Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Een in vitro systeem om de trombolytische werkzaamheid van histotripsie en een lytisch medicijn te meten

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

Histotripsy-aided lytic delivery of lysotripsy is in ontwikkeling voor de behandeling van diepe veneuze trombose. Een in vitro procedure wordt hier gepresenteerd om de werkzaamheid van deze combinatietherapie te beoordelen. Belangrijke protocollen voor het stolselmodel, beeldbegeleiding en beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling worden besproken.

Abstract

Diepe veneuze trombose (DVT) is een wereldwijd gezondheidsprobleem. De primaire benadering om vaatrekanalisatie voor kritieke obstructies te bereiken, is kathetergerichte trombolytica (CDT). Om bijtende bijwerkingen en de lange behandelingstijd geassocieerd met CDT te verminderen, zijn adjuvante en alternatieve benaderingen in ontwikkeling. Een van die benaderingen is histotripsy, een gerichte ultrasone therapie om weefsel te aborteren via bubbelwolknucleatie. Preklinische studies hebben een sterke synergie aangetoond tussen histotripsie en trombolytica voor stolselafbraak. Dit rapport schetst een benchtop-methode om de werkzaamheid van histotripsy-aided trombolytische therapie of lysotripsie te beoordelen.

Stolsels vervaardigd uit vers menselijk veneus bloed werden geïntroduceerd in een stroomkanaal waarvan de afmetingen en acousto-mechanische eigenschappen een iliofemorale ader nabootsen. Het kanaal was doordrenkt met plasma en de lytische recombinante weefseltype plasminogeen activator. Bubbelwolken werden gegenereerd in het stolsel met een gerichte ultrasone bron ontworpen voor de behandeling van femorale veneuze stolsels. Gemotoriseerde positioners werden gebruikt om de bronfocus langs de stolsellengte te vertalen. Op elke insonatielocatie werden akoestische emissies van de bellenwolk passief geregistreerd en straalgevormd om passieve cavitatiebeelden te genereren. Metrieken om de werkzaamheid van de behandeling te meten, omvatten stolselmassaverlies (algehele werkzaamheid van de behandeling) en de concentraties van D-dimeer (fibrinolyse) en hemoglobine (hemolyse) in het perfusaat. Er zijn beperkingen aan dit in vitro ontwerp, waaronder een gebrek aan middelen om in vivo bijwerkingen of dynamische veranderingen in de stroomsnelheid te beoordelen naarmate het stolsel lyseert. Over het algemeen biedt de opstelling een effectieve methode om de werkzaamheid van op histotripsy gebaseerde strategieën voor de behandeling van DVT te beoordelen.

Introduction

Trombose is de toestand van stolselvorming in een verder gezond bloedvat dat de bloedsomloop belemmert1,2. Veneuze trombo-embolie heeft een jaarlijkse gezondheidszorgkost van $ 7-10 miljard, met 375.000-425.000 gevallen in de Verenigde Staten3. Longembolie is de obstructie van de longslagader en is het ernstigste gevolg van veneuze trombo-embolie. De primaire bron van longobstructie is diepe veneuze trombi, voornamelijk van iliofemorale veneuze segmenten4,5,6. Diepe veneuze trombose (DVT) heeft inherente gevolgen naast pulmonale obstructies, met complicaties op lange termijn die resulteren in pijn, zwelling, beenzweren en ledemaat amputaties7,8,9. Voor kritieke obstructies zijn kathetergerichte trombolytica (CDT) de eerstelijnsbenadering voor vatrekanalisatie10. De uitkomst van CDT hangt af van een aantal factoren, waaronder trombusleeftijd, locatie, grootte, samenstelling, etiologie en patiëntrisicocategorie11. Bovendien wordt CDT geassocieerd met vasculaire schade, infecties, bloedingscomplicaties en lange behandelingstijd10. Apparaten van de volgende generatie zijn gericht op het combineren van mechanische trombectomie met trombolytica (d.w.z. farmacomechanische trombectomie)12,13. Het gebruik van deze apparaten verlaagt de lytische dosering, wat leidt tot verminderde bloedingscomplicaties en verkorte de behandelingstijd12,13,14 in vergelijking met CDT. Deze apparaten hebben nog steeds problemen met hemorragische bijwerkingen en onvolledige verwijdering van chronische trombi15. Er is dus een adjuvante strategie nodig die de trombus volledig kan verwijderen met lagere bloedingscomplicaties.

Een mogelijke benadering is histotripsy-aided trombolytische behandeling, aangeduid als lysotripsy. Histotripsy is een niet-invasieve behandelingsmodaliteit die gerichte echografie gebruikt om bubbelwolken in weefsels te nucleeren16. Bubbelactiviteit wordt niet gegenereerd via exogene kernen, maar door de toepassing van ultrasone pulsen met voldoende spanning om kernen te activeren die intrinsiek zijn aan weefsels, waaronder stolsel17,18. De mechanische oscillatie van de bellenwolk geeft spanning aan het stolsel, waardoor de structuur uiteenvalt in acellulair puin19. Histotripsy bubbelactiviteit zorgt voor een effectieve afbraak van ingetrokken en niet-teruggetrokken bloedstolsels, zowel in vivo als in vitro20,21,22. Eerdere studies hebben23,24 aangetoond dat de combinatie van histotripsie en de lytische recombinante weefseltype plasminogeenactivator (rt-PA) de werkzaamheid van de behandeling aanzienlijk verhoogt in vergelijking met lytisch alleen of histotripsie alleen. Er wordt verondersteld dat twee primaire mechanismen geassocieerd met histotripsy bubbelactiviteit verantwoordelijk zijn voor de verbeterde werkzaamheid van de behandeling: 1) verhoogde fibrinolyse als gevolg van verbeterde lytische afgifte en 2) hemolyse van rode bloedcellen in het stolsel. Het grootste deel van de stolselmassa bestaat uit rode bloedcellen24en daarom is het volgen van de afbraak van erytrocyten een goed surrogaat voor ablatie van het monster. Andere gevormde stolselelementen zijn waarschijnlijk ook gedesintegreerd onder histotripsy bubbelactiviteit, maar worden niet in dit protocol overwogen.

Hier wordt een benchtop-benadering geschetst om DVT in vitro met lysotripsie te behandelen. Het protocol beschrijft kritische operationele parameters van de histotripsiebron, beoordeling van de werkzaamheid van de behandeling en beeldbegeleiding. Het protocol omvat het ontwerpen van een stroomkanaal om een iliofemoraal veneus segment na te bootsen en het produceren van menselijke volbloedstolsels. De experimentele procedure schetst de positionering van de histotripsiebron en beeldvormingsarray om histotripsy-blootstelling te bereiken langs het stolsel dat in het stroomkanaal is geplaatst. Relevante insonatieparameters om stolselverstoring te bereiken en off-target bubbelactiviteit te minimaliseren, worden gedefinieerd. Het gebruik van echografie voor begeleiding en beoordeling van bubbelactiviteit wordt geïllustreerd24. Statistieken om de werkzaamheid van de behandeling te kwantificeren, zoals stolselmassaverlies, D-dimeer (fibrinolyse) en hemoglobine (hemolyse) worden geschetst23,24,25,26,27. Over het algemeen biedt de studie een effectief middel voor het uitvoeren en beoordelen van de werkzaamheid van lysotripsy om DVT te behandelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Voor de hier gepresenteerde resultaten werd veneus menselijk bloed getrokken om stolsels te vormen na goedkeuring van de lokale interne beoordelingscommissie (IRB # 19-1300) en schriftelijke geïnformeerde toestemming van vrijwillige donoren24. Deze sectie schetst een ontwerpprotocol om de werkzaamheid van lysotripsie te beoordelen. Het protocol is gebaseerd op een eerder werk van Bollen et al.24.

1. Stolsel modellering

OPMERKING: Bereid de stolsels binnen 2 weken maar meer dan 3 dagen voorafgaand aan de dag van het experiment om de stabiliteit van het stolsel te garanderen en de terugtrekking te maximaliseren28. Bereid het stolsel voor na de goedkeuring van de lokale institutionele beoordelingscommissie.

  1. Bereid borosilicaat Pasteur pipet voor het opslaan van het bloed (zie Tabel met materialen voor specificaties van de pipet). Borosilicaatbuizen worden gebruikt vanwege de hydrofiele aard van het materiaal dat de activering van bloedplaatjes en de terugtrekking van het stolsel bevordert29. Sluit de punt van de pipet af via verhitting boven een Bunsen-brander.
  2. Trek vers menselijk veneus bloed. Aliquot het totale bloed dat wordt afgenomen in stappen van 2 ml per gewenst stolsel. Breng elke 2 ml aliquot over in één Pasteur pipet.
    OPMERKING: Voer stap 1.2 uit binnen ongeveer 3 minuten na de bloedafname, zodat het bloed niet stolt voordat het in pipetten wordt overgebracht. Zorg er ook voor dat de vrijwillige donor geen medicijnen gebruikt die de stollingscascade kunnen veranderen (bijv. bloedverdunners of bloedplaatjesremmers).
  3. Incubeer de bloedgluts in de pipetten (gelijk aan het aantal benodigde stolsels) in een waterbad gedurende 3 uur bij 37 °C.
  4. Bewaar de pipetten minimaal 3 dagen bij 4 °C om het intrekken van stolsels mogelijk te maken28. Naarmate de stolsels zich terugtrekken, zal worden waargenomen dat serum zich ophoopt aan de bovenkant van het stolsel in de pipet. De rt-PA respons van stolsels blijft stabiel gedurende 2 weken na retractie28.

2. Voorbereiding van het waterreservoir

  1. Vul het waterreservoir met omgekeerd osmosewater. Bekleed het bodemoppervlak van de tank met een akoestisch absorberend materiaal om reflectie van de therapie of echografiepulsen te verminderen. Gebruik een waterbehandelingssysteem om het water te ontgassen en te filteren om bubbelkernen te minimaliseren.
    OPMERKING: Een manier om het water te filteren is met behulp van een inline filter. De specificaties van de zak die wordt gebruikt voor het genereren van de representatieve resultaten worden gegeven in de tabel met materialen.
  2. Plaats twee verwarmingselementen op het onderste oppervlak van de tank. Verwarm het water tot 37,3 °C om de maximale lytische enzymatische activiteit te bereiken30.
  3. Stel een stroomkanaal in zoals weergegeven in figuur 1A. Het stroomkanaal bestaat uit buizen, een modelvat met materiaal- en geometrische eigenschappen die representatief zijn voor een iliofemorale ader, een reservoir voor plasma en een spuit aan het distale uiteinde van het reservoir(Tabel met materialen). De spuit is aangesloten op een pomp om een stroom door het kanaal tijdens het experiment te regelen.
  4. Dompel het stroomkanaal handmatig onder in de watertank om het kanaal op fysiologische temperatuur te brengen tijdens de ontgassings-/filter-/verwarmingsfase (stappen 2.1 en 2.2).

3. Bereiding van plasma en rt-PA mengsel

  1. Voorafgaand aan de experimenteerdag
    OPMERKING: Bij opslag bij -80 °C is plasma ten minste 2,5 jaar31 stabiel en rt-PA is ten minste 7 jaarstabiel 32. Voer daarom stap 3.1 op elk gewenst moment binnen deze perioden uit om de stabiliteit van de twee componenten te garanderen.
    1. Verdun de rt-PA verkregen van een fabrikant in poedervorm tot 1 mg/ml in steriel water.
    2. Aliquot 100 μL verdunde rt-PA in centrifugebuizen van 0,5 ml en bewaar ze bij -80 °C.
    3. Aliquot 35 ml menselijk vers ingevroren type O plasma in centrifugebuizen van 50 ml. Bewaar de buizen bij -80 °C.
  2. Op de experimentele dag
    1. Haal plasma aliquots uit de vriezer. Haal evenveel aliquots op als het aantal stolsels dat die dag moet worden getest. Dompel de bevroren aliquots onder in een waterbad bij 37 °C om te ontdooien (~10 min).
    2. Zodra het plasma is ontdooid, giet het in een bekerglas dat drieduel wordt gespoeld met ultrapijn water. Bedek de mond van het bekerglas lichtjes met aluminiumfolie om besmetting te voorkomen en plaats het bekerglas in het waterbad. Laat de folie los genoeg zitten om lucht in contact te laten met het plasma.
    3. Laat het plasma bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur in evenwicht brengen met de atmosferische druk.
    4. Haal de bevroren rt-PA injectieflacons eruit en plaats op ijs totdat het nodig is, met één injectieflacon voor elke experimentrun.
    5. Maak lage geleer agarose (2%) in een kolf van 50 ml, door agarose op te lossen in ultrapijn water. Kies de totale hoeveelheid agarose-oplossing zodanig dat ongeveer 2 ml beschikbaar is voor elk te analyseren monster. Verwarm de oplossing in de kolf in een magnetron tot het bubbels is. Zet de kolf vast met een waterdicht schroefdeksel erop. Dompel de kolf onder in het waterbad naast het plasma.
      OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat agarose beschikbaar is om blootgestelde stolselsegmenten veilig te stellen voor histologische analyse na histotripsie-insonatie.

4. Histotripsy source en imaging array instellen

  1. Zorg ervoor dat de gemotoriseerde positioners kunnen worden bestuurd vanuit de runtime-omgeving van een programmeerplatform, met behulp van aanwijzingen en opdrachten van de fabrikant. Controleer of de motoren van het systeem zijn aangesloten op de juiste poort van de computer met de runtime-omgeving.
  2. Monteer de histotripsybron op het gemotoriseerde positioneringssysteem zoals weergegeven in figuur 1B.
  3. Sluit de histotripsy-bron aan op de aandrijfelektronica (bijv. eindversterker en functiegenerator) via de juiste connectoren (bijv. BNC-kabels) zoals gespecificeerd door de fabrikant.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de aandrijfelektronica van de histotripsybron kan worden bediend via de runtime-omgeving die in stap 4.1 wordt gebruikt.
  4. Bedek de beeldarray met een sondedeksel en bevestig de array coaxiaal in het diafragma van de histotripsiebron zoals weergegeven in figuur 2. Zorg ervoor dat u de oriëntatie van het beeldvlak begrijpt ten opzichte van de oriëntatie van de histotripsybron.
  5. Sluit de beeldarray aan op een echografiescansysteem. Zorg ervoor dat dit systeem de werking en activering van de beeldarray kan regelen en beeldgegevens kan verzamelen volgens de opdrachten van de fabrikant van de scanner.
  6. Dompel de histotripsy bron/imaging array onder in de tank tijdens het ontgassen zoals weergegeven in figuur 1A. Verwijder voorzichtig alle luchtbellen met behulp van een spuit van het oppervlak van de histotripsy bron of imaging array.
    OPMERKING: Dompel de histotripsiebron en beeldvormingsarray volledig onder in water voordat u wordt gebruikt. Vermijd het aanraken van het oppervlak van de histotripsy bron.
  7. Verkrijg B-modus beelden met een snelheid van 20 frames per seconde met behulp van de imaging array en de ingebouwde commando's van de scanner. Pas het beeldvenster aan om de focus van de histotripsy-bron in deze realtime beelden te visualiseren.
    OPMERKING: Er wordt aangenomen dat de dimensies van het focale gebied van de therapeutische bron bekend zijn.
  8. Stel de bedrijfsparameters van de histotripsiebron in, inclusief de fundamentele frequentie (bijvoorbeeld 1,5 MHz), de pulsherhalingsfrequentie (bijvoorbeeld 20-100 Hz), de pulsduur (bijvoorbeeld 1-20 cycli per puls) en het totale aantal pulsen per locatie (bijvoorbeeld 100-2.000)18,23,24,33. Wijzig deze parameters als er niet voldoende stolsellysis wordt bereikt of als de belactiviteit verder reikt dan het lumen van het modelvat. Als u deze parameters wilt instellen, gebruikt u het protocol van de fabrikant van de bron of gebruikt u een programmeerplatform dat met de bron kan communiceren (stap 4.3).
  9. Gebruik het protocol of het programmeerplatform van de fabrikant dat in stap 4.8 wordt gebruikt, voer de histotripsybron uit op de ingestelde parameters alleen in ontgast water, zonder enige belemmering in de omgeving. Verhoog de spanning die op de histotripsybron wordt toegepast totdat een bellenwolk is gevormd.
  10. Pas met behulp van de real-time beeldvorming van stap 4.7 de positie van de beeldarray in de opening van de confocale transducer aan totdat de bellenwolk zich ongeveer in het midden van het afbeeldingsvenster bevindt. De bellenwolk is het gebied van hyperechoïsche pixels in het beeldvlak (Figuur 3). Draai de schroeven aan om de beeldarray stevig in de opening van de transducer te houden.
    OPMERKING: Als de array goed is uitgelijnd, moet de azimutale positie van de bellenwolk ongeveer op 0 mm in het beeldvlak liggen. De beeldvormende array kan enigszins projecteren vanaf het binnenoppervlak van de therapiebron, en daarom kan de bereikpositie van de bellenwolk verschillen van de brandpuntsafstand van de bron.
  11. Identificeer de locatie van de bellenwolk in het beeldvlak. Wijs de focus van de histotripsybron toe als het midden van de bellenwolk (Figuur 3).
  12. Noteer de gedetecteerde focale locatie (stap 4.11) in het beeldvormingsvenster(Figuur 3). Een mogelijke manier om de focuspositie te markeren, is het plaatsen van een cursor om de locatie in het beeldvenster te noteren, indien beschikbaar met het beeldvormingsplatform.
  13. Stop met insonatie en stel de spanning die wordt toegepast op de histotripsybron in op 0 V.

