Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מערכת במבחנה לאמוד את היעילות התרומבוליטית של היסטוטרפסיה וסם ליטיק

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

לידה ליטית בסיוע היסטוטרפסיה או ליזוזטריפסיה נמצאת בפיתוח לטיפול פקקת ורידים עמוקים. הליך במבחנה מוצג כאן כדי להעריך את היעילות של טיפול משולב זה. פרוטוקולים מרכזיים עבור מודל קריש דם, הדרכת תמונה, והערכה של יעילות הטיפול נדונים.

Abstract

פקקת ורידים עמוקים (DVT) היא דאגה בריאותית עולמית. הגישה העיקרית להשגת recanalization כלי עבור חסימות קריטיות היא תרומבוליטיקה מכוונת צנתר (CDT). כדי למתן את תופעות הלוואי הקאוסטית ואת זמן הטיפול הארוך הקשורים CDT, אדג'ובנט וגישות חלופיות נמצאים בפיתוח. גישה אחת כזו היא היסטומטרפסיה, טיפול אולטרסאונד ממוקד כדי לנפח רקמה באמצעות התגרענות ענן בועה. מחקרים פרה-קליניים הראו סינרגיה חזקה בין היסטוטרפסיה וטרומבוליטיקה להשפלת קריש. דו"ח זה מתאר שיטת ספסל כדי להעריך את היעילות של טיפול תרומבוליטי בסיוע היסטוטרפסיה, או ליזוזטריפסיה.

קרישי דם המיוצרים מדם ורידים אנושי טרי הוכנסו לערוץ זרימה שמידותיו ומאפייניו האקוסטו-מכניים מחקים וריד איליו-פיומורלי. הערוץ היה מנוטרל בפלזמה ובמפעיל פלסמינוגן מסוג רקמה ליטית. ענני בועה נוצרו קריש עם מקור אולטרסאונד ממוקד המיועד לטיפול של קרישי וריד הירך. מיצובים ממונעים שימשו לתרגום מוקד המקור לאורך אורך הקריש. בכל מיקום הסתה, פליטות אקוסטיות מענן הבועה תועדו באופן פסיבי, וצורת קרן כדי ליצור תמונות cavitation פסיביות. מדדים לאמוד יעילות הטיפול כללו אובדן מסת קריש (יעילות הטיפול הכוללת), ואת הריכוזים של D-dimer (פיברינוליזה) והמוגלובין (המוליזה) ב perfusate. ישנן מגבלות על עיצוב במבחנה זו, כולל חוסר אמצעים להעריך תופעות לוואי vivo או שינויים דינמיים בקצב הזרימה כמו ליס קריש. בסך הכל, ההתקנה מספקת שיטה יעילה להערכת היעילות של אסטרטגיות מבוססות היסטוטריפסיה לטיפול ב- DVT.

Introduction

פקקת היא מצב של היווצרות קריש בכלי דם בריא אחרת שחוסם את זרימת הדם1,2. תרומבואמבוליזם ורידים יש עלות בריאות שנתית של $7-10 מיליארד, עם 375,000-425,000 מקרים בארצות הברית3. תסחיף ריאתי הוא חסימה של עורק הריאות והוא התוצאה החמורה ביותר של תרומבואמבוליזם ורידים. המקור העיקרי לחסימת ריאות הוא תרומבי וריד עמוק, בעיקר מקטעים ורידיים iliofemoral4,5,6. פקקת ורידים עמוקים (DVT) יש sequela אינהרנטי מלבד חסימות ריאות, עם סיבוכים לטווח ארוך שגורמים לכאב, נפיחות, כיבים ברגל, קטיעות גפיים7,8,9. עבור מכשולים קריטיים, תרומבוליטיקה מכוונת קטטר (CDT) הם הגישה החזיתית עבור recanalization כלי10. התוצאה של CDT תלויה במספר גורמים, כולל גיל תרומבוס, מיקום, גודל, הרכב, אטיולוגיה, וקטגוריה סיכון המטופל11. יתר על כן, CDT קשורה נזק לכלי הדם, זיהומים, סיבוכים דימום, וזמן טיפול ארוך10. התקנים הדור הבא שואפים לשלב פקקת מכנית עם תרומבוליטיקה (כלומר, פקקת פרמקומכנית)12,13. השימוש במכשירים אלה להוריד את המינון lytic המוביל סיבוכים דימום מופחת, וקיצר את זמן הטיפול12,13,14 בהשוואה CDT. התקנים אלה עדיין לשמור על בעיות של תופעות לוואי דימומיות והסרה חלקית של תרומבי כרוני15. אסטרטגיה אדג'ובנטית ולכן יש צורך שיכול להסיר את פקקת לחלוטין עם סיבוכים דימום נמוך יותר.

גישה פוטנציאלית אחת היא טיפול תרומבוליטי בסיוע היסטוטרפסיה, המכונה ליזוטריפסיה. היסטוטריפסיה היא שיטות טיפול לא פולשניות המשתמשת באולטרסאונד ממוקד כדי לגרעין ענני בועה ברקמות16. פעילות הבועה נוצרת לא באמצעות גרעינים אקסוגניים, אלא על ידי יישום של פולסים אולטרסאונד עם מתח מספיק כדי להפעיל גרעינים מהותיים לרקמות, כולל קריש17,18. התנודה המכנית של ענן הבועה מקנה מאמץ לקריש הדם, מתפוררת את המבנה לפסולת אסלורית19. פעילות בועת היסטוטרפסיה מספקת השפלה יעילה של קרישי דם נסוגים ובלתי מתמשכים הן ב- vivo והן במבחנה20,21,22. מחקרים קודמים הראוכי השילוב של היסטוטריפסיה ופעיל פלסמינוגן מסוג רקמה ליטית (rt-PA) מגביר באופן משמעותי את יעילות הטיפול בהשוואה ליטיק לבד או היסטוטריפסיה בלבד. ההשערה היא כי שני מנגנונים עיקריים הקשורים לפעילות בועת היסטוטרפסיה אחראים על יעילות הטיפול המשופרת: 1) פיברינוליזה מוגברת עקב מסירת ליטיק משופרת, ו -2) המוליזה של תאי דם אדומים בתוך הקריש. עיקר מסת קריש מורכב מתאי דם אדומים24, ולכן, מעקב אחר השפלת אריתרוציטים היא תחליף טוב עבור אבלציה של המדגם. אלמנטים אחרים נוצר קריש הם גם צפויים להתפורר תחת פעילות בועת היסטוטרפסיה אבל אינם נחשבים בפרוטוקול זה.

כאן, גישה benchtop לטיפול DVT במבחנה עם ליזוזטריפסיה הוא מתואר. הפרוטוקול מתאר פרמטרי הפעלה קריטיים של מקור היסטוטריפסיה, הערכת יעילות הטיפול והדרכה בתמונה. הפרוטוקול כולל תכנון ערוץ זרימה כדי לחקות קטע ורידים iliofemoral וייצור קרישי דם שלמים אנושיים. ההליך הניסיוני מתאר את המיקום של מקור היסטוטרפסיה ומערך הדמיה כדי להשיג חשיפה היסטוטרפסיה לאורך הקריש להציב בערוץ הזרימה. מוגדרים פרמטרי אינסונציה רלוונטיים להשגת הפרעות קריש ולמזער פעילות בועת מחוץ למטרה. השימוש בהדמיית אולטרסאונד להדרכה והערכה של פעילות הבועה מאויר24. מדדים לכימות יעילות הטיפול כגון אובדן מסת קריש דם, D-dimer (פיברינוליזה) ומוגלובין (המוליזה) מפורטים23,24,25,26,27. בסך הכל, המחקר מספק אמצעי יעיל לביצוע והערכה של היעילות של ליזוזטריפסיה לטיפול ב- DVT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לתוצאות המוצגות כאן, דם אנושי ורידי נמשך כדי ליצור קרישי דם לאחר אישור ועדת הבדיקה הפנימית המקומית (IRB #19-1300) והסכמה מדעת בכתב הניתנת על ידי תורמים מתנדבים24. סעיף זה מתאר פרוטוקול עיצוב להערכת יעילות ליזוזטריפסיה. הפרוטוקול מבוסס על עבודה קודמת של בולן ואח'24.

1. דוגמנות קריש

הערה: הכן את קרישי הדם בתוך 2 שבועות אבל יותר מ 3 ימים לפני יום הניסוי כדי להבטיח יציבות קריש למקסם אתנסיגה 28. הכן את קריש הדם לאחר אישור ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

  1. הכן פיפטת פסטר בורוסיליקט לאחסון הדם (ראה טבלת חומרים למפרט של הפיפטה). צינורות Borosilicate משמשים בגלל האופי ההידרופילי של החומר אשר מקדם הפעלת טסיות דם ונסיגה קריש29. לאטום את קצה הפיפטה באמצעות חימום מעל מבער בונזן.
  2. לצייר דם ורידים אנושי טרי. Aliquot סך הדם נמשך במרווחים 2 מ"ל לכל קריש הרצוי. העבירו כל 2 מ"ל אליקווט לפיפטה פסטר אחת.
    הערה: בצע את שלב 1.2 בתוך כ 3 דקות של בדיקת דם, כך הדם לא קריש לפני המעבר pipettes. כמו כן, ודא התורם המתנדב אינו על תרופות שעשויות לשנות את מפל קרישה (למשל מדללי דם או מעכבי טסיות דם).
  3. לדגור על עליות הדם בתוך פיפטות (שווה למספר קרישי הדם הנדרשים) באמבט מים במשך 3 שעות ב 37 °C (50 °F).
  4. לאחסן את pipettes במשך מינימום של 3 ימים ב 4 °C (55 °F) כדי לאפשר נסיגה של קרישי דם28. כמו קרישי לסגת, סרום יהיה נצפה לצבור בחלק העליון של קריש בתוך pipette. תגובת RT-PA של קרישי דם נשאר יציב במשך שבועיים לאחרנסיגה 28.

2. הכנת מיכלי מים

  1. מלא את מיכל המים במי אוסמוזה הפוכים. קו המשטח התחתון של הטנק עם חומר סופג אקוסטי כדי להפחית את ההשתקפות של טיפול או הדמיה פולסים אולטרסאונד. השתמש במערכת טיפול במים כדי degas ולסנן את המים כדי למזער גרעיני בועה.
    הערה: דרך אחת לסנן את המים היא שימוש במסנן מוטבע. המפרטים של התיק המשמש להפקת התוצאות הייצוגיות ניתנים בטבלת החומרים.
  2. מניחים שני גופי חימום על המשטח התחתון של המיכל. מחממים את המים ל 37 °C (37 °F) כדי להשיג את הפעילות אנזימטית lytic המרבי30.
  3. הגדר ערוץ זרימה כפי שמוצג באיור 1A. ערוץ הזרימה מורכב צינורות, כלי מודל עם תכונות חומריות וגיאומטריות המייצגות וריד איליופומורלי, מאגר לפלסמה ומזרק בקצה הדיסטלי ביותר של המאגר (שולחן חומרים). המזרק מחובר למשאבה כדי לווסת זרימה דרך הערוץ במהלך הניסוי.
  4. הטביעו ידנית את תעלת הזרימה במיכל המים כדי להביא את הערוץ לטמפרטורה פיזיולוגית במהלך שלב הסילוק/סינון/חימום (שלבים 2.1 ו-2.2).

3. הכנת תערובת פלזמה ו- RT-PA

  1. לפני יום הניסוי
    הערה: כאשר מאוחסן ב -80 °C (80 °F), פלזמה יציבה לפחות 2.5 שנים31 ו rt-PA יציב לפחות 7 שנים32. לכן, בצע את שלב 3.1 בכל עת בתקופות אלה כדי להבטיח יציבות של שני הרכיבים.
    1. לדלל את rt-PA המתקבל מיצרן בצורת אבקה ל 1 מ"ג / מ"ל במים סטריליים.
    2. Aliquot 100 μL של rt-PA מדולל לתוך צינורות צנטריפוגות 0.5 מ"ל ולאחסן אותם ב -80 °C (50 °F).
    3. Aliquot 35 מ"ל של אדם טרי קפוא סוג O פלזמה ב 50 mL צינורות צנטריפוגות. לאחסן את הצינורות ב -80 °C (50 °F).
  2. ביום הניסוי
    1. לאחזר aliquots פלזמה מהמקפיא. לאחזר aliquots רבים כמו מספר קרישי הדם להיבדק באותו יום. לטבול את aliquots קפוא באמבט מים ב 37 °C (37 °F) כדי להפשיר (~ 10 דקות).
    2. לאחר שהפלזמה הפשיר, יוצקים אותו לתוך כי הוא שטף טריפ עם מים אולטרה pure. מכסים קלות את פיו של הכיס בנייר אלומיניום כדי למנוע זיהום ומניחים את הכיס באמבט המים. אפשר רדיד אלומיניום להיות רופף מספיק כדי לאפשר לאוויר ליצור קשר עם הפלזמה.
    3. תן פלזמה שיווי משקל ב 37 °C ללחץ אטמוספרי לפחות 2 שעות.
    4. מוציאים את בקבוקוני RT-PA הקפואים ומניחים על הקרח עד הצורך, עם בקבוקון אחד לכל ניסוי.
    5. הפוך אגרוז ג'ל נמוך (2%) בבקבוק 50 מ"ל, על ידי המסת אגרוז במים אולטרה-דור. בחר את הכמות הכוללת של פתרון agarose כך כ 2 מ"ל זמין עבור כל דגימה להיות מנותח. מחממים את התערפס בבקבוקון במיקרוגל עד לקבלת מבעבע. אבטחו את הבקבוקון עם מכסה בורג עמיד למים עליו. תטביעו את הבקבוקון באמבט המים לצד הפלזמה.
      הערה: שלב זה מבטיח agarose זמין לאבטחת מקטעי קריש חשוף לניתוח היסטולוגיה בעקבות היסטוטרפסיה הסנסונציה.

4. הגדרת מקור היסטוטריפסיה ומערך הדמיה

  1. ודא שניתן לשלוט במיצבים הממונעים מסביבת זמן הריצה של פלטפורמת תיכנות, באמצעות הוראות הגעה ופקודות שסופקו על-ידי היצרן. ודא שהמנועים של המערכת מחוברים ליציאה המתאימה של המחשב עם סביבת זמן הריצה.
  2. הר את מקור ההיסטוטריפסיה במערכת המיקום הממונע כפי שמוצג באיור 1B.
  3. חבר את מקור ההיסטוטריפסיה לאלקטרוניקה המניעה שלו (למשל, מגבר הספק ומחולל פונקציות) באמצעות המחברים המתאימים (למשל, כבלי BNC) כפי שצוין על-ידי היצרן.
    הערה: ודא שניתן לשלוט באלקטרוניקה המניעה של מקור היסטוטריפסיה באמצעות סביבת זמן הריצה המשמשת בשלב 4.1.
  4. כסו את מערך ההדמיה בכיסוי בדיקה והדביקו את המערך באופן קואקסיאלי בצמצם מקור היסטוטריפסיה כפי שמוצג באיור 2. הקפד להבין את הכיוון של מישור ההדמיה ביחס לכיוון של מקור היסטוטריפסיה.
  5. חבר את מערך ההדמיה למערכת סריקת אולטרסאונד. ודא שמערכת זו יכולה לשלוט בפעולה ובהפעלה של מערך ההדמיה ולאסוף נתוני הדמיה, בהתאם לפקודות שסופקו על-ידי יצרן הסורק.
  6. הטביעו את מערך המקור/הדמיה של היסטוטריפסיה במיכל תוך כדי סילוק גיסות כפי שמוצג באיור 1A. הסר בעדינות את כל בועות האוויר באמצעות מזרק מפני השטח של מקור היסטוטריפסיה או מערך הדמיה.
    הערה: לטבול את המקור היסטוטרפסיה ואת מערך ההדמיה לחלוטין במים לפני הפעולה. הימנע מלגעת בפני השטח של מקור ההיסטוטריפסיה.
  7. השג תמונות במצב B בקצב של 20 פריימים לשנייה באמצעות מערך ההדמיה והפקודות המוכללות של הסורק. התאם את חלון ההדמיה כדי להבטיח הדמיה של המוקד של מקור היסטוטריפסיה בתמונות בזמן אמת אלה.
    הערה: ההנחה היא כי הממדים של אזור המוקד של המקור הטיפולי ידועים.
  8. הגדר את פרמטרי ההפעלה של מקור היסטוטריפסיה, כולל תדר בסיסי (למשל, 1.5 מגה-הרץ), תדירות החזרה על פעימות (למשל, 20-100 הרץ), משך הדופק (למשל, 1-20 מחזורים לדופק) ומספר פולסים כולל לכל מיקום (למשל, 100-2,000)18,23,24,33. לשנות פרמטרים אלה אם תמה קריש מספיק לא מושגת או אם פעילות הבועה משתרעת מעבר לומן של כלי המודל. כדי להגדיר פרמטרים אלה, השתמש בפרוטוקול שסופק על-ידי יצרן המקור או השתמש בפלטפורמת תיכנות שיכולה לקיים תקשורת עם המקור (שלב 4.3).
  9. באמצעות הפרוטוקול או פלטפורמת התכנות של היצרן המשמשים בשלב 4.8, הפעל את מקור היסטוטרפסיה בפרמטרים שנקבעו במים מנוטרלים בלבד, ללא כל חסימה בסביבה שמסביב. הגדל את המתח המוחל על מקור היסטוטריפסיה עד שנוצר ענן בועה.
  10. באמצעות הדמיה בזמן אמת של שלב 4.7, התאם את המיקום של מערך ההדמיה בתוך פתח מתמר הקונפוצלי עד שענן הבועה ממוקם בערך במרכז חלון התמונה. ענן הבועה הוא האזור של הפיקסלים ההיפר-choic במישור ההדמיה(איור 3). הדקו את הברגים כדי להחזיק את מערך ההדמיה בחוזקה בפתח המתמר.
    הערה: אם המערך מיושר כראוי, המיקום אזימוטאלי של ענן הבועה צריך להיות בערך 0 מ"מ במישור ההדמיה. מערך ההדמיה עשוי להקרין מעט מפני השטח הפנימיים של מקור הטיפול, ולכן מיקום הטווח של ענן הבועה עשוי להיות שונה מאורך המוקד של המקור.
  11. זהה את מיקום ענן הבועה במישור ההדמיה. הקצה את המוקד של מקור היסטוטריפסיה כמרכז ענן הבועה (איור 3).
  12. הקלט את מיקום המוקד שזוהה (שלב 4.11) בחלון ההדמיה(איור 3). דרך אפשרית לסמן את מיקום המוקד היא הצבת סמן כדי לציין את המיקום בחלון ההדמיה, אם זמין עם פלטפורמת ההדמיה.
  13. יש להפסיק את האינוזוניציה ולהגדיר את המתח המוחל על מקור היסטוטריפסיה על V 0.

5. הכנת קריש דם

  1. הסר את הקריש מן pipette על ידי חיתוך הקצה האטום עם צבת. תן לקריש להחליק לתוך צלחת פטרי יחד עם הסרום. אם הקריש אינו נסר, יש להפעיל בעדינות לחץ מהקצה השני של הפיפטה באמצעות סומק מלוחים כדי להסיר את הקריש.
  2. חותכים את הקריש לאורך של ס"מ אחד באמצעות אזמל, מכוון ליצירה אחידה מהמרכז (כלומר, הרחק מחלקים של הקריש שנוצר בחלק העליון או התחתון של הפיפטה).
  3. השתמש ניגוב ניקוי כדי כתם את החלק לחתוך של קריש בעדינות כדי להסיר נוזל עודף.
  4. באמצעות פינצטה, מניחים את מקטע הקריש בעדינות בסולם שקילה ומקליטים את המשקל.
  5. הרימו ידנית את ערוץ הזרימה ממיכל המים והסירו את כלי הדגם מערוץ הזרימה.
  6. מניחים את הקריש בכלי הדגם באמצעות פינצטה ומצמידים שוב את כלי הדגם לערוץ הזרימה.
    הערה: מוט ניילון יכול להיות ממוקם בתוך כלי המודל כדי למנוע את קריש לנוע במורד הזרם בשל הזרימה.
  7. הורידו את ערוץ הזרימה למיכל באופן כזה שהקצה הפרוקסימלי של השלב ביחס למאגר נמוך בהשוואה לצד הדיסטלי. ההסתבכות של הבמה באופן זה מונעת השמנה של בועות בחללית המודל כאשר פלזמה נמשכת דרך ערוץ הזרימה בשלב 6.1.
  8. הוסף 30 מ"ל של פלזמה למאגר באמצעות pipette ולעקוב אחר הטמפרטורה עד שהוא מגיע לפחות 36 °C (70 °F).
  9. השתמש פיפטה כדי לחלק את rt-PA (80.4 מיקרוגרם ב 30 מ"ל של פלזמה, 2.68 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך מאגר הפלזמה. מערבבים את הפלזמה עם הפיפטה כדי להבטיח חלוקה אחידה של RT-PA בתוך המאגר.

6. תפיק את ערוץ הזרימה

  1. צייר פלזמה לתוך ערוץ הזרימה מהמאגר באמצעות משאבת המזרק עד שהפלזמה ממלאת את כלי הדגם.
    הערה: אם הקריש אינו סומק עם מוט הניילון, השתמש בציורי משאבה קצרים במהירות של 60 מ"ל / דקה כדי לנסות לכפות את הפלזמה במורד הזרם של הקריש או לצייר ידנית דרך המזרק. להגביל את כמות הפלזמה נמשך בתהליך זה או למלא את המאגר באמצעות פלזמה נוספת / rt-PA כדי להבטיח 30 מ"ל של פתרון בערוץ הזרימה.
  2. באמצעות מיצובים ממונעים, ליישר את מערך ההדמיה במקביל לאורך הקריש באמצעות סקריפט הדמיה (שלב 4.7). היישור המקביל מאפשר למשתמש להבטיח מיקום נכון של קריש הדם והיעדר בועות בתוך כלי הדגם.
  3. יישר את כלי הדגם באופן ידני וחזותי ודא שאין בועות אוויר הקיימות באמצעות חלון ההדמיה (שלב 4.7).

7. הליך ניסוי

  1. טרום טיפול
    הערה: שלב זה הוא לתכנן נתיב עבור מקור היסטוטרפסיה / מערך הדמיה לחשיפה היסטוטרפסיה אחידה לאורך אורך קריש.
    1. ישר את מערך ההדמיה באמצעות הממקמים הממונעים כך שמישור ההדמיה מקביל לחתך של קריש הדם (כלומר, בניצב לכיוון המתואר בשלב 6.2).
    2. תחת הדרכה דרך חלון ההדמיה (שלב 4.7), העבר את מקור היסטוטרפסיה לקצה הפרוקסימלי של הקריש ביחס למאגר באמצעות הממקמים הממונעים. בשלב זה, להתאים את מיקום המקור היסטוטרפסיה כך נקודת המוקד המסומנת בשלב 4.12 מיישרת קו עם מרכז הקריש.
    3. קבע את נתיב ההסתה לאורך אורך הקריש. כדי להגדיר נתיב זה, להגדיר שלוש נקודות ציון לאורך הקריש (כלומר, מיקומים של המנועים שבהם פעילות בועת היסטוטרפסיה כלולה בתוך הקריש) במרווחים של 5 מ"מ. ישר את נקודות הציון כך שהתנועה הכוללת של מקור היסטוטרפסיה לאורך הנתיב היא antegrade עם זרימה במערכת (כלומר, נקודת הציון הראשונה היא בקצה הפרוקסימלי ביותר של הקריש ביחס למאגר, ונקודת הציון השלישית נמצאת במצב דיסטלי ביחס למאגר).
    4. לפני השלמת כל נקודת ציון, בדיקות אש פולסים ממקור היסטוטריפסיה עם אותם פרמטרים אינסונציה כמו שלב 4.8 אבל להפחית את החשיפה הכוללת ל 10 פולסים הכוללים. התאם את המיקום של מקור היסטוטרפסיה באמצעות מיצובים ממונעים במידת הצורך, כדי להכיל פעילות בועה בתוך הקריש.
    5. בכל נקודת אופן, שמור את מיקומי המנוע באמצעות הפקודות שסופקו על-ידי היצרן, בדומה לשלב 4.1.
  2. טיפול
    הערה: שלב זה מגדיר את ההליך לטיפול קריש לאורך אורכו על פי הנתיב המוגדר בשלב טרום הטיפול.
    1. הפעל את משאבת המזרק ב 0.65 מ"ל / דקה ולחכות מניסקוס של הפלזמה לזוז. קצב זרימה זה מחקה כמעט מוחלט של כלי כלי האיליו-פורמורלי24,34.
    2. אינטרפולציה של הנתיב שנוצר בשלב 7.1.3 עם שלבי ביניים בין נקודות הציון שנקבעו עם גודל שלב קבוע (למשל, 0.5 מ"מ). גודל השלב נבחר להיות קטן ממחצית הרוחב של אזור המוקד כפי שנמדד לאורך אורך הקריש (כיוון גובה של מערך ההדמיה). הזז את מקור ההיסטוטריפסיה באמצעות מיצבים ממונעים בכל מיקום נתיב עם פרמטרי אינסונציה המוגדרים בשלב 4.8.
    3. צג/פעילות בועת תמונה במהלך יישום פעימת היסטוטריפסיה בכל מיקום נתיב באמצעות חלון ההדמיה (שלב 4.7). מרכז את התמונה על המוקד היסטוטריפסיה עם ממדי התמונה המכסים 15 מ"מ באזימוט ובטווח. לפני היישום של פעימת היסטוטרפסיה בכל מיקום, לרכוש תמונה במצב B כדי לספק הדמיה של כלי קריש ומודל, על ידי יצירת סקריפט בפלטפורמת תכנות. ודא שקובץ ה- Script יוצר תקשורת עם הסורק באמצעות פקודות היצרן.
    4. במהלך היישום של הדופק היסטוטריפסיה, ליישם את רכישת פליטות אקוסטיות בתסריט בשלב 7.2.3 כדי ליצור תמונות cavitation פסיבי לאחר הוק35. לרכוש תמונה אחת cavitation פסיבי לאחר כל 10 פולסים טיפול. החל פיצוי רווח זמן שטוח של 50 ב 8 עומקים מצטברים עד סוף עומק ההדמיה. בחר גודל חלון רכישה מתאים כך שהאות כולו מהקריש נלכד עם אובדן מינימלי של אנרגיה עקבחלון 35.
    5. אם קיימים ענני בועה מחוץ למטרה, התאם את מיקום המתמר במקום עם המיצבים הממונעים.
      הערה: נטר גורמים מפעילים שלא נענו של מערך ההדמיה. התאם את מספר ערכות נתוני ההדמיה שנרכשו כדי להבטיח שאחסן הנתונים יושלם לפני הפעלתו לאחר מכן.

8. לאחר הליך הניסוי

  1. הרימו ידנית את כלי הדגם ממיכל המים כדי לנקז את ההזנה באמצעות כוח המשיכה. הקפד לשמור על ערוץ הזרימה מאוזן כדי למנוע את קריש לנוע במורד הזרם ולצאת מכלי המודל במהלך ניקוז.
  2. אסוף את כל ההסתעפויות לניתוח נוסף בכוס קטנה (איור 4A) על ידי ציור פתרון פלזמה מערוץ הזרימה דרך משאבת המזרק בקצב זרימה נמוך מאוד.
  3. נתק את כלי הדגם והסר את הקריש. במידת הצורך, להזריק כמות קטנה של תמיסת מלח לתוך כלי המודל כדי לחלץ בעדינות את הקריש.
  4. נגב את הקריש בדומה לשלב 1.2.3. לשקול את קריש על סולם השקילה להערכת אובדן מסת קריש.
  5. כדי לנתח את התוכן D-dimer, להוסיף 100 מ"ג של חומצה אמינוקפרואית לצינור microcentrifuge ואחריו 1 מ"ל של זלוף, ומערבבים היטב באמצעות pipette. בצעו מדיקה ערבידימטרית של לטקס כדי לכמת את ה-D-dimer בתוך הדגימה36.
  6. כדי להעריך המוליזה, להוסיף 1 מ"ל של זלוף צינורות צנטריפוגה להסתובב ב 610 x g (3,500 סל"ד) במשך 10 דקות. לשלב 0.5 מ"ל של supernatant (להתרכז) עם 0.5 מ"ל של פתרון Drabkins ולתת את התערובת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. העבירו 200 μL ללוחות היטב, כפי שמוצג באיור 4B. השתמשו בקורא לוחות כדי לקרוא ספיגה ב-540 ננומטר, איור 4C (דראקינס37).
  7. הערכה היסתולוגית
    1. חותכים קטע ממרכז הקריש של כ 2-3 מ"מ אורך עם אזמל.
    2. הוסף את המקטע לקלטת. שמור על כיוון המקטע ביחס לכיוון התפשטות הפעימה היסטטריפסיה.
    3. הוסף 2 מ"ל של תמיסת אגרוז ג'ללינג נמוכה שהוכנה בשלב 3.2.5 לקלטת כדי לתקן את הקריש במקום.
    4. תקן את המדגם ב 10% פורמלין עבור 24 שעות. מניחים את המדגם ב 70% אלכוהול לאחר 24 שעות ולבצע hemotoxylin-eosin סטנדרטי מכתים38.

9. ניתוח תמונת cavitation פסיבי

  1. לעבד את האותות שנרכשו ממערך ההדמיה במהלך עירור היסטוטריפסיה (שלב 7.2.4) באמצעות אלגוריתם המבוסס על beamformer Capon החזק39 כדי ליצור תמונה של פליטות אקוסטיות שנוצרו על ידי ענן הבועה בכל מיקום טיפול.
    הערה: כדי ליצור תמונות כמותיות, בצע את השלבים המתוארים בהוורת ' ואח'35. אחרת, כל ערך פיקסל בתמונה אמור לייצג את האנרגיה האקוסטית היחסית של ענן הבועה (יחידות של V2) בכל מיקום מתאים.
  2. פלח את התמונה במצב B בשלבים 7.2.3 כדי להבחין בין הפיקסלים המייצגים את קריש הדם וכלי הדגם.
  3. יש לרשום במשותף את תמונת cavitation הפסיבית עם התמונה במצב B כפי שמוצג באיור 5B. לסכם את האנרגיה האקוסטית בתוך הקריש על פני תקופת החשיפה35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מדגיש את הפרטים של מידול קריש ורידים, ליזוזטריפסיה להפרעות קריש, והדמיה אולטרסאונד במבחנה של DVT. ההליך המאומץ מדגים את הצעדים הדרושים להערכת הפרעות קריש עקב ההשפעות המשולבות של פעילות ענן הבועה של rt-PA והיסטוטרפסיה. ההתקנה הספסל נועד לחקות את המאפיינים של וריד iliofemoral ורידים. איור 1A מציג כלי מודל בעל תכונות אקוסטיות, מכניות וגיאומטריות של הווריד האיליו-פיומורלי. הקריש ממוקם בתוך כלי הדגם כדי לחקות פקקת אוסמת חלקית. קריש הדם מנוצל בפלזמה וב-rt-PA שנמשך ממאגר בקצב של 0.65 מ"ל/דקה. קצב זה עולה בקנה אחד עם קצב זרימה איטי בכלי34חנוק מאוד .

מתמר ממוקד אליפטית בתדר בסיסי של 1.5 מגה-הרץ עם ציר ראשי של 9 ס"מ, ציר משני של 7 ס"מ ואורך מוקד של 6 ס"מ(איור 2A)מותקן במערכת המיקום כפי שצוין באיור 1B. מערך הדמיה מכוסה ג'ל אולטרסאונד וכיסוי לטקס (איורים 2B,C) מותקן באופן קואקסיאלי עם המתמר כפי שמוצג באיור 1A באמצעות פתח במרכז המקור היסטטריפסיה. הממקמים הממונעים שימשו לתרגום מערך מתמר/הדמיה טיפולי לאורך אורך הקריש בתוך כלי הדגם (איור 1). עם יישום של מתח מספיק למקור היסטוטריפסיה, ענן בועה נוצר באזור המוקד של המתמר ומדמיינת באמצעות הדמיית אולטרסאונד, כפי שמוצג באיור 3. מיקום המוקד מוגדר כמרכז ענן הבועה באמצעות מישור ההדמיה (שלבים 4.10-4.11).

איור 4A מראה זלוף שנאסף עבור שני תנאי טיפול שונים. הכיס המסומן כבקרה מכיל זלוף של קריש שנחשף לפלסמה בלבד. הכיס השני המסומן כמטופל מכיל את זלוף של קריש ליזוטריפסיה מטופל. הזילוף שנאסף משמש להערכת תוכן ההמוגלובין (מטרי המוליזה) ו- D-dimer (מטרי של פיברינוליזה) באמצעות עבירות כפי שצוין בפרוטוקול. ההבדל בצבע של perfusates מציין שונות בריכוז המוגלובין, אשר ניתן לכמת באמצעות ספיגה אופטית. הקשר בין ערך הספיגה לריכוז המוגלובין יכול להיקבע באמצעות עקומת כיול. פתרונות עם תוכן המוגלובין ידוע הנע בין 0 (מדידה ריקה) ל 180 מ"ג / מ"ל ממוקמים בצלחת הבאר וספיגה נקבעת משולש באמצעות קורא הלוחות (איור 4B,C). מגבלת הספיגה העליונה של קורא הלוח עשויה להשתנות וייתכן שלא ידועה מראש להכנת הפתרונות בצלחת הבאר. ככזה, ריכוזי המוגלובין עד 180 מ"ג /מ"ל מיוצרים בצלחת הבאר, איור 4B. עם זאת, קורא הלוחות המשמש כאן יכול לקרוא ספיגה לריכוזים של עד 23 מ"ג/מ"ל בלבד, איור 4C.

איור 5A מציג הדמיה של קריש הדם בתוך כלי הדגם באמצעות הדמיה במצב B לפני חשיפה להיסטוטרפסיה כמפורט בשלב 7.2.3. תמונה זו נרכשת כדי לקבוע את מיקום הקריש עבור פילוח של תמונת cavitation פסיבי. איור 5B מציג את תמונת cavitation הפסיבית הרשומה בשיתוף עם התמונה במצב B שנרכשה לפני חשיפה להיסטוטריפסיה. נתון זה מאשר כי אנרגיה אקוסטית כלולה בעיקר בתוך קריש במהלך חשיפה היסטוטרפסיה.

הפרעות קריש אופייניות עקב היסטוטרפסיה וליטיק מצוינות באיור 6. איור 6A,B מציג את תמונות הקריש שטופלו בליסטריפיה, בהתאמה. עבור דגימות שנחשפו להיסטוטרפסיה, ההפרעה מוגבלת בעיקר למרכז קרישי הדם, בהתאם למיקומים הנצפים של פעילות הבועה במעקב עם הדמיית cavitation פסיבית (איור 5B). עם זאת, עם תוספת של ליטיק, אובדן המוני מתרחש גם באזורים קרובים יותר לפריפריה של קריש. ההשערה היא כי אובדן מסה נוסף זה נובע ערבוב נוזלים משופרת של ליטיק תחת פעילות בועה. ערבוב נוזלים מגביר את עומק ההפצה והחדירה של הטיק לקריש הדם. מאז ליטיק אחראי על פיברינוליזה40, אובדן המסה גדל. פיברינוליזה ניתן לכמת על ידי מדידת התוכן D-dimer ב perfusate41.

Figure 1
איור 1: התקנה ניסיונית עבור ליזוטריפסיה של קריש דם אנושי. (A)רכיבי ההתקנה הם (1) מקור היסטוטרפסיה ממוקד עם גיאומטריה אליפטית, (2) מערך הדמיה מכוסה לטקס, (3) כלי מודל המחובר לערוץ זרימה, (4) ערוץ זרימה, (5) מאגר, (6) חומר סופג אקוסטי, (7) גוף חימום, ו - (8) מיכל מים מלא במי אוסמוזה הפוכים מפורסמים ומחוממים. הממד הזימוטי של מישור ההדמיה מאונך לממדים הגבוהים והטווחיים (אל הדף). (B)מקור ההיסטוטריפסיה רכוב על מערכת המיקום הממונעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מקור אולטרסאונד ורכיבי הדמיה. תמונות זום בודדות של (A)ממוקד מקור היסטוטריפסיה, (B) מערך הדמיה, ו (C) מערך הדמיה עם ג'ל אולטרסאונד וכיסוי לטקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ענן בועה היסטטריפסיה דמיינו באמצעות מערך הדמיה. ענן בועה נוצר באזור המוקד של מקור היסטוטריפסיה ומצומן באמצעות מערך הדמיה. המוקד הייעודי, המוצג כצלב, נשמר לתכנון הטיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כימות המוגלובין ששוחרר עקב תמוגת קריש דם. (A)דגימות זלוף שנאספו בעקבות מחקר בקרה עם פלזמה בלבד (ללא היסטוטרפסיה או ליטיק), וזרוע הטיפול, היסטוטרפסיה (למשל, לחץ שלילי שיא שיא של 35 MPa, משך דופק 5 מחזורים, תדירות בסיסית של 1.5 MHz) וחשיפה ליטית של 2.68 מיקרוגרם/מ"ל. (B)צלחת המכילה דילול של ריכוזי המוגלובין ידועים הנעים בין 180 מ"ג / מ"ל (שורה עליונה, בפינה השמאלית ביותר) ל 0 מ"ג / מ"ל (שורה תחתונה, הפינה הימנית ביותר). ראש החץ מצביע על הפחתת ריכוז ההמוגלובין. (C)דגימות אלה משמשות ליצירת עקומה סטנדרטית לכימות המוגלובין המיוצר עקב חשיפה היסטוטרפסיה באמצעות ספקטרופוטומטריה. עקומת ספיגה עבור ריכוזי המוגלובין הנעים בין 0 ל 23 מ"ג / מ"ל מתקבלת בשל המגבלה של קורא הלוח בניתוח ריכוזים גבוהים יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תמונות של קריש הדם במהלך הטיפול. (A)תמונה במצב B שנרכשה לפני תחילת הדופק הטיפולי המציגה את מיקום הקריש בתוך כלי הדגם. (B)הדמיה פוסט הוק של פליטת אנרגיה פסיבית מחושבת מהדמיית cavitation פסיבי המוצגת במפת צבע חמה הרשומה בשיתוף עם תמונת מצב B של הקריש שנרכש לפני יישום פעימת היסטוטרפסיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: היסתולוגיה של קריש הדם בתנאי טיפול שונים. (A)בקרה על קריש דם ללא טיפול. (B)קריש מטופל עם ליזוטריפסיה (למשל, 35 MPa שיא לחץ שלילי, משך דופק מחזור יחיד, תדר בסיסי 1.5 MHz). פעימת היסטוטריפסיה הופצה מלמעלה למטה בתמונה זו. הנתיב למקור היסטוטרפסיה לאורך הקריש (כלומר, מאונך למישור התמונה המוצגת כאן) מוגדר בשלב 7.2.3. קנה המידה של המיקרוגרפים הוא 2 מ"מ. שים לב כי מידת הפרעת קריש מושגת כאן יופחת לעומת תוכניות אינסונציה עם משך דופק ארוך יותר24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצע מציג מודל לכימות יעילות הטיפול של ליזוטריפסיה. בעוד הפרטים העיקריים נדונו, ישנם היבטים קריטיים מסוימים שיש לקחת בחשבון להצלחת פרוטוקול זה. הפעילות האנזימטית של rt-PA יש תלות בטמפרטורת ארניוס30. הטמפרטורה היא גם גורם תורם למהירות הקול במים וברקמות, ושינויים בטמפרטורה יכולים לגרום לשינויים קלים בגיאומטריה של אזור המוקד. לכן, טמפרטורת המים צריך להיות מוסדר בקפידה ב 37 °C (50 °F). המינון של rt-PA המשמש בפרוטוקול (2.68 מיקרוגרם / מ"ל) עולה בקנה אחד עם זה המועסק קלינית עבור אסטרטגיות פקקת פרמקומכניות אחרות42. בשלב 5.8, 30 מ"ל של פלזמה מועבר למאגר ואילו aliquot 35 מ"ל הוא ציין בשלב 3.1.3. פלזמה נוספת זו מהווה אובדן בפלזמה עקב אידוי במהלך שעות כאשר התחמם ל 37 °C עבור שיווי משקל ללחץ אטמוספרי.

אורך המוקד, רוחב הצמצם והתדירות של מתמר הטיפול מכתיבים את גודלו ועומקו של אזור המוקד. לכן, המתמר צריך להיבחר כך מאפיינים אלה ליישר עם הקוטר ואת העומק של כלי היעד (למשל וריד הירך: 2-4 ס"מ בעומק 0.6-1.2 ס"מ קוטר)43. היקף אבלציה מכנית מוגבל להיקף ענן הבועה. לכן, הבנה של תפקיד הפרמטרים insonation לשחק בשינוי התנהגות ענן בועת היסטוטריפסיה היאקריטית 33,44,45. יש לבחור גם את התדירות ואת כוחו של השדה האקוסטי תוך דגש על גודל ההחתה עקב חומרים בינוניים ומתווכים (למשל, כלי מודל). כדי להבטיח כליאה של פעילות בועה עם כלי היעד, יש לבחור חלון הדמיה מתאים כדי לפקח על אזור המוקד. הפרמטרים התפעוליים של המתמר יש לבחור כדי למנוע את ההשפעות היעד תוך מקסום הפרעה קריש מכני. בפרוטוקול זה, אובדן המוני נחשב למדד עיקרי של יעילות הטיפול. עליות באובדן המוני נצפו כמו הלחץ השלילי שיא או משך הדופק היסטוטריפסיה גדלים24,46, עם אובדן מסה נצפה מקסימלית של 94%. נוכחות של קריש שיורית לזרועות טיפול נחקרת מאפשרת השוואה של יעילות טיפולית. עם זאת, תוכניות אינסונציה כדי להבטיח הסרה מוחלטת של פקקת ניתן גם להמציא.

העכבה האקוסטית (כ 1.58 MRayl47,48) ואת המאפיינים הגיאומטריים (0.6-1.2 ס"מ קוטר43)של כלי המודל צריך להיות נציג של vasculature הוורידים iliofemoral (ראה טבלה של חומרים לפרטים). Polydimethylsiloxane ופוליאוריטן הם חלק מהחומרים האחרים המתאימים לדגמן את המערכת הוורירית בהתבסס על תכונותיהם האקוסטו-מכני. בשלב 7, חשוב להסיר את כל בועות האוויר מכלי הדגם כדי להימנע מהגנה על קריש הדם מפני חשיפה היסטוטרפסיה. עבור כלי מודל של חומר הידרופובי, ענני בועה עשויים להיווצר באופן מועדף ליד דופן כלי הדם במקום מרכז הקריש. לכן, ניטור רציף של ענן הבועה צריך להיעשות במהלך הטיפול באמצעות הדמיית אולטרסאונד, ואת המתמר צריך להיות מחדש במידת הצורך. יש לערוך מחקרי פיילוט כדי לקבוע את הפרמטרים של הסונטוטרפסיה (למשל, משך הדופק ולחץ השיא) המשיגים את הפרעת קריש הדם המיועדת הסופית.

מערך ההדמיה משמש ללכידת תמונות במצב B ותמונות cavitation פסיביות להדמיית טיפול ולכימות פעילות הבועה. הדמיה במצב B מאפשרת הדמיה של כלי המודל ואת קריש הדם, והדמיה פסיבית cavitation מודד את האנרגיה של פעילות הבועה הקשורה אבלציה קריש24,49. רוחב הפס של מערך ההדמיה צריך ליישר קו עם פעילות ענן הבועה הרצויה עם יחס אות לרעש גבוה. לקבלת אותות פס רחב גרידא הקשורים לקריסה אינרציאלית של בועות בתוך הענן, רוחב הפס של המערך לא צריך לחפוף עם התדירות הבסיסית של המתמר50,51. פולסים היסטוטריפסיה הם מאוד לא ליניארי52, וסביר להניח כי הרמוניות של התדר הבסיסי יהיה נוכח אות שהתקבל. מערכת ההדמיה צריכה להיות מתוכנתת להפעיל על סמך זמן הטיסה הידוע של פעימת היסטוטרפסיה מהמקור לאזור המוקד כדי להבטיח איסוף של נתוני הדמיית cavitation פסיביים מלאים לאורך כל ההסתה. לאחר מכן יש לעבד אותות אלה לאחר ההוג כפי שנדון בשלבים 7.2.3 ו- 9 של הפרוטוקול.

יש לציין כי כמות המוליזה רגישה לטיפול של קריש הדם. לכן, יש לנקוט בזהירות כדי למזער את הנזק לקריש לפני הטיפול. כדי להבטיח רבייה, מידול קריש (שלב 1) וזמן טרום טיפול (שלבים 6 ו -7.1) צריך להיות זהה עבור כל קרישי הדם שטופלו עם או בלי חשיפה היסטוטרפסיה. בשלב שלאחר הטיפול של הערכת המוליזה, יש לציין כי פלזמה יש ספיגה משלה. לכן, דילול המשמש ליצירת עקומות סטנדרטיות (למשל, ספיגה אופטית לעומת המוגלובין) צריך להיווצר באמצעות אותו נוזל המשמש את perfusate בערוץ הזרימה (למשל, במחקר זה, פלזמה שימשה כדילול כדי ליצור עקומות סטנדרטיות).

פרוטוקול זה נועד לספק התקנה benchtop כדי לאמוד את היעילות של ליזוזטריפסיה לטיפול קרישי דם שלמים אנושיים. ישנן מגבלות מסוימות המתעוררות בשל האופי במבחנה של ההקמה. קרישי הדם החריפים המשמשים לפרוטוקול זה כללו בעיקר תאי דם אדומים ופיברין, מה שהופך את הגישה של ליזוטריפסיה יעילה עבור DVT. עם זאת, בשלבים מאוחרים יותר של תרומבוס עשוי לפתח רשת קולגנית נוקשה53 שעשויה להתנגד לטיפול ליזוטריפסיה בשל האופי הספציפי לפיברין של rt-PA. כאשר מטפלים ב- vivo, נקודת הקצה הקלינית העיקרית ליעילות הטיפול היא שיקום הזרימה. אובדן המוני היה מדד עיקרי ליעילות הטיפול בפרוטוקול במבחנה המתואר כאן. למרות הזרימה לא הוערך בפרוטוקול זה, הדמיית דופלר צבע ניתן לשלב בנוסף יחד עם הדמיית cavitation פסיבי בשלב 7.2.4 כדי לפקח על שיקום זרימה. ההתקנה בפרוטוקול זה משתמשת בקצב זרימה קבוע, המחקה את קצב הזרימה בכלי ספינה חנוק מאוד, במהלך כל הטיפול בשלב 7.2. In vivo, זרימת כלי הדם תגדל ככל שהקריש מתפורר במהלך הטיפול. גיסת ההדגשה הנוספת הקשורה לזרימה מוגברת תהדגיש את פרופיל השפלת קריש הדם54. אין אפשרות לברר את ההשפעות מחוץ למטרה של In vivo במערך זה, כגון דימום עקב ניהול מערכתי של ליטיק55, נזק לקיר כלי הדם או vasospasm עקב פעילות ענן בועה22. האופי במבחנה של מחקר זה גם מגביל את היכולת להעריך תוצאות לטווח ארוך, כגון טפיחה כלי או פקקת מחדש לאחר הטיפול. הממשל של ליטיק במחקר זה חיקה תרומבוליטיקה מערכתית, ואילו ליטיקים מכוונים צנתר הוא ההתערבות המועדפת על פקקת ורידים7,14. הנחיית רקמות יכולה להשפיע על תחום ההיסטוטריפסיה ועל איכות ההדמיה למחקרי ויוו, ואילו כאן הנתיב האקוסטי הוא בעיקר דרך מים מנוטרלים. עיבוד נתוני פליטת cavitation עם beamformer קפון חזק (שלב 9 של הפרוטוקול) הוא יקר מבחינה חישובית ונערך כבוי עבור ניתוח פוסט הוק. ניתן להפעיל קורות אחרות (למשל, עיכוב וסכום35 או ספקטרום זוויתי56) לחלופין כדי לספק משוב בזמן אמת, אם כי ברזולוציית טווח מופחתת.

לסיכום, פרוטוקול זה מציג גישה לא פולשנית להשגת תרומבוליזה של ורידים עמוקים של קרישי דם אנושיים. הפרוטוקול קובע הליך נוח וקל לשכפול למידול קרישי דם, טיפול בהם עם ליזוטריפסיה והדמיה סימולטנית במהלך הטיפול. ניתן להשתמש בשלבי הפרוטוקול המציין יצירת ענן בועה היסטוטרפסיה, תכנון טיפול והדרכה תמונה כדי לחקור בטיפולים במבחנה של גידול בשד, גידול בלבלב, והיפרפלזיה שפירה של הערמונית, שם הוכח כי היסטוטרפסיה יעילה יותר בהשוואה להליכים סטנדרטיים57,58. השימוש rt-PA בפרוטוקול זה ניתן להכליל תרופות אחרות או נשאי סמים המשמשים לטיפול בגידולים כאלה, יחד עם היסטוטריפסיה כדי להגדיל את היעילות lytic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, גרנט R01HL13334. המחברים רוצים להודות לד"ר קווין הוורת' על שסייע לבדיקה של דרבקין ולד"ר ויקטור בולן על תמיכתו בעיצוב הפרוטוקול. המחברים מודים גם לד"ר אדם מקסוול על הדרכתו בעיצוב מקור היסטוטריפסיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 172 היסטוטרפסיה ליזוטריפסיה תרומבוליזה המוליזה פקקת ורידים עמוקים הדמיית קוויטציה פסיבית אולטרסאונד ממוקד cavitation אקוסטי
מערכת במבחנה לאמוד את היעילות התרומבוליטית של היסטוטרפסיה וסם ליטיק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter