Summary
히스토트립시 에이드 리시 전달 또는 리소트립시 심부 정맥 혈전증 치료를 위해 개발 중입니다. 시험관 내 절차는 이 조합 치료의 효험을 평가하기 위하여 여기에서 제출됩니다. 응고 모델에 대한 주요 프로토콜, 이미지 지침 및 치료 효능 평가에 대해 설명합니다.
Abstract
깊은 정맥 혈전증 (DVT)은 글로벌 건강 문제입니다. 중요한 장애물을 위한 혈관 재냉화를 달성하기 위한 1차적인 접근은 카테터 지향 혈전성 (CDT)입니다. 가성 부작용및 CDT와 관련되었던 긴 처리 시간을 완화하기 위하여는, 보조및 대체 접근은 개발되고 있습니다. 이러한 접근 방법 중 하나는 히스토트립시, 거품 구름 핵형성을 통해 조직을 축산하는 집중초음파 요법이다. 전 임상 연구는 혈전 분해를 위한 히스토트립시와 혈전 분해 사이의 강한 시너지 효과를 입증했습니다. 이 보고서는 히스토트립시 보조 혈전용 요법 또는 리소트립시의 효능을 평가하는 벤치탑 방법을 간략하게 설명합니다.
신선한 인간 정맥 혈액에서 제조 된 혈전은 그 크기와 아쿠스토 기계적 특성이 일로페모랄 정맥을 모방 흐름 채널로 도입되었다. 채널은 플라즈마와 리틱 재조합 조직 형 플라스미노겐 활성제로 침투하였다. 기포 구름은 대퇴 정맥 혈전의 치료를 위해 설계된 집중 초음파 소스와 응고에서 생성되었다. 전동 포지셔너는 응고 길이를 따라 소스 포커스를 변환하는 데 사용되었습니다. 각 음광 위치에서 버블 클라우드의 음향 방출이 수동적으로 기록되고 빔을 형성하여 수동 캐비테이션 이미지를 생성했습니다. 치료 효능을 측정하는 메트릭에는 응고 질량 손실(전체 치료 효능) 및 퍼퓸에서 D-디머(fibrinolysis) 및 헤모글로빈(혈전)의 농도가 포함되었다. 생체 외 디자인에 이에 제한이 있다, 생체 내 부작용 또는 혈전 lyses로 유량의 동적 변화를 평가 하는 수단의 부족을 포함 하 여. 전반적으로, 설정은 DVT를 취급하기 위하여 히스토트립시 기지를 둔 전략의 효험을 평가하는 효과적인 방법을 제공합니다.
Introduction
혈전증은순환을방해하는 건강한 혈관에서 응고 형성의 상태입니다1,2. 정맥 혈전 색전증은 미국에서 375,000-425,000 의 경우와 함께, 7-100 억 달러의 연간 의료 비용을 가지고3. 폐 색전증은 폐 동맥의 방해이며 정맥 혈전 색전증의 가장 심각한 결과입니다. 폐 방해의 주요 근원은 깊은 정맥 혈전, 주로 일리오페랄 정맥 세그먼트4,5,6에서. 깊은 정맥 혈전증 (DVT)은 폐 장애물 외에 내재 된 후유증을 가지고 있으며, 통증, 붓기, 다리 궤양 및 사지 절단7,8,9의장기 합병증을 앓고 있습니다. 중요한 장애물의 경우 카테터 지향 혈전용성(CDT)은 선박재방수(10)의최전선 접근법이다. CDT의 결과는 혈전 나이, 위치, 크기, 조성, 병인학 및 환자 위험 범주11을포함한 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 더욱이, CDT는 혈관 손상, 감염, 출혈 합병증 및 긴 치료 시간10과연관된다. 차세대 장치는 기계적 혈전 절제술과 혈전성(즉, 약동기계 혈전절제술)을 12,13로결합하는 것을 목표로 한다. 이러한 장치의 사용은 감소 된 출혈 합병증으로 이어지는 용액 복용량을 낮추고, CDT에 비해 치료 시간12,13,14 단축. 이러한 장치는 여전히 출혈 성 부작용및 만성 혈전15의불완전한 제거의 문제를 유지합니다. 따라서 낮은 출혈 합병증으로 혈전을 완전히 제거 할 수있는 보조 전략이 필요합니다.
한 가지 잠재적인 접근법은 히스토트립시 보조 혈전용 치료이며, 리소트립시라고 합니다. 히스토트립증은조직(16)에서기포 구름을 핵에 심기 위해 집중초음파를 사용하는 비침습적 치료 양식이다. 버블 활성은 외인성 핵을 통해서가 아니라혈전(17,18)을포함한 조직에 내재된 핵을 활성화하기에 충분한 장력을 가진 초음파 펄스의 적용에 의해 생성된다. 기포 구름의 기계적 진동은 응고에 변형을 부여하여 구조를 세포이물질(19)으로붕괴시한다. 히스토트립시 버블 활성은 생체 내 및 시험관 내20,21,22모두에서 후퇴및 폐개되지 않은 혈전의 효과적인 분해를 제공한다. 선행 연구는23,24 히스토트립티와 리틱 재조합 조직 형 플라스미노겐 활성제 (rt-PA)의 조합이 단독으로 또는 히스토트립시에 비해 치료 효능을 크게 증가시킨다는 것을 입증하였다. 히스토트립시 버블 활동과 관련된 두 가지 주요 메커니즘이 향상된 치료 효능에 책임이 있다는 가설이 있습니다: 1) 향상된 용액 전달로 인한 세혈성 분석 증가, 그리고 2) 혈전 내의 적혈구의 용혈. 혈전 질량의 대부분은적혈구(24)로구성되며, 따라서 적혈구 분해를 추적하는 것은 시료의 절제에 좋은 대리이다. 다른 형성된 응고 요소는 히스토트립시 버블 활성하에서 분해될 가능성이 있지만 이 프로토콜에서는 고려되지 않습니다.
여기, 리소트립시와 시험관내에서 DVT를 치료하는 벤치탑 접근 방식이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 히스토트립소스의 중요한 작동 매개 변수, 치료 효능 평가 및 이미지 지침을 설명합니다. 이 프로토콜에는 일리오페랄 정맥 세그먼트를 모방하기 위한 흐름 채널을 설계하고 인간 전체 혈전을 제조하는 것이 포함됩니다. 실험 절차는 유동 채널에 배치된 응고를 따라 히스토트립시 노출을 달성하기 위해 히스토트립시 소스 및 이미징 어레이의 위치를 간략하게 설명합니다. 응고 중단을 달성하고 오프 타겟 버블 활동을 최소화하기 위한 관련 음화 매개 변수가 정의됩니다. 기포 활성의 지도 및 평가를 위한 초음파 영상의 사용은24를도시한다. 응고 질량 손실, D-디머(fibrinolysis), 헤모글로빈(혈전)과 같은 치료 효능을 정량화하는 메트릭은23,24,25,26,27로윤곽을 비운다. 전반적으로, 연구 결과는 DVT를 취급하기 위하여 lysotripsy의 효험을 실행하고 평가하기 위한 효과적인 수단을 제공합니다.
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Protocol
여기에 제시 된 결과에 대 한, 정맥 인간의 혈액 지역 내부 검토 위원회에서 승인 후 혈전을 형성 하기 위해 그려진 (IRB #19-1300) 자원 봉사 기부자에 의해 제공 된 서면 통보 된 동의24. 이 섹션에서는 lysotripsy 효능을 평가하기 위한 설계 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 프로토콜은 볼렌 외24에의해 이전 작품을 기반으로합니다.
1. 혈전 모델링
참고: 혈전 안정성을 보장하고 회수28을최대화하기 위해 실험 일 3일 전에 2주 이내에 혈전을 준비한다. 지역 기관 검토 위원회의 승인에 따라 응고를 준비합니다.
- 혈액을 저장하기 위한 보로실리케이트 파스퇴르 파이펫을 준비하십시오(파이펫 사양을 위한 재료 표 참조). 보로실리케이트 튜브는 혈소판 활성화 및 응고회수(29)를촉진하는 물질의 친성특성 때문에 사용된다. 번센 버너 위로 가열하여 파이펫 끝을 밀봉합니다.
- 신선한 인간의 정맥 혈액을 그립니다. Aliquot는 원하는 응고당 2mL 단위로 그려진 총 혈액을 인용합니다. 각 2mL 알리쿼트를 파스퇴르 파이펫 1개로 옮기습니다.
참고: 피의 약 3분 이내에 1.2단계를 실행하여 혈액이 파이펫으로 옮겨지기 전에 응고하지 않도록 합니다. 또한, 자원 봉사 기증자가 응고 폭포 (예 : 혈액 희석제 또는 혈소판 억제제)를 변경할 수있는 약물에 있지 않은지 확인하십시오. - 37°C에서 3시간 동안 수조에서 파이펫(필요한 혈전 수와 동일)내의 혈액 알리쿼트를 배양한다.
- 혈전28의후퇴를 허용하기 위해 4 °C에서 최소 3 일 동안 파이펫을 저장합니다. 혈전이 후퇴함에 따라 혈청은 파이펫 내의 혈전 상단에 축적되는 것을 관찰할 것입니다. 혈전의 rt-PA 응답은 철회28이후 2 주 동안 안정적으로 유지됩니다.
2. 물 탱크 준비
- 물 탱크를 역 삼투압 물로 채웁니다. 음향 흡수 재료로 탱크의 바닥 표면을 라인화하여 치료 또는 이미징 초음파 펄스의 반사를 줄입니다. 물 처리 시스템을 사용하여 물을 분해하고 필터링하여 거품 핵을 최소화합니다.
참고: 물을 걸기 하는 한 가지 방법은 인라인 필터를 사용하는 것입니다. 대표 결과를 생성하는 데 사용되는 가방의 사양은 재료표에부여됩니다. - 탱크의 하단 표면에 두 개의 가열 요소를 배치합니다. 최대 lytic 효소활성(30)을달성하기 위해 물을 37.3°C로 가열한다.
- 도 1A에표시된 대로 흐름 채널을 설정합니다. 흐름 채널은 튜빙, 일리오페모랄 정맥을 대표하는 재료 및 기하학적 특성을 가진 모형 용기, 플라즈마용 저수지 및 저수지의 대부분의 끝에주사기(재료표)로구성됩니다. 주사기는 실험 중에 채널을 통해 흐름을 조절하기 위해 펌프에 연결된다.
- 물 탱크의 흐름 채널을 수동으로 침수하여 탈기/ 필터링 / 가열 단계 (단계 2.1 및 2.2)에서 생리적 온도로 채널을 가져옵니다.
3. 플라즈마 및 rt-PA 혼합물의 준비
- 실험일 이전
참고: -80°C에 보관할 때 플라즈마는 최소 2.5년31년 동안 안정되고 rt-PA는 최소 7년동안 32년이상 안정적입니다. 따라서 두 구성 요소의 안정성을 보장하기 위해 이러한 기간 내에 언제든지 3.1 단계를 실행합니다.- 제조업체로부터 얻은 rt-PA를 멸균수에서 1 mg/mL로 희석시켰다.
- 0.5mL 원심분리기 튜브로 희석 된 rt-PA의 Aliquot 100 μL을 -80 °C에 저장합니다.
- 50mL 원심분리기 튜브의 인간 신선 냉동 형 O 플라즈마의 알리쿼트 35 mL. 튜브를 -80°C에 저장합니다.
- 실험 당일
- 냉동고에서 플라즈마 알리쿼트를 검색합니다. 그날 테스트할 혈전 수만큼 많은 알리코트를 검색합니다. 37°C의 수조에 얼어붙은 알리코트(aliquots)를 담그고 해동시다(~10분).
- 플라즈마가 해동되면 초순수물로 반소 헹구는 비커에 붓습니다. 비커의 입을 알루미늄 호일로 가볍게 덮어 오염을 방지하고 비커를 수조에 놓습니다. 공기가 플라즈마에 닿을 수 있을 만큼 호일을 느슨하게 할 수 있습니다.
- 플라즈마가 37°C에서 대기압에 2시간 이상 평형화하게 하십시오.
- 얼어 붙은 rt-PA 바이알을 꺼내 필요할 때까지 얼음 위에 놓고 각 실험 실행에 대해 하나의 바이알을 배치합니다.
- 50mL 플라스크에서 저겔화 아가로즈(2%)를 초순수수로 녹여 내세요. 분석될 각 시편에 대해 약 2mL가 가능하도록 아가로즈 용액의 총량을 선택한다. 거품이 날 때까지 전자 레인지에 플라스크에 용액을 가열합니다. 방수 나사 뚜껑으로 플라스크를 고정하십시오. 플라즈마와 함께 수조에 플라스크를 잠급니다.
참고: 이 단계는 아가로즈가 히스토트립시 인포네이션 에 따른 히스토로지 분석을 위해 노출된 응고 세그먼트를 확보할 수 있도록 합니다.
4. 히스토트립시 소스 및 이미징 배열 설정
- 제조업체에서 제공하는 방향과 명령을 사용하여 전동 포지셔너가 프로그래밍 플랫폼의 런타임 환경에서 제어할 수 있는지 확인합니다. 시스템의 모터가 런타임 환경이 있는 컴퓨터의 적절한 포트에 연결되어 있는지 확인합니다.
- 도 1B에도시된 바와 같이 전동 포지셔닝 시스템에 히스토트립시 소스를 탑재한다.
- 제조업체가 지정한 대로 적절한 커넥터(예: BNC 케이블)를 통해 히스토트립시 소스를 구동 전자 장치(예: 전력 증폭기 및 기능 발생기)에 연결합니다.
참고: 히스토트립시 소스의 구동 전자 장치가 4.1 단계에서 사용되는 런타임 환경을 통해 제어할 수 있는지 확인합니다. - 이미징 어레이를 프로브 커버로 덮고 도 2에도시된 히스토트립시 소스의 조리개에서 어레이를 동축으로 부착한다. 히스토트립시 소스의 방향에 상대적인 이미징 평면의 방향을 이해해야 합니다.
- 이미징 어레이를 초음파 스캐닝 시스템에 연결합니다. 이 시스템이 스캐너 제조업체에서 제공하는 명령에 따라 이미징 어레이의 작동 및 트리거링을 제어하고 이미징 데이터를 수집할 수 있는지 확인합니다.
- 도 1A에도시된 바와 같이 분해하면서 히스토트립시 소스/이미징 어레이를 탱크에 잠급한다. 히스토트립시 소스 또는 이미징 어레이의 표면에서 주사기를 사용하여 기포를 부드럽게 제거합니다.
참고: 히스토트립시 소스와 이미징 어레이를 작동 전에 물에 완전히 담급다. 히스토트립시 소스의 표면에 닿지 마십시오. - 이미징 어레이와 스캐너의 기본 제공 명령을 사용하여 초당 20프레임의 속도로 B 모드 이미지를 획득합니다. 이미징 창을 조정하여 이러한 실시간 이미지에서 히스토트립소스의 초점의 시각화를 보장합니다.
참고: 치료원의 초점 영역의 치수가 알려져 있다고 가정한다. - 기초 주파수(예를 들어, 1.5MHz), 펄스 반복 주파수(예: 20-100Hz), 펄스 지속 시간(예를 들어, 펄스당 1-20 사이클), 위치당 총 펄스 수(예: 100-2,000)18, 23, 23, 23,23, 23, 23, 23, 23, 23, 23, 23, 23. 충분한 응고 용해가 달성되지 않거나 기포 활동이 모델 용기의 루멘을 넘어 확장되는 경우 이러한 매개변수를 수정합니다. 이러한 매개 변수를 설정하려면 소스 제조업체에서 제공하는 프로토콜을 사용하거나 소스와 통신할 수 있는 프로그래밍 플랫폼(Step 4.3)을 사용합니다.
- 4.8 단계에서 사용되는 제조업체의 프로토콜 또는 프로그래밍 플랫폼을 사용하여 주변 환경에서 방해없이 탈기 된 물에서만 설정된 매개 변수에서 히스토트립시 소스를 실행합니다. 기포 구름이 형성될 때까지 히스토트립시 소스에 가해지는 전압을 늘립니다.
- 단계 4.7의 실시간 이미징을 사용하여, 버블 구름이 이미지 창의 중심에 대략 위치할 때까지 공초점 트랜스듀서 개구부 내부의 이미징 어레이의 위치를 조정한다. 버블 구름은 이미징 평면의 초반향 픽셀영역(도3)이다. 나사를 조여 이미징 어레이를 트랜스듀서 개구부에서 단단히 고정합니다.
참고: 어레이가 제대로 정렬되면 버블 구름의 아지무탈 위치는 이미징 평면에서 약 0mm여야 합니다. 이미징 어레이는 치료 원의 내부 표면으로부터 약간 투영될 수 있으며, 따라서 버블 구름의 범위 위치는 소스의 초점 거리와 다를 수 있다. - 이미징 평면의 버블 클라우드 위치를 식별합니다. 히스토트립시 소스의 초점을 버블 클라우드의 중심으로 할당합니다(도3).
- 이미징창(도 3)에서검출된 초점 위치(단계 4.11)를 기록한다. 초점 위치를 표시하는 가능한 방법은 이미징 플랫폼에서 사용할 수있는 경우 이미징 창의 위치를 기록하는 커서를 배치하는 것입니다.
- 인소네이션을 중단하고 히스토트립시 소스에 가해지는 전압을 0 V로 설정합니다.
5. 응고 준비
- 밀폐된 끝을 펜치로 절단하여 파이펫에서 응고를 제거합니다. 혈전이 세럼과 함께 페트리 접시에 넣습니다. 응고가 빠지지 않으면 식염수 플러시를 통해 파이펫의 다른 쪽 끝에서 압력을 부드럽게 적용하여 응고를 제거합니다.
- 메스를 사용하여 응고를 1cm 길이로 자르고, 중앙에서 균일한 조각을 노린다(즉, 파이펫의 위쪽 또는 하부에 형성된 응고의 단부에서 멀리 떨어져 있음).
- 클리닝 와이프를 사용하여 응고의 절단 부분을 부드럽게 얼룩내어 과도한 유체를 제거하십시오.
- 핀셋을 사용하여 응고 섹션을 계량 스케일에 부드럽게 놓고 무게를 기록합니다.
- 수동으로 물 탱크에서 유동 채널을 올리고 흐름 채널에서 모델 용기를 제거합니다.
- 핀셋을 사용하여 모델 용기에 응고를 배치하고 모델 용기를 유량 채널에 다시 부착합니다.
참고: 나일론 막대를 모델 용기 내에 배치하여 흐름으로 인해 혈전이 하류로 이동하는 것을 방지할 수 있습니다. - 저수지에 비해 스테이지의 근접 끝이 탈면에 비해 낮은 방식으로 탱크내의 유동 채널을 낮춥니다. 이러한 방식으로 단계의 앵글링은 플라즈마가 6.1 단계에서 유동 채널을 통해 그려질 때 모델 용기의 거품 을 포획하는 것을 방지합니다.
- 파이펫을 사용하여 30mL플라즈마를 저수지에 추가하고 최소 36°C에 도달할 때까지 온도를 모니터링합니다.
- 파이펫을 사용하여 rt-PA(플라즈마 30mL의 80.4 μg, 2.68 μg/mL)를 플라즈마 저장소에 분배합니다. 피펫으로 플라즈마를 저어 저수지 내에서 균일한 rt-PA 분포를 보장합니다.
6. 흐름 채널을 프라이밍
- 플라즈마가 모델 용기를 채울 때까지 주사기 펌프를 통해 저수지에서 유량 채널로 플라즈마를 그립니다.
참고: 응고가 나일론 로드와 플러시되지 않는 경우, 짧은 펌프를 사용하여 60mL/min에서 짧은 펌프 를 사용하여 혈전을 하류로 밀어 내거나 수동으로 주사기를 통해 그립니다. 이 공정에서 그려진 플라즈마의 양을 제한하거나 추가 플라즈마/rt-PA를 사용하여 저장소를 리필하여 유량 채널에서 30mL의 용액을 보장합니다. - 전동 포지셔터를 사용하여 이미징 스크립트(Step 4.7)를 사용하여 응고 길이와 평행하게 이미징 어레이를 정렬합니다. 병렬 정렬을 통해 사용자는 모델 용기 내부에 혈전을 적절히 배치하고 거품이 없는지 시각적으로 보장할 수 있습니다.
- 모델 용기를 수동으로 레벨화하고 시각적으로 이미징 창(단계 4.7)을 사용하여 기포가 존재하지 않도록 합니다.
7. 실험 절차
- 전처리
참고: 이 단계는 응고 길이를 따라 균일한 히스토트립시 노출을 위한 히스토트립시 소스/이미징 어레이에 대한 경로를 계획하는 것입니다.- 이미징 평면이 응고의 단면에 평행하도록 전동 포지셔터를 사용하여 이미징 어레이를 정렬합니다(즉, 단계 6.2에 기술된 방향에 수직).
- 이미징 창(Step 4.7)을 통한 지도 하에, 전동 포지셔터를 사용하여 저수지에 비해 혈전의 근접 끝으로 히스토트립시 소스를 이동한다. 이 때, 4.12 단계의 표시된 초점이 응고의 중심과 정렬하도록 히스토트립시 소스 위치를 조정한다.
- 응고 길이를 따라 인네이션 경로를 결정합니다. 이 경로를 정의하려면 응고 길이(즉, 히스토트립버블 활동이 응고 내에 포함된 모터의 위치)를 따라 3개의 웨이포인트를 5mm 단위로 설정합니다. 경로를 따라 히스토트립시 소스의 전체 움직임이 시스템의 흐름과 선행되는 것과 같은 웨이포인트를 정렬합니다(즉, 첫 번째 웨이포인트는 저수지에 비해 혈전의 가장 근접한 끝에 있고, 제3 웨이포인트는 저수지에 비해 단층 위치에 있음).
- 각 웨이포인트를 마무리하기 전에 4.8단계와 동일한 인소네이션 파라미터를 사용하여 히스토트립시 소스에서 화재 테스트 펄스를 발생시키지만 전체 노출을 총 10펄스로 줄입니다. 필요한 경우 전동 포지셔터를 사용하여 히스토트립시 소스의 위치를 조정하여 응고 내에서 거품 활동을 억제합니다.
- 각 웨이포인트에서 4.1 단계와 유사한 제조업체에서 제공하는 명령을 사용하여 모터 위치를 저장합니다.
- 치료
참고: 이 단계는 전처리 단계에 정의된 경로에 따라 길이를 따라 응고를 처리하는 절차를 정의합니다.- 주사기 펌프를 0.65mL/min에서 실행하고 플라즈마의 반월상 연골이 움직일 때까지 기다립니다. 이 유량은 일리오페모랄 혈관24, 34의거의 총 폐색을 모방한다.
- 7.1.3 단계에서 생성된 경로를 고정된 스텝 크기(예: 0.5 mm)로 설정된 웨이포인트 사이의 중간 단계와 함께 보간합니다. 단계 크기는 응고 길이(이미징 어레이의 고도 방향)를 따라 측정된 초점 영역의 절반 너비보다 작도록 선택된다. 4.8 단계에서 정의된 인소네이션 매개변수를 사용하여 각 경로 위치에서 전동 포지셔터를 사용하여 히스토트립시 소스를 이동합니다.
- 이미징 창(Step 4.7)을 이용하여 각 경로 위치에서 히스토트립시 펄스를 적용하는 동안 모니터/이미지 버블 활성을 모니터링한다. 아지무트와 범위에서 15mm를 커버하는 이미지 치수로 히스토트립시 초점에 이미지를 중앙집중합니다. 각 위치에서 히스토트립시 펄스를 적용하기 전에 프로그래밍 플랫폼에서 스크립트를 생성하여 응고 및 모델 용기의 시각화를 제공하는 B 모드 이미지를 획득합니다. 스크립트가 제조업체의 명령을 사용하여 스캐너와의 통신을 설정했는지 확인합니다.
- 히스토트립시 펄스를 적용하는 동안, 7.2.3 단계에서 스크립트에서 음향 방출의 획득을 구현하여 수동 캐비테이션 영상을 형성하여 hoc35를지나서한다. 매 10개의 처리 펄스 후에 1개의 수동 캐비테이션 심상을 취득합니다. 이미징 깊이가 끝날 때까지 8증분 깊이에서 50의 평평한 시간 게인 보정을 적용하십시오. 윈도우(35)로인해 크롯의 전체 신호가 최소 에너지 손실로 캡처되는 적절한 획득 창 크기를 선택합니다.
- 오프 타겟 버블 구름이 있는 경우 전동 포지셔너와 함께 트랜스듀서 위치를 조정합니다.
참고: 이미징 배열의 누락된 트리거를 모니터링합니다. 획득한 이미징 데이터 세트 수를 조정하여 후속 트리거하기 전에 데이터 저장이 완료되도록 합니다.
8. 사후 실험 절차
- 수동으로 물 탱크에서 모델 용기를 올려 중력을 통해 난투를 배출합니다. 유량 채널을 수평으로 유지하여 배수 중에 혈전이 하류와 모델 용기 밖으로 이동하는 것을 방지해야 합니다.
- 매우 낮은 유량으로 주사기 펌프를 통해 유량 채널로부터 플라즈마 용액을 끌어서 작은 비커(도4A)에서추가 분석을 위해 전체 난투를 수집한다.
- 모델 용기를 분리하고 응고를 제거합니다. 필요한 경우 소량의 식염수를 모델 용기에 주입하여 응고를 부드럽게 빼냅니다.
- 1.2.3 단계와 유사한 응고를 닦아냅니다. 응고 질량 손실을 평가하기 위해 계량 스케일의 응고를 계량합니다.
- D-이머 함량을 분석하려면 마이크로센트심분리기 튜브에 100 mg의 아미노카프로산을 넣고 1mL의 퍼퓸을 넣고 파이펫을 사용하여 잘 섞는다. 라텍스 면역 편도측정 분석법을 수행하여샘플(36)내에서 D-디머를 정량화한다.
- 혈류를 평가하기 위해, 원심분리관에 1mL의 난투를 추가하고 610 x g (3,500 rpm)에서 10 분 동안 회전하십시오. 도 4B에도시된 바와 같이 200 μL을 잘 플레이트로 옮길 수 있습니다. 플레이트 판독기를 사용하여 540nm, 그림 4C(Drabkins 분석37)에서흡광도를 읽습니다.
- 히스토로지 평가
- 메스로 길이약 2-3mm의 응고 의 중심에서 단면을 자른다.
- 카세트에 섹션을 추가합니다. 히스토트립시 펄스 전파의 방향에 따라 단면의 방향을 유지한다.
- 3.2.5 단계에서 제조된 저겔링 아가로즈 용액 2mL을 카세트에 추가하여 응고를 제자리에 고정시하십시오.
- 샘플을 24시간 동안 10% 포르말린으로 수정합니다. 24시간 후 70% 알코올에 샘플을 놓고 표준 헤모톡시린-에신 염색38을수행한다.
9. 수동 캐비테이션 이미지 분석
- 강력한 Capon빔포어(39)를 기반으로 알고리즘을 사용하여 히스토트립시 여기(Step 7.2.4) 동안 이미징 어레이로부터 획득한 신호를 처리하여 각 처리 위치에서 버블 클라우드에 의해 생성된 음향 방출 이미지를 생성한다.
참고: 정량적 이미지를 생성하려면 하워스 등35에설명된 단계를 따르십시오. 그렇지 않으면 이미지의 각 픽셀 값은 각 해당 위치에서 상대 버블 클라우드 음향 에너지(V2단위)를 나타내야 합니다. - 7.2.3 단계로 조회된 B 모드 이미지를 분할하여 응고를 나타내는 픽셀과 모델 용기를 구분합니다.
- 도 5B에도시된 바와 같이 수동 캐비테이션 이미지를 B 모드 이미지와 함께 공동 등록합니다. 노출기간(35)에걸쳐 응고 내의 음향 에너지를 합산한다.
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Representative Results
이 연구에서 설명된 프로토콜은 정맥 응고 모델링, 응고 중단을 위한 리소트립시 및 DVT의 체외 설정에서 초음파 이미징의 세부 사항을 강조합니다. 채택된 절차는 rt-PA 및 히스토트립버블 클라우드 활동의 결합된 효과로 인해 응고 중단을 평가하는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 벤치탑 설정은 정맥 일리오페랄덕 정맥의 특성을 모방하도록 설계되었습니다. 도 1A는 일리오페랄 정맥의 음향, 기계적 및 기하학적 특성을 가지는 모델 용기를 나타낸다. 응고는 부분적으로 폐색 혈전을 모방하기 위해 모델 용기 내부에 배치됩니다. 혈전은 0.65 mL/min의 속도로 저수지에서 가져온 플라즈마 및 rt-PA로 perfused됩니다. 이 속도는 고도로 가려진선박(34)의느린 유량과 일치한다.
9cm 축, 7cm 축, 6cm 초점길이(도 2A)를가진 1.5MHz 기본 주파수의 타원형 집중 트랜스듀서는 도 1B에명시된 바와 같이 위치 지정 시스템에 장착된다. 초음파 젤과 라텍스커버(그림 2B,C)로덮인 이미징 어레이는 히스토트립시 소스의 중심의 개구부를 통해 도 1A에 도시된 바와 같이 트랜스듀서와 동축으로 장착된다. 전동 포지셔너는 모델 용기 내의 응고 길이를 따라 치료 트랜스듀서/이미징 어레이를 변환하는 데사용되었다(도 1). 히스토트립시 소스에 충분한 전압을 적용하면, 도 3에도시된 바와 같이 트랜스듀서의 초점 부위에서 버블 구름이 생성되고 초음파 이미징을 통해 시각화된다. 초점 위치는 이미징 평면(4.10-4.11 단계)을 사용하여 버블 클라우드의 중심으로 정의됩니다.
도 4A는 두 가지 다른 치료 조건에 대해 수집된 난투를 나타낸다. 컨트롤로 표시된 비커는 플라즈마에만 노출된 응고의 난자혈을 포함합니다. 처리로 표시된 두 번째 비커는 리소트립시 처리 된 응고의 난투를 포함합니다. 수집된 퍼퓨자스는 프로토콜에 명시된 분석법을 통해 헤모글로빈(용혈측정수) 및 D-디머(섬유질 분석메트릭) 함량을 평가하는 데 사용됩니다. 퍼서퍼의 색상 차이는 광학 흡광도를 통해 정량화 될 수있는 헤모글로빈 농도의 가변성을 나타냅니다. 흡광도 값과 헤모글로빈 농도 사이의 관계는 교정 곡선을 통해 결정될 수 있다. 0(공백 측정)에서 180 mg/mL에 이르는 공지된 헤모글로빈 함량을 가진 솔루션은 플레이트 판독기(도4B,C)를이용하여 삼중판에 배치된다. 플레이트 판독기의 상부 흡광도 제한은 다를 수 있으며 웰 플레이트에서 솔루션을 만드는 데 우선순위가 알려지지 않을 수 있다. 이와 같이, 헤모글로빈 농도는 최대 180 mg/mL이 웰 플레이트, 도 4B로 이루어진다. 그러나, 여기서 사용되는 플레이트 판독기는 최대 23 mg/mL의 농도에 대한 흡광도를 읽을 수 있으며, 도 4C.
도 5A는 7.2.3 단계에서 지정된 대로 히스토트립시 노출 전에 B 모드 이미징을 통해 모델 용기 내의 응고의 시각화를 나타낸다. 이 이미지는 수동 캐비테이션 이미지의 분할을 위한 응고 위치를 결정하기 위해 획득됩니다. 도 5B는 히스토트립시 노출 전에 획득한 B모드 영상과 공동 등록된 수동 캐비테이션 영상을 나타낸다. 이 수치는 음향 에너지가 히스토트립시 노출 중에 주로 응고 내에 포함되어 있음을 확인합니다.
히스토트립증 및 lytic으로 인한 일반적인 응고 중단은 도 6에표시됩니다. 도 6A,B는 처리되지 않은 및 리소트립시 처리 응고 응고 이미지를 각각 보여 준다. 히스토트립시에 노출된 샘플의 경우, 중단은 주로 수동 캐비테이션이미징(도 5B)으로추적된 버블 활성의 관찰된 위치와 일치하는 응고 중심으로 제한됩니다. 그러나, lytic의 추가와 함께, 질량 손실은 또한 혈전의 주변에 가까운 지역에서 발생합니다. 이 추가 질량 손실은 거품 활동 하에서 용액의 향상된 유체 혼합때문이라는 가설이 있습니다. 유체 혼합은 혈전으로 리틱의 분포 및 침투 깊이를 증가시킵니다. 용액은세혈성(40)에대한 책임이 있기 때문에 질량 손실이 증가합니다. 섬유질은난투41에서D-이머 함량을 측정하여 정량화할 수 있다.
도 1: 인간 혈전의 리소트립시에 대한 실험용 설정. (A)설정의 성분은 (1) 타원형 기하학을 가진 히스토트립소스에 초점을 맞추고, (2) 라텍스 로이징 이미징 어레이, (3) 유량 채널에 부착된 모형 용기, (5) 흐름 채널, (5) 저수지, (6) 음향 흡수 재료, (7) 음향 흡수 재료, (7) 가열된 소자 및 증기로 채워진 소자 및(8) 가열된 수분및 이미징 평면의 막부 치수는 고도 및 범위 치수(페이지 내)에 수직입니다. (B)전동 포지셔닝 시스템에 장착된 히스토트립시 소스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 초음파 소스 및 이미징 구성 요소. (A)의 개별확대 이미지는 히스토트립소스,(B)이미징 어레이, 및(C)초음파 젤 및 라텍스 커버를 통한 이미징 어레이를 집중시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미징 어레이를 사용하여 시각화된 히스토트립시 버블 클라우드입니다. 버블 클라우드는 히스토트립소스의 초점 영역에서 생성되고 이미징 어레이를 사용하여 이미지화됩니다. 지정된 포커스는 십자가로 표시되어 치료 계획을 위해 저장됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 혈전 용해로 인해 방출된 헤모글로빈의 정량화.(A) 혈장 단독으로 제어 연구(히스토트립시 또는 lytic 없음) 및 치료암, 히스토트립시(예: 35MPa 피크 음압, 5사이클 펄스 지속시간, 1.5MHz 기본 주파수) 및 2.68 μg/lyl 노출로 인해 방출된다. (B)180 mg/mL(상단 행, 왼쪽 최상층)에서 0 mg/mL(맨 아래 줄, 오른쪽 코너)에 이르는 알려진 헤모글로빈 농도의 희석을 함유한 음판. 화살촉은 헤모글로빈 농도를 감소시키는 쪽으로 가리킵니다. (C)이들 샘플은 분광광계를 통한 히스토트립시 노출로 인해 생성된 헤모글로빈을 정량화하기 위해 표준 곡선을 만드는 데 사용된다. 0에서 23 mg/mL에 이르는 헤모글로빈 농도에 대한 흡광도 곡선은 더 높은 농도를 분석하는 플레이트 판독기의 제한으로 인해 얻어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 치료 중 응고의 이미지. (A)B 모드 이미지는 모델 용기 내의 응고 위치를 나타내는 처리 펄스의 시작 전에 획득했다. (B)히스토트립시 펄스의 적용 전에 획득한 응고의 B 모드 영상과 함께 열화된 핫 컬러맵에 도시된 수동 캐비테이션 영상으로부터 산출된 음향 에너지 방출의 후비액화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 상이한 치료 조건 하에서 축약혈의 연고. (A)치료 없이 응고를 제어한다. (B)리소트립시로 처리된 응고(예: 35MPa 피크 음압, 단일 사이클 펄스 지속시간, 1.5MHz 기본 주파수). 히스토트립시 펄스가 이 이미지에서 위에서 아래로 전파되었습니다. 응고 길이(즉, 여기에 표시된 이미지의 평면에 수직)를 따라 히스토트립시 소스의 경로는 7.2.3 단계에서 정의된다. 현미경 사진의 규모는 2mm입니다. 여기서 달성된 응고 중단의 정도는 펄스 지속 시간이24가긴 음광 계획에 비해 감소될 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제안된 프로토콜은 리소트립시의 치료 효능을 정량화하는 모델을 제시한다. 주요 세부 사항에 대해 논의되었지만 이 프로토콜의 성공을 고려해야 할 중요한 측면이 있습니다. rt-PA의 효소 활성은 아레니우스 온도의존30을가지고 있습니다. 온도는 또한 물과 조직의 소리 속도에 기여하는 요인이며, 온도의 변화는 초점 영역 지오메트리의 사소한 변화를 일으킬 수 있습니다. 따라서 수온은 37°C에서 신중하게 조절되어야 한다. 프로토콜(2.68 μg/mL)에 사용되는 rt-PA의 투여량은 다른 약동체 혈전 절제술전략(42)에대해 임상적으로 사용되는 것과 일치한다. 5.8 단계에서, 30mL의 플라즈마는 저수지로 옮겨지는 반면 35mL 알리쿼트단계3.1.3에서 주목된다. 이 추가 플라즈마는 대기압에 대한 평형을 위해 37°C로 따뜻해지면 몇 시간 동안 증발로 인해 플라즈마의 손실을 차지합니다.
치료 트랜스듀서의 초점 거리, 조리개 폭 및 주파수는 초점 영역의 크기와 깊이를 지시합니다. 따라서, 트랜스듀서는 이러한 특성이 대상 용기의 직경 및 깊이(예: 2-4cm 깊이 및 직경 0.6-1.2cm)에맞추어 선택되어야 한다. 기계적 절제의 범위는 버블 클라우드의 범위로 제한됩니다. 따라서, 히스토트립시 버블 클라우드 거동을 수정하는 데 있어 매개 변수가 재생되는 역할에 대한 이해는33,44,45에매우 중요하다. 음향 분야의 주파수와 강도는 중간 및 중개인 재료(예: 모델 용기)로 인한 감쇠의 크기를 주목하도록 선택해야 합니다. 대상 용기와 함께 거품 활동의 감금을 보장하기 위해 초점 영역을 모니터링하기 위해 적절한 이미징 창을 선택해야 합니다. 변환기의 작동 매개 변수는 기계적 응고 중단을 최대화하면서 대상 효과를 피하기 위해 선택해야 합니다. 이 프로토콜에서, 질량 손실은 처리 효험의 1 차적인 메트릭으로 간주되었습니다. 질량 손실의 증가는 최대 음압 또는 히스토트립시 펄스의 지속 시간이24,46증가하여최대 관찰 질량 손실94%를 기록함에 따라 관찰되었다. 조사된 치료용 암에 대한 잔류 응고의 존재는 치료 효능의 비교를 용이하게 한다. 그러나, 혈전의 총 제거를 보장하기 위한 소네이션 계획도 고안될 수 있다.
음향 임피던스(약 1.58 MRayl47,48)와기하학적 특성(직경43cm0.6-1.2cm)은 일로페고성 정맥 혈관을 대표해야 한다(자세한 내용은 재료표 참조). 폴리디메틸실록산과 폴리우레탄은 아쿠스토-기계적 특성에 따라 정맥 시스템을 모델링하는 데 적합한 다른 재료 중 일부이다. 7단계에서는, 히스토트립노출로부터 응고를 차폐하지 않도록 모델 용기에서 모든 기포를 제거하는 것이 중요하다. 소수성 물질의 모형 용기의 경우, 버블 구름은 응고의 중심이 아닌 용기 벽 근처에 우선적으로 형성될 수 있다. 따라서 초음파 영상을 통해 치료 중에 버블 클라우드의 지속적인 모니터링을 수행해야하며 필요한 경우 트랜스듀서를 재배치해야 합니다. 최종 응고 중단을 달성하는 히스토트립시 인포네이션 파라미터(예: 펄스 지속시간 및 피크 압력)를 결정하기 위한 파일럿 연구를 수행해야 합니다.
이미징 어레이는 B 모드 이미지와 수동 캐비테이션 이미지를 캡처하여 치료 시각화를 위해 사용하고 거품 활동을 정량화하는 데 사용됩니다. B 모드 이미징을 통해 모델 용기와 응고의 시각화를 허용하고, 수동 캐비테이션 이미징은 응고 절제와 관련된 기포 활성의 에너지를측정한다(24,49). 이미징 어레이의 대역폭은 원하는 버블 클라우드 활동과 높은 신호 대 잡음 비율과 일치해야 합니다. 구름 내의 버블의 관성 붕괴와 관련된 순수 광대역 신호를 얻기 위해 배열의 대역폭은 트랜스듀서50,51의기본 주파수와 일치해서는 안된다. 히스토트립시 펄스는 매우 비선형52이며,기본 주파수의 고조파가 수신된 신호에 존재할 가능성이 높습니다. 이미징 시스템은 소스에서 초점 영역으로 의 소화맥 펄스의 알려진 비행 시간을 기반으로 트리거하도록 프로그래밍되어야하므로 수동 전체에 걸쳐 완전한 수동 캐비테이션 이미징 데이터의 수집을 보장합니다. 그런 다음 이러한 신호는 프로토콜의 7.2.3 및 9 단계에서 설명한 대로 사후 hoc을 처리해야 합니다.
혈연의 양은 혈전의 처리에 민감하다는 점에 유의해야합니다. 따라서 치료 전에 혈전 손상을 최소화하기 위해주의를 기울여야합니다. 재현성을 보장하기 위해 응고 모델링(1단계) 및 치료 전 시간(단계 6 및 7.1)은 히스토트립시 노출 유무에 관계없이 처리된 모든 혈전과 동일해야 합니다. 혈혈 성 평가의 후 처리 단계에서 플라즈마는 자체 흡수성을 가지고 있음을 주목해야합니다. 따라서, 표준 곡선을 형성하는 데 사용되는 희석제(예를 들어, 광학 흡광도 대 헤모글로빈)은 유동 채널에서 의 과두질과 동일한 유체를 사용하여 형성되어야 한다(예를 들어, 본 연구에서, 플라즈마는 표준 곡선을 형성하기 위해 희석제로 사용되었다).
이 프로토콜은 인간 전체 혈전을 치료하는 리소 트립티의 효능을 측정하기 위해 벤치 탑 설정을 제공하는 것을 목표로합니다. 설정의 체외 특성으로 인해 발생하는 특정 제한이 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 급성 혈전은 주로 적혈구와 피브린으로 구성되어 DVT에 효과적인 리소트립시 접근법을 만들었습니다. 그러나, 혈전의 후기 단계는 rt-PA의 피브린 특이적 특성으로 인해 리소트립시 치료에 저항할 수 있는 뻣뻣한 콜라주네트워크(53)를 개발할 수 있다. 생체 내에서 치료할 때, 치료 효능에 대한 1차 임상 종점은 흐름의 복원이다. 질량 손실은 여기에 설명된 체외 프로토콜에서 치료 효능에 대한 1차 메트릭이었다. 이 프로토콜에서 흐름이 평가되지 는 않았지만, 색상 도플러 이미징은 흐름 복원을 모니터링하기 위해 7.2.4 단계에서 수동 캐비테이션 이미징과 함께 추가로 통합될 수 있습니다. 이 프로토콜의 설정은 7.2 단계의 전체 처리 중에 고도로 폐색된 용기의 유량을 모방한 고정 유량을 사용합니다. 생체 내에서, 처리 도중 응고가 붕괴됨에 따라 혈관 흐름이 증가합니다. 증가된 흐름과 관련된 추가 전단 응력은 응고 분해프로파일(54)을강조합니다. 생체 내 오프 표적 효과는 이 설정에서서정성(55)의전신 투여로 인한 출혈, 혈관 벽 손상 또는 혈관경련(22)으로 인한 출혈과 같은 이 설정에서 확인할 수 없다. 이 연구의 체외 특성은 또한 장기 결과 평가 하는 능력을 제한, 혈관 육아 또는 치료 후 다시 혈전증 등. 이 연구에서 리스틱의 투여는 전신 혈전용제를 모방한 반면, 카테터 지향 리틱은 정맥 혈전증7,14에대한 바람직한 내정간섭이다. 조직 감쇠는 유방 학장 및 생체 내 연구를 위한 화상 진찰 질에 영향을 미칠 수 있는 반면, 여기에서 음향 경로는 주로 탈가스수를 통해서입니다. 강력한 Capon 빔포어(프로토콜의 9단계)를 사용하여 캐비테이션 배출 데이터의 처리는 계산 비용이 많이 들며 사후 분석을 위해 오프라인으로 수행되었다. 다른 빔포머(예: 지연 및 합계35 또는 각 스펙트럼56)는감소된 범위 해상도에도 불구하고 실시간 피드백을 제공하기 위해 대안적으로 작동될 수 있다.
요약하자면, 이 프로토콜은 인간 혈전의 심부 정맥 혈전용증을 달성하기 위한 비침습적 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜은 혈전 모델링, 리소트립시 로 치료, 치료 중 동시 이미징을 위한 편리하고 복제하기 쉬운 절차를 수립합니다. 히스토트립시 버블 클라우드 생성, 치료 계획 및 이미지 지침을 지정하는 프로토콜 단계는 유방 종양, 췌장 종양 및 양성 전립선 증증의 체외 치료를 조사하기 위해 더 사용될 수 있으며, 여기서 히스토트립시는 표준절차(57,58)에비해 더 효과적인 것으로 나타났다. 이 프로토콜에서 rt-PA의 사용은 lytic 효능을 증가시키기 위해 히스토트립증과 함께 이러한 종양 치료에 사용되는 다른 약물 또는 약물 운반체에 일반화 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 투자되었다, 그랜트 R01HL13334. 저자들은 드라킨 박사의 분석과 빅토르 볼렌 박사의 프로토콜 설계 지원에 도움을 준 케빈 하워스 박사에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자들은 또한 아담 맥스웰 박사에게 히스토트립소스 설계에 대한 그의 지침에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing sheets | Precision acoustics | F28-SMALL-M | 300mm x 300 mm x 10 mm |
| Borosilicate Pasteur pippettes | Fisher Scientific | 1367820A | 14.6 cm length, 2 mL capacity |
| Centrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL capacity |
| Drabkin's assay | Sigma Aldrich | D5941-6VL | |
| Draw syringe | Cole-Parmer | EW-07945-43 | 60 mL capacity |
| Filter bags | McMaster-Carr | 5162K111 | Remove particle size upto 1 microns |
| Flow channel tubing | McMaster-Carr | 5154K25 | Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4" |
| Heating elements | Won Brothers | HT 300 Titanium | Titanium rods placed at the bottom of tank |
| Imaging array | Verasonics | L11-5v | 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB |
| Low gelling agarose | Millipore Sigma | A9414 | |
| Model vessel | McMaster-Carr | 5234K98 | 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness |
| Nanopure water | Barnstead | Nanopure Diamond | ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity |
| Plasma | Vitalant | 4PF000 | Plasma frozen within 24 hours |
| Plate reader | Biotek | Synergy Neo HST Plate Reader | For haemoglobin quantification |
| Probe cover | Civco | 610-362 | |
| Programming platform | MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA) | ||
| Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) | Genentech | Activase | |
| Reservoir | Cole-Parmer | EW-07945-43 | 60 mL capacity |
| Syringe pump | Cole-Parmer | EW-74900-20 | pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate |
| Transducer | In-house customized | Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network | |
| Ultrasound scaning system | Verasonics | Vantage Research Ultrasound System | |
| Water tank | Advanced acrylics | C133 | 14 x 14 x 12, 1/2" |
References
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