5. Stolselpreparaat

  1. Verwijder het stolsel uit de pipet door het verzegelde uiteinde met een tang door te snijden. Laat het stolsel samen met het serum in een petrischaaltje glijden. Als het stolsel niet losraakt, oefen dan voorzichtig druk uit vanaf het andere uiteinde van de pipet via zoutoplossingspoeling om het stolsel te verwijderen.
  2. Snijd het stolsel tot 1 cm lengte met behulp van een scalpel, gericht op een uniform stuk vanuit het midden (d.w.z. weg van delen van het stolsel gevormd aan de boven- of onderkant van de pipet).
  3. Gebruik een reinigingsdoekje om het gesneden deel van het stolsel voorzichtig te deppen om overtollig vocht te verwijderen.
  4. Plaats met een pincet het stolselgedeelte voorzichtig op een weegschaal en noteer het gewicht.
  5. Til het stroomkanaal handmatig uit de watertank en verwijder het modelvat uit het stroomkanaal.
  6. Plaats het stolsel met een pincet in het modelvat en bevestig het modelvat opnieuw aan het stroomkanaal.
    OPMERKING: Een nylon staaf kan in het modelvat worden geplaatst om te voorkomen dat het stolsel stroomafwaarts beweegt als gevolg van de stroom.
  7. Laat het stroomkanaal in de tank zodanig zakken dat het proximale uiteinde van het stadium ten opzichte van het reservoir laag is in vergelijking met de distale kant. Het op deze manier hengelen van het podium voorkomt het vangen van bellen in het modelvat wanneer plasma door het stroomkanaal wordt getrokken in stap 6.1.
  8. Voeg met een pipet 30 ml plasma toe aan het reservoir en controleer de temperatuur totdat deze ten minste 36 °C bereikt.
  9. Gebruik een pipet om de rt-PA (80,4 μg in 30 ml plasma, 2,68 μg/ml) in het plasmareservoir te spuiten. Roer het plasma met de pipet om een uniforme rt-PA-verdeling in het reservoir te garanderen.

6. Het stroomkanaal prikken

  1. Trek plasma via de spuitpomp in het stroomkanaal van het reservoir totdat het plasma het modelvat vult.
    OPMERKING: Als het stolsel niet gelijk is met de nylon staaf, gebruik dan korte pomptrekkingen bij 60 ml / min om te proberen het plasma stroomafwaarts van het stolsel te dwingen of handmatig door de spuit te trekken. Beperk de hoeveelheid plasma die in dit proces wordt getrokken of vul het reservoir bij met extra plasma/rt-PA om ervoor te zorgen dat 30 ml oplossing in het stroomkanaal zit.
  2. Lijn met behulp van de gemotoriseerde positioners de beeldarray parallel aan de lengte van het stolsel uit met behulp van het beeldvormingsscript (stap 4.7). De parallelle uitlijning stelt de gebruiker in staat om visueel te zorgen voor een juiste plaatsing van het stolsel en de afwezigheid van bubbels in het modelvat.
  3. Egaliseert het modelvat handmatig en visueel zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn met behulp van het beeldvormingsvenster (stap 4.7).

7. Experimenteerprocedure

  1. Voorbehandeling
    OPMERKING: Deze stap is om een pad te plannen voor de histotripsy bron / beeldvorming array voor uniforme histotripsy blootstelling langs stolsel lengte.
    1. Lijn de beeldarray uit met behulp van de gemotoriseerde positioners, zodat het beeldvlak evenwijdig is aan de doorsnede van het stolsel (d.w.z. loodrecht op de oriëntatie beschreven in stap 6.2).
    2. Verplaats onder begeleiding via het beeldvormingsvenster (stap 4.7) de histotripsiebron naar het proximale uiteinde van het stolsel ten opzichte van het reservoir met behulp van de gemotoriseerde positioners. Pas op dit punt de histotripsiebronpositie zodanig aan dat het gemarkeerde brandpunt in stap 4.12 wordt uitgelijnd met het midden van het stolsel.
    3. Bepaal het insonatiepad langs de stolsellengte. Om dit pad te definiëren, stelt u drie waypoints in langs de lengte van het stolsel (d.w.z. posities van de motoren waar histotripsy bubbelactiviteit zich in het stolsel bevindt) in stappen van 5 mm. Lijn de waypoints zo uit dat de totale beweging van de histotripsybron langs het pad antegrade is met de stroming in het systeem (d.w.z. het eerste waypoint bevindt zich aan het meest proximale uiteinde van het stolsel ten opzichte van het reservoir en het derde waypoint bevindt zich in de distale positie ten opzichte van het reservoir).
    4. Voordat elk waypoint wordt voltooid, vuurtestpulsen van de histotripsybron met dezelfde insonatieparameters als stap 4.8, maar verminder de totale blootstelling tot 10 totale pulsen. Pas indien nodig de positie van de histotripsybron aan met behulp van de gemotoriseerde positioners om bubbelactiviteit in het stolsel te bevatten.
    5. Sla op elk waypoint de motorposities op met behulp van de commando's van de fabrikant, vergelijkbaar met stap 4.1.
  2. Behandeling
    OPMERKING: Deze stap definieert de procedure om het stolsel over de lengte te behandelen volgens het pad dat is gedefinieerd in de voorbehandelingsstap.
    1. Zet de spuitpomp op 0,65 ml/min en wacht tot de meniscus van het plasma beweegt. Dit debiet bootst een bijna totale occlusie van de iliofemorale vasculatuur24,34na.
    2. Interpoleer het pad dat in stap 7.1.3 is gemaakt met tussenstappen tussen de vastgestelde waypoints met een vaste stapgrootte (bijvoorbeeld 0,5 mm). De stapgrootte wordt gekozen om kleiner te zijn dan de helft van de breedte van het brandpuntsgebied zoals gemeten langs de stolsellengte (hoogterichting van de beeldreeks). Verplaats de histotripsybron met gemotoriseerde positioners op elke padlocatie met insonatieparameters die zijn gedefinieerd in stap 4.8.
    3. Monitor/beeldbelactiviteit tijdens het aanbrengen van de histotripsiepuls op elke padlocatie met behulp van het beeldvormingsvenster (stap 4.7). Centreer de afbeelding op de histotripsy focus met de afbeeldingsafmetingen van 15 mm in het azimut en bereik. Voorafgaand aan de toepassing van histotripsy-puls op elke locatie, verwerft u een B-modusbeeld om visualisatie van het stolsel en het modelvat te bieden, door een script in een programmeerplatform te maken. Zorg ervoor dat het script communicatie met de scanner tot stand brengt met behulp van de opdrachten van de fabrikant.
    4. Implementeer tijdens de toepassing van de histotripsiepuls de verwerving van akoestische emissies in het script in stap 7.2.3 om passieve cavitatiebeelden te vormen na hoc35. Verkrijg één passief cavitatiebeeld na elke 10 behandelingspulsen. Pas een vlakke tijdwinstcompensatie van 50 toe op 8 incrementele diepten tot het einde van de beelddiepte. Kies een geschikte grootte van het acquisitievenster, zodat het volledige signaal van het stolsel wordt opgevangen met minimaal energieverlies als gevolg van vensters35.
    5. Als er off-target bellenwolken aanwezig zijn, past u de positie van de transducer ter plaatse aan met de gemotoriseerde positioners.
      OPMERKING: Controleer op gemiste triggers van de imaging array. Pas het aantal verkregen beeldgegevenssets aan om ervoor te zorgen dat de opslag van gegevens is voltooid voordat deze vervolgens wordt geactiveerd.

8. Procedure na het experiment

  1. Til het modelvat handmatig uit de watertank om het perfusaat via de zwaartekracht af te tappen. Zorg ervoor dat het stroomkanaal waterpas blijft om te voorkomen dat het stolsel stroomafwaarts en uit het modelvat beweegt tijdens het aftappen.
  2. Verzamel het volledige perfusaat voor verdere analyse in een klein bekerglas (figuur 4A) door plasma-oplossing uit het stroomkanaal door de spuitpomp te trekken met een zeer laag debiet.
  3. Koppel het modelvat los en verwijder het stolsel. Injecteer indien nodig een kleine hoeveelheid zoutoplossing in het modelvat om het stolsel voorzichtig los te maken.
  4. Veeg het stolsel af zoals in stap 1.2.3. Weeg het stolsel op de weegschaal om het verlies van de stolselmassa te beoordelen.
  5. Om het D-dimeergehalte te analyseren, voegt u 100 mg aminocaproïnezuur toe aan een microcentrifugebuis gevolgd door 1 ml perfusaat en mengt u goed met een pipet. Voer een latex immuun-troebele test uit om het D-dimeer in het monster te kwantificeren36.
  6. Om hemolyse te beoordelen, voegt u 1 ml perfusaat toe aan centrifugebuizen en draait u gedurende 10 minuten bij 610 x g (3.500 tpm). Combineer 0,5 ml supernatant (concentraat) met 0,5 ml Drabkins-oplossing en laat het mengsel gedurende 15 minuten op kamertemperatuur rusten. Breng 200 μL over op putplaten, zoals weergegeven in figuur 4B. Gebruik een plaatlezer om absorptie bij 540 nm af te lezen, figuur 4C (Drabkins-test37).
  7. Histologie beoordeling
    1. Snijd een gedeelte uit het midden van het stolsel van ongeveer 2-3 mm lang met een scalpel.
    2. Voeg de sectie toe aan een cassette. Behoud de oriëntatie van de sectie ten opzichte van de richting van de histotripsy pulsvoortplanting.
    3. Voeg 2 ml lage geleer agarose-oplossing bereid in stap 3.2.5 toe aan de cassette om het stolsel op zijn plaats te fixeren.
    4. Bevestig het monster gedurende 24 uur in 10% formaline. Plaats het monster na 24 uur in 70% alcohol en voer standaard hemotoxyline-eosinekleuring uit38.

9. Passieve cavitatiebeeldanalyse

  1. Verwerk de signalen die tijdens de histotripsie-excitatie (stap 7.2.4) van de beeldarray zijn verkregen met behulp van een algoritme op basis van de robuuste Capon beamformer39 om een beeld te creëren van akoestische emissies gegenereerd door de bellenwolk op elke behandelingslocatie.
    OPMERKING: Om kwantitatieve afbeeldingen te genereren, volgt u de stappen die worden beschreven in Haworth et al.35. Anders moet elke pixelwaarde in de afbeelding de relatieve akoestische energie van de bellenwolk (eenheden van V2) op elke overeenkomstige locatie vertegenwoordigen.
  2. Segmenteer de B-modusafbeelding die in stap 7.2.3 is vereist om onderscheid te maken tussen de pixels die het stolsel vertegenwoordigen en het modelvat.
  3. Registreer het passieve cavitatiebeeld samen met het B-modusbeeld zoals weergegeven in figuur 5B. Som de akoestische energie in het stolsel op gedurende de blootstellingsperiode35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol dat in deze studie wordt geschetst, benadrukt de details van veneuze stolselmodellering, lysotripsie voor stolselverstoring en echografie in een in vitro opstelling van DVT. De goedgekeurde procedure toont de stappen die nodig zijn om stolselverstoring te beoordelen als gevolg van de gecombineerde effecten van rt-PA en histotripsy bubble cloud-activiteit. De benchtopopstelling is ontworpen om de kenmerken van een veneuze iliofemorale ader na te bootsen. Figuur 1A toont een modelvat dat de akoestische, mechanische en geometrische eigenschappen van de iliofemorale ader heeft. Het stolsel wordt in het modelvat geplaatst om een gedeeltelijk occlusieve trombus na te bootsen. Het stolsel wordt doordrenkt met plasma en rt-PA uit een reservoir met een snelheid van 0,65 ml / min. Deze snelheid komt overeen met een langzaam debiet in een sterk afgesloten vat34.

Een elliptisch gerichte transducer van 1,5 MHz fundamentele frequentie met een 9 cm grote as, 7 cm kleine as en 6 cm brandpuntsafstand (figuur 2A) is gemonteerd op het positioneringssysteem zoals aangegeven in figuur 1B. Een beeldvormende array bedekt met ultrasone gel en een latex deksel (figuren 2B, C) wordt coaxially gemonteerd met de transducer zoals weergegeven in figuur 1A via een opening in het midden van de histotripsiebron. De gemotoriseerde positioners werden gebruikt om de therapietransducer / beeldvormingsarray langs de stolsellengte in het modelvat te vertalen(figuur 1). Bij toepassing van voldoende spanning op de histotripsiebron wordt een bellenwolk gegenereerd in het brandpuntsgebied van de transducer en gevisualiseerd via echografie, zoals weergegeven in figuur 3. De brandpuntspositie wordt gedefinieerd als het centrum van de bellenwolk met behulp van het beeldvlak (stappen 4.10-4.11).

Figuur 4A toont perfusaten verzameld voor twee verschillende behandelingscondities. Het bekerglas gelabeld als controle bevat perfusaat van een stolsel dat alleen aan plasma wordt blootgesteld. Het tweede bekerglas dat als behandeld is gelabeld, bevat het perfusaat van het met lysotripsie behandelde stolsel. De verzamelde perfusaten worden gebruikt om het hemoglobinegehalte (metriek van hemolyse) en D-dimeer (metriek van fibrinolyse) te beoordelen door middel van assays zoals gespecificeerd in het protocol. Het verschil in kleur van de perfusaten duidt op variabiliteit in hemoglobineconcentratie, die kan worden gekwantificeerd via optische absorptie. De relatie tussen absorptiewaarde en hemoglobineconcentratie kan worden bepaald door middel van een kalibratiecurve. Oplossingen met een bekend hemoglobinegehalte variërend van 0 (blanco meting) tot 180 mg / ml worden in de putplaat geplaatst en de absorptie wordt in drievoud bepaald met behulp van de plaatlezer(figuur 4B,C). De bovenste absorptiegrens van de plaatlezer kan variëren en is mogelijk niet bekend a priori bij het maken van de oplossingen in de putplaat. Als zodanig worden hemoglobineconcentraties tot 180 mg / ml gemaakt in de putplaat, figuur 4B. De hier gebruikte plaatlezer kan echter alleen de absorptie lezen voor concentraties tot 23 mg / ml, figuur 4C.

Figuur 5A toont visualisatie van het stolsel in het modelvat via B-modus beeldvorming voorafgaand aan histotripsieblootstelling zoals gespecificeerd in stap 7.2.3. Dit beeld wordt verkregen om de stolselpositie te bepalen voor segmentatie van het passieve cavitatiebeeld. Figuur 5B toont het passieve cavitatiebeeld dat gelijktijdig is geregistreerd met het B-modusbeeld dat vóór de histotripsiebelichting is verkregen. Dit cijfer bevestigt dat akoestische energie zich voornamelijk in het stolsel bevindt tijdens blootstelling aan histotripsie.

Typische verstoring van het stolsel als gevolg van histotripsie en lytiek zijn aangegeven in figuur 6. Figuur 6A(B) toont respectievelijk de onbehandelde en lysotripsy behandelde stolselbeelden. Voor monsters die worden blootgesteld aan histotripsie, is verstoring voornamelijk beperkt tot het stolselcentrum, in overeenstemming met de waargenomen locaties van bubbelactiviteit die worden gevolgd met passieve cavitatiebeeldvorming(figuur 5B). Met toevoeging van lytisch treedt massaverlies echter ook op in regio's dichter bij de periferie van het stolsel. Er wordt verondersteld dat dit extra massaverlies te wijten is aan verbeterde vloeistofmenging van de lytische onderbelactiviteit. Vloeistof mengen verhoogt de verdeling en penetratiediepte van de lytic in het stolsel. Omdat de lytiek verantwoordelijk is voor fibrinolyse40, neemt het massaverlies toe. Fibrinolyse kan worden gekwantificeerd door het D-dimeergehalte in het perfusaat41te meten.

Figure 1
Figuur 1: Experimentele opstelling voor lysotripsie van menselijk bloedstolsel. (A) De componenten van de opstelling zijn (1) gerichte histotripsiebron met elliptische geometrie, (2) met latex bedekte beeldvormingsarray, (3) modelvat bevestigd aan stroomkanaal, (4) stroomkanaal, (5) reservoir, (6) akoestisch absorberend materiaal, (7) verwarmingselement en (8) watertank gevuld met ontgast en verwarmd omgekeerd osmosewater. De azimutdimensie van het beeldvlak staat loodrecht op de hoogte- en bereikdimensie (in de pagina). (B) De histotripsy bron gemonteerd op het gemotoriseerde positioneringssysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Ultrasone bron en beeldvormingscomponenten. Individuele ingezoomde beelden van (A) gefocuste histotripsy bron, (B) imaging array, en (C) imaging array met ultrasone gel en latex cover. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Histotripsy bubble cloud gevisualiseerd met behulp van imaging array. Een bellenwolk wordt gegenereerd in de focuszone van de histotripsy-bron en afgebeeld met behulp van een imaging array. De aangewezen focus, weergegeven als een kruis, wordt bewaard voor de planning van de behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Kwantificering van hemoglobine dat vrijkomt als gevolg van stolsellysis. (A) Perfusaatmonsters verzameld na controlestudie met plasma alleen (geen histotripsie of lytisch), en behandelingsarm, histotripsie (bijv. 35 MPa piek negatieve druk, 5 cycluspulsduur, 1,5 MHz fundamentele frequentie) en 2,68 μg / ml lytische blootstelling. (B)Putplaat met verdunningen van bekende hemoglobineconcentraties variërend van 180 mg / ml (bovenste rij, meest linkse hoek) tot 0 mg / ml (onderste rij, meest rechtse hoek). De pijlpunt wijst in de richting van een afnemende hemoglobineconcentratie. (C) Deze monsters worden gebruikt om een standaardcurve te creëren om hemoglobine geproduceerd als gevolg van histotripsieblootstelling via spectrofotometrie te kwantificeren. Absorptiecurve voor hemoglobineconcentraties variërend van 0 tot 23 mg / ml wordt verkregen als gevolg van beperking van de plaatlezer bij het analyseren van hogere concentraties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Beelden van het stolsel tijdens de behandeling. (A) B-modus beeld verkregen vóór het begin van de behandelingspuls met de stolselpositie in het modelvat. (B) Post-hoc visualisatie vanakoestische energie-emissie berekend op basis van passieve cavitatiebeeldvorming getoond in hot colormap co-geregistreerd met B-mode beeld van het stolsel verkregen voorafgaand aan toepassing van de histotripsiepuls. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Histologie van het geableerde stolsel onder verschillende behandelingsomstandigheden. (A) Controlestolsel zonder behandeling. (B)Stolsel behandeld met lysotripsie (bijv. 35 MPa piek negatieve druk, single cycle pulse duur, 1,5 MHz fundamentele frequentie). De histotripsy puls verspreidt zich van boven naar beneden in deze afbeelding. Het pad voor de histotripsybron langs de lengte van het stolsel (d.w.z. loodrecht op het vlak van de hier afgebeelde afbeelding) wordt gedefinieerd in stap 7.2.3. De schaal van de micrografieën is 2 mm. Merk op dat de mate van stolselverstoring die hier wordt bereikt, zou worden verminderd in vergelijking met insonatieschema's met een langere pulsduur24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het voorgestelde protocol presenteert een model om de werkzaamheid van lysotripsy bij de behandeling te kwantificeren. Hoewel de belangrijkste details zijn besproken, zijn er bepaalde kritieke aspecten waarmee rekening moet worden gehouden voor het succes van dit protocol. De enzymatische activiteit van rt-PA heeft een Arrhenius temperatuurafhankelijkheid30. Temperatuur is ook een factor die bijdraagt aan de snelheid van geluid in water en weefsel, en variaties in temperatuur kunnen kleine veranderingen in de geometrie van de focale zone veroorzaken. De watertemperatuur moet dus zorgvuldig worden geregeld op 37 °C. De dosis rt-PA die in het protocol wordt gebruikt (2,68 μg/ml) is consistent met de dosis die klinisch wordt gebruikt voor andere farmacomechanische trombectomiestrategieën42. In stap 5.8 wordt 30 ml plasma overgebracht naar het reservoir, terwijl in stap 3.1.3 een aliquot van 35 ml wordt genoteerd. Dit extra plasma is verantwoordelijk voor plasmaverlies als gevolg van verdamping in de loop van uren bij opwarming tot 37 °C voor evenwicht met atmosferische druk.

De brandpuntsafstand, diafragmabreedte en frequentie van de therapietransducer bepalen de grootte en diepte van het brandpuntsgebied. Daarom moet de transducer zodanig worden gekozen dat deze kenmerken overeenkomen met de diameter en de diepte van het doelvat (bijv. dijbeenader: 2-4 cm diep en 0,6-1,2 cm in diameter)43. De mate van mechanische ablatie is beperkt tot de mate van de bellenwolk. Een goed begrip van de rol die insonatieparameters spelen bij het wijzigen van histotripsy bubble cloud-gedrag is dus van cruciaal belang33,44,45. De frequentie en de sterkte van het akoestische veld moeten ook worden gekozen, rekening houdend met de omvang van de demping als gevolg van medium en intermediaire materialen (bijv. Modelvat). Om ervoor te zorgen dat de bubbelactiviteit met het doelvat wordt beperkt, moet een geschikt beeldvenster worden gekozen om de focuszone te bewaken. De bedrijfsparameters van de transducer moeten worden gekozen om off-target effecten te voorkomen en tegelijkertijd mechanische stolselverstoring te maximaliseren. In dit protocol werd massaverlies beschouwd als een primaire maatstaf voor de werkzaamheid van de behandeling. Toename van massaverlies is waargenomen als de piek negatieve druk of de duur van de histotripsiepuls wordt verhoogd24,46, met een maximaal waargenomen massaverlies van 94%. De aanwezigheid van reststolsel voor onderzochte behandelingsarmen vergemakkelijkt de vergelijking van de therapeutische werkzaamheid. Er kunnen echter ook insonatieschema's worden bedacht om ervoor te zorgen dat de trombus volledig wordt verwijderd.

De akoestische impedantie (ongeveer 1,58 MRayl47,48) en de geometrische eigenschappen (0,6-1,2 cm in diameter43) van het modelvat moeten representatief zijn voor de iliofemorale veneuze vasculatuur (zie tabel met materialen voor details). Polydimethylsiloxaan en polyurethaan zijn enkele van de andere materialen die geschikt zijn om het veneuze systeem te modelleren op basis van hun acousto-mechanische eigenschappen. In stap 7 is het belangrijk om alle luchtbellen uit het modelvat te verwijderen om te voorkomen dat het stolsel wordt afgeschermd van blootstelling aan histotripsie. Voor een modelvat van hydrofoob materiaal kunnen zich bij voorkeur bellenwolken vormen in de buurt van de vaatwand in plaats van het midden van het stolsel. Daarom moet de bellenwolk tijdens de behandeling continu worden gecontroleerd via echografie en moet de transducer indien nodig worden verplaatst. Er moeten pilotstudies worden uitgevoerd om histotripsy-insonatieparameters te bepalen (bijv. pulsduur en piekdruk) die de uiteindelijke beoogde stolselverstoring bereiken.

De imaging array wordt gebruikt om B-modus beelden en passieve cavitatie beelden vast te leggen voor behandelingsvisualisatie en om bubbelactiviteit te kwantificeren. B-modus beeldvorming maakt visualisatie van het modelvat en het stolsel mogelijk, en passieve cavitatiebeeldvorming meet de energie van de belactiviteit geassocieerd met stolselablatie24,49. De bandbreedte van de beeldarray moet worden afgestemd op de gewenste bubbelwolkactiviteit met een hoge signaal-ruisverhouding. Voor het verkrijgen van zuiver breedbandsignalen die verband houden met de traagheidsinstorting van bellen in de cloud, mag de bandbreedte van de array niet samenvallen met de fundamentele frequentie van de transducer50,51. Histotripsiepulsen zijn zeer niet-lineair52, en het is waarschijnlijk dat harmonischen van de fundamentele frequentie aanwezig zullen zijn in het ontvangen signaal. Het beeldvormingssysteem moet worden geprogrammeerd om te activeren op basis van het bekende vluchttijds tijdstip van de histotripsiepuls van de bron naar de focale zone om ervoor te zorgen dat volledige passieve cavitatiebeeldgegevens gedurende de hele insonatie worden verzameld. Deze signalen moeten vervolgens post hoc worden verwerkt zoals besproken in stap 7.2.3 en 9 van het protocol.

Opgemerkt moet worden dat de hoeveelheid hemolyse gevoelig is voor de behandeling van het stolsel. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat schade aan het stolsel vóór de behandeling wordt geminimaliseerd. Om de reproduceerbaarheid te garanderen, moeten de stolselmodellering (stap 1) en de prebehandelingstijd (stappen 6 en 7.1) hetzelfde zijn voor alle stolsels die met of zonder histotripsieblootstelling worden behandeld. In de post-behandeling stap van hemolyse beoordeling, moet worden opgemerkt dat plasma zijn eigen absorptie heeft. Daarom moet het verdunningswaterstof dat wordt gebruikt om standaardcurven te vormen (bijv. Optische absorptie versus hemoglobine) worden gevormd met behulp van dezelfde vloeistof die wordt gebruikt als het perfusaat in het stroomkanaal (in deze studie werd plasma bijvoorbeeld gebruikt als het verdunningsgeent om standaardcurven te vormen).

Dit protocol is bedoeld om een benchtop-opstelling te bieden om de werkzaamheid van lysotripsy te meten om menselijke volbloedstolsels te behandelen. Er zijn bepaalde beperkingen die ontstaan door het in vitro karakter van de opstelling. De acute stolsels die voor dit protocol werden gebruikt, bestonden voornamelijk uit rode bloedcellen en fibrine, waardoor de aanpak van lysotripsie effectief was voor DVT. Latere stadia van trombus kunnen echter een stijf collageennetwerk53 ontwikkelen dat de lysotripsiebehandeling kan weerstaan vanwege de fibrine-specifieke aard van rt-PA. Bij behandeling in vivo is het primaire klinische eindpunt voor de werkzaamheid van de behandeling herstel van de stroom. Massaverlies was een primaire maatstaf voor de werkzaamheid van de behandeling in het hier beschreven in vitro protocol. Hoewel de stroming niet in dit protocol werd beoordeeld, kan kleuren-Doppler-beeldvorming bovendien worden opgenomen, samen met passieve cavitatiebeeldvorming in stap 7.2.4 om het herstel van de stroom te controleren. De opstelling in dit protocol maakt gebruik van een vast debiet, waarbij het debiet in een sterk afgesloten vat wordt nagebootst, gedurende de gehele behandeling in stap 7.2. In vivo zal de vasculaire stroom toenemen naarmate het stolsel tijdens de behandeling uiteenvalt. De extra schuifspanningen geassocieerd met een verhoogde stroming zullen het stolselafbraakprofiel accentueren54. In vivo off-target effecten kunnen in deze opstelling niet worden vastgesteld, zoals bloedingen als gevolg van systemische toediening van lytic55,vaatwandbeschadiging of vasospasme als gevolg van bubbelwolkactiviteit22. Het in vitro karakter van deze studie beperkt ook het vermogen om langetermijnresultaten te beoordelen, zoals vaatgankelijkheid of retrombose na de behandeling. De toediening van lytica in deze studie bootste systemische trombolytica na, terwijl kathetergerichte lytica de voorkeursinterventie is voor veneuze trombose7,14. Weefselverzwakking kan het histotripsieveld en de beeldkwaliteit voor in vivo studies beïnvloeden, terwijl hier het akoestische pad voornamelijk door ontgast water loopt. Verwerking van cavitatie-emissiegegevens met de robuuste Capon beamformer (stap 9 van het protocol) is computationeel duur en werd off-line uitgevoerd voor post-hoc analyse. Andere beamformers (bijv. delay-and-sum35 of angular spectrum56) kunnen alternatief worden gebruikt om real-time feedback te geven, zij het met een lagere bereikresolutie.

Samenvattend presenteert dit protocol een niet-invasieve aanpak om diepe veneuze trombolyse van menselijke bloedstolsels te bereiken. Het protocol stelt een handige en gemakkelijk te repliceren procedure vast voor het modelleren van bloedstolsels, het behandelen ervan met lysotripsie en gelijktijdige beeldvorming tijdens de behandeling. De protocolstappen die histotripsy bubble cloud-generatie, behandelingsplanning en beeldbegeleiding specificeren, kunnen verder worden gebruikt om in vitro behandelingen van borsttumor, pancreastumor en goedaardige prostaathyperplasie te onderzoeken, waarbij histotripsie effectiever is gebleken in vergelijking met standaardprocedures57,58. Het gebruik van rt-PA in dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar andere geneesmiddelen of medicijndragers die worden gebruikt voor de behandeling van dergelijke tumoren, samen met histotripsie om de lytische werkzaamheid te verhogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health, Grant R01HL13334. De auteurs willen Dr. Kevin Haworth bedanken voor het assisteren bij drabkin's test en Dr. Viktor Bollen voor zijn steun bij het ontwerpen van het protocol. De auteurs zijn ook Dr. Adam Maxwell dankbaar voor zijn begeleiding bij het ontwerpen van de histotripsy bron.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Tags

Bio-engineering histotripsy lysotripsy trombolyse hemolyse diepe veneuze trombose passieve cavitatie beeldvorming gerichte echografie akoestische cavitatie
Een in vitro systeem om de trombolytische werkzaamheid van histotripsie en een lytisch medicijn te meten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter