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Bioengineering

Un sistema in vitro per valutare l'efficacia trombolitica dell'istotripsia e di un farmaco lititico

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

La consegna litica assistita da istotripsia o lisitripsia è in fase di sviluppo per il trattamento della trombosi venosa profonda. Una procedura in vitro è presentata qui per valutare l'efficacia di questa terapia di combinazione. Vengono discussi i protocolli chiave per il modello di coagulo, la guida all'immagine e la valutazione dell'efficacia del trattamento.

Abstract

La trombosi venosa profonda (TVP) è un problema di salute globale. L'approccio principale per ottenere la ricanalizzazione dei vasi per le ostruzioni critiche è la trombolitica diretta dal catetere (CDT). Per mitigare gli effetti collaterali caustici e il lungo tempo di trattamento associato alla CDT, sono in fase di sviluppo approcci adiuvanti e alternativi. Uno di questi approcci è l'istotripsia, una terapia ad ultrasuoni focalizzata per ablare il tessuto tramite nucleazione a bolle. Studi pre-clinici hanno dimostrato una forte sinergia tra istotripsia e trombolitici per la degradazione del coagulo. Questo rapporto delinea un metodo da banco per valutare l'efficacia della terapia trombolitica assistita da istotripsia o litossitripsia.

I coaguli prodotti da sangue venoso umano fresco sono stati introdotti in un canale di flusso le cui dimensioni e proprietà acusto-meccaniche imitano una vena iliofemorale. Il canale è stato perfuso con plasma e l'attivatore del plasminogeno di tipo tisviale ricombinante lalitico. Le nuvole di bolle sono state generate nel coagulo con una sorgente di ultrasuoni focalizzata progettata per il trattamento dei coaguli venosi femorali. I posizionatori motorizzati sono stati utilizzati per tradurre la messa a fuoco della sorgente lungo la lunghezza del coagulo. In ogni luogo di insonazione, le emissioni acustiche della nube di bolle sono state registrate passivamente e formate in fascio per generare immagini di cavitazione passiva. Le metriche per valutare l'efficacia del trattamento includevano la perdita di massa del coagulo (efficacia complessiva del trattamento) e le concentrazioni di D-dimero (fibrinolisi) ed emoglobina (emolisi) nel perfusato. Ci sono limitazioni a questo disegno in vitro, compresa la mancanza di mezzi per valutare gli effetti collaterali in vivo o i cambiamenti dinamici nella portata come la lisi del coagulo. Nel complesso, la configurazione fornisce un metodo efficace per valutare l'efficacia delle strategie basate sull'istotripsia per il trattamento della TVP.

Introduction

La trombosi è la condizione di formazione di coaguli in un vaso sanguigno altrimenti sano che ostruisce la circolazione1,2. Il tromboembolismo venoso ha un costo sanitario annuo di $ 7-10 miliardi, con 375.000-425.000 casi negli Stati Uniti3. L'embolia polmonare è l'ostruzione dell'arteria polmonare ed è la conseguenza più grave del tromboembolismo venoso. La fonte primaria di ostruzione polmonare sono i trombi venosi profondi, principalmente dai segmenti venosi ileofemorali4,5,6. La trombosi venosa profonda (TVP) ha sequele intrinseche oltre alle ostruzioni polmonari, con complicanze a lungo termine che provocano dolore, gonfiore, ulcerazioni alle gambe e amputazioni degli arti7,8,9. Per le ostruzioni critiche, i trombolitici diretti dal catetere (CDT) sono l'approccio di prima linea per la ricanalizzazione della nave10. L'esito della CDT dipende da una serie di fattori, tra cui l'età del trombo, la posizione, le dimensioni, la composizione, l'eziologia e la categoria di rischio delpaziente 11. Inoltre, la CDT è associata a danni vascolari, infezioni, complicanze emorragiche e lungo tempo di trattamento10. I dispositivi di nuova generazione mirano a combinare la trombectomia meccanica con i trombolitici(cioèla trombectomia farmacocineccanica) 12,13. L'uso di questi dispositivi abbassa il dosaggio litico portando a una riduzione delle complicanze emorragiche e riduce il tempo di trattamento12,13,14 rispetto al CDT. Questi dispositivi conservano ancora problemi di effetti collaterali emorragici e rimozione incompleta di trombi cronici15. È quindi necessaria una strategia adiuvante in grado di rimuovere completamente il trombo con minori complicanze emorragici.

Un potenziale approccio è il trattamento trombolitico assistito da istotripsia, indicato come lysotripsy. L'istotripsia è una modalità di trattamento non invasiva che utilizza ultrasuoni focalizzati per nucleane nuvole di bolle nei tessuti16. L'attività della bolla è generata non tramite nuclei esogeni, ma dall'applicazione di impulsi ultrasonici con tensione sufficiente ad attivare nuclei intrinseci ai tessuti, tra cui il coagulo17,18. L'oscillazione meccanica della nube di bolle conferisce tensione al coagulo, disintegrando la struttura in detriti acellulari19. L'attività della bolla istotripsia fornisce un'efficace degradazione dei coaguli di sangue retratti e non rintracciati sia in vivo che in vitro20,21,22. Studi precedenti hannodimostrato 23,24 che la combinazione di istotripsia e attivatore del plasminogeno di tipo tissutale ricombinante lititico (rt-PA) aumenta significativamente l'efficacia del trattamento rispetto alla sola lititica o all'istotripsia da sola. Si ipotizza che due meccanismi primari associati all'attività della bolla istotripsia siano responsabili della migliore efficacia del trattamento: 1) aumento della fibrinolisi a causa di una maggiore consegna litica e 2) emolisi dei globuli rossi all'interno del coagulo. La maggior parte della massa del coagulo è composta da globuli rossi24e, pertanto, il monitoraggio della degradazione degli eritrociti è un buon surrogato per l'ablazione del campione. Altri elementi coaguli formati sono anche probabilmente disintegrati sotto l'attività della bolla istotripsia, ma non sono considerati in questo protocollo.

Qui, viene delineato un approccio da banco per trattare la TVP in vitro con lisitripsia. Il protocollo descrive i parametri operativi critici della fonte di istotripsia, la valutazione dell'efficacia del trattamento e la guida all'immagine. Il protocollo include la progettazione di un canale di flusso per imitare un segmento venoso iliofemorale e la produzione di coaguli di sangue intero umano. La procedura sperimentale delinea il posizionamento della sorgente di istotripsia e dell'array di imaging per ottenere l'esposizione istotripsia lungo il coagulo posto nel canale di flusso. Vengono definiti i parametri di insonazione rilevanti per ottenere l'interruzione del coagulo e ridurre al minimo l'attività della bolla fuori bersaglio. L'uso dell'imaging a ultrasuoni per la guida e la valutazione dell'attività delle bolle è illustrato24. Le metriche per quantificare l'efficacia del trattamento come la perdita di massa del coagulo, il D-dimero (fibrinolisi) e l'emoglobina (emolisi) sono delineate23,24,25,26,27. Nel complesso, lo studio fornisce un mezzo efficace per eseguire e valutare l'efficacia della lysotripsy per il trattamento della TVP.

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Protocol

Per i risultati qui presentati, il sangue umano venoso è stato prelevato per formare coaguli dopo l'approvazione da parte del comitato di revisione interno locale (IRB #19-1300) e il consenso informato scritto fornito da donatori volontari24. Questa sezione delinea un protocollo di progettazione per valutare l'efficacia della lisitripsia. Il protocollo si basa su un precedente lavoro di Bollen et al.24.

1. Modellazione del coagulo

NOTA: Preparare i coaguli entro 2 settimane ma più di 3 giorni prima del giorno dell'esperimento per garantire la stabilità del coagulo e massimizzare la retrazione28. Preparare il coagulo dopo l'approvazione da parte del comitato di revisione istituzionale locale.

  1. Preparare la pipetta Pasteur al borosilicato per la conservazione del sangue (vedere Tabella dei materiali per le specifiche della pipetta). I tubi borosilicati sono utilizzati a causa della natura idrofila del materiale che promuove l'attivazione piastrinica e la retrazione del coagulo29. Sigillare la punta della pipetta riscaldando un bruciatore Bunsen.
  2. Prelevare sangue venoso umano fresco. Aliquotare il sangue totale prelevato con incrementi di 2 ml per coagulo desiderato. Trasferire ogni aliquota da 2 ml in una pipetta Pasteur.
    NOTA: Eseguire il passaggio 1.2 entro circa 3 minuti dal prelievo di sangue in modo che il sangue non si coaguli prima del trasferimento alle pipette. Inoltre, assicurarsi che il donatore volontario non stia utilizzando farmaci che possano alterare la cascata di coagulazione (ad esempio fluidificanti del sangue o inibitori piastrinici).
  3. Incubare le aliquote di sangue all'interno delle pipette (pari al numero di coaguli necessari) a bagnomaria per 3 ore a 37 °C.
  4. Conservare le pipette per un minimo di 3 giorni a 4 °C per consentire la retrazione dei coaguli28. Mentre i coaguli si ritraggono, si osserverà che il siero si accumula nella parte superiore del coagulo all'interno della pipetta. La risposta rt-PA dei coaguli rimane stabile per 2 settimane dopo la retrazione28.

2. Preparazione del serbatoio dell'acqua

  1. Riempire il serbatoio dell'acqua con acqua ad osmosi inversa. Rivestire la superficie inferiore del serbatoio con un materiale acustico assorbente per ridurre la riflessione della terapia o l'imaging degli impulsi a ultrasuoni. Utilizzare un sistema di gestione dell'acqua per degassare e filtrare l'acqua per ridurre al minimo i nuclei di bolle.
    NOTA: un modo per filtrare l'acqua è utilizzare un filtro in linea. Le specifiche del sacchetto utilizzato per generare i risultati rappresentativi sono riportate nella Tabella dei materiali.
  2. Posizionare due elementi riscaldanti sulla superficie inferiore del serbatoio. Riscaldare l'acqua a 37,3 °C per ottenere la massima attività enzimatica30.
  3. Impostare un canale di flusso come illustrato nella Figura 1A. Il canale di flusso è costituito da tubi, un recipiente modello con materiale e proprietà geometriche rappresentative di una vena iliofemorale, un serbatoio per il plasma e una siringa sull'estremità distale più del serbatoio (Tabella dei materiali). La siringa è collegata a una pompa per regolare un flusso attraverso il canale durante l'esperimento.
  4. Immergere manualmente il canale di flusso nel serbatoio dell'acqua per portare il canale alla temperatura fisiologica durante la fase di degasaggio/filtraggio/riscaldamento (passaggi 2.1 e 2.2).

3. Preparazione della miscela di plasma e rt-PA

  1. Prima del giorno dell'esperimento
    NOTA: Se conservato a -80 °C, il plasma è stabile per almeno 2,5 anni31 e rt-PA è stabile per almeno 7 anni32. Pertanto, eseguire il passaggio 3.1 in qualsiasi momento entro questi periodi per garantire la stabilità dei due componenti.
    1. Diluire l'rt-PA ottenuto da un produttore in polvere a 1 mg/mL in acqua sterile.
    2. Aliquota 100 μL di rt-PA diluito in tubi centrifughi da 0,5 mL e conservarli a -80 °C.
    3. Aliquota 35 mL di plasma umano di tipo O congelato fresco in tubi da centrifuga da 50 mL. Conservare i tubi a -80 °C.
  2. Il giorno dell'esperimento
    1. Recuperare le aliquote di plasma dal congelatore. Recupera tante aliquote quante sono le quantità di coaguli da testare quel giorno. Immergere le aliquote congelate a bagnomaria a 37 °C per scongelare (~10 min).
    2. Una volta che il plasma si è scongelato, versarlo in un becher che viene risciacquato triplicamente con acqua ultrapura. Coprire leggermente la bocca del becher con un foglio di alluminio per evitare la contaminazione e posizionare il becher a bagnomaria. Lasciare che la lamina sia abbastanza sciolta da consentire all'aria di contattare il plasma.
    3. Lasciare che il plasma si equilibra a 37 °C alla pressione atmosferica per almeno 2 ore.
    4. Esere le fiale di rt-PA congelate e metterle sul ghiaccio fino a quando non è necessario, con una fiala per ogni esperimento.
    5. Produrre acarosio a bassa gelificazione (2%) in un matraccio da 50 ml, sciogliendo l'agarose in acqua ultrapura. Scegliere la quantità totale di soluzione di agarose in modo tale che siano disponibili circa 2 ml per ciascun campione da analizzare. Riscaldare la soluzione in un matraccio in un microonde fino a quando non è frizzante. Fissare il pallone con un coperchio a vite impermeabile su di esso. Immergere il pallone a bagnomaria accanto al plasma.
      NOTA: questo passaggio garantisce che l'agarose sia disponibile per proteggere i segmenti di coagulo esposti per l'analisi istologica dopo l'insonazione dell'istotripsia.

4. Impostazione della sorgente di istotripsia e dell'array di imaging

  1. Assicurarsi che i posizionatori motorizzati possano essere controllati dall'ambiente di runtime di una piattaforma di programmazione, utilizzando le indicazioni e i comandi forniti dal produttore. Verificare che i motori del sistema siano collegati alla porta appropriata del computer con l'ambiente di runtime.
  2. Montare la sorgente di istotripsia sul sistema di posizionamento motorizzato come mostrato nella Figura 1B.
  3. Collegare la sorgente di istotripsia alla sua elettronica di guida (ad esempio, amplificatore di potenza e generatore di funzioni) tramite i connettori appropriati (ad esempio, cavi BNC) come specificato dal produttore.
    NOTA: assicurarsi che l'elettronica di guida della sorgente di istotripsia possa essere controllata tramite l'ambiente di runtime utilizzato nel passaggio 4.1.
  4. Coprire l'array di imaging con un coperchio della sonda e apporre l'array coassialmente nell'apertura della sorgente di istotripsia come mostrato nella Figura 2. Assicurarsi di comprendere l'orientamento del piano di imaging rispetto all'orientamento della sorgente di istotripsia.
  5. Collegare l'array di imaging a un sistema di scansione ad ultrasuoni. Assicurarsi che questo sistema sia in grado di controllare il funzionamento e l'attivazione dell'array di imaging e raccogliere dati di imaging, secondo i comandi forniti dal produttore dello scanner.
  6. Immergere la sorgente di istotripsia/array di imaging nel serbatoio durante il degassamento come mostrato nella Figura 1A. Rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria utilizzando una siringa dalla superficie della sorgente di istotripsia o dell'array di imaging.
    NOTA: immergere completamente la sorgente di istotripsia e l'array di imaging in acqua prima dell'operazione. Evitare di toccare la superficie della sorgente di istotripsia.
  7. Acquisisci immagini in modalità B a una velocità di 20 fotogrammi al secondo utilizzando l'array di immagini e i comandi incorporati dello scanner. Regolare la finestra di imaging per garantire la visualizzazione della messa a fuoco della sorgente di istotripsia in queste immagini in tempo reale.
    NOTA: Si presume che le dimensioni della regione focale della fonte terapeutica siano note.
  8. Impostare i parametri operativi della sorgente istotripsia, tra cui la frequenza fondamentale (ad esempio, 1,5 MHz), la frequenza di ripetizione dell'impulso (ad esempio, 20-100 Hz), la durata dell'impulso (ad esempio, 1-20 cicli per impulso) e il numero totale di impulsi per posizione (ad esempio, 100-2.000)18,23,24,33. Modificare questi parametri se non si ottiene una sufficiente lisi del coagulo o se l'attività della bolla si estende oltre il lume del recipiente modello. Per impostare questi parametri, utilizzare il protocollo fornito dal produttore dell'origine o utilizzare una piattaforma di programmazione in grado di comunicare con l'origine (passaggio 4.3).
  9. Utilizzando il protocollo del produttore o la piattaforma di programmazione utilizzata nel passaggio 4.8, eseguire la sorgente di istotripsia ai parametri impostati solo in acqua degassata, senza alcuna ostruzione nell'ambiente circostante. Aumentare la tensione applicata alla sorgente di istotripsia fino a formare una nuvola di bolle.
  10. Utilizzando l'imaging in tempo reale del passaggio 4.7, regolare la posizione dell'array di immagini all'interno dell'apertura del trasduttore confocale fino a quando la nuvola di bolle non si trova approssimativamente al centro della finestra dell'immagine. La nube a bolle è la regione dei pixel iperecoici nel piano di imaging (Figura 3). Stringere le viti per tenere saldamente l'array di immagini nell'apertura del trasduttore.
    NOTA: se l'array è allineato correttamente, la posizione azimutale della nube a bolle deve essere approssimativamente a 0 mm nel piano di imaging. L'array di imaging può proiettare leggermente dalla superficie interna della sorgente di terapia, e quindi la posizione dell'intervallo della nube di bolle può differire dalla lunghezza focale della sorgente.
  11. Identificare la posizione della nuvola di bolle nel piano di imaging. Assegnare il focus della sorgente di istotripsia come centro della nube a bolle (Figura 3).
  12. Registrare la posizione focale rilevata (passaggio 4.11) nella finestra di imaging (Figura 3). Un modo possibile per contrassegnare la posizione focale è posizionare un cursore per annotare la posizione nella finestra di imaging, se disponibile con la piattaforma di imaging.
  13. Interrompere l'insonazione e impostare la tensione applicata alla sorgente di istotripsia su 0 V.

5. Preparazione del coagulo

  1. Rimuovere il coagulo dalla pipetta tagliando l'estremità sigillata con una pinza. Lasciare che il coagulo scivoli in una capsula di Petri insieme al siero. Se il coagulo non si sposta, applicare delicatamente una pressione dall'altra estremità della pipetta tramite filo salino per rimuovere il coagulo.
  2. Tagliare il coagulo a 1 cm di lunghezza usando un bisturi, mirando a un pezzo uniforme dal centro (cioè lontano da sezioni del coagulo formate nella parte superiore o inferiore della pipetta).
  3. Utilizzare una salvietta detergente per asciugare delicatamente la sezione tagliata del coagulo per rimuovere il liquido in eccesso.
  4. Utilizzando una pinzetta, posizionare delicatamente la sezione del coagulo su una bilancia e registrare il peso.
  5. Sollevare manualmente il canale di flusso fuori dal serbatoio dell'acqua e rimuovere il recipiente modello dal canale di flusso.
  6. Posizionare il coagulo nel recipiente modello usando una pinzetta e collegare nuovamente il recipiente modello al canale di flusso.
    NOTA: un'asta di nylon può essere posizionata all'interno del recipiente modello per evitare che il coagulo si muova a valle a causa del flusso.
  7. Abbassare il canale di flusso nel serbatoio in modo tale che l'estremità prossimale dello stadio rispetto al serbatoio sia bassa rispetto al lato distale. L'inclinazione dello stadio in questo modo impedisce l'intrappolamento di bolle nel recipiente modello quando il plasma viene aspirato attraverso il canale di flusso nel passaggio 6.1.
  8. Aggiungere 30 ml di plasma al serbatoio utilizzando una pipetta e monitorare la temperatura fino a raggiungere almeno 36 °C.
  9. Utilizzare una pipetta per erogare l'rt-PA (80,4 μg in 30 ml di plasma, 2,68 μg/mL) nel serbatoio di plasma. Mescolare il plasma con la pipetta per garantire una distribuzione uniforme di rt-PA all'interno del serbatoio.

6. Adescamento del canale di flusso

  1. Aspirare il plasma nel canale di flusso dal serbatoio tramite la pompa della siringa fino a quando il plasma non riempie il recipiente modello.
    NOTA: se il coagulo non è a filo con l'asta di nylon, utilizzare brevi tiranti della pompa a 60 ml/min per cercare di forzare il plasma a valle del coagulo o aspirare manualmente attraverso la siringa. Limitare la quantità di plasma aspirato in questo processo o riempire il serbatoio utilizzando plasma/rt-PA aggiuntivo per garantire 30 ml di soluzione nel canale di flusso.
  2. Utilizzando i posizionatori motorizzati, allineare l'array di imaging parallelamente alla lunghezza del coagulo utilizzando lo script di imaging (passaggio 4.7). L'allineamento parallelo consente all'utente di garantire visivamente il corretto posizionamento del coagulo e l'assenza di bolle all'interno del recipiente modello.
  3. Livellare il recipiente modello manualmente e visivamente per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria utilizzando la finestra di imaging (passaggio 4.7).

7. Procedura dell'esperimento

  1. Pre-trattamento
    NOTA: questo passaggio consiste nel pianificare un percorso per la sorgente di istotripsia/array di imaging per un'esposizione uniforme all'istotripsia lungo la lunghezza del coagulo.
    1. Allineare l'array di imaging utilizzando i posizionatori motorizzati in modo tale che il piano di imaging sia parallelo alla sezione trasversale del coagulo (cioè perpendicolare all'orientamento descritto nel passaggio 6.2).
    2. Sotto guida tramite la finestra di imaging (passaggio 4.7), spostare la sorgente di istotripsia all'estremità prossimale del coagulo rispetto al serbatoio utilizzando i posizionatori motorizzati. A questo punto, regolare la posizione della sorgente di istotripsia in modo tale che il punto focale contrassegnato nel passaggio 4.12 si allinei con il centro del coagulo.
    3. Determinare il percorso di insonazione lungo la lunghezza del coagulo. Per definire questo percorso, impostare tre waypoint lungo la lunghezza del coagulo (cioè le posizioni dei motori in cui l'attività della bolla istotripsia è contenuta all'interno del coagulo) con incrementi di 5 mm. Allineare i waypoint in modo tale che il moto complessivo della sorgente istotripsia lungo il percorso sia anantegrado con il flusso nel sistema (cioè, il primo waypoint è all'estremità più prossimale del coagulo rispetto al serbatoio, e il terzo waypoint è in posizione distale rispetto al serbatoio).
    4. Prima di finalizzare ogni waypoint, il test del fuoco pulsa dalla sorgente istotripsia con gli stessi parametri di insonazione del passaggio 4.8, ma riduce l'esposizione complessiva a 10 impulsi totali. Regolare la posizione della sorgente di istotripsia utilizzando i posizionatori motorizzati, se necessario, per contenere l'attività della bolla all'interno del coagulo.
    5. In ogni waypoint, salvare le posizioni del motore utilizzando i comandi forniti dal produttore, in modo simile al passaggio 4.1.
  2. Trattamento
    NOTA: Questa fase definisce la procedura per trattare il coagulo lungo la sua lunghezza in base al percorso definito nella fase di pre-trattamento.
    1. Aegua la pompa della siringa a 0,65 ml/min e attendi che il menisco del plasma si muova. Questa portata imita un'occlusione quasi totale della vascolarizzazione iliofemorale24,34.
    2. Interpolare il percorso creato nel passaggio 7.1.3 con passaggi intermedi tra i waypoint stabiliti con una dimensione del passo fissa (ad esempio, 0,5 mm). La dimensione del passo viene scelta per essere inferiore alla metà della larghezza della regione focale misurata lungo la lunghezza del coagulo (direzione di elevazione dell'array di imaging). Spostare la sorgente di istotripsia utilizzando posizionatori motorizzati in ogni posizione del percorso con i parametri di insonazione definiti nel passaggio 4.8.
    3. Monitorare l'attività della bolla/immagine durante l'applicazione dell'impulso istotripsia in ogni posizione del percorso utilizzando la finestra di imaging (passaggio 4.7). Centra l'immagine sulla messa a fuoco dell'istotripsia con le dimensioni dell'immagine che coprono 15 mm nell'azimut e nell'intervallo. Prima dell'applicazione dell'impulso istotripsia in ogni posizione, acquisire un'immagine in modalità B per fornire la visualizzazione del coagulo e del vaso modello, creando uno script in una piattaforma di programmazione. Assicurarsi che lo script stabilisca la comunicazione con lo scanner utilizzando i comandi del produttore.
    4. Durante l'applicazione dell'impulso istotripsia, implementare l'acquisizione delle emissioni acustiche nello script al punto 7.2.3 per formare immagini di cavitazione passiva post hoc35. Acquisire un'immagine di cavitazione passiva dopo ogni 10 impulsi di trattamento. Applicare una compensazione del guadagno temporale piatto di 50 a 8 profondità incrementali fino alla fine della profondità di imaging. Scegli una dimensione della finestra di acquisizione appropriata in modo tale che l'intero segnale dal coagulo venga catturato con una perdita minima di energia dovuta alla finestra35.
    5. Se sono presenti nuvole di bolle fuori bersaglio, regolare la posizione del trasduttore in situ con i posizionatori motorizzati.
      NOTA: monitorare i trigger mancati dell'array di immagini. Regolare il numero di set di dati di imaging acquisiti per garantire che l'archiviazione dei dati sia completata prima del successivo attivazione.

8. Procedura post-esperimento

  1. Sollevare manualmente il recipiente modello dal serbatoio dell'acqua per drenare il perfusato per gravità. Assicurarsi di mantenere il canale di flusso livellato per evitare che il coagulo si muova a valle e fuori dal recipiente modello durante il drenaggio.
  2. Raccogliere l'intero perfusato per ulteriori analisi in un piccolo becher (Figura 4A) disegnando la soluzione di plasma dal canale di flusso attraverso la pompa della siringa a una portata molto bassa.
  3. Scollegare il recipiente modello e rimuovere il coagulo. Se necessario, iniettare una piccola quantità di soluzione salina nel recipiente modello per rimuovere delicatamente il coagulo.
  4. Pulire il coagulo in modo simile al passaggio 1.2.3. Pesare il coagulo sulla bilancia per valutare la perdita di massa del coagulo.
  5. Per analizzare il contenuto di D-dimero, aggiungere 100 mg di acido aminocaproico a un tubo di microcentrifuga seguito da 1 mL di perfusato e mescolare bene usando una pipetta. Eseguire un test immuno-turbidimetrico del lattice per quantificare il D-dimero all'interno del campione36.
  6. Per valutare l'emolisi, aggiungere 1 mL di perfusato ai tubi della centrifuga e ruotare a 610 x g (3.500 giri/min) per 10 minuti. Combinare 0,5 mL di surnatante (concentrato) con 0,5 mL di soluzione di Drabkins e lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. Trasferire 200 μL alle piastre del pozzo, come mostrato nella Figura 4B. Utilizzare un lettore di piastre per leggere l'assorbanza a 540 nm, Figura 4C (saggio Drabkins37).
  7. Valutazione istologica
    1. Tagliare una sezione dal centro del coagulo di circa 2-3 mm di lunghezza con un bisturi.
    2. Aggiungere la sezione a una cassetta. Mantenere l'orientamento della sezione rispetto alla direzione della propagazione dell'impulso istotripsia.
    3. Aggiungere 2 mL di soluzione di agarose a bassa gelificazione preparata al punto 3.2.5 nella cassetta per fissare il coagulo in posizione.
    4. Fissare il campione in formalina al 10% per 24 ore. Posizionare il campione in alcool al 70% dopo 24 ore ed eseguire la colorazione standard di emotoxilina-eosina38.

9. Analisi delle immagini di cavitazione passiva

  1. Elaborare i segnali acquisiti dall'array di imaging durante l'eccitazione istotripsia (fase 7.2.4) utilizzando un algoritmo basato sul robusto capon beamformer39 per creare un'immagine delle emissioni acustiche generate dalla nube di bolle in ogni luogo di trattamento.
    NOTA: Per generare immagini quantitative, seguire i passaggi descritti in Haworth et al.35. In caso contrario, ogni valore di pixel nell'immagine dovrebbe rappresentare l'energia acustica relativa della nuvola di bolle (unità di V2) in ogni posizione corrispondente.
  2. Segmentare l'immagine in modalità B acquistata nei passaggi 7.2.3 per distinguere tra i pixel che rappresentano il coagulo e il recipiente modello.
  3. Co-registrare l'immagine di cavitazione passiva con l'immagine in modalità B come mostrato nella Figura 5B. Sommare l'energia acustica all'interno del coagulo durante il periodo di esposizione35.

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Representative Results

Il protocollo delineato in questo studio evidenzia i dettagli della modellazione del coagulo venoso, della lisotripsia per l'interruzione del coagulo e dell'imaging ecografico in una configurazione in vitro della TVP. La procedura adottata dimostra i passaggi necessari per valutare l'interruzione del coagulo dovuta agli effetti combinati dell'attività della nube a bolle di rt-PA e istotripsia. La configurazione da banco è stata progettata per imitare le caratteristiche di una vena iliofemorale venosa. La Figura 1A mostra un vaso modello che ha le proprietà acustiche, meccaniche e geometriche della vena iliofemorale. Il coagulo viene posto all'interno del vaso modello per imitare un trombo parzialmente occlusivo. Il coagulo viene perfuso con plasma e rt-PA prelevati da un serbatoio ad una velocità di 0,65 ml / min. Questa velocità è coerente con la portata lenta in un recipiente altamente occluso34.

Un trasduttore ellitticamente focalizzato di frequenza fondamentale di 1,5 MHz con un asse maggiore di 9 cm, un asse minore di 7 cm e una lunghezza focale di 6 cm(Figura 2A)è montato sul sistema di posizionamento come indicato nella Figura 1B. Un array di imaging coperto con gel ad ultrasuoni e una copertura in lattice (Figure 2B, C) è montato coassialmente con il trasduttore come mostrato nella Figura 1A tramite un'apertura al centro della sorgente di istotripsia. I posizionatori motorizzati sono stati utilizzati per tradurre il trasduttore di terapia/ array di imaging lungo la lunghezza del coagulo all'interno del vaso modello (Figura 1). Dopo l'applicazione di una tensione sufficiente alla sorgente di istotripsia, viene generata una nube di bolle nella regione focale del trasduttore e visualizzata tramite imaging ad ultrasuoni, come mostrato nella Figura 3. La posizione focale è definita come il centro della nube a bolle utilizzando il piano di imaging (passi 4.10-4.11).

La Figura 4A mostra i perfusati raccolti per due diverse condizioni di trattamento. Il becher etichettato come controllo contiene perfusato di un coagulo esposto al solo plasma. Il secondo becher etichettato come trattato contiene il perfusato del coagulo trattato con lisitripsia. I perfusati raccolti vengono utilizzati per valutare il contenuto di emoglobina (metrica di emolisi) e D-dimero (metrica della fibrinolisi) attraverso saggi come specificato nel protocollo. La differenza di colore dei perfusati denota variabilità nella concentrazione di emoglobina, che può essere quantificata tramite assorbanza ottica. La relazione tra valore di assorbanza e concentrazione di emoglobina può essere determinata attraverso una curva di calibrazione. Le soluzioni con contenuto noto di emoglobina compreso tra 0 (misurazione in bianco) e 180 mg/mL vengono poste nella piastra del pozzo e l'assorbanza viene determinata in triplice copia utilizzando il lettore di piastre (Figura 4B,C). Il limite superiore di assorbanza del lettore di piastre può variare e potrebbe non essere noto a priori per realizzare le soluzioni nella piastra del pozzo. Pertanto, le concentrazioni di emoglobina fino a 180 mg / mL sono prodotte nella piastra del pozzo, Figura 4B. Tuttavia, il lettore di piastre utilizzato qui può leggere l'assorbanza solo per concentrazioni fino a 23 mg / mL, Figura 4C.

La Figura 5A mostra la visualizzazione del coagulo all'interno del vaso modello tramite imaging in modalità B prima dell'esposizione all'istotripsia come specificato nel passaggio 7.2.3. Questa immagine viene acquisita per determinare la posizione del coagulo per la segmentazione dell'immagine di cavitazione passiva. La Figura 5B mostra l'immagine di cavitazione passiva co-registrata con l'immagine in modalità B acquisita prima dell'esposizione all'istotripsia. Questa cifra conferma che l'energia acustica è contenuta principalmente all'interno del coagulo durante l'esposizione all'istotripsia.

La tipica interruzione del coagulo dovuta a istotripsia e lititica è indicata nella Figura 6. La Figura 6A,B mostra rispettivamente le immagini del coagulo non trattate e trattate con lysotripsia. Per i campioni esposti all'istotripsia, l'interruzione è principalmente limitata al centro del coagulo, in linea con le posizioni osservate dell'attività della bolla tracciate con l'imaging della cavitazione passiva (Figura 5B). Tuttavia, con l'aggiunta di lytic, la perdita di massa si verifica anche in regioni più vicine alla periferia del coagulo. Si ipotizza che questa ulteriore perdita di massa sia dovuta a una maggiore miscelazione fluida della fluidità della lirica sotto l'attività della bolla. La miscelazione del fluido aumenta la distribuzione e la profondità di penetrazione del litico nel coagulo. Poiché il litico è responsabile della fibrinolisi40, la perdita di massa aumenta. La fibrinolisi può essere quantificata misurando il contenuto di D-dimero nel perfusato41.

Figure 1
Figura 1: Configurazione sperimentale per la litotripsia del coagulo di sangue umano. (A) I componenti dell'impianto sono (1) sorgente di istotripsia focalizzata con geometria ellittica, (2) array di immagini rivestito in lattice, (3) vaso modello collegato al canale di flusso, (4) canale di flusso, (5) serbatoio, (6) materiale assorbente acustico, (7) elemento riscaldante e (8) serbatoio d'acqua riempito con acqua di osmosi inversa degassata e riscaldata. La dimensione azimutale del piano di imaging è perpendicolare alle dimensioni elevazionale e di intervallo (nella pagina). (B) La sorgente di istotripsia montata sul sistema di posizionamento motorizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Sorgente di ultrasuoni e componenti di imaging. Singole immagini ingrandite di(A)sorgente di istotripsia focalizzata,(B)array di imaging e(C)array di imaging con gel ad ultrasuoni e copertura in lattice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Nuvola di bolle di istotripsia visualizzata utilizzando l'array di immagini. Una nuvola di bolle viene generata nella zona focale della sorgente di istotripsia e ripresa utilizzando un array di immagini. Il focus designato, mostrato come una croce, viene salvato per la pianificazione del trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Quantificazione dell'emoglobina rilasciata a causa della lisi del coagulo. (A) Campioni di perfusato raccolti a seguito di studio di controllo con plasma da solo (senza istotripsia o litica) e braccio di trattamento, istotripsia (ad esempio, pressione negativa di picco di 35 MPa, durata dell'impulso a 5 cicli, frequenza fondamentale di 1,5 MHz) ed esposizione litica a 2,68 μg/mL. (B) Piastra contenente diluizioni di concentrazioni note di emoglobina comprese tra 180 mg/mL (fila superiore, angolo più a sinistra) a 0 mg/mL (riga inferiore, angolo più a destra). La punta della freccia punta verso la diminuzione della concentrazione di emoglobina. (C) Questi campioni vengono utilizzati per creare una curva standard per quantificare l'emoglobina prodotta a causa dell'esposizione all'istotripsia tramite spettrofotometria. La curva di assorbanza per concentrazioni di emoglobina comprese tra 0 e 23 mg/mL si ottiene a causa della limitazione del lettore di piastre nell'analisi di concentrazioni più elevate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Immagini del coagulo durante il trattamento. ( A )Immaginein modalità B acquisita prima dell'iniziodel trattamento che mostra la posizione del coagulo all'interno del recipiente modello. (B) Visualizzazione post-hoc dell'emissione di energia acustica calcolata dall'imaging a cavitazione passiva mostrato in hot colormap co-registrato con l'immagine in modalità B del coagulo acquisito prima dell'applicazione dell'impulso istotripsia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Istologia del coagulo ablato in diverse condizioni di trattamento. (A) Coagulo di controllo senza trattamento. (B) Coagulo trattato con lisitripsia (ad esempio, pressione negativa di picco di 35 MPa, durata dell'impulso a ciclo singolo, frequenza fondamentale di 1,5 MHz). L'impulso istotripsia si è propagato dall'alto verso il basso in questa immagine. Il percorso per la sorgente di istotripsia lungo la lunghezza del coagulo (cioè perpendicolare al piano dell'immagine mostrata qui) è definito al passo 7.2.3. La scala delle micrografie è di 2 mm. Si noti che il grado di interruzione del coagulo raggiunto qui sarebbe ridotto rispetto agli schemi di insonazione con una durata dell'impulso piùlunga 24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo proposto presenta un modello per quantificare l'efficacia del trattamento della lisitripsia. Mentre i dettagli chiave sono stati discussi, ci sono alcuni aspetti critici da considerare per il successo di questo protocollo. L'attività enzimatica di rt-PA ha una dipendenza dalla temperatura di Arrhenius30. La temperatura è anche un fattore che contribuisce alla velocità del suono nell'acqua e nei tessuti, e le variazioni di temperatura possono causare piccole alterazioni della geometria della zona focale. Pertanto, la temperatura dell'acqua deve essere attentamente regolata a 37 °C. La dose di rt-PA utilizzata nel protocollo (2,68 μg/mL) è coerente con quella impiegata clinicamente per altre strategie di trombectomia farmacomeccanica42. Nella fase 5.8, 30 mL di plasma vengono trasferiti al serbatoio, mentre un'aliquota di 35 mL è annotata nel passaggio 3.1.3. Questo plasma aggiuntivo rappresenta la perdita di plasma dovuta all'evaporazione nel corso delle ore quando riscaldato a 37 °C per l'equilibrio alla pressione atmosferica.

La lunghezza focale, la larghezza dell'apertura e la frequenza del trasduttore terapeutico determinano le dimensioni e la profondità della regione focale. Pertanto, il trasduttore deve essere scelto in modo tale che queste caratteristiche si allineino con il diametro e la profondità del vaso bersaglio (ad esempio vena femorale: 2-4 cm di profondità e 0,6-1,2 cm di diametro)43. L'estensione dell'ablazione meccanica è limitata all'estensione della nube a bolle. Pertanto, una comprensione del ruolo che i parametri di insonazione svolgono nel modificare il comportamento della nuvola di bolle istotripsia è fondamentale33,44,45. La frequenza e l'intensità del campo acustico dovrebbero anche essere scelte notando l'entità dell'attenuazione dovuta ai materiali medi e intermedi (ad esempio, nave modello). Per garantire il confinamento dell'attività della bolla con la nave bersaglio, è necessario scegliere una finestra di imaging appropriata per monitorare la zona focale. I parametri operativi del trasduttore devono essere scelti per evitare effetti fuori bersaglio massimizzando al contempo l'interruzione meccanica del coagulo. In questo protocollo, la perdita di massa è stata considerata una metrica primaria dell'efficacia del trattamento. Aumenti della perdita di massa sono stati osservati quando la pressione negativa di picco o la durata dell'impulso istotripsia sono aumentate24,46, con una perdita di massa massima osservata del 94%. La presenza di coagulo residuo per i bracci di trattamento studiati facilita il confronto dell'efficacia terapeutica. Tuttavia, possono essere ideati anche schemi di insonazione per garantire la rimozione totale del trombo.

L'impedenza acustica (circa 1,58 MRayl47,48)e le proprietà geometriche (0,6-1,2 cm di diametro43)del recipiente modello devono essere rappresentative della vascolarizzazione venosa iliofemorale (vedi Tabella dei materiali per i dettagli). Polidimetilsilossano e poliuretano sono alcuni degli altri materiali adatti a modellare il sistema venoso in base alle loro proprietà acusto-meccaniche. Nel passaggio 7, è importante rimuovere tutte le bolle d'aria dalla nave modello per evitare di schermare il coagulo dall'esposizione istotripsia. Per un vaso modello di materiale idrofobo, le nuvole di bolle possono formarsi preferenzialmente vicino alla parete del vaso anziché al centro del coagulo. Pertanto, il monitoraggio continuo della nube di bolle deve essere effettuato durante il trattamento tramite imaging a ultrasuoni e il trasduttore deve essere riposizionato se necessario. Dovrebbero essere condotti studi pilota per determinare i parametri di insonazione dell'istotripsia (ad esempio, durata dell'impulso e pressione di picco) che raggiungono l'interruzione finale del coagulo prevista.

L'array di imaging viene utilizzato per acquisire immagini in modalità B e immagini di cavitazione passiva per la visualizzazione del trattamento e per quantificare l'attività delle bolle. L'imaging in modalità B consente la visualizzazione del vaso modello e del coagulo e l'imaging a cavitazione passiva misura l'energia dell'attività della bolla associata all'ablazione del coagulo24,49. La larghezza di banda dell'array di immagini deve essere allineata all'attività cloud a bolle desiderata con un elevato rapporto segnale-rumore. Per ottenere segnali puramente a banda larga associati al collasso inerziale delle bolle all'interno della nuvola, la larghezza di banda dell'array non deve coincidere con la frequenza fondamentale del trasduttore50,51. Gli impulsi di istotripsia sono altamente non lineari52ed è probabile che armoniche della frequenza fondamentale siano presenti nel segnale ricevuto. Il sistema di imaging deve essere programmato per attivarsi in base al tempo di volo noto dell'impulso istotripsia dalla sorgente alla zona focale per garantire la raccolta di dati di imaging a cavitazione passiva completa durante l'insonazione. Questi segnali dovrebbero quindi essere elaborati post hoc come discusso nei passaggi 7.2.3 e 9 del protocollo.

Va notato che la quantità di emolisi è sensibile alla manipolazione del coagulo. Pertanto, è necessario prestare attenzione per ridurre al minimo i danni al coagulo prima del trattamento. Per garantire la riproducibilità, la modellizzazione dei coaguli (fase 1) e il tempo di pre-trattamento (fasi 6 e 7.1) devono essere gli stessi per tutti i coaguli trattati con o senza esposizione all'istotripsia. Nella fase post-trattamento della valutazione dell'emolisi, va notato che il plasma ha una propria assorbanza. Pertanto, il diluente utilizzato per formare curve standard (ad esempio, assorbanza ottica vs emoglobina) dovrebbe essere formato utilizzando lo stesso fluido usato come perfusato nel canale di flusso (ad esempio, in questo studio, il plasma è stato usato come diluente per formare curve standard).

Questo protocollo mira a fornire una configurazione da banco per valutare l'efficacia della lisitripsia per il trattamento di coaguli di sangue intero umano. Ci sono alcune limitazioni che sorgono a causa della natura in vitro del set-up. I coaguli acuti utilizzati per questo protocollo consistevano principalmente di globuli rossi e fibrina, rendendo l'approccio della lisitripsia efficace per la TVP. Tuttavia, le fasi successive del trombo possono sviluppare una rete collagenosa rigida53 che può resistere al trattamento con lysotripsy a causa della natura specifica della fibrina di rt-PA. Quando si tratta in vivo, l'endpoint clinico primario per l'efficacia del trattamento è il ripristino del flusso. La perdita di massa era una metrica primaria per l'efficacia del trattamento nel protocollo in vitro qui descritto. Sebbene il flusso non sia stato valutato in questo protocollo, l'imaging Doppler a colori può essere ulteriormente incorporato insieme all'imaging a cavitazione passiva nel passaggio 7.2.4 per monitorare il ripristino del flusso. La configurazione in questo protocollo utilizza una portata fissa, imitando la portata in un recipiente altamente occluso, durante l'intero trattamento nel passaggio 7.2. In vivo, il flusso vascolare aumenterà man mano che il coagulo si disintegra durante il trattamento. Le sollecitazioni di taglio aggiuntive associate all'aumento del flusso accentueranno il profilo di degradazione del coagulo54. In vivo gli effetti off-target non possono essere accertati in questa configurazione, come sanguinamento dovuto alla somministrazione sistemica dilytic 55, danno alla parete del vaso o vasospasmo dovuto all'attività della nube di bolle22. La natura in vitro di questo studio limita anche la capacità di valutare i risultati a lungo termine, come la pervietà dei vasi o la ri-trombosi dopo il trattamento. La somministrazione di lytic in questo studio ha imitato trombolitici sistemici, mentre i lytics diretti dal catetere sono l'intervento preferito per la trombosi venosa7,14. L'attenuazione dei tessuti può influenzare il campo istotripsia e la qualità dell'imaging per gli studi in vivo, mentre qui il percorso acustico è principalmente attraverso l'acqua degassata. L'elaborazione dei dati di emissione di cavitazione con il robusto capon beamformer (fase 9 del protocollo) è computazionalmente costosa ed è stata condotta off-line per analisi post hoc. Altri beamformer (ad esempio, delay-and-sum35 o spettro angolare56) possono essere utilizzati in alternativa per fornire feedback in tempo reale, anche se con una risoluzione di portata ridotta.

In sintesi, questo protocollo presenta un approccio non invasivo per ottenere una trombolisi venosa profonda dei coaguli di sangue umano. Il protocollo stabilisce una procedura comoda e facile da replicare per la modellazione dei coaguli di sangue, il loro trattamento con lisotripsia e l'imaging simultaneo durante il trattamento. Le fasi del protocollo che specificano la generazione di nuvole di bolle istotripsia, la pianificazione del trattamento e la guida dell'immagine possono essere ulteriormente utilizzate per studiare i trattamenti in vitro del tumore al seno, del tumore pancreatico e dell'iperplasia prostatica benigna, in cui l'istotripsia ha dimostrato di essere più efficace rispetto alle procedure standard57,58. L'uso di rt-PA in questo protocollo può essere generalizzato ad altri farmaci o vettori di farmaci che vengono utilizzati per il trattamento di tali tumori, insieme all'istotripsia per aumentare l'efficacia lititica.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kevin Haworth per l'assistenza con il test di Drabkin e il Dr. Viktor Bollen per il suo supporto nella progettazione del protocollo. Gli autori sono anche grati al Dr. Adam Maxwell per la sua guida sulla progettazione della fonte di istotripsia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioingegneria Numero 172 istotripsia lisotripsia trombolisi emolisi trombosi venosa profonda imaging a cavitazione passiva ultrasuoni focalizzati cavitazione acustica
Un sistema in vitro per valutare l'efficacia trombolitica dell'istotripsia e di un farmaco lititico
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Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

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