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Bioengineering

Ein In-vitro-System zur Messung der thrombolytischen Wirksamkeit von Histotripsie und einem lytischen Medikament

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

Zur Behandlung einer tiefen Venenthrombose befindet sich eine histotripsiegestützte lytische Abgabe oder Lysotripsie in der Entwicklung. Hier wird ein In-vitro-Verfahren vorgestellt, um die Wirksamkeit dieser Kombinationstherapie zu beurteilen. Schlüsselprotokolle für das Gerinnselmodell, die Bildführung und die Bewertung der Behandlungswirksamkeit werden diskutiert.

Abstract

Tiefe Venenthrombose (DVT) ist ein globales Gesundheitsproblem. Der primäre Ansatz zur Gefäßrekanalisation bei kritischen Obstruktionen sind kathetergerichtete Thrombolytika (CDT). Um ätzende Nebenwirkungen und die lange Behandlungszeit im Zusammenhang mit CDT zu mildern, werden adjuvante und alternative Ansätze entwickelt. Ein solcher Ansatz ist die Histotripsie, eine fokussierte Ultraschalltherapie zur Ablate von Gewebe durch Blasenwolkenkeimbildung. Präklinische Studien haben eine starke Synergie zwischen Histotripsie und Thrombolytika für den Gerinnselabbau gezeigt. Dieser Bericht beschreibt eine Benchtop-Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit der histotripsiegestützten thrombolytischen Therapie oder Lysotripsie.

Gerinnsel, die aus frischem menschlichem Venenblut hergestellt wurden, wurden in einen Strömungskanal eingeführt, dessen Abmessungen und akustomechanische Eigenschaften eine iliofemorale Vene nachahmen. Der Kanal wurde mit Plasma und dem lytischen rekombinanten Gewebetyp Plasminogenaktivator durchblutet. Blasenwolken wurden im Gerinnsel mit einer fokussierten Ultraschallquelle erzeugt, die für die Behandlung von femoralvenösen Gerinnseln entwickelt wurde. Motorisierte Positionierer wurden verwendet, um den Quellfokus entlang der Gerinnsellänge zu übersetzen. An jedem Insonationsort wurden akustische Emissionen aus der Blasenwolke passiv aufgezeichnet und beamgeformt, um passive Kavitationsbilder zu erzeugen. Metriken zur Messung der Behandlungswirksamkeit umfassten den Verlust der Gerinnselmasse (Gesamtwirksamkeit der Behandlung) und die Konzentrationen von D-Dimer (Fibrinolyse) und Hämoglobin (Hämolyse) im Perfusat. Es gibt Einschränkungen für dieses In-vitro-Design, einschließlich des Fehlens von Mitteln zur Beurteilung von In-vivo-Nebenwirkungen oder dynamischen Änderungen der Durchflussrate, wenn das Gerinnsel lysiert. Insgesamt bietet das Setup eine effektive Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit von Histotripsie-basierten Strategien zur Behandlung von TVT.

Introduction

Thrombose ist der Zustand der Gerinnselbildung in einem ansonsten gesunden Blutgefäß, das die Durchblutung behindert1,2. Venöse Thromboembolien haben jährliche Gesundheitskosten von 7-10 Milliarden US-Dollar, mit 375.000-425.000 Fällen in den Vereinigten Staaten3. Lungenembolie ist die Obstruktion der Lungenarterie und ist die schwerwiegendste Folge der venösen Thromboembolie. Die primäre Quelle der Lungenobstruktion sind tiefe Venenthrombolien, hauptsächlich aus iliofemoralen venenösen Segmenten4,5,6. Tiefe Venenthrombose (DVT) hat inhärente Folgeerscheinungen neben Lungenobstruktionen, mit langfristigen Komplikationen, die zu Schmerzen, Schwellungen, Beingeschwüren und Gliedmaßenamputationen führen7,8,9. Bei kritischen Obstruktionen sind kathetergerichtete Thrombolytika (CDT) der Frontline-Ansatz für die Gefäßrekanalisation10. Das Ergebnis der CDT hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter Thrombusalter, Ort, Größe, Zusammensetzung, Ätiologie und Patientenrisikokategorie11. Darüber hinaus ist CDT mit Gefäßschäden, Infektionen, Blutungskomplikationen und langer Behandlungszeit verbunden10. Geräte der nächsten Generation zielen darauf ab, mechanische Thrombektomie mit Thrombolytika (d.h. pharmakomechanischer Thrombektomie) zu kombinieren12,13. Die Verwendung dieser Geräte senkt die lytische Dosierung, was zu reduzierten Blutungskomplikationen führt, und verkürzt die Behandlungszeit12,13,14 im Vergleich zu CDT. Diese Geräte behalten immer noch Probleme mit hämorrhagischen Nebenwirkungen und unvollständiger Entfernung chronischer Thromben15. Es bedarf daher einer adjuvanten Strategie, die den Thrombus mit geringeren Blutungskomplikationen vollständig entfernen kann.

Ein möglicher Ansatz ist die histotripsiegestützte thrombolytische Behandlung, die als Lysotripsie bezeichnet wird. Histotripsie ist eine nicht-invasive Behandlungsmodalität, die fokussierten Ultraschall verwendet, um Blasenwolken in Geweben zu nukleieren16. Die Blasenaktivität wird nicht über exogene Kerne erzeugt, sondern durch die Anwendung von Ultraschallimpulsen mit ausreichender Spannung, um Gewebekerne zu aktivieren, einschließlich Gerinnsel17,18. Die mechanische Schwingung der Blasenwolke belastet das Gerinnsel und zerfällt die Struktur in azelluläre Trümmer19. Die Histotripsie-Blasenaktivität sorgt für einen effektiven Abbau von eingezogenen und nicht retraktierten Blutgerinnseln sowohl in vivo als auch in vitro20,21,22. Frühere Studien haben23,24 gezeigt, dass die Kombination von Histotripsie und dem lytischen rekombinanten Gewebetyp-Plasminogenaktivator (rt-PA) die Behandlungswirksamkeit im Vergleich zu lytischen allein oder Histotripsie allein signifikant erhöht. Es wird angenommen, dass zwei primäre Mechanismen, die mit der Histotripsie-Blasenaktivität verbunden sind, für die verbesserte Wirksamkeit der Behandlung verantwortlich sind: 1) erhöhte Fibrinolyse aufgrund einer verbesserten lytischen Abgabe und 2) Hämolyse der roten Blutkörperchen im Gerinnsel. Der Großteil der Gerinnselmasse besteht aus roten Blutkörperchen24, und daher ist die Verfolgung des Erythrozytenabbaus ein guter Ersatz für die Ablation der Probe. Andere gebildete Gerinnselelemente werden wahrscheinlich auch unter Histotripsie-Blasenaktivität zerfallen, werden aber in diesem Protokoll nicht berücksichtigt.

Hier wird ein Benchtop-Ansatz zur Behandlung von TVT in vitro mit Lysotripsie skizziert. Das Protokoll beschreibt kritische Betriebsparameter der Histotripsiequelle, die Beurteilung der Behandlungswirksamkeit und die Bildführung. Das Protokoll umfasst die Entwicklung eines Strömungskanals zur Nachahmung eines iliofemoralen Venensegments und die Herstellung menschlicher Vollblutgerinnsel. Das experimentelle Verfahren beschreibt die Positionierung der Histotripsiequelle und des Bildgebungsarrays, um eine Histotripsie-Exposition entlang des im Strömungskanal platzierten Gerinnsels zu erreichen. Relevante Insonationsparameter, um gerinnselunterbrechungen zu erreichen und die Blasenaktivität außerhalb des Ziels zu minimieren, werden definiert. Die Verwendung von Ultraschallbildgebung zur Führung und Beurteilung der Blasenaktivität wird veranschaulicht24. Metriken zur Quantifizierung der Behandlungswirksamkeit wie Gerinnselmassenverlust, D-Dimer (Fibrinolyse) und Hämoglobin (Hämolyse) werden23,24,25,26,27beschrieben. Insgesamt bietet die Studie ein wirksames Mittel zur Durchführung und Bewertung der Wirksamkeit von Lysotripsie zur Behandlung von TVT.

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Protocol

Für die hier vorgestellten Ergebnisse wurde venöses menschliches Blut entnommen, um Gerinnsel zu bilden, nachdem das lokale interne Überprüfungsgremium (IRB # 19-1300) genehmigt und die schriftliche Einwilligung freiwilliger Spender24erteilt wurde. In diesem Abschnitt wird ein Entwurfsprotokoll zur Beurteilung der Wirksamkeit der Lysotripsie beschrieben. Das Protokoll basiert auf einer früheren Arbeit von Bollen et al.24.

1. Gerinnselmodellierung

HINWEIS: Bereiten Sie die Gerinnsel innerhalb von 2 Wochen, aber mehr als 3 Tage vor dem Tag des Experiments vor, um die Gerinnselstabilität zu gewährleisten und den Rückzug zu maximieren28. Bereiten Sie das Gerinnsel nach der Genehmigung durch das lokale institutionelle Überprüfungsgremium vor.

  1. Bereiten Sie die Borosilikat-Pasteur-Pipette für die Lagerung des Blutes vor (siehe Materialtabelle für Spezifikationen der Pipette). Borosilikatröhrchen werden wegen der hydrophilen Natur des Materials verwendet, die die Thrombozytenaktivierung und den Gerinnselrückzug fördert29. Versiegeln Sie die Spitze der Pipette durch Erhitzen über einem Bunsenbrenner.
  2. Ziehen Sie frisches menschliches Venenblut. Aliquot das gesamt entnommene Blut in 2-ml-Schritten pro gewünschtem Gerinnsel. Geben Sie jedes 2 ml Aliquot in eine Pasteur-Pipette.
    HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.2 innerhalb von ca. 3 Minuten nach der Blutentnahme aus, damit kein Blut gerinnt, bevor es in Pipetten überführt wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass der freiwillige Spender keine Medikamente einnimmt, die die Gerinnungskaskade verändern können (z. B. Blutverdünner oder Thrombozytenhemmer).
  3. Inkubieren Sie die Blutaliquoten in den Pipetten (entspricht der Anzahl der benötigten Gerinnsel) in einem Wasserbad für 3 h bei 37 °C.
  4. Lagern Sie die Pipetten mindestens 3 Tage bei 4 °C, um das Zurückziehen der Gerinnsel zu ermöglichen28. Wenn sich die Gerinnsel zurückziehen, wird beobachtet, dass sich Serum an der Oberseite des Gerinnsels in der Pipette ansammelt. Die rt-PA-Reaktion von Gerinnseln bleibt 2 Wochen nach dem Rückzug stabil28.

2. Vorbereitung des Wassertanks

  1. Füllen Sie den Wassertank mit Umkehrosmosewasser. Bekleiden Sie die Unterseite des Tanks mit einem akustisch absorbierenden Material, um die Reflexion der Therapie oder der Ultraschallimpulse zu reduzieren. Verwenden Sie ein Wasseraufbereitungssystem, um das Wasser zu entgasen und zu filtern, um Blasenkerne zu minimieren.
    HINWEIS: Eine Möglichkeit, das Wasser zu filtern, ist die Verwendung eines Inline-Filters. Die Spezifikationen des Beutels, der zur Erzeugung der repräsentativen Ergebnisse verwendet wird, sind in der Materialtabelle angegeben.
  2. Platzieren Sie zwei Heizelemente an der Unterseite des Tanks. Erhitzen Sie das Wasser auf 37,3 °C, um die maximale lytische enzymatische Aktivität30zu erreichen.
  3. Richten Sie einen Flusskanal ein, wie in Abbildung 1Adargestellt. Der Strömungskanal besteht aus Schläuchen, einem Modellgefäß mit Material- und geometrischen Eigenschaften, die für eine iliofemorale Vene repräsentativ sind, einem Reservoir für Plasma und einer Spritze am distalsten Ende des Reservoirs (Materialtabelle). Die Spritze wird an eine Pumpe angeschlossen, um während des Experiments einen Durchfluss durch den Kanal zu regulieren.
  4. Tauchen Sie den Strömungskanal manuell in den Wassertank ein, um den Kanal während der Entgasungs-/Filter-/Heizstufe auf physiologische Temperatur zu bringen (Schritte 2.1 und 2.2).

3. Herstellung von Plasma und rt-PA-Gemisch

  1. Vor dem Experimentiertag
    HINWEIS: Bei Lagerung bei -80 °C ist Plasma mindestens 2,5 Jahre31 und rt-PA mindestens 7 Jahre stabil32. Führen Sie daher Schritt 3.1 jederzeit innerhalb dieser Zeiträume aus, um die Stabilität der beiden Komponenten sicherzustellen.
    1. Verdünnen Sie das von einem Hersteller erhaltene rt-PA in pulverförmiger Form auf 1 mg/ml in sterilem Wasser.
    2. Aliquot 100 μL verdünntes rt-PA in 0,5 mL Zentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -80 °C.
    3. Aliquot 35 ml menschliches frisch gefrorenes Plasma vom Typ O in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Röhrchen bei -80 °C.
  2. Am Experimenttag
    1. Holen Sie Plasma-Aliquoten aus dem Gefrierschrank. Rufen Sie so viele Aliquoten ab, wie die Anzahl der gerinnsel, die an diesem Tag getestet werden sollen. Tauchen Sie die gefrorenen Aliquoten in ein Wasserbad bei 37 °C, um aufzutauen (~10 min).
    2. Sobald das Plasma aufgetaut ist, gießen Sie es in ein Becherglas, das dreifach mit Reinstwasser gespült wird. Bedecken Sie den Mund des Becherglases leicht mit Aluminiumfolie, um eine Kontamination zu vermeiden, und legen Sie das Becherglas in das Wasserbad. Lassen Sie die Folie locker genug sein, damit Luft mit dem Plasma in Kontakt treten kann.
    3. Plasma wird bei 37 °C mindestens 2 h auf Atmosphärendruck ausgeglichen.
    4. Nehmen Sie die gefrorenen rt-PA-Fläschchen heraus und legen Sie sie auf Eis, bis sie benötigt werden, mit einer Durchstechflasche für jeden Versuchslauf.
    5. Machen Sie Agarose mit niedrigem Gelieren (2%) in einem 50-ml-Kolben, indem Sie Agarose in Reinstwasser auflösen. Wählen Sie die Gesamtmenge an Agaroselösung so, dass für jede zu analysierende Probe etwa 2 ml zur Verfügung stehen. Die Lösung im Kolben in der Mikrowelle erhitzen, bis sie sprudelt. Befestigen Sie den Kolben mit einem wasserdichten Schraubdeckel darauf. Tauchen Sie den Kolben neben dem Plasma in das Wasserbad.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass Agarose verfügbar ist, um exponierte Gerinnselsegmente für die histologische Analyse nach Histotripsiesonation zu sichern.

4. Einrichten der Histotripsiequelle und des Imaging-Arrays

  1. Stellen Sie sicher, dass die motorisierten Positionierer von der Laufzeitumgebung einer Programmierplattform aus gesteuert werden können, indem Sie die vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen und Befehle verwenden. Überprüfen Sie, ob die Motoren des Systems an den entsprechenden Port des Computers mit der Laufzeitumgebung angeschlossen sind.
  2. Montieren Sie die Histotripsiequelle am motorisierten Positioniersystem, wie in Abbildung 1B dargestellt.
  3. Schließen Sie die Histotripsiequelle über die entsprechenden Anschlüsse (z. B. BNC-Kabel) wie vom Hersteller angegeben an ihre Antriebselektronik (z. B. Endstufe und Funktionsgenerator) an.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Antriebselektronik der Histotripsiequelle über die in Schritt 4.1 verwendete Laufzeitumgebung gesteuert werden kann.
  4. Decken Sie das Imaging-Array mit einer Sondenabdeckung ab, und befestigen Sie das Array koaxial in der Blende der Histotripsiequelle, wie in Abbildung 2 dargestellt. Achten Sie darauf, die Ausrichtung der Abbildungsebene relativ zur Ausrichtung der Histotripsiequelle zu verstehen.
  5. Schließen Sie das Bildgebungsarray an ein Ultraschall-Scansystem an. Stellen Sie sicher, dass dieses System den Betrieb und die Auslösung des Imaging-Arrays steuern und Imaging-Daten gemäß den Befehlen des Herstellers des Scanners sammeln kann.
  6. Tauchen Sie die Histotripsiequelle/das Imaging-Array während der Entgasung in den Tank ein, wie in Abbildung 1Adargestellt. Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen mit einer Spritze von der Oberfläche der Histotripsiequelle oder des Imaging-Arrays.
    HINWEIS: Tauchen Sie die Histotripsiequelle und das Imaging-Array vor dem Betrieb vollständig in Wasser. Vermeiden Sie es, die Oberfläche der Histotripsiequelle zu berühren.
  7. Erfassen Sie B-Modus-Bilder mit einer Rate von 20 Bildern pro Sekunde mit dem Imaging-Array und den integrierten Befehlen des Scanners. Passen Sie das Bildfenster an, um die Visualisierung des Fokus der Histotripsiequelle in diesen Echtzeitbildern sicherzustellen.
    HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass die Dimensionen der Fokusregion der therapeutischen Quelle bekannt sind.
  8. Stellen Sie die Betriebsparameter der Histotripsiequelle ein, einschließlich Grundfrequenz (z. B. 1,5 MHz), Pulswiederholfrequenz (z. B. 20-100 Hz), Pulsdauer (z. B. 1-20 Zyklen pro Impuls) und Gesamtzahl der Impulse pro Ort (z. B. 100-2.000)18,23,24,33. Ändern Sie diese Parameter, wenn keine ausreichende Gerinnsellyse erreicht wird oder wenn die Blasenaktivität über das Lumen des Modellgefäßes hinausgeht. Um diese Parameter einzustellen, verwenden Sie das vom Hersteller der Quelle bereitgestellte Protokoll oder verwenden Sie eine Programmierplattform, die mit der Quelle kommunizieren kann (Schritt 4.3).
  9. Führen Sie die Histotripsiequelle mit dem in Schritt 4.8 verwendeten Protokoll oder der Programmierplattform des Herstellers bei den eingestellten Parametern nur in entgasten Gewässern ohne Behinderung in der Umgebung aus. Erhöhen Sie die spannungsangebrachte Histotripsiequelle, bis sich eine Blasenwolke bildet.
  10. Passen Sie mithilfe der Echtzeitabbildung von Schritt 4.7 die Position des Bildgebungsarrays innerhalb der öffnung des konfokalen Wandlers an, bis sich die Blasenwolke ungefähr in der Mitte des Bildfensters befindet. Die Blasenwolke ist der Bereich hyperechoischer Pixel in der Abbildungsebene (Abbildung 3). Ziehen Sie die Schrauben fest, um das Imaging-Array fest in der Wandleröffnung zu halten.
    HINWEIS: Wenn das Array richtig ausgerichtet ist, sollte die azimutale Position der Blasenwolke ungefähr bei 0 mm in der Abbildungsebene liegen. Das bildgebungsfeld kann leicht von der inneren Oberfläche der Therapiequelle projizieren, und daher kann die Bereichsposition der Blasenwolke von der Brennweite der Quelle abweichen.
  11. Identifizieren Sie die Position der Blasenwolke in der Abbildungsebene. Weisen Sie den Fokus der Histotripsiequelle als Zentrum der Blasenwolke zu (Abbildung 3).
  12. Notieren Sie die erkannte Brennposition (Schritt 4.11) im Bildfenster (Abbildung 3). Eine möglichkeit, die Fokusposition zu markieren, besteht darin, einen Cursor zu platzieren, um die Position im Imaging-Fenster zu notieren, sofern dies mit der Imaging-Plattform verfügbar ist.
  13. Beenden Sie die Insonation und stellen Sie die an die Histotripsiequelle angelegte Spannung auf 0 V ein.

5. Gerinnselzubereitung

  1. Entfernen Sie das Gerinnsel aus der Pipette, indem Sie das versiegelte Ende mit einer Zange schneiden. Lassen Sie das Gerinnsel zusammen mit dem Serum in eine Petrischale gleiten. Wenn sich das Gerinnsel nicht löst, drücken Sie vorsichtig Druck vom anderen Ende der Pipette durch Kochsalzlösung aus, um das Gerinnsel zu entfernen.
  2. Schneiden Sie das Gerinnsel mit einem Skalpell auf 1 cm Länge und zielen Sie auf ein einheitliches Stück von der Mitte aus (dh weg von Abschnitten des Gerinnsels, die oben oder unten in der Pipette gebildet werden).
  3. Verwenden Sie ein Reinigungstuch, um den geschnittenen Abschnitt des Gerinnsels vorsichtig abzutuchen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
  4. Legen Sie den Gerinnselabschnitt mit einer Pinzette vorsichtig auf eine Waage und notieren Sie das Gewicht.
  5. Heben Sie den Strömungskanal manuell aus dem Wassertank an und entfernen Sie den Modellbehälter aus dem Strömungskanal.
  6. Legen Sie das Gerinnsel mit einer Pinzette in das Modellgefäß und befestigen Sie das Modellgefäß wieder am Strömungskanal.
    HINWEIS: Ein Nylonstab kann innerhalb des Modellgefäßes platziert werden, um zu verhindern, dass sich das Gerinnsel aufgrund der Strömung stromabwärts bewegt.
  7. Senken Sie den Strömungskanal so in den Tank, dass das proximale Ende der Stufe relativ zum Reservoir im Vergleich zur distalen Seite niedrig ist. Das Angeln der Stufe auf diese Weise verhindert das Einfangen von Blasen im Modellgefäß, wenn in Schritt 6.1 Plasma durch den Strömungskanal gezogen wird.
  8. 30 ml Plasma werden mit einer Pipette in das Reservoir geben und die Temperatur überwacht, bis sie mindestens 36 °C erreicht.
  9. Verwenden Sie eine Pipette, um das rt-PA (80,4 μg in 30 ml Plasma, 2,68 μg/ml) in das Plasmareservoir zu dosieren. Rühren Sie das Plasma mit der Pipette um, um eine gleichmäßige rt-PA-Verteilung innerhalb des Reservoirs zu gewährleisten.

6. Ansaugen des Strömungskanals

  1. Ziehen Sie Plasma aus dem Reservoir über die Spritzenpumpe in den Strömungskanal, bis das Plasma das Modellgefäß füllt.
    HINWEIS: Wenn das Gerinnsel nicht bündig mit dem Nylonstab ist, verwenden Sie kurze Pumpenzuge bei 60 ml / min, um zu versuchen, das Plasma dem Gerinnsel nachgeschaltet zu zwingen oder manuell durch die Spritze zu ziehen. Begrenzen Sie die Menge an Plasma, die bei diesem Prozess entnommen wird, oder füllen Sie das Reservoir mit zusätzlichem Plasma / rt-PA auf, um 30 ml Lösung im Strömungskanal zu gewährleisten.
  2. Richten Sie das Imaging-Array mithilfe der motorisierten Positionierer mithilfe des Imaging-Skripts parallel zur Länge des Gerinnsels aus (Schritt 4.7). Die parallele Ausrichtung ermöglicht es dem Benutzer, die korrekte Platzierung des Gerinnsels und das Fehlen von Blasen im Modellgefäß visuell sicherzustellen.
  3. Nivellieren Sie das Modellschiff manuell und visuell, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind, indem Sie das Bildfenster verwenden (Schritt 4.7).

7. Ablauf des Experiments

  1. Vorbehandlung
    HINWEIS: In diesem Schritt wird ein Pfad für die Histotripsiequelle/das Imaging-Array für eine gleichmäßige Histotripsie-Exposition entlang der Gerinnsellänge geplant.
    1. Richten Sie das Bildgebungsarray mit den motorisierten Positionierern so aus, dass die Abbildungsebene parallel zum Querschnitt des Gerinnsels verläuft (d. h. senkrecht zur in Schritt 6.2 beschriebenen Ausrichtung).
    2. Bewegen Sie unter Anleitung des Bildgebungsfensters (Schritt 4.7) die Histotripsiequelle mit den motorisierten Positionierern zum proximalen Ende des Gerinnsels relativ zum Reservoir. Passen Sie an dieser Stelle die Position der Histotripsiequelle so an, dass der markierte Brennpunkt in Schritt 4.12 mit dem Zentrum des Gerinnsels ausgerichtet ist.
    3. Bestimmen Sie den Resonanzpfad entlang der Gerinnsellänge. Um diesen Pfad zu definieren, legen Sie drei Wegpunkte entlang der Länge des Gerinnsels (d. h. Positionen der Motoren, in denen die histotripsy Blasenaktivität im Gerinnsel enthalten ist) in Schritten von 5 mm fest. Richten Sie die Wegpunkte so aus, dass die Gesamtbewegung der histotripsieartigen Quelle entlang des Pfades antegrad mit der Strömung im System ist (dh der erste Wegpunkt befindet sich am proximalsten Ende des Gerinnsels relativ zum Reservoir und der dritte Wegpunkt befindet sich in der distalen Position relativ zum Reservoir).
    4. Bevor Sie jeden Wegpunkt abschließen, feuern Sie Testimpulse von der Histotripsiequelle mit den gleichen Insonationsparametern wie Schritt 4.8 ab, reduzieren sie jedoch die Gesamtexposition auf 10 Gesamtimpulse. Stellen Sie die Position der Histotripsiequelle bei Bedarf mit den motorisierten Positionierern ein, um die Blasenaktivität im Gerinnsel einzudämmen.
    5. Speichern Sie an jedem Wegpunkt die Motorpositionen mit den vom Hersteller bereitgestellten Befehlen, ähnlich wie in Schritt 4.1.
  2. Behandlung
    HINWEIS: Dieser Schritt definiert das Verfahren zur Behandlung des Gerinnsels entlang seiner Länge entsprechend dem im Vorbehandlungsschritt definierten Pfad.
    1. Führen Sie die Spritzenpumpe mit 0,65 ml/min aus und warten Sie, bis sich der Meniskus des Plasmas bewegt hat. Diese Durchflussrate ahmt einen nahezu vollständigen Verschluss des iliofemoralenGefäßes 24,34 nach.
    2. Interpolieren Sie den in Schritt 7.1.3 angelegten Pfad mit Zwischenschritten zwischen den festgelegten Wegpunkten mit einer festen Schrittgröße (z.B. 0,5 mm). Die Schrittgröße wird so gewählt, dass sie kleiner als die Hälfte der Breite des Fokusbereichs ist, gemessen entlang der Gerinnsellänge (Höhenrichtung des Bildgebungsarrays). Bewegen Sie die Histotripsiequelle mit motorisierten Positionierern an jeder Pfadposition mit den in Schritt 4.8 definierten Insonationsparametern.
    3. Überwachen/Bildblasenaktivität während der Anwendung des Histotripsieimpulses an jeder Pfadstelle mithilfe des Bildgebungsfensters (Schritt 4.7). Zentrieren Sie das Bild auf dem Histotripsie-Fokus mit den Bildabmessungen von 15 mm im Azimut und -bereich. Vor der Anwendung des Histotripsieimpulses an jeder Stelle erfassen Sie ein B-Modus-Bild, um die Visualisierung des Gerinnsels und des Modellgefäßes zu ermöglichen, indem Sie ein Skript in einer Programmierplattform erstellen. Stellen Sie sicher, dass das Skript die Kommunikation mit dem Scanner mithilfe der Befehle des Herstellers herstellt.
    4. Implementieren Sie während der Anwendung des Histotripsieimpulses die Erfassung der akustischen Emissionen im Skript in Schritt 7.2.3, um passive Kavitationsbilder post hoc35zu bilden. Erfassen Sie ein passives Kavitationsbild nach jeweils 10 Behandlungsimpulsen. Wenden Sie eine flache Zeitverstärkungskompensation von 50 bei 8 inkrementellen Tiefen bis zum Ende der Bildtiefe an. Wählen Sie eine geeignete Erfassungsfenstergröße, so dass das gesamte Signal des Gerinnsels mit minimalem Energieverlust durch Fenster35erfasst wird.
    5. Wenn Off-Target-Blasenwolken vorhanden sind, stellen Sie die Wandlerposition in situ mit den motorisierten Positionierern ein.
      HINWEIS: Überwachen Sie auf verpasste Trigger des Imaging-Arrays. Passen Sie die Anzahl der erfassten Bilddatensätze an, um sicherzustellen, dass die Speicherung der Daten vor dem anschließenden Auslösen abgeschlossen ist.

8. Verfahren nach dem Experiment

  1. Heben Sie das Modellgefäß manuell aus dem Wassertank an, um das Parfüm über die Schwerkraft abzulassen. Achten Sie darauf, den Strömungskanal nivelliert zu halten, um zu verhindern, dass sich das Gerinnsel während des Abtropfens stromabwärts und aus dem Modellbehälter bewegt.
  2. Sammeln Sie das gesamte Perfusat zur weiteren Analyse in einem kleinen Becherglas (Abbildung 4A), indem Sie Plasmalösung aus dem Strömungskanal durch die Spritzenpumpe mit einer sehr niedrigen Durchflussrate ziehen.
  3. Trennen Sie das Modellgefäß, und entfernen Sie das Gerinnsel. Bei Bedarf eine kleine Menge Kochsalzlösung in das Modellgefäß injizieren, um das Gerinnsel sanft zu vertreiben.
  4. Wischen Sie das Gerinnsel ähnlich wie in Schritt 1.2.3. Wiegen Sie das Gerinnsel auf der Waage, um den Gerinnselmassenverlust zu beurteilen.
  5. Um den D-Dimergehalt zu analysieren, fügen Sie 100 mg Aminocapronsäure in ein Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, gefolgt von 1 ml Perfusat, und mischen Sie es gut mit einer Pipette. Führen Sie einen immun-turbidimetrischen Latex-Assay durch, um das D-Dimer in der Probe zu quantifizieren36.
  6. Um die Hämolyse zu beurteilen, fügen Sie 1 ml Perfusat in Zentrifugenröhrchen hinzu und spinnen Sie bei 610 x g (3.500 U / min) für 10 min. Kombinieren Sie 0,5 ml Überstand (Konzentrat) mit 0,5 ml Drabkins-Lösung und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 15 min ruhen. Übertragen Sie 200 μL auf Bohrplatten, wie in Abbildung 4B dargestellt. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption bei 540 nm abzulesen, Abbildung 4C (Drabkins-Assay37).
  7. Histologische Beurteilung
    1. Schneiden Sie einen Abschnitt aus der Mitte des Gerinnsels von etwa 2-3 mm Länge mit einem Skalpell.
    2. Fügen Sie den Abschnitt zu einer Kassette hinzu. Halten Sie die Ausrichtung des Abschnitts relativ zur Richtung der Histotripsie-Pulsausbreitung aufrecht.
    3. 2 ml niedriggelnde Agaroselösung, die in Schritt 3.2.5 hergestellt wurde, werden in die Kassette geben, um das Gerinnsel an Ort und Stelle zu fixieren.
    4. Fixieren Sie die Probe in 10% Formalin für 24 h. Legen Sie die Probe nach 24 h in 70% Alkohol und führen Sie eine Standard-Hemotoxylin-Eosin-Färbung38durch.

9. Passive Kavitationsbildanalyse

  1. Verarbeiten Sie die Signale, die während der Histotripsie-Anregung (Schritt 7.2.4) vom Bildgebungsarray erfasst wurden, mit einem Algorithmus, der auf dem robusten Capon-Beamformer39 basiert, um ein Bild der akustischen Emissionen zu erstellen, die von der Blasenwolke an jedem Behandlungsort erzeugt werden.
    HINWEIS: Um quantitative Bilder zu generieren, befolgen Sie die in Haworth et al.35beschriebenen Schritte. Andernfalls sollte jeder Pixelwert im Bild die relative akustische Energie der Blasenwolke (Einheiten von V2)an jeder entsprechenden Stelle darstellen.
  2. Segmentieren Sie das in Schritt 7.2.3 angequirte B-Modus-Bild, um zwischen den Pixeln, die das Gerinnsel darstellen, und dem Modellgefäß zu unterscheiden.
  3. Registrieren Sie das passive Kavitationsbild mit dem B-Modus-Bild, wie in Abbildung 5Bdargestellt. Summieren Sie die akustische Energie innerhalb des Gerinnsels über den Expositionszeitraum35.

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Representative Results

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll hebt die Details der venösen Gerinnselmodellierung, der Lysotripsie bei Gerinnselstörungen und der Ultraschallbildgebung in einem In-vitro-Setup der TVT hervor. Das gewählte Verfahren zeigt die Schritte, die zur Beurteilung der Gerinnselstörung aufgrund der kombinierten Effekte von rt-PA und histotripsy Bubble Cloud-Aktivität erforderlich sind. Das Benchtop-Setup wurde entwickelt, um die Eigenschaften einer venösen Iliofemoralvene nachzuahmen. Abbildung 1A zeigt ein Modellgefäß, das die akustischen, mechanischen und geometrischen Eigenschaften der iliofemoralen Vene aufweist. Das Gerinnsel wird in das Modellgefäß gelegt, um einen teilweise okklusiven Thrombus nachzuahmen. Das Gerinnsel wird mit Plasma und rt-PA aus einem Reservoir mit einer Geschwindigkeit von 0,65 ml/min durchblutet. Diese Rate stimmt mit der langsamen Durchflussrate in einem stark verschlossenenGefäß überein 34.

Ein elliptisch fokussierter Wandler mit einer Grundfrequenz von 1,5 MHz mit einer Hauptachse von 9 cm, einer 7 cm nebenachse und einer Brennweite von 6 cm (Abbildung 2A) ist auf dem Positioniersystem montiert, wie in Abbildung 1Bangegeben. Ein mit Ultraschallgel und einer Latexabdeckung(Abbildungen 2B,C)bedecktes Bildgebungsarray wird koaxial mit dem Wandler montiert, wie in Abbildung 1A über eine Öffnung in der Mitte der Histotripsiequelle gezeigt. Die motorisierten Positionierer wurden verwendet, um den Therapiewandler / das Bildgebungsarray entlang der Gerinnsellänge innerhalb des Modellgefäßes zu übersetzen (Abbildung 1). Bei Anbringung einer ausreichenden Spannung an der Histotripsiequelle wird im Fokusbereich des Wandlers eine Blasenwolke erzeugt und mittels Ultraschallbildgebung visualisiert, wie in Abbildung 3gezeigt. Die Fokusposition wird mit Hilfe der Abbildungsebene als Zentrum der Blasenwolke definiert (Schritte 4.10-4.11).

Abbildung 4A zeigt Perfusate, die für zwei verschiedene Behandlungsbedingungen gesammelt wurden. Das als Kontrolle gekennzeichnete Becherglas enthält Perfusat eines Gerinnsels, das allein Plasma ausgesetzt ist. Das zweite als behandelt gekennzeichnete Becherglas enthält das Perfusat des mit Lysotripsie behandelten Gerinnsels. Die gesammelten Perfusate werden verwendet, um den Hämoglobingehalt (Metrik der Hämolyse) und den D-Dimergehalt (Metrik der Fibrinolyse) durch Assays gemäß dem Protokoll zu beurteilen. Der Farbunterschied der Perfusate bezeichnet die Variabilität der Hämoglobinkonzentration, die über die optische Absorption quantifiziert werden kann. Der Zusammenhang zwischen Absorptionswert und Hämoglobinkonzentration kann durch eine Kalibrierkurve bestimmt werden. Lösungen mit bekanntem Hämoglobingehalt im Bereich von 0 (Blindmessung) bis 180 mg/ml werden in die Bohrplatte eingelegt und die Absorption wird in dreifacher Ausfertigung mit dem Plattenleser bestimmt (Abbildung 4B,C). Die obere Absorptionsgrenze des Plattenlesers kann variieren und ist möglicherweise nicht von vorndlich bekannt, um die Lösungen in der Bohrplatte herzustellen. Daher werden Hämoglobinkonzentrationen von bis zu 180 mg/ml in der Wellplatte hergestellt, Abbildung 4B. Der hier verwendete Plattenleser kann jedoch die Absorption nur für Konzentrationen bis zu 23 mg/ml ablesen, Abbildung 4C.

Abbildung 5A zeigt die Visualisierung des Gerinnsels innerhalb des Modellgefäßes mittels B-Mode-Bildgebung vor der Histotripsie-Exposition gemäß Schritt 7.2.3. Dieses Bild wird aufgenommen, um die Gerinnselposition für die Segmentierung des passiven Kavitationsbildes zu bestimmen. Abbildung 5B zeigt das passive Kavitationsbild, das mit dem B-Mode-Bild registriert wurde, das vor der Histotripsie-Belichtung aufgenommen wurde. Diese Zahl bestätigt, dass die akustische Energie während der Histotripsie-Exposition hauptsächlich im Gerinnsel enthalten ist.

Typische Gerinnselstörungen aufgrund von Histotripsie und Lytikum sind in Abbildung 6 dargestellt. Abbildung 6A,B zeigt die unbehandelten bzw. lysotripsiebehandelten Gerinnselbilder. Bei Proben, die einer Histotripsie ausgesetzt sind, ist die Störung in erster Linie auf das Gerinnselzentrum beschränkt, im Einklang mit den beobachteten Stellen der Blasenaktivität, die mit passiver Kavitationsbildgebung verfolgt wurden (Abbildung 5B). Bei Zugabe von Lytikum tritt der Massenverlust jedoch auch in Regionen auf, die näher an der Peripherie des Gerinnsels liegen. Es wird angenommen, dass dieser zusätzliche Massenverlust auf eine verstärkte Flüssigkeitsmischung des Lytikums unter Blasenaktivität zurückzuführen ist. Die Flüssigkeitsmischung erhöht die Verteilung und Eindringtiefe des Lytikums in das Gerinnsel. Da der Lytiker für die Fibrinolyse40verantwortlich ist, nimmt der Massenverlust zu. Die Fibrinolyse kann durch Messung des D-Dimergehalts im Perfusat41quantifiziert werden.

Figure 1
Abbildung 1: Versuchsaufbau für die Lysotripsie menschlicher Blutgerinnsel. (A) Die Komponenten des Aufbaus sind (1) fokussierte Histotripsiequelle mit elliptischer Geometrie, (2) latexbedecktes Bildgebungsarray, (3) Modellgefäß, das am Strömungskanal befestigt ist, (4) Strömungskanal, (5) Reservoir, (6) akustisches absorbierendes Material, (7) Heizelement und (8) Wassertank, der mit entgastem und beheiztem Umkehrosmosewasser gefüllt ist. Die Azimutbemaßung der Abbildungsebene steht senkrecht zu den Höhen- und Bereichsdimensionen (in die Seite). (B) Die histotripsy Quelle, die auf dem motorisierten Positioniersystem montiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2:Ultraschallquelle und bildgebungsgebende Komponenten. Individuelle gezoomte Bilder von (A) fokussierter Histotripsiequelle, (B) Bildgebungsarray und (C) Bildgebungsarray mit Ultraschallgel und Latexabdeckung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Histotripsy-Blasenwolke, visualisiert mit einem Imaging-Array. In der Fokuszone der Histotripsiequelle wird eine Blasenwolke erzeugt und mit einem Bildarray abgebildet. Der als Kreuz dargestellte Fokus wird für die Behandlungsplanung gespeichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Quantifizierung des hämoglobinfreiten Hämoglobins durch Gerinnsellyse. (A) Perfusatproben, die nach Kontrollstudie mit Plasma allein (keine Histotripsie oder Lytik) und Behandlungsarm, Histotripsie (z. B. 35 MPa Peak-Unterdruck, 5-Zyklus-Pulsdauer, 1,5 MHz-Grundfrequenz) und 2,68 μg/ml lytische Exposition entnommen wurden. (B) Well-Platte mit Verdünnungen bekannter Hämoglobinkonzentrationen im Bereich von 180 mg/ml (obere Reihe, linke Ecke) bis 0 mg/ml (untere Reihe, rechte Ecke). Die Pfeilspitze zeigt auf eine abnehmende Hämoglobinkonzentration hin. (C) Diese Proben werden verwendet, um eine Standardkurve zur Quantifizierung von Hämoglobin zu erstellen, das aufgrund einer Histotripsie-Exposition mittels Spektrophotometrie entsteht. Die Absorptionskurve für Hämoglobinkonzentrationen im Bereich von 0 bis 23 mg/ml wird aufgrund der Begrenzung des Plattenlesers bei der Analyse höherer Konzentrationen erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Bilder des Gerinnsels während der Behandlung. (A) B-Mode-Bild, das vor Beginn des Behandlungsimpulses aufgenommen wurde und die Gerinnselposition innerhalb des Modellgefäßes zeigt. (B) Post-hoc-Visualisierung der akustischen Energieemission, berechnet aus passiver Kavitationsbildgebung, die in einer heißen Farbkarte gezeigt wird, die mit dem B-Mode-Bild des Gerinnsels, das vor der Anwendung des Histotripsiepulses aufgenommen wurde, koregistriert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Histologie des abgetragenen Gerinnsels unter verschiedenen Behandlungsbedingungen. (A) Kontrolle des Gerinnsels ohne Behandlung. (B) Gerinnsel, das mit Lysotripsie behandelt wurde (z. B. 35 MPa Spitzennegpressdruck, Einzyklusimpulsdauer, 1,5 MHz Grundfrequenz). Der Histotripsiepuls breitete sich in diesem Bild von oben nach unten aus. Der Pfad für die Histotripsiequelle entlang der Länge des Gerinnsels (d. h. senkrecht zur Ebene des hier gezeigten Bildes) wird in Schritt 7.2.3 definiert. Der Maßstab der Mikroaufnahmen beträgt 2 mm. Beachten Sie, dass der hier erreichte Grad der Gerinnselstörung im Vergleich zu Insonationsschemata mit längerer Pulsdauer reduziert würde24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das vorgeschlagene Protokoll stellt ein Modell zur Quantifizierung der Behandlungswirksamkeit von Lysotripsie dar. Während die wichtigsten Details diskutiert wurden, gibt es bestimmte kritische Aspekte, die für den Erfolg dieses Protokolls zu berücksichtigen sind. Die enzymatische Aktivität von rt-PA hat eine Arrhenius-Temperaturabhängigkeit30. Die Temperatur ist auch ein Faktor für die Schallgeschwindigkeit in Wasser und Gewebe, und Temperaturschwankungen können geringfügige Veränderungen der Geometrie der Fokuszone verursachen. Daher sollte die Wassertemperatur bei 37 °C sorgfältig reguliert werden. Die im Protokoll verwendete Dosis von rt-PA (2,68 μg/ml) stimmt mit der Dosis überein, die klinisch für andere pharmakomechanische Thrombektomiestrategien verwendet wird42. In Schritt 5.8 werden 30 ml Plasma in das Reservoir übertragen, während in Schritt 3.1.3 ein Aliquot von 35 ml festgestellt wird. Dieses zusätzliche Plasma führt zu einem Verlust im Plasma aufgrund von Verdampfung im Laufe von Stunden, wenn es auf 37 °C erwärmt wird, um es mit dem atmosphärischen Druck auszugleichen.

Die Brennweite, Blendenbreite und Frequenz des Therapieaufnehmers bestimmen die Größe und Tiefe des Fokusbereichs. Daher sollte der Wandler so gewählt werden, dass diese Eigenschaften mit dem Durchmesser und der Tiefe des Zielgefäßes übereinstimmen (z. B. Oberschenkelvene: 2-4 cm Tiefe und 0,6-1,2 cm Durchmesser)43. Das Ausmaß der mechanischen Ablation ist auf das Ausmaß der Blasenwolke beschränkt. Daher ist ein Verständnis der Rolle, die Insonationsparameter bei der Modifizierung des Histotripsie-Blasenwolkenverhaltensspielen,kritisch33,44,45. Die Frequenz und die Stärke des akustischen Feldes sollten auch unter Berücksichtigung der Größe der Dämpfung aufgrund von Medium und Zwischenmaterialien (z. B. Modellgefäß) gewählt werden. Um die Blasenaktivität mit dem Zielgefäß einzuschließen, sollte ein geeignetes Bildgebungsfenster zur Überwachung der Fokuszone gewählt werden. Die Betriebsparameter des Wandlers sollten so gewählt werden, dass Off-Target-Effekte vermieden und gleichzeitig die mechanische Gerinnselstörung maximiert wird. In diesem Protokoll wurde der Massenverlust als primäre Metrik für die Wirksamkeit der Behandlung angesehen. Es wurde ein Anstieg des Massenverlusts beobachtet, da der maximale Unterdruck oder die Dauer des Histotripsieimpulses erhöht sind24,46, mit einem maximal beobachteten Massenverlust von 94%. Das Vorhandensein von Restgerinnseln für untersuchte Behandlungsarme erleichtert den Vergleich der therapeutischen Wirksamkeit. Es können jedoch auch Insonationsschemata entwickelt werden, um die vollständige Entfernung des Thrombus zu gewährleisten.

Die akustische Impedanz (ca. 1,58 MRayl47,48) und die geometrischen Eigenschaften (0,6-1,2 cm im Durchmesser43)des Modellgefäßes sollten repräsentativ für das iliofemorale venöse Gefäß sein (siehe Materialtabelle für Details). Polydimethylsiloxan und Polyurethan sind einige der anderen Materialien, die geeignet sind, das Venensystem auf der Grundlage ihrer akusto-mechanischen Eigenschaften zu modellieren. In Schritt 7 ist es wichtig, alle Luftblasen aus dem Modellgefäß zu entfernen, um zu vermeiden, dass das Gerinnsel vor histotripsieartiger Exposition geschützt wird. Für ein Modellgefäß aus hydrophobem Material können sich Blasenwolken bevorzugt in der Nähe der Gefäßwand anstelle der Mitte des Gerinnsels bilden. Daher sollte die Blasenwolke während der Behandlung kontinuierlich per Ultraschallbildgebung überwacht und der Schallkopf gegebenenfalls neu positioniert werden. Es sollten Pilotstudien durchgeführt werden, um Histotripsie-Insonationsparameter (z. B. Pulsdauer und Spitzendruck) zu bestimmen, die die endgültige beabsichtigte Gerinnselstörung erreichen.

Das Imaging-Array wird verwendet, um B-Mode-Bilder und passive Kavitationsbilder zur Behandlungsvisualisierung zu erfassen und die Blasenaktivität zu quantifizieren. Die B-Mode-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung des Modellgefäßes und des Gerinnsels, und die passive Kavitationsbildgebung misst die Energie der Blasenaktivität, die mit der Gerinnselablation verbunden ist24,49. Die Bandbreite des Imaging-Arrays sollte sich an der gewünschten Blasenwolkenaktivität mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis ausrichten. Um rein breitbandige Signale zu erhalten, die mit dem Trägheitskollaps von Blasen innerhalb der Cloud verbunden sind, sollte die Bandbreite des Arrays nicht mit der Grundfrequenz desWandlers 50,51übereinstimmen. Histotripsy-Impulse sind sehr nichtlinear52, und es ist wahrscheinlich, dass Oberschwingungen der Grundfrequenz im empfangenen Signal vorhanden sind. Das Bildgebungssystem sollte so programmiert werden, dass es basierend auf der bekannten Flugzeit des Histotripsiepulses von der Quelle in die Fokuszone auslöst, um die Erfassung vollständiger passiver Kavitationsbildgebungsdaten während der gesamten Insonation sicherzustellen. Diese Signale sollten dann post-hoc verarbeitet werden, wie in den Schritten 7.2.3 und 9 des Protokolls erläutert.

Es sollte beachtet werden, dass die Menge der Hämolyse empfindlich auf den Umgang mit dem Gerinnsel reagiert. Daher sollte darauf geachtet werden, die Schädigung des Gerinnsels vor der Behandlung zu minimieren. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, sollten die Gerinnselmodellierung (Schritt 1) und die Vorbehandlungszeit (Schritte 6 und 7.1) für alle Gerinnsel, die mit oder ohne Histotripsie-Exposition behandelt werden, gleich sein. Im Nachbehandlungsschritt der Hämolysebewertung ist zu beachten, dass Plasma seine eigene Absorption hat. Daher sollte das Verdünnungsmittel, das zur Bildung von Standardkurven verwendet wird (z. B. optische Absorption vs. Hämoglobin), mit der gleichen Flüssigkeit gebildet werden, die wie das Perfusat im Strömungskanal verwendet wird (z. B. wurde in dieser Studie Plasma als Verdünnungsmittel verwendet, um Standardkurven zu bilden).

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein Benchtop-Setup bereitzustellen, um die Wirksamkeit der Lysotripsie zur Behandlung von menschlichen Vollblutgerinnseln zu messen. Es gibt bestimmte Einschränkungen, die sich aufgrund der In-vitro-Natur des Aufbaus ergeben. Die akuten Gerinnsel, die für dieses Protokoll verwendet wurden, bestanden hauptsächlich aus roten Blutkörperchen und Fibrin, was den Ansatz der Lysotripsie für die TVT wirksam machte. Spätere Stadien des Thrombus können jedoch ein steifes kollagenes Netzwerk53 entwickeln, das der Lysotripsie-Behandlung aufgrund der Fibrin-spezifischen Natur von rt-PA widerstehen kann. Bei der In-vivo-Behandlung ist der primäre klinische Endpunkt für die Wirksamkeit der Behandlung die Wiederherstellung des Flusses. Der Massenverlust war eine primäre Metrik für die Wirksamkeit der Behandlung in dem hier beschriebenen In-vitro-Protokoll. Obwohl der Durchfluss in diesem Protokoll nicht bewertet wurde, kann die Farb-Doppler-Bildgebung zusätzlich zusammen mit der passiven Kavitationsbildgebung in Schritt 7.2.4 integriert werden, um die Durchflusswiederherstellung zu überwachen. Das Setup in diesem Protokoll verwendet eine feste Durchflussrate, die die Durchflussrate in einem stark verschlossenen Gefäß während der gesamten Behandlung in Schritt 7.2 nachahmt. In vivo wird der Gefäßfluss zunehmen, wenn das Gerinnsel während der Behandlung zerfällt. Die zusätzlichen Scherspannungen, die mit einer erhöhten Strömung verbunden sind, verstärken das Gerinnselabbauprofil54. In vivo Off-Target-Effekte können in diesem Setup nicht festgestellt werden, wie Blutungen aufgrund systemischer Verabreichung von lytischen55, Gefäßwandschäden oder Vasospasmus aufgrund von Blasenwolkenaktivität22. Der In-vitro-Charakter dieser Studie schränkt auch die Fähigkeit ein, langfristige Ergebnisse wie Gefäßdurchgängigkeit oder Rethrombose nach der Behandlung zu beurteilen. Die Verabreichung von Lytika in dieser Studie ahmte systemische Thrombolytika nach, während kathetergesteuerte Lytika die bevorzugte Intervention bei Venenthrombosensind 7,14. Die Gewebedämpfung kann das Histotripsiefeld und die Abbildungsqualität für In-vivo-Studien beeinflussen, während hier der akustische Weg hauptsächlich durch entgastes Wasser erfolgt. Die Verarbeitung von Kavitationsemissionsdaten mit dem robusten Capon-Beamformer (Schritt 9 des Protokolls) ist rechenintensiv und wurde offline für die Post-hoc-Analyse durchgeführt. Andere Beamformer (z. B. Delay-and-Sum35 oder Winkelspektrum56)können alternativ betrieben werden, um Echtzeit-Feedback zu liefern, wenn auch mit reduzierter Reichweitenauflösung.

Zusammenfassend stellt dieses Protokoll einen nicht-invasiven Ansatz dar, um eine tiefe Venenthrombolyse menschlicher Blutgerinnsel zu erreichen. Das Protokoll etabliert ein bequemes und einfach zu replizierendes Verfahren zur Modellierung von Blutgerinnseln, zur Behandlung mit Lysotripsie und zur gleichzeitigen Bildgebung während der Behandlung. Die Protokollschritte zur Spezifizierung der Histotripsie-Blasenwolkengenerierung, Behandlungsplanung und Bildführung können weiter verwendet werden, um In-vitro-Behandlungen von Brusttumoren, Pankreastumoren und benigner Prostatahyperplasie zu untersuchen, bei denen sich die Histotripsie im Vergleich zu Standardverfahren als wirksamer erwiesen hat57,58. Die Verwendung von rt-PA in diesem Protokoll kann auf andere Medikamente oder Arzneimittelträger verallgemeinert werden, die zur Behandlung solcher Tumoren verwendet werden, zusammen mit Histotripsie, um die lytische Wirksamkeit zu erhöhen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, Grant R01HL13334, finanziert. Die Autoren danken Dr. Kevin Haworth für die Unterstützung bei Drabkins Assay und Dr. Viktor Bollen für seine Unterstützung bei der Gestaltung des Protokolls. Die Autoren sind auch Dr. Adam Maxwell für seine Anleitung zur Gestaltung der Histotripsie-Quelle dankbar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Ein In-vitro-System zur Messung der thrombolytischen Wirksamkeit von Histotripsie und einem lytischen Medikament
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Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

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