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Bioengineering

हिस्टोट्रिप्सी और एक Lytic दवा की थ्रोम्बोलिटिक प्रभावकारिता गेज करने के लिए एक इन विट्रो सिस्टम

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

गहरी नस थ्रोम्बोसिस के उपचार के लिए हिस्टोट्रिप्सी-एडेड लाइटिक डिलीवरी या लाइसोट्रिप्सी का विकास किया जा रहा है। इस संयोजन चिकित्सा की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए यहां एक इन विट्रो प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है। थक्का मॉडल, छवि मार्गदर्शन, और उपचार प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए मुख्य प्रोटोकॉल पर चर्चा कर रहे हैं ।

Abstract

गहरी नस थ्रोम्बोसिस (डीवीटी) एक वैश्विक स्वास्थ्य चिंता का विषय है। महत्वपूर्ण अवरोधों के लिए पोत पुनर्नैनाइजेशन प्राप्त करने के लिए प्राथमिक दृष्टिकोण कैथेटर-निर्देशित थ्रोम्बोलिटिक्स (सीडीटी) है। कास्टिक दुष्प्रभावों को कम करने और सीडीटी, एडजुवेंट और वैकल्पिक दृष्टिकोणों से जुड़े लंबे उपचार के समय के विकास के अधीन हैं। ऐसा ही एक दृष्टिकोण हिस्टोट्राइप्सी है, जो बुलबुला क्लाउड न्यूक्लियेशन के माध्यम से ऊतक को त्यागने के लिए एक केंद्रित अल्ट्रासाउंड थेरेपी है। प्री-क्लीनिकल अध्ययनों ने थक्का क्षरण के लिए हिस्टोट्रिप्सी और थ्रोम्बोलिटिक्स के बीच मजबूत तालमेल का प्रदर्शन किया है। इस रिपोर्ट में हिस्टोट्राइप्सी-एडेड थ्रोम्बोलिटिक थेरेपी या lysotripsy की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक बेंचटॉप विधि की रूपरेखा तैयार की गई है ।

ताजा मानव शिराक रक्त से निर्मित थक्के को एक प्रवाह चैनल में पेश किया गया था जिसके आयाम और एसीोस्टो-मैकेनिकल गुण एक iliofemoral नस की नकल करते हैं। चैनल प्लाज्मा और lytic recombinant ऊतक प्रकार प्लाज्मिनोजेन एक्टिवेटर के साथ perfused था । फीमोरल वेनस क्लॉट्स के उपचार के लिए डिज़ाइन किए गए एक केंद्रित अल्ट्रासाउंड स्रोत के साथ थक्के में बुलबुला बादल उत्पन्न हुए थे। थक्के की लंबाई के साथ स्रोत फोकस का अनुवाद करने के लिए मोटर चालित स्थितिकमान का उपयोग किया गया था। प्रत्येक इनसोनेशन स्थान पर, बुलबुले के बादल से ध्वनिक उत्सर्जन निष्क्रिय रूप से दर्ज किए गए थे, और निष्क्रिय कैविटेशन छवियों को उत्पन्न करने के लिए मुस्कराते हुए। उपचार प्रभावकारिता को मापने के लिए मैट्रिक्स में थक्का द्रव्यमान हानि (समग्र उपचार प्रभावकारिता), और परफ्यूसेट में डी-डाइमर (फाइब्रिनोलिसिस) और हीमोग्लोबिन (हीमोलिसिस) की सांद्रता शामिल थी। विट्रो डिजाइन में इसकी सीमाएं हैं, जिनमें वीवो साइड इफेक्ट्स में आकलन करने के लिए साधनों की कमी या थक्के के रूप में प्रवाह दर में गतिशील परिवर्तन शामिल हैं। कुल मिलाकर, सेटअप डीवीटी के इलाज के लिए हिस्टोट्रिप्सी-आधारित रणनीतियों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है।

Introduction

थ्रोम्बोसिस अन्यथा स्वस्थ रक्त वाहिका में थक्के बनने की स्थिति है जो परिसंचरण में बाधा डालती है1,2. वेनस थ्रोम्बोएम्बोलिज्म की वार्षिक स्वास्थ्य देखभाल लागत $ 7-10 बिलियन है, जिसमें संयुक्त राज्य अमेरिका में 375,000-425,000 मामलेहैं। पल्मोनरी एम्बोलिज्म पल्मोनरी धमनी की बाधा है और वेनस थ्रोम्बोएम्बोलिज्म का सबसे गंभीर परिणाम है। पल्मोनरी बाधा का प्राथमिक स्रोत गहरी नस थ्रोम्बी है, मुख्य रूप से इलियोफेमोरल वेनस सेगमेंट4,5,6से। गहरी नस थ्रोम्बोसिस (डीवीटी) में फेफड़े के अवरोधों के अलावा अंतर्निहित सीक्वेल है, जिसमें दीर्घकालिक जटिलताएं होती हैं जिसके परिणामस्वरूप दर्द, सूजन, पैर के छाले और अंग विच्छेदन7,8,9होते हैं। महत्वपूर्ण अवरोधों के लिए, कैथेटर निर्देशित थ्रोम्बोलिटिक्स (सीडीटी) पोत पुनर्नैनाइजेशन10के लिए अग्रिम दृष्टिकोण हैं। सीडीटी का परिणाम कई कारकों पर निर्भर करता है, जिनमें थ्रोम्बस आयु, स्थान, आकार, संरचना, एटियोलॉजी और रोगी जोखिम श्रेणी11शामिल हैं। इसके अलावा, सीडीटी संवहनी क्षति, संक्रमण, रक्तस्राव जटिलताओं, और लंबे समय तक उपचार समय10से जुड़ा हुआ है। अगली पीढ़ी के उपकरणों का उद्देश्य मैकेनिकल थ्रोम्बेक्टॉमी को थ्रोम्बोलिटिक्स (यानी फार्माकोनिकल थ्रोम्बेक्टॉमी)12, 13के साथ जोड़ना है। इन उपकरणों का उपयोग lytic खुराक कम करने के लिए कम रक्तस्राव जटिलताओं के लिए अग्रणी है, और सीडीटी की तुलना में12,13,14 छोटा उपचार समय । ये उपकरण अभी भी रक्तस्रावी दुष्प्रभावों और पुरानी थ्रोम्बी15को अधूरा हटाने के मुद्दों को बनाए रखते हैं। इस प्रकार एक एडजुवेंट रणनीति की आवश्यकता होती है जो कम रक्तस्राव जटिलताओं के साथ थ्रोम्बस को पूरी तरह से हटा सकती है।

एक संभावित दृष्टिकोण हिस्टोट्रिप्सी-एडेड थ्रोम्बोलिटिक उपचार है, जिसे lysotripsy के रूप में जाना जाता है। हिस्टोट्रिप्सी एक गैर-इनवेसिव उपचार मोडलि मोडली है जो ऊतकों में बुलबुले के बादलों को नाभिित करने के लिए केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग करता है16। बबल गतिविधि एक्सोजेनस नाभिक के माध्यम से उत्पन्न नहीं होती है, बल्कि अल्ट्रासाउंड दालों के आवेदन से ऊतकों के लिए नाभिक आंतरिक को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त तनाव के साथ होती है, जिसमें थक्का17,18शामिल हैं। बुलबुले के बादल का यांत्रिक दोलन थक्के को तनाव प्रदान करता है, संरचना को एककोशिकीय मलबे में विघटित करता है19। हिस्टोट्रिप्सी बबल एक्टिविटी वीवो और इन विट्रो20 , 21 , 22दोनों में मुकर गए और अनट्रेक्ट रक्त के थक्केकाप्रभावी क्षरण प्रदान करतीहै। पूर्व अध्ययनों में23,24 ने दर्शाया है कि हिस्टोट्रिप्सी और लिस्टिक रेकॉम्बिनेंट टिश्यू-प्रकार प्लाज्मिनोजेन एक्टिवेटर (आरटी-पीए) का संयोजन अकेले lytic या हिस्टोट्रिप्सी की तुलना में उपचार प्रभावकारिता को काफी बढ़ाता है। यह परिकल्पना की जाती है कि हिस्टोट्रिप्सी बबल गतिविधि से जुड़े दो प्राथमिक तंत्र बेहतर उपचार प्रभावकारिता के लिए जिम्मेदार हैं: 1) बढ़ी हुई लाइटिक डिलीवरी के कारण फाइब्रिनोलिसिस में वृद्धि हुई है, और 2) थक्के के भीतर लाल रक्त कोशिकाओं का हीमोलिसिस। थक्का द्रव्यमान का थोक लाल रक्त कोशिकाओं24से शामिल है, और इसलिए, एरिथ्रोसाइट क्षरण पर नज़र रखने के नमूने के ablation के लिए एक अच्छा किराए है। अन्य गठित थक्के तत्वों की भी संभावना हिस्टोरिप्सी बबल गतिविधि के तहत विघटित हो जाती है लेकिन इस प्रोटोकॉल में विचार नहीं किया जाता है।

यहां, वीवीटी इन विट्रो के साथ एलियोट्रिप्सी के इलाज के लिए एक बेंचटॉप दृष्टिकोण रेखांकित किया गया है। प्रोटोकॉल हिस्टोरिप्सी स्रोत के महत्वपूर्ण ऑपरेटिंग मापदंडों, उपचार प्रभावकारिता का आकलन, और छवि मार्गदर्शन का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल में एक iliofemoral शिराद खंड की नकल करने और मानव पूरे रक्त के थक्के का निर्माण करने के लिए एक प्रवाह चैनल डिजाइन करना शामिल है। प्रायोगिक प्रक्रिया प्रवाह चैनल में रखे थक्के के साथ हिस्टोट्रिप्सी एक्सपोजर प्राप्त करने के लिए हिस्टोट्रिप्सी स्रोत और इमेजिंग सरणी की स्थिति को रेखांकित करती है। थक्का व्यवधान प्राप्त करने और ऑफ-टारगेट बबल गतिविधि को कम करने के लिए प्रासंगिक इनसोनेशन पैरामीटर परिभाषित किए गए हैं। बबल गतिविधि के मार्गदर्शन और मूल्यांकन के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग24दर्शाया गया है । थक्के जन हानि, डी-डाइमर (फाइब्रिनोलिसिस), और हीमोग्लोबिन (हीमोलिसिस) जैसे उपचार प्रभावकारिता की मात्रा निर्धारित करने के लिए मैट्रिक्स23,24,25,26, 27बताए गए हैं। कुल मिलाकर, यह अध्ययन डीवीटी के इलाज के लिए lysotripsy की प्रभावकारिता को निष्पादित करने और उसका आकलन करने के लिए एक प्रभावी साधन प्रदान करता है।

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Protocol

यहां प्रस्तुत परिणामों के लिए, शिरा मानव रक्त स्थानीय आंतरिक समीक्षा बोर्ड (आईआरबी #19-1300) से अनुमोदन के बाद थक्के बनाने के लिए तैयार किया गया था और स्वयंसेवक दाताओं द्वारा प्रदान की गई सूचित सहमति24। यह खंड एक डिजाइन प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है ताकि एलसोट्रीप्सी प्रभावकारिता का आकलन किया जा सके। प्रोटोकॉल24के बायलेन एट अल द्वारा पिछले काम पर आधारित है ।

1. क्लॉट मॉडलिंग

नोट: थक्के स्थिरता सुनिश्चित करने और पीछे हटने 28 को अधिकतम करने के लिए प्रयोग के दिन से 3 दिन पहले2सप्ताह के भीतर थक्के तैयार करें । स्थानीय संस्थागत समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन के बाद थक्का तैयार करें।

  1. रक्त के भंडारण के लिए बोरोसिलिकेट पाश्चर पिपेट तैयार करें (पिपेट के विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें)। बोरोसिलिकेट ट्यूब का उपयोग उस सामग्री की हाइड्रोफिलिक प्रकृति के कारण किया जाता है जो प्लेटलेट सक्रियण और थक्का वापसी को बढ़ावा देता है29. एक Bunsen बर्नर पर हीटिंग के माध्यम से पिपेट की नोक सील ।
  2. ताजा मानव शिरा रक्त आकर्षित करें। एलिकोट कुल रक्त वांछित थक्के प्रति 2 एमएल वेतन वृद्धि में खींचा। प्रत्येक 2 एमएल एलिकोट को एक पाश्चर पिपेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: रक्त ड्रा के लगभग 3 मिनट के भीतर चरण 1.2 निष्पादित करें ताकि पिपेट में स्थानांतरित करने से पहले रक्त थक्का न बन जाए। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करें कि स्वयंसेवक दाता किसी भी दवा पर नहीं है जो थक्के झरना (जैसे रक्त पतले या प्लेटलेट अवरोधक) को बदल सकता है।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए पानी के स्नान में पिपेट (आवश्यक थक्के की संख्या के बराबर) के भीतर रक्त एलिकोट्स को इनक्यूबेट करें।
  4. 28 थक्के के पीछे हटने की अनुमति देने के लिए पिपेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम3दिनों के लिए स्टोर करें। जैसे ही थक्के वापस लेते हैं, सीरम को पिपेट के भीतर थक्के के शीर्ष पर जमा करने के लिए मनाया जाएगा। थक्के की आरटी-पीए प्रतिक्रिया28के बाद 2 सप्ताह के लिए स्थिर बनी हुई है ।

2. पानी की टंकी तैयार करने

  1. पानी की टंकी को रिवर्स ऑस्मोसिस पानी से भरें। चिकित्सा या इमेजिंग अल्ट्रासाउंड दालों के प्रतिबिंब को कम करने के लिए एक ध्वनिक अवशोषित सामग्री के साथ टैंक की निचली सतह लाइन। बबल न्यूक्लियी को कम करने के लिए पानी को डेगास और फ़िल्टर करने के लिए पानी हैंडलिंग सिस्टम का उपयोग करें।
    नोट: पानी को फ़िल्टर करने का एक तरीका इनलाइन फ़िल्टर का उपयोग कर रहा है। प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बैग के विनिर्देश सामग्री तालिकामें दिए गए हैं।
  2. टैंक की निचली सतह पर दो हीटिंग तत्व रखें। अधिकतम लिटिक एंजाइमेटिक गतिविधि 30 को प्राप्त करने के लिए पानी को37.3डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. एक प्रवाह चैनल सेटअप के रूप में चित्रा 1Aमें दिखाया गया है । प्रवाह चैनल में टयूबिंग, सामग्री और ज्यामितीय गुणों के साथ एक मॉडल पोत होता है जो एक iliofemoral नस के प्रतिनिधि, प्लाज्मा के लिए एक जलाशय, और जलाशय के सबसे अंत(सामग्री की तालिका)पर एक सिरिंज। सिरिंज प्रयोग के दौरान चैनल के माध्यम से एक प्रवाह को विनियमित करने के लिए एक पंप से जुड़ा हुआ है ।
  4. डिगैसिंग/फिल्टरिंग/हीटिंग स्टेज (चरण 2.1 और 2.2) के दौरान चैनल को शारीरिक तापमान पर लाने के लिए पानी की टंकी में प्रवाह चैनल को मैन्युअल रूप से जलमग्न कर दें।

3. प्लाज्मा और आरटी-पीए मिश्रण की तैयारी

  1. प्रयोग दिवस से पहले
    नोट: जब -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, प्लाज्मा कम से कम 2.5 साल31 के लिए स्थिर है और आरटी-पीए कम से कम 7 साल32के लिए स्थिर है। इसलिए, दो घटकों की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए इन अवधियों के भीतर किसी भी समय चरण 3.1 निष्पादित करें।
    1. पाउडर रूप में एक निर्माता से बाँझ पानी में 1 मिलीग्राम/एमएल के लिए प्राप्त आरटी-पीए पतला ।
    2. एलिकोट 100 μL पतला आरटी-पीए 0.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब्स में और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब्स में ह्यूमन फ्रेश-फ्रोजन टाइप ओ प्लाज्मा का 35 एमएल अलीकोट। ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. प्रयोग दिवस पर
    1. फ्रीजर से प्लाज्मा एलिकोट्स को पुनः प्राप्त करें। उस दिन परीक्षण किए जाने वाले थक्के की संख्या के रूप में कई एलिकोट्स को पुनः प्राप्त करें। गल (~ 10 मिनट) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में जमे हुए aliquots विसर्जित कर दिया।
    2. एक बार प्लाज्मा गल गया है, यह एक बीकर है कि ट्रिपली अल्ट्रापुरे पानी के साथ धोया जाता है में डालना । संदूषण को रोकने और पानी के स्नान में बीकर को रखने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर के मुंह को हल्के से कवर करें। पन्नी को पर्याप्त ढीला होने दें ताकि हवा को प्लाज्मा से संपर्क करने की अनुमति मिल सके।
    3. प्लाज्मा कम से कम 2 घंटे के लिए वायुमंडलीय दबाव के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संतुलन चलो।
    4. प्रत्येक प्रयोग चलाने के लिए एक शीशी के साथ, जरूरत तक बर्फ पर जमे हुए आरटी-पीए शीशियों और जगह को बाहर निकालें।
    5. अल्ट्रापुरे पानी में एगर उठी को भंग करके, 50 एमएल फ्लास्क में कम गेलिंग एगर उठी (2%) बनाएं। एग्राजिंग समाधान की कुल राशि चुनें जैसे कि प्रत्येक नमूने का विश्लेषण करने के लिए लगभग 2 एमएल उपलब्ध है। चुलबुली जब तक एक माइक्रोवेव में फ्लास्क में समाधान गर्म करें। उस पर वाटरप्रूफ स्क्रू ढक्कन के साथ फ्लास्क को सुरक्षित करें। प्लाज्मा के साथ पानी के स्नान में फ्लास्क जलमग्न।
      नोट: यह कदम सुनिश्चित करता है कि एग्लैंड हिस्टोरोलॉजी इनसोनेशन के बाद हिस्टोरोलॉजी विश्लेषण के लिए उजागर क्लॉट सेगमेंट सुरक्षित करने के लिए उपलब्ध है।

4. हिस्टोरिप्सी सोर्स और इमेजिंग सरणी स्थापित करना

  1. सुनिश्चित करें कि मोटरचालित स्थिति निर्माता द्वारा प्रदान किए गए दिशाओं और आदेशों का उपयोग करके प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म के रनटाइम वातावरण से नियंत्रित किया जा सकता है। चेक करें कि सिस्टम की मोटर्स रनटाइम वातावरण के साथ कंप्यूटर के उपयुक्त बंदरगाह से जुड़ी हुई हैं।
  2. मोटराइज्ड पोजिशनिंग सिस्टम पर हिस्टोट्रिप्सी स्रोत माउंट करें जैसा कि चित्र 1 बीमें दिखाया गया है।
  3. निर्माता द्वारा निर्दिष्ट उपयुक्त कनेक्टर (जैसे, बीएनसी केबल) के माध्यम से हिस्टोट्रिप्सी स्रोत को अपने ड्राइविंग इलेक्ट्रॉनिक्स (जैसे, पावर एम्पलीफायर और फ़ंक्शन जनरेटर) से कनेक्ट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि हिस्टोर्रिप्सी स्रोत के ड्राइविंग इलेक्ट्रॉनिक्स को चरण 4.1 में उपयोग किए जाने वाले रनटाइम वातावरण के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है।
  4. इमेजिंग सरणी को जांच कवर के साथ कवर करें और चित्र 2 में दिखाए गए हिस्टोट्रिप्सी स्रोत के एपर्चर में सरणी को सह-डस करते हैं। हिस्टोट्रिप्सी स्रोत के अभिविन्यास के सापेक्ष इमेजिंग विमान के अभिविन्यास को समझना सुनिश्चित करें।
  5. इमेजिंग सरणी को अल्ट्रासाउंड स्कैनिंग सिस्टम से कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि यह प्रणाली स्कैनर के निर्माता द्वारा प्रदान की गई आज्ञाओं के अनुसार, इमेजिंग सरणी के संचालन और ट्रिगरिंग को नियंत्रित कर सकती है, और इमेजिंग डेटा एकत्र कर सकती है।
  6. चित्रा 1Aमें दिखाए गए डगैसिंग के दौरान हिस्टोट्रिप्सी स्रोत/इमेजिंग सरणी को टैंक में जलमग्न कर दें । धीरे-धीरे हिस्टोट्रिप्सी स्रोत या इमेजिंग सरणी की सतह से एक सिरिंज का उपयोग करके किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।
    नोट: ऑपरेशन से पहले हिस्टोरिप्सी स्रोत और इमेजिंग सरणी को पूरी तरह से पानी में विसर्जित करें। हिस्टोर्रिप्सी स्रोत की सतह को छूने से बचें।
  7. इमेजिंग सरणी और स्कैनर के अंतर्निहित आदेशों का उपयोग करके प्रति सेकंड 20 फ्रेम की दर से बी-मोड छवियों का अधिग्रहण करें। इन वास्तविक समय छवियों में हिस्टोरिप्सी स्रोत के ध्यान का दृश्य सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग विंडो को समायोजित करें।
    नोट: यह माना जाता है कि चिकित्सीय स्रोत के केंद्र क्षेत्र के आयामों को जाना जाता है।
  8. हिस्टोर्रिप्सी स्रोत के ऑपरेटिंग पैरामीटर सेट करें, मौलिक आवृत्ति (जैसे, 1.5 मेगाहर्ट्ज), पल्स पुनरावृत्ति आवृत्ति (जैसे, 20-100 हर्ट्ज), पल्स अवधि (जैसे, 1-20 चक्र प्रति पल्स), और प्रति स्थान दालों की कुल संख्या (जैसे, 100-2,000)18,23,24,33शामिल हैं । यदि पर्याप्त थक्का लाइसिस प्राप्त नहीं किया जाता है या यदि बुलबुला गतिविधि मॉडल पोत के ल्यूमेन से परे फैली हुई है तो इन मापदंडों को संशोधित करें। इन मापदंडों को सेट करने के लिए, स्रोत के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करें या एक प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करें जो स्रोत (चरण 4.3) के साथ संवाद कर सकता है।
  9. चरण 4.8 में उपयोग किए जाने वाले निर्माता के प्रोटोकॉल या प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके, आसपास के वातावरण में किसी भी बाधा के बिना, केवल डीगैस किए गए पानी में निर्धारित मापदंडों पर हिस्टोट्रिप्सी स्रोत चलाएं। एक बुलबुला बादल बनने तक हिस्टोट्रिप्सी स्रोत पर लागू वोल्टेज बढ़ाएं।
  10. चरण 4.7 के वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग करके, कॉन्फोकल ट्रांसड्यूसर खोलने के अंदर इमेजिंग सरणी की स्थिति को समायोजित करें जब तक कि बुलबुला बादल लगभग छवि खिड़की के केंद्र में स्थित न हो जाए। बबल क्लाउड इमेजिंग प्लेन(चित्रा 3)में हाइपरकोइक पिक्सल का क्षेत्र है। ट्रांसड्यूसर खोलने में इमेजिंग सरणी को मजबूती से पकड़ने के लिए शिकंजा कसें।
    नोट: यदि सरणी ठीक से गठबंधन किया है, बुलबुला बादल की azimuthal स्थिति इमेजिंग विमान में लगभग 0 मिमी पर होना चाहिए । इमेजिंग सरणी चिकित्सा स्रोत की आंतरिक सतह से थोड़ा प्रोजेक्ट कर सकती है, और इसलिए बुलबुले बादल की सीमा की स्थिति स्रोत की फोकल लंबाई से भिन्न हो सकती है।
  11. इमेजिंग विमान में बुलबुला बादल स्थान की पहचान करें। बबल क्लाउड(चित्रा 3)के केंद्र के रूप में हिस्टोट्रिप्सी स्रोत का ध्यान दें।
  12. इमेजिंग विंडो(चित्रा 3)में पता लगाया फोकल स्थान (चरण 4.11) रिकॉर्ड करें। फोकल स्थिति को चिह्नित करने का एक संभावित तरीका इमेजिंग विंडो में स्थान को नोट करने के लिए एक कर्सर रख रहा है, यदि इमेजिंग प्लेटफॉर्म के साथ उपलब्ध है।
  13. इनसोनेशन बंद करें और हिस्टोरिप्सी स्रोत पर लागू वोल्टेज को 0 वी में सेट करें।

5. थक्का तैयारी

  1. चिमटा के साथ सील अंत को काटकर पिपेट से थक्का हटा दें। थक्का सीरम के साथ एक पेट्री डिश में स्लाइड करते हैं । यदि थक्का उखाड़ नहीं पाता है, तो थक्का हटाने के लिए नमकीन फ्लश के माध्यम से पिपेट के दूसरे छोर से धीरे-धीरे दबाव लागू करें।
  2. एक स्केलपेल का उपयोग करके थक्के को 1 सेमी लंबाई तक काटें, केंद्र से एक समान टुकड़े के लिए लक्ष्य (यानी, पिपेट के ऊपर या नीचे बने थक्के के वर्गों से दूर)।
  3. अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने के लिए थक्के के कट सेक्शन को धीरे से दागने के लिए एक सफाई पोंछ का उपयोग करें।
  4. चिमटी का उपयोग करके, थक्का अनुभाग को धीरे-धीरे वजन पैमाने पर रखें और वजन रिकॉर्ड करें।
  5. मैन्युअल रूप से पानी की टंकी से बाहर प्रवाह चैनल उठाएं और प्रवाह चैनल से मॉडल पोत को हटा दें।
  6. चिमटी का उपयोग कर मॉडल पोत में थक्का रखें और प्रवाह चैनल के लिए फिर से मॉडल पोत देते हैं।
    नोट: एक नायलॉन रॉड मॉडल पोत के भीतर रखा जा सकता है प्रवाह के कारण नीचे की ओर जाने से थक्का रोकने के लिए ।
  7. प्रवाह चैनल को टैंक में इस तरह से कम करें कि जलाशय के सापेक्ष चरण का समीपस्थ अंत डिस्टल साइड की तुलना में कम हो। इस तरीके से मंच का एंगलिंग मॉडल पोत में बुलबुले को फंसाने से रोकता है जब प्लाज्मा चरण 6.1 में प्रवाह चैनल के माध्यम से खींचा जाता है।
  8. एक पिपेट का उपयोग करके जलाशय में प्लाज्मा के 30 एमएल जोड़ें और तापमान की निगरानी करें जब तक कि यह कम से कम 36 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए।
  9. प्लाज्मा जलाशय में 30 एमएल प्लाज्मा, 2.68 माइक्रोग्राम/एमएल में आरटी-पीए (80.4 माइक्रोग्राम) को वितरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। जलाशय के भीतर एक समान आरटी-पीए वितरण सुनिश्चित करने के लिए पिपेट के साथ प्लाज्मा हिलाएं।

6. प्रवाह चैनल भड़काना

  1. सिरिंज पंप के माध्यम से जलाशय से प्रवाह चैनल में प्लाज्मा ड्रा जब तक प्लाज्मा मॉडल पोत भरता है ।
    नोट: यदि थक्का नायलॉन रॉड के साथ फ्लश नहीं है, ६० एमएल पर छोटे पंप ड्रॉ का उपयोग करें/ इस प्रक्रिया में तैयार प्लाज्मा की मात्रा को सीमित करें या प्रवाह चैनल में समाधान के 30 एमएल सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त प्लाज्मा/आरटी-पीए का उपयोग करके जलाशय को फिर से भरें ।
  2. मोटरचालित पोजिशनर्स का उपयोग करके, इमेजिंग स्क्रिप्ट (चरण 4.7) का उपयोग करके थक्के की लंबाई के समानांतर इमेजिंग सरणी को संरेखित करें। समानांतर संरेखण उपयोगकर्ता को मॉडल पोत के अंदर थक्के और बुलबुले की अनुपस्थिति की उचित नियुक्ति सुनिश्चित करने में सक्षम बनाता है।
  3. मॉडल पोत को मैन्युअल रूप से और नेत्रहीन रूप से स्तर दें कि इमेजिंग विंडो (चरण 4.7) का उपयोग करके कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं।

7. प्रयोग प्रक्रिया

  1. पूर्व उपचार
    नोट: यह कदम के लिए हिस्टोर्रिप्सी स्रोत के लिए एक रास्ता योजना है/
    1. मोटराइज्ड पोजिशनर्स का उपयोग करके इमेजिंग सरणी को संरेखित करें ताकि इमेजिंग विमान थक्के के क्रॉस-सेक्शन के समानांतर हो (यानी, चरण 6.2 में वर्णित अभिविन्यास के लंबवत)।
    2. इमेजिंग विंडो (चरण 4.7) के माध्यम से मार्गदर्शन के तहत, मोटरचालित पोजिशनर्स का उपयोग करके जलाशय के सापेक्ष थक्के के समीपस्थ छोर पर हिस्टोट्रिप्सी स्रोत को स्थानांतरित करें। इस बिंदु पर, हिस्टोट्रिप्सी स्रोत स्थिति को समायोजित करें जैसे कि चरण 4.12 में चिह्नित फोकल पॉइंट थक्के के केंद्र के साथ संरेखित होता है।
    3. थक्का लंबाई के साथ ओंओनेशन पथ निर्धारित करें। इस रास्ते को परिभाषित करने के लिए, 5 मिमी वेतन वृद्धि में थक्के की लंबाई (यानी, मोटर्स की स्थिति जहां हिस्टोट्राइप्सी बबल गतिविधि थक्के के भीतर निहित है) के साथ तीन मार्ग निर्धारित करें। मार्ग को इस तरह से संरेखित करें कि पथ के साथ हिस्टोर्रिप्सी स्रोत की समग्र गति प्रणाली में प्रवाह के साथ एंटेग्रेड है (यानी, पहला रास्ता जलाशय के सापेक्ष थक्के के सबसे समीपस्थ छोर पर है, और तीसरा रास्ता जलाशय के सापेक्ष डिस्टल स्थिति में है)।
    4. प्रत्येक मार्ग को अंतिम रूप देने से पहले, स्टेप 4.8 के समान इनसोनेशन मापदंडों के साथ हिस्टोर्रिप्सी स्रोत से अग्नि परीक्षण दालों को लेकिन कुल 10 कुल दालों के समग्र जोखिम को कम करें। थक्के के भीतर बुलबुला गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए, यदि आवश्यक हो तो मोटर चालित स्थिति का उपयोग करके हिस्टोट्रिप्सी स्रोत की स्थिति को समायोजित करें।
    5. प्रत्येक मार्ग पर, निर्माता द्वारा प्रदान की गई आज्ञाओं का उपयोग करके मोटर पदों को बचाएं, चरण 4.1 के समान।
  2. उपचार
    नोट: यह कदम पूर्व उपचार चरण में परिभाषित पथ के अनुसार अपनी लंबाई के साथ थक्का इलाज करने की प्रक्रिया को परिभाषित करता है ।
    1. 0.65 mL/min पर सिरिंज पंप चलाएं और प्लाज्मा के मेनिस्कस को स्थानांतरित करने के लिए प्रतीक्षा करें। यह प्रवाह दर इलियोफेमोरल वैक्यूलेचर24,34के लगभग कुल ऑक्क्यूज़ेशन की नकल करती है ।
    2. एक निश्चित चरण आकार (जैसे, 0.5 मिमी) के साथ स्थापित मार्ग बिंदुओं के बीच मध्यवर्ती चरणों के साथ चरण 7.1.3 में बनाए गए पथ को इंटरपोलेट करें। कदम का आकार फोकल क्षेत्र की चौड़ाई से आधे से छोटा होने के लिए चुना जाता है जैसा कि थक्का लंबाई (इमेजिंग सरणी की ऊंचाई दिशा) के साथ मापा जाता है। चरण 4.8 में परिभाषित इनसोनेशन मापदंडों के साथ प्रत्येक पथ स्थान पर मोटरीकृत स्थिति का उपयोग करके हिस्टोट्रिप्सी स्रोत को स्थानांतरित करें।
    3. इमेजिंग विंडो (चरण 4.7) का उपयोग करके प्रत्येक पथ स्थान पर हिस्टोट्रिप्सी पल्स के अनुप्रयोग के दौरान मॉनिटर/इमेज बबल गतिविधि। एजिमुथ और रेंज में 15 मिमी को कवर करने वाले छवि आयामों के साथ हिस्टोट्रिप्सी फोकस पर छवि को केंद्र करें। प्रत्येक स्थान पर हिस्टोट्रिप्सी पल्स के आवेदन से पहले, एक प्रोग्रामिंग प्लेटफॉर्म में एक स्क्रिप्ट बनाकर, थक्का और मॉडल पोत का दृश्य प्रदान करने के लिए एक बी-मोड छवि प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि स्क्रिप्ट निर्माता के आदेशों का उपयोग करके स्कैनर के साथ संचार स्थापित करती है।
    4. हिस्टोट्रिप्सी पल्स के आवेदन के दौरान,35के बाद निष्क्रिय कैविटेशन छवियों को बनाने के लिए कदम 7.2.3 में स्क्रिप्ट में ध्वनिक उत्सर्जन के अधिग्रहण को लागू करें। हर 10 उपचार दालों के बाद एक निष्क्रिय कैविटेशन छवि प्राप्त करें। इमेजिंग गहराई के अंत तक 8 वृद्धिशील गहराई पर 50 का एक फ्लैट समय लाभ मुआवजा लागू करें। एक उपयुक्त अधिग्रहण विंडो आकार चुनें ताकि थक्के से पूरे संकेत को35विंडोइंग के कारण ऊर्जा की न्यूनतम हानि के साथ कैप्चर किया जाए।
    5. यदि ऑफ-टारगेट बुलबुला बादल मौजूद हैं, तो मोटरचालित स्थिति के साथ सीटू में ट्रांसड्यूसर स्थिति को समायोजित करें।
      नोट: इमेजिंग सरणी के छूटे हुए ट्रिगर्स के लिए मॉनिटर करें। बाद में ट्रिगर करने से पहले डेटा का भंडारण पूरा हो गया है सुनिश्चित करने के लिए अधिग्रहीत इमेजिंग डेटा सेट की संख्या को समायोजित करें।

8. प्रयोग प्रक्रिया के बाद

  1. मैन्युअल रूप से गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से परफ्यूसेट को निकालने के लिए पानी की टंकी से मॉडल पोत को उठाएं। थक्के को नीचे और मॉडल पोत से बाहर जाने से रोकने के लिए लगाए गए प्रवाह चैनल को रखना सुनिश्चित करें।
  2. एक बहुत कम प्रवाह दर पर सिरिंज पंप के माध्यम से प्रवाह चैनल से प्लाज्मा समाधान ड्राइंग द्वारा एक छोटे से बीकर(चित्रा 4A)में आगे के विश्लेषण के लिए पूरे perfusate लीजिए ।
  3. मॉडल पोत को डिस्कनेक्ट करें और थक्का हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो थक्का को धीरे-धीरे उखाड़ फेंकने के लिए मॉडल पोत में नमकीन की एक छोटी राशि इंजेक्ट करें।
  4. स्टेप 1.2.3 के समान थक्का पोंछें। थक्का बड़े पैमाने पर नुकसान का आकलन करने के लिए वजन पैमाने पर थक्का वजन।
  5. डी-डाइमर सामग्री का विश्लेषण करने के लिए, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 100 मिलीग्राम अमीनोकेप्रोइक एसिड जोड़ें और इसके बाद 1 एमएल पेफ्यूसेट का उपयोग करके, और एक पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं। नमूना36के भीतर डी-डाइमर की मात्रा निर्धारित करने के लिए लेटेक्स प्रतिरक्षा-टर्बिडिमेट्रिक परख करें।
  6. हीमोलिसिस का आकलन करने के लिए, 10 मिनट के लिए 610 x ग्राम (3,500 आरपीएम) पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में परफ्यूज़ेट का 1 मिलियन जोड़ें। 0.5 एमएल सुपरनैंट (ध्यान केंद्रित) के साथ 0.5 एमएल ड्राबकिंस समाधान के साथ जोड़ें और मिश्रण को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आराम दें। 200 माइक्रोल को अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करें, जैसा कि चित्र 4बीमें दिखाया गया है। 540 एनएम, चित्रा 4C (ड्राबकिंस परख37)पर अवशोषण पढ़ने के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग करें।
  7. हिसटोलॉजी असेसमेंट
    1. एक स्केलपेल के साथ लंबाई में लगभग 2-3 मिमी के थक्के के केंद्र से एक खंड काटें।
    2. एक कैसेट में अनुभाग जोड़ें। हिस्टोरिप्सी पल्स प्रचार की दिशा के सापेक्ष अनुभाग का अभिविन्यास बनाए रखें।
    3. जगह में थक्का ठीक करने के लिए कैसेट में कदम 3.2.5 में तैयार कम जेलिंग एगर उठे समाधान के 2 एमएल जोड़ें।
    4. 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मलिन में नमूना ठीक करें। 24 घंटे के बाद 70% अल्कोहल में नमूना रखें और मानक हेमोक्सिलिन-इओसिन स्टेनिंग38करें।

9. निष्क्रिय कैविटेशन छवि विश्लेषण

  1. प्रत्येक उपचार स्थान पर बुलबुला बादल द्वारा उत्पन्न ध्वनिक उत्सर्जन की छवि बनाने के लिए मजबूत कैपन बीमफॉर्मर 39 के आधार पर एल्गोरिदम का उपयोग करके हिस्टोट्रिप्सी एक्सटिटेशन (चरण7.2.4) के दौरान इमेजिंग सरणी से प्राप्त संकेतों को संसाधित करें।
    नोट: मात्रात्मक छवियों को उत्पन्न करने के लिए, हैवर्थ एट अल में वर्णित चरणों का पालन करें ।३५। अन्यथा, छवि में प्रत्येक पिक्सेल मूल्य प्रत्येक संबंधित स्थान पर सापेक्ष बुलबुला बादल ध्वनिक ऊर्जा (वी2की इकाइयों) का प्रतिनिधित्व करना चाहिए।
  2. थक्का और मॉडल पोत का प्रतिनिधित्व करने वाले पिक्सल के बीच अंतर करने के लिए बी-मोड छवि को चरण 7.2.3 में तैयार किया गया है।
  3. चित्रा 5Bमें दिखाए गए बी-मोड छवि के साथ निष्क्रिय कैविटेशन छवि को सह-पंजीकृत करें। 35की अवधि में थक्के के भीतर ध्वनिक ऊर्जा का योग करें ।

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Representative Results

इस अध्ययन में उल्लिखित प्रोटोकॉल में डीवीटी के इन विट्रो सेटअप में शिरस क्लॉट मॉडलिंग, थक्का व्यवधान के लिए lysotripsy और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के विवरण पर प्रकाश डाला गया है। अपनाई गई प्रक्रिया आरटी-पीए और हिस्टोट्रिप्सी बबल क्लाउड गतिविधि के संयुक्त प्रभावों के कारण थक्का व्यवधान का आकलन करने के लिए आवश्यक कदमों को दर्शाती है। बेंचटॉप सेटअप को एक शिराशील इलियोफेमोरल नस की विशेषताओं की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। चित्रा 1A एक मॉडल पोत दिखाता है जिसमें iliofemoral नस के ध्वनिक, यांत्रिक और ज्यामितीय गुण होते हैं। थक्का आंशिक रूप से ऑक्सीक्लुसिव थ्रोम्बस की नकल करने के लिए मॉडल पोत के अंदर रखा गया है। थक्का प्लाज्मा और आरटी-पीए ०.६५ मिलीएल/मिनट की दर से एक जलाशय से तैयार के साथ perfused है । यह दर अत्यधिक ओसीलेड पोत34में धीमी प्रवाह दर के अनुरूप है .

9 सेमी प्रमुख धुरी, 7 सेमी माइनर एक्सिस और 6 सेमी फोकल लेंथ(चित्रा 2 ए)के साथ 1.5 मेगाहर्ट्ज फंडामेंटल फ्रीक्वेंसी का एक अंडाकार केंद्रित ट्रांसड्यूसर पोजिशनिंग सिस्टम पर रखा गया है जैसा कि चित्र 1बीमें उल्लेख किया गया है। अल्ट्रासाउंड जेल और एक लेटेक्स कवर(आंकड़े 2 बी,सी)के साथ कवर की गई एक इमेजिंग सरणी को हिस्टोट्रिप्सी स्रोत के केंद्र में एक उद्घाटन के माध्यम से चित्रा 1 ए में दिखाए गए ट्रांसड्यूसर के साथ coaxially पर रखा जाता है। मोटरचालित पोजिशनर्स का उपयोग मॉडल पोत(चित्रा 1)के भीतर थक्का लंबाई के साथ थेरेपी ट्रांसड्यूसर/इमेजिंग सरणी का अनुवाद करने के लिए किया गया था। हिस्टोट्रिप्सी स्रोत के लिए पर्याप्त वोल्टेज के आवेदन पर, ट्रांसड्यूसर के फोकल क्षेत्र में एक बुलबुलाबादल उत्पन्न होता है और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के माध्यम से कल्पना की जाती है, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। फोकल स्थिति इमेजिंग विमान (चरण 4.10-4.11) का उपयोग कर बुलबुला बादल के केंद्र के रूप में परिभाषित किया गया है।

चित्रा 4A दो अलग-अलग उपचार स्थितियों के लिए एकत्र किए गए परफ्यूडेट दिखाता है। नियंत्रण के रूप में लेबल बीकर में अकेले प्लाज्मा के संपर्क में आने वाले थक्के का परफ्यूसेट होता है। इलाज के रूप में लेबल दूसरे बीकर में lysotripsy इलाज थक्का के perfusate शामिल हैं । एकत्र किए गए परफ्यूसेट का उपयोग प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट परख के माध्यम से हीमोग्लोबिन (हीमोलिसिस का मीट्रिक) और डी-डाइमर (फाइब्रिनोलिसिस का मीट्रिक) सामग्री का आकलन करने के लिए किया जाता है। परफ्यूसेट के रंग में अंतर हीमोग्लोबिन एकाग्रता में परिवर्तनशीलता को दर्शाता है, जिसे ऑप्टिकल अवशोषण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। अवशोषण मूल्य और हीमोग्लोबिन एकाग्रता के बीच संबंध एक अंशांकन वक्र के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। 0 (ब्लैंक मेजरमेंट) से लेकर 180 मिलीग्राम/एमएल तक ज्ञात हीमोग्लोबिन सामग्री के साथ समाधान अच्छी तरह से प्लेट में रखे जाते हैं और प्लेट रीडर(चित्रा 4B,सी)का उपयोग करके ट्राइलेट में अवशोषण निर्धारित किया जाता है। प्लेट रीडर की ऊपरी अवशोषण सीमा भिन्न हो सकती है और अच्छी तरह से प्लेट में समाधान करने के लिए प्राथमिकताओं को नहीं जाना जा सकता है। जैसे, 180 मिलीग्राम/एमएल तक हीमोग्लोबिन सांद्रता वेल प्लेट, फिगर 4बीमें बनाई जाती है। हालांकि, यहां इस्तेमाल किया प्लेट रीडर केवल 23 मिलीग्राम/एमएल तक सांद्रता के लिए अवशोषण पढ़ सकते हैं, चित्रा 4C।

चित्रा 5A बी-मोड इमेजिंग के माध्यम से मॉडल पोत के भीतर थक्के के दृश्य को दिखाता है, जैसा कि चरण 7.2.3 में निर्दिष्ट हिस्टोरिप्सी एक्सपोजर से पहले है। यह छवि निष्क्रिय कैविटेशन छवि के विभाजन के लिए थक्का स्थिति निर्धारित करने के लिए अधिग्रहीत की जाती है। चित्रा 5B को दिखाया गया है कि एस्टोरिप्सी एक्सपोजर से पहले अधिग्रहीत बी-मोड छवि के साथ निष्क्रिय कैविटेशन इमेज सह-पंजीकृत है। यह आंकड़ा पुष्टि करता है कि ध्वनिक ऊर्जा मुख्य रूप से हिस्टोट्रिप्सी एक्सपोजर के दौरान थक्के के भीतर निहित है।

हिस्टोट्रिप्सी और लितिक के कारण विशिष्ट थक्का व्यवधान चित्र 6में दर्शाया गया है । चित्रा 6A,बी क्रमशः अनुपचारित और lysotripsy इलाज थक्का छवियों को दिखाते हैं । हिस्टोट्रिप्सी के संपर्क में आने वाले नमूनों के लिए, व्यवधान मुख्य रूप से थक्का केंद्र तक सीमित है, जो निष्क्रिय कैविटेशन इमेजिंग(चित्रा 5B)के साथ ट्रैक किए गए बुलबुला गतिविधि के मनाए गए स्थानों के अनुरूप है। हालांकि, lytic के अलावा के साथ, थक्के की परिधि के करीब क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर नुकसान भी होता है। यह परिकल्पना की गई है कि यह अतिरिक्त जन हानि बबल गतिविधि के तहत lytic के उन्नत तरल पदार्थ मिश्रण के कारण है। तरल पदार्थ मिश्रण थक्के में lytic के वितरण और प्रवेश गहराई बढ़ जाती है। चूंकि लाइटिक फाइब्रिनोलिसिस40के लिए जिम्मेदार है, इसलिए बड़े पैमाने पर नुकसान बढ़ जाता है। फिब्रिनोलिसिस को परफ्यूसेट41में डी-डाइमर सामग्री को मापकर मात्रा निर्धारित की जा सकती है।

Figure 1
चित्र 1:मानव रक्त के थक्के के लाइसोट्रीप्सी के लिए प्रायोगिक सेटअप। (क)सेटअप के घटक (1) अण्डाकार ज्यामिति के साथ हिस्टोट्राइप्सी स्रोत केंद्रित हैं, (2) लेटेक्स-कवर इमेजिंग सरणी, (3) मॉडल पोत प्रवाह चैनल से जुड़ा हुआ है, (4) प्रवाह चैनल, (5) जलाशय, (6) ध्वनिक अवशोषित सामग्री, (7) हीटिंग तत्व, और (8) पानी की टंकी डेगास और गर्म रिवर्स पॉस्टस से भरा। इमेजिंग विमान का ज़िमुथ आयाम ऊंचाई और सीमा आयामों (पृष्ठ में) के लंबवत है। (ख)हिस्टोट्रिप्सी सोर्स मोटराइज्ड पोजिशनिंग सिस्टम पर चढ़कर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:अल्ट्रासाउंड स्रोत और इमेजिंग घटक। अल्ट्रासाउंड जेल और लेटेक्स कवर के साथ(ए)केंद्रित हिस्टोट्रिप्सी स्रोत,(बी)इमेजिंग सरणी, और(सी)इमेजिंग सरणी की व्यक्तिगत ज़ूम छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:इमेजिंग सरणी का उपयोग करके हिस्टोट्रिप्सी बबल क्लाउड की कल्पना की गई है। हिस्टोरिप्सी स्रोत के फोकल जोन में एक बुलबुला बादल उत्पन्न होता है और इमेजिंग सरणी का उपयोग करके चित्रित किया जाता है। एक क्रॉस के रूप में दिखाया गया नामित फोकस, उपचार योजना के लिए बचाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:थक्का लाइसिस के कारण जारी हीमोग्लोबिन का मात्राकरण। (ए)परफ्यूडेट नमूने अकेले प्लाज्मा (कोई हिस्टोस्ट्रिप्सी या लाइटिक) के साथ नियंत्रण अध्ययन के बाद एकत्र किए गए हैं, और उपचार शाखा, हिस्टोट्रिप्सी (जैसे, 35 MPa पीक नकारात्मक दबाव, 5 चक्र पल्स अवधि, 1.5 मेगाहर्ट्ज मौलिक आवृत्ति), और 2.68 माइक्रोन/ (ख)अच्छी तरह से १८० मिलीग्राम/एमएल (शीर्ष पंक्ति, बाएं-सबसे कोने) से लेकर 0 मिलीग्राम/एमएल (नीचे पंक्ति, दाएं-सबसे कोने) से लेकर ज्ञात हीमोग्लोबिन सांद्रता के कमजोर पड़ने वाली प्लेट । तीर सिर हीमोग्लोबिन एकाग्रता को कम करने की ओर इशारा करता है। (ग)इन नमूनों का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के माध्यम से हिस्टोट्रिप्सी एक्सपोजर के कारण उत्पादित हीमोग्लोबिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र बनाने के लिए किया जाता है । उच्च सांद्रता का विश्लेषण करने में प्लेट रीडर की सीमा के कारण 0 से 23 मिलीग्राम/एमएल तक की हीमोग्लोबिन सांद्रता के लिए अवशोषण वक्र प्राप्त किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5-उपचार के दौरान थक्के की छवियां। (ए)बी-मोड छवि उपचार नाड़ी की शुरुआत से पहले अधिग्रहीत मॉडल पोत के भीतर थक्का स्थिति दिखा । (ख)पोस्ट-हॉक विज़ुअलाइज़ेशन ऑफाएकेटिक एनर्जी एमिशन की गणना हॉट कलरमैप इमेजिंग में दिखाए गए निष्क्रिय कैविटेशन इमेजिंग से की जाती है, जो हिस्टोट्रिप्सी पल्स के आवेदन से पहले अधिग्रहीत थक्के की बी-मोड छवि के साथ सह-पंजीकृत है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:विभिन्न उपचार स्थितियों में एब्लेटेड क्लॉट की हिसटोलॉजी। (ए)उपचार के बिना थक्का क्लॉट। (ख)क्लॉट को ग्लिसोट्रिप्सी (उदाहरण के लिए, 35 एमपीए पीक निगेटिव प्रेशर, सिंगल साइकिल पल्स अवधि, 1.5 मेगाहर्ट्ज फंडामेंटल फ्रीक्वेंसी) के साथ ट्रीट किया जाता है। हिस्टोरिस्टी पल्स इस इमेज में ऊपर से नीचे तक प्रचारित की गई। थक्के की लंबाई के साथ हिस्टोट्रिप्सी स्रोत के लिए पथ (यानी, यहां दिखाए गए छवि के विमान के लंबवत) को चरण 7.2.3 में परिभाषित किया गया है। माइक्रोग्राफ का पैमाना 2 मिमी है। ध्यान रहे कि यहां हासिल की गई थक्के व्यवधान की मात्रा24लंबी नाड़ी अवधि वाली बीमा योजनाओं की तुलना में कम हो जाएगी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रस्तावित प्रोटोकॉल lysotripsy के उपचार प्रभावकारिता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मॉडल प्रस्तुत करता है। हालांकि प्रमुख विवरणों पर चर्चा की गई है, इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण पहलू हैं । आरटी-पीए की एंजाइमेटिक गतिविधि में एरोहेनियस तापमान निर्भरता30है । तापमान भी पानी और ऊतक में ध्वनि की गति के लिए एक योगदान कारक है, और तापमान में बदलाव फोकल जोन ज्यामिति के मामूली परिवर्तन का कारण बन सकता है । इस प्रकार, पानी के तापमान को ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस पर विनियमित किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल (2.68 माइक्रोग्राम/एमएल) में उपयोग की जाने वाली आरटी-पीए की खुराक अन्य फार्माकोमैकेनिकल थ्रोम्बेक्टॉमी रणनीतियों42के लिए चिकित्सकीय रूप से नियोजित है। चरण 5.8 में, प्लाज्मा के 30 एमएल जलाशय में स्थानांतरित कर दिया जाता है जबकि एक 35 एमएल एलिकोट चरण 3.1.3 में उल्लेख किया जाता है। यह अतिरिक्त प्लाज्मा वायुमंडलीय दबाव के संतुलन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होने पर घंटों के दौरान वाष्पीकरण के कारण प्लाज्मा में नुकसान के लिए खाता है।

फोकल लंबाई, एपर्चर चौड़ाई, और चिकित्सा ट्रांसड्यूसर की आवृत्ति फोकल क्षेत्र के आकार और गहराई को निर्देशित करती है। इसलिए, ट्रांसड्यूसर को इस तरह चुना जाना चाहिए कि ये विशेषताएं व्यास और लक्ष्य पोत की गहराई के साथ संरेखित हों (उदाहरण के लिए फेमोरल नस: 2-4 सेमी गहराई में और 0.6-1.2 सेमी व्यास में)43। यांत्रिक एब्लेशन की सीमा बुलबुले बादल की सीमा तक सीमित है। इस प्रकार, हिस्टोस्ट्रिप्सी बबल क्लाउड व्यवहार को संशोधित करने में भूमिका इनसोनेशन मापदंडों की समझ महत्वपूर्ण है33,44,45. ध्वनिक क्षेत्र की आवृत्ति और ताकत को मध्यम और मध्यस्थ सामग्रियों (जैसे, मॉडल पोत) के कारण क्षीणन की भयावहता को देखते हुए भी चुना जाना चाहिए। लक्ष्य पोत के साथ बुलबुला गतिविधि कारावास सुनिश्चित करने के लिए, फोकल जोन की निगरानी के लिए एक उपयुक्त इमेजिंग विंडो चुनी जानी चाहिए। मैकेनिकल क्लॉट व्यवधान को अधिकतम करते हुए लक्ष्य प्रभावों से बचने के लिए ट्रांसड्यूसर के ऑपरेटिंग मापदंडों को चुना जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, बड़े पैमाने पर नुकसान उपचार प्रभावकारिता का एक प्राथमिक मीट्रिक माना जाता था। बड़े पैमाने पर नुकसान में वृद्धि को देखा गया है क्योंकि चोटी नकारात्मक दबाव या हिस्टोस्ट्रिप्सी पल्स की अवधि24,46बढ़ जाती है, जिसमें अधिकतम 94% की वृद्धि हुई है। जांच उपचार हथियारों के लिए अवशिष्ट थक्के की उपस्थिति चिकित्सीय प्रभावकारिता की तुलना की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, थ्रोम्बस को पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने के लिए बीमा योजनाएं भी तैयार की जा सकती हैं।

ध्वनिक बाधा (लगभग 1.58 MRayl47,48)और ज्यामितीय गुण (व्यास 43 में 0.6-1.2 सेमी) iliofemoral शिरात्व वाष्र्णेय का प्रतिनिधि होना चाहिए (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन और पॉलीयूरेथेन कुछ अन्य सामग्री हैं जो अपने एसीओस्टो-मैकेनिकल गुणों के आधार पर वेनस सिस्टम को मॉडल करने के लिए उपयुक्त हैं। स्टेप 7 में, मॉडल पोत से सभी हवा के बुलबुले को हटाना महत्वपूर्ण है ताकि हिस्टोट्रिप्सी एक्सपोजर से थक्के को बचाने से बचा जा सके। हाइड्रोफोबिक सामग्री के एक मॉडल पोत के लिए, बुलबुला बादल थक्के के केंद्र के बजाय पोत की दीवार के पास अधिमानतः बन सकते हैं। इसलिए, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के माध्यम से उपचार के दौरान बुलबुले बादल की निरंतर निगरानी की जानी चाहिए, और यदि आवश्यक हो तो ट्रांसड्यूसर को फिर से तैनात किया जाना चाहिए। अंतिम इरादा थक्का व्यवधान को प्राप्त करने वाले हिस्टोरिप्सी इनसोनेशन पैरामीटर (जैसे, पल्स अवधि और पीक प्रेशर) निर्धारित करने के लिए प्रायोगिक अध्ययन किए जाने चाहिए।

इमेजिंग सरणी का उपयोग उपचार दृश्य के लिए बी-मोड छवियों और निष्क्रिय कैविटेशन छवियों को कैप्चर करने और बुलबुला गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। बी-मोड इमेजिंग मॉडल पोत और थक्के के दृश्य की अनुमति देता है, और निष्क्रिय कैविटेशन इमेजिंग थक्का एब्लेशन24, 49से जुड़े बुलबुले गतिविधि की ऊर्जा को मापता है। इमेजिंग सरणी की बैंडविड्थ को उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ वांछित बुलबुला बादल गतिविधि के साथ संरेखित करना चाहिए। बादल के भीतर बुलबुले के जड़त्वीय पतन से जुड़े विशुद्ध ब्रॉडबैंड संकेतों को प्राप्त करने के लिए, सरणी की बैंडविड्थ ट्रांसड्यूसर50, 51की मौलिक आवृत्ति के साथ मेल नहीं खानी चाहिए। हिस्टोट्रिप्सी दालें अत्यधिक nonlinear52हैं, और यह संभावना है कि मौलिक आवृत्ति के हार्मोनिक्स प्राप्त संकेत में मौजूद होंगे। इमेजिंग प्रणाली को स्रोत से फोकल जोन तक हिस्टोट्रिप्सी पल्स की उड़ान के ज्ञात समय के आधार पर ट्रिगर करने के लिए प्रोग्राम किया जाना चाहिए ताकि पूरे इनसोनेशन में पूर्ण निष्क्रिय कैविटेशन इमेजिंग डेटा का संग्रह सुनिश्चित किया जा सके। इन संकेतों को तब प्रोटोकॉल के चरण 7.2.3 और 9 में चर्चा के रूप में पोस्ट हॉक संसाधित किया जाना चाहिए।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हीमोलिसिस की मात्रा थक्के की हैंडलिंग के प्रति संवेदनशील है। इसलिए, उपचार से पहले थक्के को कम से कम नुकसान के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, क्लॉट मॉडलिंग (चरण 1) और पूर्व-उपचार समय (चरण 6 और 7.1) हिस्टोट्रिप्सी एक्सपोजर के साथ या बिना इलाज किए गए सभी थक्के के लिए समान होना चाहिए। हीमोलिसिस आकलन के उपचार के बाद के चरण में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्लाज्मा का अपना अवशोषण है। इसलिए, मानक घटता बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले मंद (उदाहरण के लिए, ऑप्टिकल अवशोषण बनाम हीमोग्लोबिन) प्रवाह चैनल में परफ्यूसेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले एक ही तरल पदार्थ का उपयोग करके बनाया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, प्लाज्मा का उपयोग मानक घटता बनाने के लिए मंद के रूप में किया जाता था)।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मानव पूरे रक्त के थक्के के इलाज के लिए lysotripsy की प्रभावकारिता को मापने के लिए एक बेंचटॉप सेटअप प्रदान करना है। कुछ सीमाएं हैं जो सेट अप की इन विट्रो प्रकृति के कारण उत्पन्न होती हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले तीव्र थक्के में मुख्य रूप से लाल रक्त कोशिकाएं और फाइब्रिन शामिल थे, जिससे डीवीटी के लिए lysotripsy का दृष्टिकोण प्रभावी हो जाता है। हालांकि, थ्रोम्बस के बाद के चरणों में एक कठोर कोलेजनस नेटवर्क53 विकसित हो सकता है जो आरटी-पीए की फाइब्रिन-विशिष्ट प्रकृति के कारण lysotripsy उपचार का विरोध कर सकता है। वीवो में इलाज करते समय, उपचार प्रभावकारिता के लिए प्राथमिक नैदानिक अंतिम बिंदु प्रवाह की बहाली है। यहां वर्णित इन विट्रो प्रोटोकॉल में उपचार प्रभावकारिता के लिए बड़े पैमाने पर नुकसान एक प्राथमिक मीट्रिक था। यद्यपि इस प्रोटोकॉल में प्रवाह का मूल्यांकन नहीं किया गया था, लेकिन प्रवाह बहाली की निगरानी के लिए चरण 7.2.4 में निष्क्रिय कैविटेशन इमेजिंग के साथ रंग डॉप्लर इमेजिंग को अतिरिक्त रूप से शामिल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में सेटअप एक निश्चित प्रवाह दर का उपयोग करता है, जो चरण 7.2 में पूरे उपचार के दौरान एक अत्यधिक ऑक्सक्यूल्ड पोत में प्रवाह दर की नकल करता है। वीवो में, संवहनी प्रवाह में वृद्धि होगी क्योंकि उपचार के दौरान थक्का विघटित हो जाता है। बढ़े हुए प्रवाह से जुड़े अतिरिक्त कतरनी तनाव ों से थक्का क्षरण प्रोफाइल54पर दबाव पड़ेगा . वीवो ऑफ-टारगेट प्रभावों में इस सेटअप में पता नहीं लगाया जा सकता है, जैसे कि lytic55के प्रणालीगत प्रशासन के कारण रक्तस्राव, पोत दीवार क्षति या बुलबुला बादल गतिविधि22के कारण वासोस्पास्म। इस अध्ययन की इन विट्रो प्रकृति भी उपचार के बाद पोत पैटेंसी या री-थ्रोम्बोसिस जैसे दीर्घकालिक परिणामों का आकलन करने की क्षमता को सीमित करती है। इस अध्ययन में लाइटिक के प्रशासन ने प्रणालीगत थ्रोम्बोलिटिक्स की नकल की, जबकि कैथेटर-निर्देशित लाइटिक्स वेनस थ्रोम्बोसिस7,14के लिए पसंदीदा हस्तक्षेप है। ऊतक क्षीणन हिस्टोट्रिप्सी क्षेत्र और वीवो अध्ययनों में इमेजिंग गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है, जबकि यहां ध्वनिक पथ मुख्य रूप से डिगास्ड पानी के माध्यम से है। मजबूत कैपन बीमफॉर्मर (प्रोटोकॉल के चरण 9) के साथ कैविटेशन उत्सर्जन डेटा का प्रसंस्करण गणना रूप से महंगा है और पोस्ट हॉक विश्लेषण के लिए ऑफ लाइन आयोजित किया गया था। अन्य बीमफॉर्मर्स (उदाहरण के लिए, विलंब और राशि35 या कोणीय स्पेक्ट्रम56)को वास्तविक समय प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए वैकल्पिक रूप से संचालित किया जा सकता है, हालांकि कम रेंज रिज़ॉल्यूशन के साथ।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल मानव रक्त के थक्के की गहरी नस थ्रोम्बोलिसिस को प्राप्त करने के लिए एक गैर-आक्रामक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल रक्त के थक्के के मॉडलिंग के लिए एक सुविधाजनक और आसानी से दोहराने की प्रक्रिया स्थापित करता है, उन्हें lysotripsy के साथ इलाज, और उपचार के दौरान एक साथ इमेजिंग । प्रोटोकॉल कदम हिस्टोट्रिप्सी बुलबुला बादल पीढ़ी, उपचार की योजना बना, और छवि मार्गदर्शन निर्दिष्ट आगे स्तन ट्यूमर, अग्नाशय ट्यूमर, और सौम्य प्रोस्थेटिक हाइपरप्लासिया, जहां हिस्टोट्राइप्सी मानक प्रक्रियाओं की तुलना में अधिक प्रभावी होने के लिए दिखाया गया है की विट्रो उपचार में जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है५७,५८। इस प्रोटोकॉल में आरटी-पीए के उपयोग को अन्य दवाओं या दवा वाहकों के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है जिनका उपयोग इस तरह के ट्यूमर के इलाज के लिए किया जाता है, साथ ही लाइटिक प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए हिस्टोट्रिप्सी के साथ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, ग्रांट R01HL13334 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक डॉ केविन हैवर्थ को डॉ केविन हैवर्थ को प्रोटोकॉल डिजाइन करने में उनके समर्थन के लिए ड्राबकिन की परख और डॉ विक्टर बोल्लेन के साथ सहायता करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । लेखक भी हिस्टोरिप्सी सोर्स डिजाइन करने पर उनके मार्गदर्शन के लिए डॉ एडम मैक्सवेल के आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

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बायोइंजीनियरिंग अंक 172 हिस्टोट्रिप्सी लाइसोट्रिप्सी थ्रोम्बोलिसिस हीमोलिसिस गहरी नस थ्रोम्बोसिस निष्क्रिय कैविटेशन इमेजिंग केंद्रित अल्ट्रासाउंड ध्वनिक कैविटेशन
हिस्टोट्रिप्सी और एक Lytic दवा की थ्रोम्बोलिटिक प्रभावकारिता गेज करने के लिए एक इन विट्रो सिस्टम
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Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

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