Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Et in vitro-system for å måle trombolytisk effekt av histotripsy og et lytisk legemiddel

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

Histotripsy-støttet lytisk levering eller lysotripsy er under utvikling for behandling av dyp venetrombose. En in vitro-prosedyre presenteres her for å vurdere effekten av denne kombinasjonsterapien. Viktige protokoller for blodproppmodellen, bildeveiledningen og vurderingen av behandlingseffekten diskuteres.

Abstract

Dyp venetrombose (DVT) er et globalt helseproblem. Den primære tilnærmingen for å oppnå karrekanalisering for kritiske hindringer er kateterstyrt trombolytikk (CDT). For å redusere kaustiske bivirkninger og den lange behandlingstiden forbundet med CDT, er adjuvans og alternative tilnærminger under utvikling. En slik tilnærming er histotripsy, en fokusert ultralydbehandling for å fyre opp vev via bobleskykjernedannelse. Prekliniske studier har vist sterk synergi mellom histotripsy og trombolytika for blodpropp nedbrytning. Denne rapporten skisserer en benkeplatemetode for å vurdere effekten av histotripsy-støttet trombolytisk terapi, eller lysotripsy.

Blodpropper produsert av friskt menneskelig venøst blod ble introdusert i en strømningskanal hvis dimensjoner og acousto-mekaniske egenskaper etterligner en iliofemoral vene. Kanalen ble perfundert med plasma og den lytiske rekombinante vevs-type plasminogenaktivatoren. Bobleskyer ble generert i blodpropp med en fokusert ultralydkilde designet for behandling av lår venøse blodpropper. Motoriserte posisjoner ble brukt til å oversette kildefokuset langs blodpropplengden. På hvert insonasjonssted ble akustiske utslipp fra bobleskyen passivt registrert, og stråleformet for å generere passive kavitasjonsbilder. Målinger for å måle behandlingseffekten inkluderte blodproppmassetap (total behandlingseffekt), og konsentrasjonene av D-dimer (fibrinolyse) og hemoglobin (hemolyse) i perfusatet. Det er begrensninger i denne in vitro design, inkludert mangel på midler til å vurdere in vivo bivirkninger eller dynamiske endringer i strømningshastigheten som blodpropp lyses. Totalt sett gir oppsettet en effektiv metode for å vurdere effekten av histotripsy-baserte strategier for å behandle DVT.

Introduction

Trombose er tilstanden til blodproppdannelse i et ellers sunt blodkar som hindrersirkulasjon 1,2. Venøs tromboembolisme har en årlig helsekostnad på $ 7-10 milliarder, med 375,000-425,000 tilfeller i USA3. Lungeemboli er hindringen av lungearterien og er den mest alvorlige konsekvensen av venøs tromboembolisme. Den primære kilden til lungeobstruksjon er dyp venetrom, hovedsakelig fra iliofemorale venøse segmenter4,5,6. Dyp venetrombose (DVT) har iboende oppfølgere i tillegg til lungeobstruksjoner, med langsiktige komplikasjoner som resulterer i smerte, hevelse, bensår og lemmer amputasjoner7,8,9. For kritiske hindringer er kateter rettet trombolytikk (CDT) frontlinjetilnærmingen for karrekanalisering10. Utfallet av CDT avhenger av en rekke faktorer, inkludert trombealder, plassering, størrelse, sammensetning, etiologi og pasientrisikokategori11. Videre er CDT forbundet med vaskulær skade, infeksjoner, blødningskomplikasjoner og lang behandlingstid10. Neste generasjons enheter tar sikte på å kombinere mekanisk trombektomi med trombolytika (dvs. farmacomechanical trombektomi)12,13. Bruk av disse enhetene senker lytisk dosering som fører til reduserte blødningskomplikasjoner, og forkortet behandlingstid12,13,14 sammenlignet med CDT. Disse enhetene beholder fortsatt problemer med hemorragiske bivirkninger og ufullstendig fjerning av kronisk trombe15. En adjuvant strategi er dermed nødvendig som kan fjerne tromben helt med lavere blødningskomplikasjoner.

En potensiell tilnærming er histotripsy-støttet trombolytisk behandling, referert til som lysotripsy. Histotripsy er en ikke-invasiv behandlingsmodalitet som bruker fokusert ultralyd for å nukleere bobleskyer i vev16. Bobleaktivitet genereres ikke via eksogene kjerner, men ved bruk av ultralydpulser med tilstrekkelig spenning til å aktivere kjerner iboende i vev, inkludert blodpropp17,18. Den mekaniske svingningen av bobleskyen gir belastning til blodpropp, og oppløser strukturen i acellulært rusk19. Histotripsy boble aktivitet gir effektiv nedbrytning av trukket og uberørt blodpropp både in vivo og in vitro20,21,22. Tidligere studier har23,24 vist at kombinasjonen av histotripsy og lytisk rekombinant vev-type plasminogen aktivator (rt-PA) øker behandlingseffekten betydelig sammenlignet med lytisk alene eller histotripsy alene. Det er hypoteset at to primære mekanismer forbundet med histotripsy bobleaktivitet er ansvarlig for forbedret behandlingseffekt: 1) økt fibrinolyse på grunn av forbedret lytisk levering, og 2) hemolyse av røde blodlegemer i blodpropp. Hoveddelen av blodproppmassen består av røde blodlegemer24, og derfor er sporing av erytrocyttforringelse en god surrogat for ablasjon av prøven. Andre dannede blodproppelementer er også sannsynligvis oppløst under histotripsy bobleaktivitet, men vurderes ikke i denne protokollen.

Her er en stasjonær tilnærming for å behandle DVT in vitro med lysotripsy skissert. Protokollen beskriver kritiske driftsparametere for histotripsykilden, vurdering av behandlingseffekt og bildeveiledning. Protokollen inkluderer å designe en strømningskanal for å etterligne et iliofemoralt venøst segment og produsere menneskelige hele blodpropper. Den eksperimentelle prosedyren skisserer plasseringen av histotripsy-kilden og bildebehandlingsmatrisen for å oppnå histotripsyeksponering langs blodpropp plassert i strømningskanalen. Relevante insonasjonsparametere for å oppnå blodproppavbrudd og minimere off-target bobleaktivitet er definert. Bruk av ultralydavbildning for veiledning og vurdering av bobleaktivitet er illustrert24. Målinger for å kvantifisere behandlingseffekten som blodproppmassetap, D-dimer (fibrinolyse) og hemoglobin (hemolyse) er skissert23,24,25,26,27. Totalt sett gir studien et effektivt middel for å utføre og vurdere effekten av lysotripsy for å behandle DVT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For resultatene som presenteres her, ble venøst menneskelig blod trukket for å danne blodpropp etter godkjenning fra det lokale interne gjennomgangsstyret (IRB # 19-1300) og skriftlig informert samtykke gitt av frivillige givere24. Denne delen skisserer en utformingsprotokoll for å vurdere lysotripsy effekt. Protokollen er basert på et tidligere verk av Bollen et al.24.

1. Clot modellering

MERK: Forbered blodproppene innen 2 uker, men mer enn 3 dager før eksperimentets dag for å sikre blodproppstabilitet og maksimeretilbaketrekningen 28. Forbered blodpropp etter godkjenning fra lokal institusjonell kontrollkomité.

  1. Forbered borosilikat Pasteur pipette for lagring av blodet (se Tabell over materialer for spesifikasjoner av pipetten). Borosilikatrør brukes på grunn av materialets hydrofile natur som fremmer blodplateaktivering og blodpropp tilbaketrekning29. Forsegle tuppen av pipetten ved oppvarming over en Bunsen-brenner.
  2. Tegn friskt menneskelig venøst blod. Aliquot det totale blodet trukket i 2 ml trinn per ønsket blodpropp. Overfør hver 2 ml aliquot til en Pasteur pipette.
    MERK: Utfør trinn 1.2 innen ca. 3 min blodprøve, slik at blodet ikke koagulerer før det overføres til pipetter. Sørg også for at den frivillige donoren ikke bruker medisiner som kan endre koaguleringskaskaden (f.eks. blodfortynnende eller blodplatehemmere).
  3. Inkuber blod aliquots i pipettene (lik antall blodpropper som kreves) i et vannbad i 3 timer ved 37 °C.
  4. Oppbevar pipettene i minst 3 dager ved 4 °C for å tillate tilbaketrekking av blodpropper28. Når blodproppene trekker seg tilbake, vil serum bli observert å akkumulere på toppen av blodpropp i pipetten. RT-PA-responsen til blodproppene forblir stabil i 2 uker etter tilbaketrekning28.

2. Forberedelse av vanntank

  1. Fyll vanntanken med omvendt osmosevann. Line bunnen overflaten av tanken med et akustisk absorberende materiale for å redusere refleksjon av terapi eller bildebehandling ultralyd pulser. Bruk et vannhåndteringssystem til å avfette og filtrere vannet for å minimere boblekjerner.
    MERK: En måte å filtrere vannet på er å bruke et innebygd filter. Spesifikasjonene til posen som brukes til å generere de representative resultatene er gitt i materialtabellen.
  2. Plasser to varmeelementer på tankens nedre overflate. Varm opp vannet til 37,3 °C for å oppnå maksimal lytisk enzymatisk aktivitet30.
  3. Konfigurer en flytkanal som vist i figur 1A. Strømningskanalen består av rør, et modellfartøy med materiale og geometriske egenskaper som er representative for en iliofemoral vene, et reservoar for plasma og en sprøyte på den distale enden av reservoaret (Tabell over materialer). Sprøyten er koblet til en pumpe for å regulere en strømning gjennom kanalen under eksperimentet.
  4. Senk strømningskanalen manuelt ned i vanntanken for å bringe kanalen til fysiologiske temperaturer under avgassings-/filtrerings-/varmetrinnet (trinn 2.1 og 2.2).

3. Fremstilling av plasma- og rt-PA-blanding

  1. Før eksperimentdagen
    MERK: Når det oppbevares ved -80 °C, er plasma stabilt i minst 2,5 år31 og rt-PA er stabilt i minst 7 år32. Utfør derfor trinn 3.1 når som helst i disse periodene for å sikre stabiliteten til de to komponentene.
    1. Fortynn rt-PA oppnådd fra en produsent i pulverform til 1 mg / ml i sterilt vann.
    2. Aliquot 100 μL fortynnet rt-PA i 0,5 ml sentrifugerør og oppbevar dem ved -80 °C.
    3. Aliquot 35 ml humant ferskfrossen type O-plasma i 50 ml sentrifugerør. Oppbevar rørene ved -80 °C.
  2. På eksperimentdagen
    1. Hent plasma aliquots fra fryseren. Hent så mange aliquots som antall blodpropper som skal testes den dagen. Senk de frosne aliquots i et vannbad ved 37 °C for å tine (~10 min).
    2. Når plasma har tint, hell det i et beger som skylles med ultrapure vann. Dekk lett munnen på begeret med aluminiumsfolie for å forhindre forurensning og plasser begeret i vannbadet. La folien være løs nok til at luft kan komme i kontakt med plasmaet.
    3. La plasmalikevekten være 37 °C til atmosfærisk trykk i minst 2 timer.
    4. Ta ut de frosne rt-PA hetteglassene og legg dem på is til det er nødvendig, med ett hetteglass for hvert eksperimentløp.
    5. Lag lav gelling agarose (2%) i en 50 ml kolbe, ved å oppløse agarose i ultrapurt vann. Velg den totale mengden agaroseløsning slik at ca. 2 ml er tilgjengelig for hver prøve som skal analyseres. Varm oppløsningen i kolbe i en mikrobølgeovn til boblende. Fest kolben med et vanntett skruelokk på. Senk kolben ned i vannbadet ved siden av plasmaet.
      MERK: Dette trinnet sikrer at agarose er tilgjengelig for å sikre eksponerte blodproppsegmenter for histologianalyse etter histotripsy-insonasjon.

4. Sette opp histotripsy kilde og bildebehandling matrise

  1. Forsikre deg om at de motoriserte posisjoneringsenhetene kan styres fra kjøretidsmiljøet til en programmeringsplattform, ved hjelp av retninger og kommandoer levert av produsenten. Kontroller at motorene i systemet er koblet til riktig port på datamaskinen med kjøretidsmiljøet.
  2. Monter histotripsykilden på det motoriserte posisjoneringssystemet som vist i figur 1B.
  3. Koble histotripsykilden til kjøreelektronikken (f.eks. effektforsterker og funksjonsgenerator) via de aktuelle kontaktene (f.eks. BNC-kabler) som spesifisert av produsenten.
    MERK: Kontroller at kjøreelektronikken til histotripsykilden kan styres via kjøretidsmiljøet som brukes i trinn 4.1.
  4. Dekk bildematerialet med et sondedeksel og fest matrisen koaksialt i blenderåpningen til histotripsykilden som vist i figur 2. Pass på å forstå retningen på bildeplanet i forhold til retningen til histotripsy-kilden.
  5. Koble bildebehandlingsmatrisen til et ultralydskanningssystem. Kontroller at dette systemet kan kontrollere driften og utløseren av bildebehandlingsmatrisen, og samle inn bildedata i henhold til kommandoene fra skannerprodusenten.
  6. Senk histotripsykilden/bildebehandlingsmatrisen ned i tanken under avgassing som vist i figur 1A. Fjern forsiktig eventuelle luftbobler ved hjelp av en sprøyte fra overflaten av histotripsy-kilden eller bildebehandlingsmatrisen.
    MERK: Senk histotripsykilden og bildebehandlingsrekken helt ned i vann før bruk. Unngå å berøre overflaten av histotripsy kilden.
  7. Hent bilder i B-modus med en hastighet på 20 bilder per sekund ved hjelp av bildematrisen og de innebygde kommandoene til skanneren. Juster bildevinduet for å sikre visualisering av fokuset til histotripsy-kilden i disse sanntidsbildene.
    MERK: Det antas at dimensjonene til fokusområdet til den terapeutiske kilden er kjent.
  8. Angi driftsparametrene til histotripsy-kilden, inkludert grunnleggende frekvens (f.eks. 1,5 MHz), pulsrepetisjonsfrekvens (f.eks. 20-100 Hz), pulsvarighet (f.eks. 1-20 sykluser per puls) og totalt antall pulser per sted (f.eks. 100-2000)18,23,24,33. Modifiser disse parametrene hvis tilstrekkelig blodpropplys ikke oppnås, eller hvis bobleaktiviteten strekker seg utover lumen til modellfartøyet. Hvis du vil angi disse parameterne, bruker du protokollen fra produsenten av kilden eller bruker en programmeringsplattform som kan kommunisere med kilden (trinn 4.3).
  9. Bruk produsentens protokoll eller programmeringsplattform som brukes i trinn 4.8, kjør histotripsy-kilden bare ved de angitte parametrene i avgasset vann, uten hindring i omgivelsene. Øk spenningen som påføres histotripsykilden til en boblesky dannes.
  10. Bruk sanntidsavbildningen av trinn 4.7 til å justere plasseringen av bildebehandlingsmatrisen inne i den konfiske svingeråpningen til bobleskyen er plassert omtrent midt i bildevinduet. Bobleskyen er området med hyperechoiske bildepunkter i bildeplanet (figur 3). Stram skruene for å holde bildebehandlingsrekken godt fast i svingeråpningen.
    MERK: Hvis matrisen er riktig justert, skal azimuthalposisjonen til bobleskyen være omtrent 0 mm i bildeplanet. Bildebehandlingsmatrisen kan projisere litt fra den indre overflaten av behandlingskilden, og derfor kan rekkeviddeposisjonen til bobleskyen avvike fra kildens brennvidde.
  11. Identifiser bobleskyplasseringen i bildeplanet. Tilordne fokus for histotripsy-kilden som midten av bobleskyen (Figur 3).
  12. Registrer den oppdagede brennvidden (trinn 4.11) i bildevinduet (Figur 3). En mulig måte å markere fokusposisjonen på, er å plassere en markør for å notere plasseringen i bildevinduet, hvis den er tilgjengelig med bildeplattformen.
  13. Avslutt insonasjonen og sett spenningen på histotripsykilden til 0 V.

5. Clot forberedelse

  1. Fjern blodpropp fra pipetten ved å kutte den forseglede enden med tanger. La blodpropp gli inn i en Petri-tallerken sammen med serumet. Hvis blodproppen ikke løsner, legg forsiktig trykk fra den andre enden av pipetten via saltvannsspyling for å fjerne blodpropp.
  2. Klipp blodpropp til 1 cm lengde ved hjelp av en skalpell, og sikt på et jevnt stykke fra midten (dvs. vekk fra deler av blodpropp dannet øverst eller nederst på pipetten).
  3. Bruk en rengjøringsserviett til å flekke den kuttede delen av blodpropp forsiktig for å fjerne overflødig væske.
  4. Bruk pinsett, plasser blodproppdelen forsiktig på en veievekt og registrer vekten.
  5. Løft strømningskanalen manuelt ut av vanntanken og fjern modellbeholderen fra strømningskanalen.
  6. Plasser blodpropp i modellfartøyet ved hjelp av pinsett og fest modellfartøyet igjen til strømningskanalen.
    MERK: En nylonstang kan plasseres i modellbeholderen for å hindre at blodpropp beveger seg nedstrøms på grunn av strømmen.
  7. Senk strømningskanalen inn i tanken på en slik måte at den proksimale enden av scenen i forhold til reservoaret er lav sammenlignet med den distale siden. Sportsfisket av scenen på denne måten forhindrer fangst av bobler i modellfartøyet når plasma trekkes gjennom strømningskanalen i trinn 6.1.
  8. Tilsett 30 ml plasma i reservoaret ved hjelp av en pipette og overvåk temperaturen til den når minst 36 °C.
  9. Bruk en pipette til å dispensere rt-PA (80,4 μg i 30 ml plasma, 2,68 μg/ml) i plasmareservoaret. Rør plasmaet med pipetten for å sikre en jevn rt-PA-fordeling i reservoaret.

6. Påfylling av strømningskanalen

  1. Trekk plasma inn i strømningskanalen fra reservoaret via sprøytepumpen til plasmaet fyller modellbeholderen.
    MERK: Hvis blodpropp ikke er i flukt med nylonstangen, bruk korte pumpetrekk på 60 ml/min for å prøve å tvinge plasmaet nedstrøms koaguleringen eller trekke gjennom sprøyten manuelt. Begrens mengden plasma som trekkes i denne prosessen, eller fyll på reservoaret ved hjelp av ekstra plasma/rt-PA for å sikre 30 ml oppløsning i strømningskanalen.
  2. Bruk de motoriserte posisjoneringsenhetene til å justere bildetabellen parallelt med lengden på blodpropp ved hjelp av bildeskriptet (trinn 4.7). Parallelljusteringen gjør det mulig for brukeren å visuelt sikre riktig plassering av blodpropp og fravær av bobler inne i modellfartøyet.
  3. Utjevn modellbeholderen manuelt og visuelt for å sikre at det ikke finnes luftbobler ved hjelp av bildevinduet (trinn 4.7).

7. Eksperimenter prosedyre

  1. Forbehandling
    MERK: Dette trinnet er å planlegge en bane for histotripsy kilde / bildematrise for jevn histotripsy eksponering langs blodpropp lengde.
    1. Juster bildebehandlingsmatrisen ved hjelp av de motoriserte posisjoneringsenhetene slik at bildeplanet er parallelt med tverrsnittet av blodpropp (dvs. vinkelrett på retningen som er beskrevet i trinn 6.2).
    2. Under veiledning via bildevinduet (trinn 4.7) flytter du histotripsykilden til den proksimale enden av blodpropp i forhold til reservoaret ved hjelp av de motoriserte posisjoneringene. På dette tidspunktet justerer du histotripsykildeposisjonen slik at det markerte fokuspunktet i trinn 4.12 stemmer overens med midten av blodproppen.
    3. Bestem insonasjonsbanen langs blodpropplengden. For å definere denne banen, angi tre veipunkter langs lengden av blodpropp (dvs. posisjonene til motorene der histotripsy bobleaktivitet er inneholdt i blodpropp) i 5 mm trinn. Juster veipunktene slik at den totale bevegelsen til histotripsykilden langs banen er antegrade med strømning i systemet (dvs. det første veipunktet er på den mest proksimale enden av blodpropp i forhold til reservoaret, og det tredje veipunktet er i distal posisjon i forhold til reservoaret).
    4. Før du fullfører hvert veipunkt, pulserer branntest fra histotripsy-kilden med de samme insonasjonsparametrene som trinn 4.8, men reduserer den totale eksponeringen til 10 totale pulser. Juster posisjonen til histotripsykilden ved hjelp av de motoriserte posisjoneringsenhetene om nødvendig, for å inneholde bobleaktivitet i blodpropp.
    5. På hvert veipunkt lagrer du motorposisjonene ved hjelp av kommandoene fra produsenten, som ligner på trinn 4.1.
  2. Behandling
    MERK: Dette trinnet definerer prosedyren for å behandle blodpropp langs lengden i henhold til banen som er definert i forbehandlingstrinnet.
    1. Kjør sprøytepumpen på 0,65 ml/min og vent til menisken i plasmaet beveger seg. Denne strømningshastigheten etterligner en nesten total okklusjon av iliofemoral vaskulatur24,34.
    2. Interpolere banen som ble opprettet i trinn 7.1.3 med mellomliggende trinn mellom de etablerte veipunktene med en fast trinnstørrelse (f.eks. 0,5 mm). Trinnstørrelsen velges til å være mindre enn halvparten av bredden på brennvidden målt langs blodpropplengden (avbildningsmatrisens retning). Flytt histotripsy-kilden ved hjelp av motoriserte posisjoneringspersoner på hvert banested med insonasjonsparametere definert i trinn 4.8.
    3. Overvåk/bildebobleaktivitet under påføring av histotripsypulsen på hvert banested ved hjelp av bildevinduet (trinn 4.7). Midtstill bildet på histotripsy-fokuset med bildedimensjonene som dekker 15 mm i asimut og rekkevidde. Før anvendelsen av histotripsy puls på hvert sted, skaffe et B-modus bilde for å gi visualisering av blodpropp og modell fartøy, ved å lage et skript i en programmeringsplattform. Kontroller at skriptet oppretter kommunikasjon med skanneren ved hjelp av produsentens kommandoer.
    4. Under anvendelsen av histotripsy-pulsen implementerer du oppkjøpet av akustiske utslipp i manuset i trinn 7.2.3 for å danne passive kavitasjonsbilder etter hoc35. Skaff deg ett passivt kavitasjonsbilde etter hver 10 behandlingspuls. Bruk en flat kompensasjon for tidsøkning på 50 ved 8 inkrementelle dybder til slutten av bildedybden. Velg en passende oppkjøpsvindustørrelse slik at hele signalet fra blodpropp fanges opp med minimalt tap av energi på grunn av vindu35.
    5. Hvis det finnes bobleskyer utenfor målet, justerer du svingerposisjonen in situ med de motoriserte posisjoneringsenhetene.
      MERK: Overvåk for tapte utløsere av bildebehandlingsmatrisen. Juster antall innsammede bildedatasett for å sikre at lagringen av data fullføres før etterfølgende utløsing.

8. Etter eksperimentprosedyre

  1. Løft modellfartøyet manuelt ut av vanntanken for å tømme perfusatet via tyngdekraften. Sørg for å holde strømningskanalen nivellert for å forhindre at blodpropp beveger seg nedstrøms og ut av modellfartøyet under drenering.
  2. Samle hele perfusate for videre analyse i et lite beger (Figur 4A) ved å trekke plasmaoppløsning fra strømningskanalen gjennom sprøytepumpen med svært lav strømningshastighet.
  3. Koble fra modellbeholderen og fjern blodpropp. Om nødvendig, injiser en liten mengde saltvann i modellbeholderen for å løsne blodproppen forsiktig.
  4. Tørk av blodproppen på samme måte som trinn 1.2.3. Vei blodpropp på veievekten for å vurdere blodproppmassetapet.
  5. For å analysere D-dimerinnholdet, tilsett 100 mg aminokaproinsyre til et mikrocentrifugerør etterfulgt av 1 ml perfusat, og bland godt ved hjelp av en pipette. Utfør en lateks immun-turbidimetrisk analyse for å kvantifisere D-dimer iprøven 36.
  6. For å vurdere hemolyse, tilsett 1 ml perfusat til sentrifugerør og spinn ved 610 x g (3500 rpm) i 10 min. Kombiner 0,5 ml supernatant (konsentrat) med 0,5 ml Drabkins-løsning og la blandingen hvile ved romtemperatur i 15 minutter. Overfør 200 μL til brønnplater, som vist i figur 4B. Bruk en plateleser til å lese absorbans ved 540 nm, figur 4C (Drabkins-analyse37).
  7. Histologi vurdering
    1. Klipp en seksjon fra midten av blodpropp på ca 2-3 mm i lengde med en skalpell.
    2. Legg til delen i en kassett. Oppretthold orientering av seksjonen i forhold til retningen av histotripsy pulsutbredelse.
    3. Tilsett 2 ml lav gelling agarose løsning fremstilt i trinn 3.2.5 i kassetten for å fikse blodpropp på plass.
    4. Fest prøven i 10% formalin i 24 timer. Legg prøven i 70% alkohol etter 24 timer og utfør standard hemotoxylin-eosinfarging38.

9. Passiv kavitasjonsbildeanalyse

  1. Behandle signalene fra bildebehandlingsrekken under histotripsy excitation (trinn 7.2.4) ved hjelp av en algoritme basert på den robuste Capon beamformer39 for å skape et bilde av akustiske utslipp generert av bobleskyen på hvert behandlingssted.
    MERK: For å generere kvantitative bilder, følg trinnene som er beskrevet i Haworth et al.35. Ellers bør hver pikselverdi i bildet representere den relative akustiske bobleskyenergien (enheter av V2) på hvert tilsvarende sted.
  2. Segmenter B-modusbildet som er aquired i trinn 7.2.3 for å skille mellom pikslene som representerer blodpropp og modellfartøyet.
  3. Registrer det passive kavitasjonsbildet samtidig med B-modusbildet, som vist i figur 5B. Summer den akustiske energien i blodpropp over eksponeringsperioden35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen som er skissert i denne studien fremhever detaljene i venøs blodproppmodellering, lysotripsy for blodproppforstyrrelser og ultralydavbildning i et in vitro-oppsett av DVT. Den vedtatte prosedyren demonstrerer trinnene som er nødvendige for å vurdere blodproppforstyrrelser på grunn av de kombinerte effektene av rt-PA og histotripsy boble skyaktivitet. Benkeplaten ble designet for å etterligne egenskapene til en venøs iliofemoral vene. Figur 1A viser et modellfartøy som har de akustiske, mekaniske og geometriske egenskapene til den iliofemorale venen. Blodpropp er plassert inne i modellfartøyet for å etterligne en delvis okklusiv trombe. Blodproppen er perfundert med plasma og rt-PA trukket fra et reservoar med en hastighet på 0,65 ml / min. Denne hastigheten er i samsvar med langsom strømningshastighet i et svært okkludert fartøy34.

En elliptisk fokusert svinger med 1,5 MHz grunnleggende frekvens med en 9 cm hovedakse, 7 cm mindre akse og 6 cm brennvidde (figur 2A) er montert på posisjoneringssystemet som nevnt i figur 1B. En bildebehandlingsmatrise dekket med ultralydgel og et lateksdeksel (Figur 2B,C) er montert koaksialt med svingeren som vist i figur 1A via en åpning i midten av histotripsykilden. De motoriserte posisjoneringsenhetene ble brukt til å oversette terapitransduseren/bildebehandlingsmatrisen langs blodpropplengden i modellfartøyet (figur 1). Ved påføring av tilstrekkelig spenning til histotripsykilden genereres en boblesky i svingerens fokusområde og visualiseres via ultralydavbildning, som vist i figur 3. Brennvidden defineres som midten av bobleskyen ved hjelp av bildeplanet (trinn 4.10-4.11).

Figur 4A viser perfusater samlet inn for to ulike behandlingstilstander. Begeret merket som kontroll inneholder perfusat av en blodpropp eksponert for plasma alene. Det andre begeret merket som behandlet inneholder perfusate av lysotripsy behandlet blodpropp. De innsamlede perfusatene brukes til å vurdere hemoglobin (metrisk hemolyse) og D-dimer (metrisk fibrinolyse) innhold gjennom analyser som angitt i protokollen. Forskjellen i fargen på perfusatene betegner variasjon i hemoglobinkonsentrasjon, som kan kvantifiseres via optisk absorbans. Sammenhengen mellom absorbansverdi og hemoglobinkonsentrasjon kan bestemmes gjennom en kalibreringskurve. Løsninger med kjent hemoglobininnhold fra 0 (blank måling) til 180 mg/ml plasseres i brønnplaten og absorbansen bestemmes ved hjelp av plateleseren (Figur 4B,C). Plateleserens øvre absorbansgrense kan variere og er kanskje ikke kjent som en prioritering av å lage løsningene i brønnplaten. Som sådan er hemoglobinkonsentrasjoner opp til 180 mg / ml laget i brønnplaten, figur 4B. Plateleseren som brukes her, kan imidlertid lese absorbans for konsentrasjoner som bare er opptil 23 mg/ml, figur 4C.

Figur 5A viser visualisering av blodpropp i modellfartøyet via B-modusavbildning før histotripsyeksponering som angitt i trinn 7.2.3. Dette bildet er anskaffet for å bestemme blodproppposisjonen for segmentering av det passive kavitasjonsbildet. Figur 5B viser det passive kavitasjonsbildet som er registrert sammen med B-modusbildet som ble anskaffet før histotripsyeksponeringen. Denne figuren bekrefter at akustisk energi hovedsakelig finnes i blodpropp under histotripsy eksponering.

Typiske blodproppforstyrrelser på grunn av histotripsy og lytisk er angitt i figur 6. Figur 6A,B viser henholdsvis ubehandlede og lysotripsybehandlede blodproppbilder. For prøver som utsettes for histotripsy, er forstyrrelser først og fremst begrenset til blodproppsenteret, i samsvar med de observerte stedene for bobleaktivitet sporet med passiv kavitasjonsavbildning (figur 5B). Men med tilsetning av lytisk forekommer massetap også i regioner nærmere periferien av blodpropp. Det er hypoteset at dette ekstra massetapet skyldes forbedret væskeblanding av lytic under bobleaktivitet. Væskeblanding øker fordelingen og penetrasjonsdybden til lytic i blodpropp. Siden lytic er ansvarlig for fibrinolyse40, øker massetapet. Fibrinolyse kan kvantifiseres ved å måle D-dimerinnholdet i perfusate41.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt oppsett for lysotripsy av human blodpropp. (A) Komponentene i oppsettet er (1) fokusert histotripsy kilde med elliptisk geometri, (2) latex-dekket bildebehandling matrise, (3) modell fartøy festet til strømningskanal, (4) strømningskanal, (5) reservoar, (6) akustisk absorberende materiale, (7) varmeelement, og (8) vanntank fylt med avgasset og oppvarmet omvendt osmose vann. Azimuth-dimensjonen til bildeplanet er vinkelrett på høyde- og områdedimensjonene (inn på siden). (B) Histotripsy-kilden montert på det motoriserte posisjoneringssystemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Ultralydkilde og bildekomponenter. Individuelle zoomede bilder av (A) fokuserte sintotripsykilde, (B) bildematrise og (C) bildebehandlingsmatrise med ultralydgel og lateksdeksel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Histotripsy boblesky visualisert ved hjelp av bildematrise. En boblesky genereres i fokussonen til histotripsykilden og avbildes ved hjelp av en bildematrise. Det utpekte fokuset, vist som et kors, lagres for behandlingsplanlegging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kvantifisering av hemoglobin som frigjøres på grunn av blodpropplys. (A) Perfusatprøver samlet inn etter kontrollstudie med plasma alene (ingen histotripsy eller lytisk) og behandlingsarm, histotripsy (f.eks. 35 MPa topp negativt trykk, 5 syklusvarighet puls, 1,5 MHz grunnleggende frekvens) og 2,68 μg/ml lytisk eksponering. (B) Brønnplate som inneholder fortynninger av kjente hemoglobinkonsentrasjoner fra 180 mg/ml (øverste rad, venstre hjørne) til 0 mg/ml (nederste rad, høyre hjørne). Pilspissen peker mot avtagende hemoglobinkonsentrasjon. (C) Disse prøvene brukes til å lage en standardkurve for å kvantifisere hemoglobin produsert på grunn av histotripsy eksponering via spektrofotometri. Absorbanskurve for hemoglobinkonsentrasjoner fra 0 til 23 mg/ml oppnås på grunn av begrensning av plateleseren ved analyse av høyere konsentrasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bilder av blodpropp under behandling. (A) B-modus bilde ervervet før starten av behandlingspulsen som viser blodproppposisjonen i modellfartøyet. (B) Post-hoc visualisering avacoustic energi utslipp beregnet fra passiv kavitasjon avbildning vist i hot colormap co-registrert med B-modus bilde av blodpropp ervervet før påføring av histotripsy puls. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Histologi av den ablerte blodpropp under ulike behandlingsforhold. (A) Kontroller blodpropp uten behandling. (B) Blodpropp behandlet med lysotripsy (f.eks. 35 MPa topp negativt trykk, enkeltsyklus puls varighet, 1,5 MHz grunnleggende frekvens). Histotripsy-pulsen forplantet seg fra topp til bunn i dette bildet. Banen til histotripsykilden langs lengden av blodpropp (dvs. vinkelrett på planet i bildet som vises her) er definert i trinn 7.2.3. Mikrografenes skala er 2 mm. Merk at graden av blodproppforstyrrelser oppnådd her vil bli redusert sammenlignet med insonasjonsordninger med lengre pulsvarighet24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foreslåtte protokollen presenterer en modell for å kvantifisere behandlingseffekten av lysotripsy. Selv om nøkkeldetaljene har blitt diskutert, er det visse kritiske aspekter å vurdere for å lykkes med denne protokollen. Den enzymatiske aktiviteten til rt-PA har en Arrhenius temperaturavhengighet30. Temperatur er også en medvirkende årsak til lydens hastighet i vann og vev, og variasjoner i temperatur kan forårsake mindre endringer i fokalsonegeometrien. Dermed bør vanntemperaturen reguleres nøye ved 37 °C. Dosen av rt-PA som brukes i protokollen (2,68 μg/ml) er i samsvar med den som brukes klinisk for andre farmakobekaniske trombektomistrategier42. I trinn 5,8 overføres 30 ml plasma til reservoaret, mens en 35 ml aliquot er notert i trinn 3.1.3. Dette ekstra plasmaet står for tap i plasma på grunn av fordampning i løpet av timer når det varmes opp til 37 °C for likevekt til atmosfærisk trykk.

Brennvidden, blenderbredden og frekvensen av terapitransduseren dikterer størrelsen og dybden på fokusområdet. Derfor bør svingeren velges slik at disse egenskapene stemmer overens med diameteren og dybden på målbeholderen (f.eks. lårbenet: 2-4 cm i dybden og 0,6-1,2 cm i diameter)43. Omfanget av mekanisk ablasjon er begrenset til omfanget av bobleskyen. Dermed er en forståelse av rollen insonasjonsparametere spiller i å endre histotripsy boblesky-oppførsel kritisk33,44,45. Frekvensen og styrken på akustisk felt bør også velges og merkes størrelsen på demping på grunn av middels og mellomliggende materialer (f.eks. modellfartøy). For å sikre innesperring av bobleaktivitet med målfartøyet, bør det velges et passende bildevindu for å overvåke fokussonen. Transduserens driftsparametere bør velges for å unngå måleffekter samtidig som mekanisk blodproppforstyrrelse maksimeres. I denne protokollen ble massetap ansett som en primær beregning av behandlingseffekt. Økning i massetap har blitt observert som topp negativt trykk eller varigheten av histotripsy pulsen økes24,46, med et maksimalt observert massetap på 94%. Tilstedeværelsen av gjenværende blodpropp for undersøkte behandlingsarmer letter sammenligning av terapeutisk effekt. Imidlertid kan det også utarbeides insonasjonsordninger for å sikre total fjerning av tromben.

Den akustiske impedansen (ca. 1,58 MRayl47,48) og de geometriske egenskapene (0,6-1,2 cm i diameter43) til modellbeholderen skal være representativ for iliofemoral venøs vaskulatur (se Tabell over materialer for detaljer). Polydimetylsiloksan og polyuretan er noen av de andre materialene som er egnet til å modellere venøst system basert på deres acousto-mekaniske egenskaper. I trinn 7 er det viktig å fjerne alle luftboblene fra modellfartøyet for å unngå å beskytte blodpropp fra histotripsyeksponering. For et modellfartøy av hydrofobt materiale kan bobleskyer dannes fortrinnsvis nær karveggen i stedet for midten av blodpropp. Derfor bør kontinuerlig overvåking av bobleskyen gjøres under behandlingen via ultralydavbildning, og transduseren bør om nødvendig omplasseres. Pilotstudier bør gjennomføres for å bestemme hanstotripsy-insonasjonsparametere (f.eks. pulsvarighet og topptrykk) som oppnår den endelige tiltenkte blodproppforstyrrelsen.

Bildebehandlingsmatrisen brukes til å ta bilder i B-modus og passive kavitasjonsbilder for behandlingsvisualisering og til å kvantifisere bobleaktivitet. B-modus bildebehandling tillater visualisering av modellfartøyet og blodpropp, og passiv kavitasjonsavbildning måler energien til bobleaktiviteten forbundet med blodpropp ablasjon24,49. Båndbredden til bildebehandlingsmatrisen bør justeres etter ønsket skyaktivitet med høyt signal-til-støy-forhold. For å oppnå rent bredbåndssignaler knyttet til det inertiale sammenbruddet av bobler i skyen, bør båndbredden til matrisen ikke falle sammen med den grunnleggende frekvensen til svingeren50,51. Histotripsy pulser er svært ikke-lineære52, og det er sannsynlig at harmonikk av den grunnleggende frekvensen vil være til stede i det mottatte signalet. Bildesystemet bør programmeres til å utløses basert på den kjente flytiden til histotripsypulsen fra kilden til fokussonen for å sikre innsamling av komplette passive kavitasjonsavbildningsdata gjennom hele insonasjonen. Disse signalene bør deretter behandles post hoc som beskrevet i trinn 7.2.3 og 9 i protokollen.

Det skal bemerkes at mengden hemolyse er følsom for håndtering av blodpropp. Derfor bør det utvises forsiktighet for å minimere skade på blodpropp før behandling. For å sikre reproduserbarhet bør blodproppmodellering (trinn 1) og forbehandlingstid (trinn 6 og 7.1) være det samme for alle blodproppene som behandles med eller uten histotripsyeksponering. I etterbehandlingstrinnet av hemolysevurderingen bør det bemerkes at plasma har sin egen absorbans. Derfor bør fortynningsmiddelet som brukes til å danne standardkurver (f.eks. optisk absorbans vs. hemoglobin) dannes ved hjelp av samme væske som brukes som perfusat i strømningskanalen (f.eks. i denne studien ble plasma brukt som fortynningsmiddel for å danne standardkurver).

Denne protokollen tar sikte på å gi en benk topp oppsett for å måle effekten av lysotripsy å behandle menneskelige hele blodpropper. Det er visse begrensninger som oppstår på grunn av in vitro-naturen til oppsettet. De akutte blodproppene som brukes til denne protokollen besto hovedsakelig av røde blodlegemer og fibrin, noe som gjorde tilnærmingen til lysotripsy effektiv for DVT. Senere stadier av trombe kan imidlertid utvikle et stivt kollagenisk nettverk53 som kan motstå lysotripsybehandlingen på grunn av den fibrinspesifikke karakteren av rt-PA. Ved behandling av in vivo er det primære kliniske endepunktet for behandlingseffektivitet restaurering av strømning. Massetap var en primær beregning for behandlingseffekt i in vitro-protokollen som er beskrevet her. Selv om flyten ikke ble vurdert i denne protokollen, kan farge Doppler-avbildning i tillegg innlemmes sammen med passiv kavitasjonsavbildning i trinn 7.2.4 for å overvåke strømningsrestaurering. Oppsettet i denne protokollen bruker en fast strømningshastighet, som etterligner strømningshastigheten i et svært okkludert fartøy, under hele behandlingen i trinn 7.2. In vivo, vaskulær strømning vil øke som blodpropp oppløses under behandlingen. De ekstra skjærspenningene forbundet med økt strømning vil fremheve blodproppforringelsesprofilen54. In vivo off-target effekter kan ikke fastslås i dette oppsettet, for eksempel blødning på grunn av systemisk administrering av lytisk55, karveggskade eller vasospasme på grunn av bobleskyaktivitet22. In vitro-karakteren til denne studien begrenser også evnen til å vurdere langsiktige resultater, for eksempel kar patency eller re-trombose etter behandling. Administrasjonen av lytisk i denne studien mimicked systemiske trombolytika, mens kateterstyrte lytika er den foretrukne intervensjonen for venøs trombose7,14. Vevsdemping kan påvirke histotripsyfeltet og bildekvaliteten for in vivo-studier, mens her er den akustiske banen først og fremst gjennom avgasset vann. Behandling av kavitasjonsutslippsdata med den robuste Capon beamformer (trinn 9 i protokollen) er beregningsmessig dyrt og ble utført off-line for post hoc-analyse. Andre stråleformere (f.eks. forsinkelse og sum35 eller vinkelspektrum56) kan betjenes alternativt for å gi tilbakemelding i sanntid, om enn med redusert rekkeviddeoppløsning.

Oppsummert presenterer denne protokollen en ikke-invasiv tilnærming for å oppnå dyp venetrombolyse av menneskelige blodpropper. Protokollen etablerer en praktisk og lett replikert prosedyre for modellering av blodpropper, behandling av dem med lysotripsy og samtidig avbildning under behandling. Protokolltrinnene som spesifiserer histotripsy boble skygenerering, behandlingsplanlegging og bildeveiledning kan videre brukes til å undersøke in vitro behandlinger av brystsvulst, bukspyttkjertel svulst og godartet prostatahyperplasi, hvor histotripsy har vist seg å være mer effektiv sammenlignet med standardprosedyrer57,58. Bruken av rt-PA i denne protokollen kan generaliseres til andre legemidler eller legemiddelbærere som brukes til behandling av slike svulster, sammen med histotripsy for å øke den lytiske effekten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Forfatterne vil takke Dr. Kevin Haworth for å ha hjulpet til med Drabkins analyse og Dr. Viktor Bollen for hans støtte til å designe protokollen. Forfatterne er også takknemlige til Dr. Adam Maxwell for hans veiledning om å designe histotripsy kilden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Tags

Bioengineering Utgave 172 histotripsy lysotripsy trombolyse hemolyse dyp venetrombose passiv kavitasjonsavbildning fokusert ultralyd akustisk kavitasjon
Et in vitro-system for å måle trombolytisk effekt av histotripsy og et lytisk legemiddel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter