmatrixen. Juster antallet af indhøstede billeddatasæt for at sikre, at lagringen af data er fuldført, før den efterfølgende udløsning udløses.

8. Procedure efter forsøg

  1. Løft manuelt modelbeholderen ud af vandtanken for at dræne perfusate via tyngdekraften. Sørg for at holde flowkanalen nivelleret for at forhindre, at blodproppen bevæger sig nedstrøms og ud af modelbeholderen under dræning.
  2. Saml hele perfusatet til yderligere analyse i et lille bæger (Figur 4A) ved at trække plasmaopløsning fra strømningskanalen gennem sprøjtepumpen ved en meget lav strømningshastighed.
  3. Tag modelbeholderen ud, og fjern blodproppen. Om nødvendigt skal du injicere en lille mængde saltvand i modelbeholderen for forsigtigt at løsne blodproppen.
  4. Blodproppen tørres af i lighed med trin 1.2.3. Afvej blodproppen på vægtskalaen til vurdering af massetabet af blodpropper.
  5. For at analysere D-dimer indhold, tilføje 100 mg aminosyre til en mikrocentrifuge rør efterfulgt af 1 mL perfusat, og bland godt ved hjælp af en pipette. Udfør en latex immun-turbidimetrisk analyse for at kvantificere D-dimer i prøven36.
  6. For at vurdere hæmolyse tilsættes 1 mL perfusate til centrifugerør og spin ved 610 x g (3.500 rpm) i 10 min. Kombiner 0,5 mL supernatant (koncentrat) med 0,5 mL Drabkins-opløsning og lad blandingen hvile ved stuetemperatur i 15 min. Overfør 200 μL til brøndplader, som vist i figur 4B. Brug en pladelæser til at aflæse absorbans ved 540 nm, Figur 4C (Drabkins assay37).
  7. Histologivurdering
    1. Skær en sektion fra midten af blodproppen på ca. 2-3 mm i længden med en skalpel.
    2. Føj sektionen til en kassette. Opretholde orientering af afsnittet i forhold til retningen af histotripsi puls formering.
    3. Der tilsættes 2 mL lav vallak agaroseopløsning, der fremstilles i trin 3.2.5, i kassetten for at fastgøre blodproppen på plads.
    4. Prøven anbringes i 10 % formalin i 24 timer. Prøven anbringes i 70 % alkohol efter 24 timer, og udfør standard hæmotoxylin-eosinfarvning38.

9. Passiv kavitation billede analyse

  1. Behandl de signaler, der er erhvervet fra billeddannelsesmatrixen under histotripsi excitation (trin 7.2.4) ved hjælp af en algoritme baseret på den robuste Capon beamformer39 for at skabe et billede af akustiske emissioner genereret af bobleskyen på hvert behandlingssted.
    BEMÆRK: For at generere kvantitative billeder skal du følge de trin, der er beskrevet i Haworth et al.35. Ellers skal hver pixelværdi i billedet repræsentere den relative akustiske boblesky (enheder af V2) på hvert tilsvarende sted.
  2. Segmenter det B-tilstandsbillede, der er gemt i trin 7.2.3, for at skelne mellem de pixel, der repræsenterer blodproppen, og modelbeholderen.
  3. Registrer billedet i passiv kavitation med B-tilstandsbilledet som vist i figur 5B. Opsummer den akustiske energi i blodproppen i eksponeringsperioden35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen skitseret i denne undersøgelse fremhæver detaljerne i venøs blodprop modellering, lysotripsi for blodprop forstyrrelser, og ultralydsscanning i en in vitro setup af DVT. Den vedtagne procedure viser de nødvendige skridt til at vurdere forstyrrelser i blodpropper på grund af de kombinerede virkninger af rt-PA og histotripsy boble cloud aktivitet. Bænken setup var designet til at efterligne de særlige kendetegn ved en venøs iliofemoral vene. Figur 1A viser et modelkar, der har iliofemoralvens akustiske, mekaniske og geometriske egenskaber. Blodproppen er placeret inde i modelbeholderen for at efterligne en delvist okklusiv trombe. Blodproppen er gennemsyret af plasma og rt-PA trukket fra et reservoir med en hastighed på 0,65 mL/min. Denne hastighed er i overensstemmelse med den langsomme strømningshastighed i et stærkt okkluderet fartøj34.

En elliptisk fokuseret transducer på 1,5 MHz grundlæggende frekvens med en 9 cm større akse, 7 cm mindre akse og 6 cm brændvidde (Figur 2A) er monteret på positioneringssystemet som angivet i figur 1B. En billeddannelse array dækket med ultralyd gel og en latex dækning (Tal 2B,C) er monteret koaksially med transducer som vist i figur 1A via en åbning i midten af histotripsi kilde. De motoriserede positioner blev brugt til at oversætte terapitransducer/billeddannelsesmatrix langs blodproppens længde i modelbeholderen (figur 1). Ved anvendelse af tilstrækkelig spænding til histotripsikilden genereres en boblesky i transducerens brændvidde og visualiseres via ultralydsscanning, som vist i figur 3. Fokuspositionen defineres som midten af bobleskyen ved hjælp af billedplanet (trin 4.10-4.11).

Figur 4A viser perfusates indsamlet til to forskellige behandlingsbetingelser. Bægerglasset, der er mærket som kontrol, indeholder perfusat af en blodprop, der er udsat for plasma alene. Det andet bæger, der er mærket som behandlet, indeholder perfusat af den lysotripsibehandlede blodprop. De indsamlede perfusates bruges til at vurdere hæmoglobin (metriske af hæmolyse) og D-dimer (metriske af fibrinolyse) indhold gennem assays som angivet i protokollen. Forskellen i farve af perfusates betegner variabilitet i hæmoglobin koncentration, som kan kvantificeres via optisk absorbans. Forholdet mellem absorbansværdi og hæmoglobinkoncentration kan bestemmes gennem en kalibreringskurve. Opløsninger med kendt hæmoglobinindhold fra 0 (blank måling) til 180 mg/mL placeres i brøndpladen, og absorbansen bestemmes i tredotel ved hjælp af pladelæseren (Figur 4B, C). Den øvre absorbansgrænse for pladelæseren kan variere og kendes muligvis ikke på forhånd for at lave opløsningerne i brøndpladen. Som sådan er hæmoglobinkoncentrationer op til 180 mg /mL lavet i brøndpladen, Figur 4B. Den pladelæser, der bruges her, kan dog kun aflæse absorbans for koncentrationer på op til 23 mg/mL, figur 4C.

Figur 5A viser visualisering af blodproppen i modelbeholderen via B-tilstandsbilleddannelse forud for histotripsieksponering som angivet i trin 7.2.3. Dette billede er erhvervet for at bestemme blodproppen position for segmentering af den passive kavitation billede. Figur 5B viser det passive kavitationsbillede, der er co-registreret med B-mode-billedet, der er erhvervet før histotripsieksponering. Dette tal bekræfter, at akustisk energi primært er indeholdt i blodproppen under histotripsi eksponering.

Typiske blodpropforstyrrelser på grund af histotripsi og lytic er angivet i figur 6. Figur 6A, B viser henholdsvis ubehandlede og lysotripsibehandlede blodpropbilleder. For prøver, der udsættes for histotripsi, er forstyrrelser primært begrænset til blodproppercentret, i overensstemmelse med de observerede steder for bobleaktivitet, der spores med passiv kavitationsbilleddannelse (Figur 5B). Men med tilsætning af lytic forekommer massetab også i regioner tættere på periferien af blodproppen. Det er en hypotese, at dette ekstra massetab skyldes øget væskeblanding af lytic under bobleaktivitet. Væskeblanding øger fordelingen og indtrængningsdybden af lytic i blodproppen. Da lytic er ansvarlig for fibrinolyse40, massetabet stiger. Fibrinolyse kan kvantificeres ved at måle D-dimerindholdet i perfusatet41.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel opsætning til lysotripsi af human blodprop. (A) Opsætningens komponenter er (1) fokuseret histotripsikilde med elliptisk geometri, (2) latex-dækket billeddannelsessystem, (3) modelbeholder fastgjort til flowkanal, (4) flowkanal, (5) reservoir, (6) akustisk absorberende materiale, (7) varmeelement og (8) vandtank fyldt med afgasset og opvarmet omvendt osmosevand. Billedplanets azimuthdimension er vinkelret på højde- og områdedimensionerne (ind på siden). (B) Histotripsykilden monteret på det motoriserede positioneringssystem. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ultralydskilde- og billedkomponenter. Individuelle zoomede billeder af (A) fokuseret histotripsy kilde, (B)imaging array, og(C)imaging array med ultralyd gel og latex dækning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3:Histotripsy boble sky visualiseret ved hjælp af billeddannelse array. En boblesky genereres i fokuszonen for histotripsikilden og afbildes ved hjælp af et billedsystem. Det udpegede fokus, vist som et kryds, gemmes til behandlingsplanlægning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Kvantificering af hæmoglobin frigivet på grund af blodprop lysis. (A) Perfusatprøver indsamlet efter kontrolstudiet med plasma alene (ingen histotripsi eller lytic) og behandlingsarm, histotripsi (f.eks. 35 MPa-topsubpression, 5 cykluspulsvarighed, 1,5 MHz grundlæggende frekvens) og 2,68 μg/mL lytic eksponering. (B) Nå plade indeholdende fortyndinger af kendte hæmoglobin koncentrationer spænder fra 180 mg / mL (øverste række, venstre-mest hjørne) til 0 mg / mL (nederste række, højre-mest hjørne). Pilespidsen peger i retning af faldende hæmoglobinkoncentration. (C) Disse prøver anvendes til at skabe en standardkurve til kvantificering af hæmoglobin produceret på grund af histotripsi eksponering via spektrofotometri. Absorbanskurve for hæmoglobinkoncentrationer fra 0 til 23 mg/mL opnås på grund af begrænsning af pladelæseren i analysen af højere koncentrationer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Billeder af blodproppen under behandlingen. (A) B-tilstand, der er erhvervet før behandlingspulsens start, og som viser blodproppens position i modelbeholderen. (B) Post-hoc visualisering afacoustisk energiemission beregnet ud fra passiv kavitationsbilleddannelse vist i varmt farvekort, der er registreret sammen med B-tilstandsbillede af den blodprop, der er erhvervet før påføring af histotripsipulsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Histologi af den ablated blodprop under forskellige behandlingsforhold. (B) Blodprop behandlet med lysotripsi (f.eks. 35 MPa-topsubetryk, enkeltcykluspulsvarighed, 1,5 MHz grundlæggende frekvens). Histotripsi pulsen forplantet fra top til bund i dette billede. Stien til histotripsikilden langs blodproppens længde (dvs. vinkelret på det billede, der vises her), er defineret i trin 7.2.3. Mikrografernes skala er 2 mm. Bemærk , at graden af blodpropforstyrrelser, der opnås her , vil blive reduceret i forhold til insonationsordninger med længere pulsvarighed24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foreslåede protokol præsenterer en model til at kvantificere behandlingseffekten af lysotripsi. Mens de vigtigste detaljer er blevet drøftet, er der visse kritiske aspekter at overveje for succesen af denne protokol. Den enzymatiske aktivitet af RT-PA har en Arrhenius temperatur afhængighed30. Temperatur er også en medvirkende faktor til lydens hastighed i vand og væv, og temperaturudsving kan forårsage mindre ændringer af fokuszonens geometri. Vandtemperaturen bør således reguleres omhyggeligt ved 37 °C. Den dosis rt-PA, der anvendes i protokollen (2,68 μg/mL), er i overensstemmelse med den dosis, der anvendes klinisk til andre farmakologiske trombektomistrategier42. I trin 5.8 overføres 30 mL plasma til reservoiret, mens en 35 mL aliquot er noteret i trin 3.1.3. Dette ekstra plasma tegner sig for tab af plasma som følge af fordampning i løbet af timer, når det opvarmes til 37 °C for ækvilibrering til atmosfærisk tryk.

Brændvidden, blændebredden og hyppigheden af terapitransduceren dikterer størrelsen og dybden af fokusområdet. Derfor bør transduceren vælges således, at disse egenskaber flugter med målbeholderens diameter og dybde (f.eks. lårårevene: 2-4 cm i dybden og 0,6-1,2 cm i diameter)43. Omfanget af mekanisk ablation er begrænset til omfanget af bobleskyen. Således er en forståelse af den rolle, insonationsparametre spiller i at ændre histotripsi bobleskyadfærd, kritisk33,44,45. Frekvensen og styrken af akustisk felt bør også vælges med den store dæmpning som følge af mellem- og mellemmaterialer (f.eks. modelbeholder). For at sikre indespærring af bobleaktiviteten med målbeholderen bør der vælges et passende billedvindue til overvågning af brændzonen. Transducerens driftsparametre bør vælges for at undgå off target-effekter, samtidig med at mekaniske blodpropforstyrrelser maksimeres. I denne protokol blev massetab betragtet som en primær metrikværdi for behandlingseffekt. Stigninger i massetab er blevet observeret som peak negative tryk eller varigheden af histotripsi puls er steget24,46, med et maksimalt observeret massetab på 94%. Tilstedeværelsen af restprop til undersøgte behandlingsarme letter sammenligningen af terapeutisk effekt. Men insonation ordninger for at sikre en fuldstændig fjernelse af tromben kan også udtænkes.

Modelbeholderens akustiske impedans (ca. 1,58 MRayl47,48) og de geometriske egenskaber (0,6-1,2 cm i diameter43)af modelbeholderen skal være repræsentative for den iliofemoralske venøse vaskulatur (se materialetabellen for detaljer). Polydimethylsiloxan og polyurethan er nogle af de andre materialer, der er egnede til at modellere det venøse system baseret på deres acousto-mekaniske egenskaber. I trin 7 er det vigtigt at fjerne alle luftbobler fra modelbeholderen for at undgå at beskytte blodproppen mod histotripsieksponering. For et modelkar af hydrofobisk materiale kan bobleskyer fortrinsvis dannes i nærheden af karvæggen i stedet for midten af blodproppen. Derfor bør kontinuerlig overvågning af bobleskyen ske under behandlingen via ultralydsscanning, og transduceren skal flyttes, hvis det er nødvendigt. Der bør gennemføres pilotundersøgelser for at bestemme histotripsi insonationsparametre (f.eks. pulsvarighed og spidsbelastning), der opnår den endelige tilsigtede blodpropforstyrrelse.

Billedmatrixen bruges til at fange B-tilstandsbilleder og passive kavitationsbilleder til behandlingsvisualisering og til at kvantificere bobleaktivitet. B-mode billeddannelse gør det muligt visualisering af modelbeholderen og blodproppen, og passiv kavitation imaging måler energien i boblen aktivitet forbundet med blodprop ablation24,49. Båndbredden i billedmatrixen skal flugte med den ønskede bobleskyaktivitet med et højt signal-til-støj-forhold. For at opnå rent bredbåndssignaler, der er forbundet med inertielle sammenbrud af bobler i skyen, bør båndbredden af arrayet ikke falde sammen med den grundlæggende frekvens af transducer50,51. Histotripsi pulser er meget ikke-lineære52, og det er sandsynligt, at harmoniske af den grundlæggende frekvens vil være til stede i det modtagne signal. Billeddannelsessystemet bør programmeres til at udløse på grundlag af det kendte tidspunkt for histotripsipulsens flyvning fra kilden til brændzonen for at sikre indsamling af komplette passive kavitationsbilleddata under hele insonationen. Disse signaler bør derefter behandles efter hoc som beskrevet i protokollens trin 7.2.3 og 9.

Det skal bemærkes, at mængden af hæmolyse er følsom over for håndteringen af blodproppen. Derfor bør man være forsigtig med at minimere skader på blodproppen før behandling. For at sikre reproducerbarhed bør clotmodellering (trin 1) og forbehandlingstid (trin 6 og 7.1) være ens for alle de blodpropper, der behandles med eller uden histotripsieksponering. I hæmolysevurderingen efter behandlingen skal det bemærkes, at plasma har sin egen absorbans. Derfor bør det fortyndingsnøgle, der anvendes til at danne standardkurver (f.eks. optisk absorbans vs. hæmoglobin), dannes ved hjælp af den samme væske, der anvendes som perfusatet i flowkanalen (f.eks. blev plasma i denne undersøgelse brugt som fortyndingsstoffer til at danne standardkurver).

Denne protokol har til formål at give en bordplade setup til at måle effekten af lysotripsi til behandling af humane fuldblodspropper. Der er visse begrænsninger, der opstår på grund af in vitro-karakteren af opsætningen. De akutte blodpropper, der anvendes til denne protokol bestod hovedsageligt af røde blodlegemer og fibrin, hvilket gør tilgangen af lysotripsi effektiv for DVT. Senere stadier af trombe kan dog udvikle et stive kollageniske netværk53, der kan modstå lysotripsibehandling på grund af rt-PA's fibrin-specifikke karakter. Ved behandling af in vivo er det primære kliniske endepunkt for behandlingseffekt genoprettelse af flowet. Massetab var en primær metrik for behandlingseffekten i in vitro-protokollen, der er beskrevet her. Selvom flow ikke blev vurderet i denne protokol, kan farve Doppler billeddannelse desuden indarbejdes sammen med passiv kavitation imaging i trin 7.2.4 til at overvåge flow restaurering. Opsætningen i denne protokol bruger en fast strømningshastighed, der efterligner strømningshastigheden i et meget okkluderet fartøj under hele behandlingen i trin 7.2. In vivo vil vaskulær strømning stige, efterhånden som blodproppen opløses under behandlingen. Den ekstra forskydningsspændinger, der er forbundet med øget flow, vil forstærke nedbrydningsprofilen for blodpropper54. In vivo off-target effekter kan ikke fastslås i denne opsætning, såsom blødning på grund af systemisk administration af lytic55, fartøj vægskader eller vasospasm på grund af boble sky aktivitet22. In vitro-karakteren af denne undersøgelse begrænser også evnen til at vurdere langsigtede resultater, såsom karpatency eller retrombose efter behandling. Administrationen af lytic i denne undersøgelse efterlignede systemiske trombolytika, mens kateter-rettet lytics er den foretrukne intervention for venøs trombose7,14. Vævsdæmpning kan påvirke histotripsifeltet og billedkvaliteten for in vivo-studier, mens her er den akustiske vej primært gennem afgasset vand. Behandling af kavitation emissionsdata med den robuste Capon beamformer (trin 9 i protokollen) er beregningsmæssigt dyrt og blev udført off-line for post hoc analyse. Andre beamformere (f.eks. delay-and-sum35 eller kantede spektrum56)kan betjenes alternativt for at give feedback i realtid, om end med reduceret rækkeviddeopløsning.

Sammenfattende, denne protokol præsenterer en ikke-invasiv tilgang til at opnå dyb vene trombolyse af humane blodpropper. Protokollen etablerer en bekvem og nem at replikere procedure for modellering af blodpropper, behandle dem med lysotripsi, og samtidig billeddannelse under behandlingen. Protokollen trin angiver histotripsi boble cloud generation, behandling planlægning, og billede vejledning kan yderligere bruges til at undersøge in vitro behandlinger af brystsvulst, bugspytkirtel tumor, og godartet prostatahyperplasi, hvor histotripsi har vist sig at være mere effektiv i forhold til standardprocedurer57,58. Brugen af rt-PA i denne protokol kan generaliseres til andre lægemidler eller lægemiddelbærere, der bruges til behandling af sådanne tumorer, sammen med histotripsi for at øge den lytic effekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Forfatterne vil gerne takke Dr. Kevin Haworth for at hjælpe med Drabkin's assay og Dr. Viktor Bollen for hans støtte i udformningen af protokollen. Forfatterne er også taknemmelige for Dr. Adam Maxwell for hans vejledning om at designe histotripsy kilde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Tags

Bioengineering histotripsi lysotripsi trombolyse hæmolyse dyb venetrombose passiv kavitationsscanning fokuseret ultralyd akustisk kavitation
Et In vitro-system til at måle den trombolytiske effekt af histotripsi og et lytisk lægemiddel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter