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Bioengineering

Un sistema in vitro para medir la eficacia trombolítica de la histotricia y un fármaco lítico

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

La administración lítica asistida por histotricia o lisotricia está en desarrollo para el tratamiento de la trombosis venosa profunda. Aquí se presenta un procedimiento in vitro para evaluar la eficacia de esta terapia combinada. Se discuten los protocolos clave para el modelo de coágulos, la guía de imágenes y la evaluación de la eficacia del tratamiento.

Abstract

La trombosis venosa profunda (TVP) es un problema de salud mundial. El enfoque primario para lograr la recanalización de los vasos para obstrucciones críticas es la trombolítica dirigida por catéter (CDT). Para mitigar los efectos secundarios cáusticos y el largo tiempo de tratamiento asociado con cdT, se están desarrollo enfoques adyuvantes y alternativos. Uno de estos enfoques es la histotricia, una terapia de ultrasonido enfocada para extirpar el tejido a través de la nucleación de nubes de burbujas. Los estudios preclínicos han demostrado una fuerte sinergia entre la histotricia y los trombolíticos para la degradación de coágulos. Este informe describe un método de sobremesa para evaluar la eficacia de la terapia trombolítica asistida por histotricia, o lisotricia.

Los coágulos fabricados a partir de sangre venosa humana fresca se introdujeron en un canal de flujo cuyas dimensiones y propiedades acusto-mecánicas imitan una vena iliofemoral. El canal se perfundió con plasma y el activador lítico recombinante de tipo tisinógeno tipo tejido. Se generaron nubes de burbujas en el coágulo con una fuente de ultrasonido enfocada diseñada para el tratamiento de coágulos venosos femorales. Se utilizaron posicionadores motorizados para traducir el foco de la fuente a lo largo de la longitud del coágulo. En cada ubicación de insonación, las emisiones acústicas de la nube de burbujas se registraron pasivamente y se formaron haces para generar imágenes de cavitación pasiva. Las métricas para medir la eficacia del tratamiento incluyeron la pérdida de masa del coágulo (eficacia general del tratamiento) y las concentraciones de dímero D (fibrinólisis) y hemoglobina (hemólisis) en el perfusato. Existen limitaciones para este diseño in vitro, incluida la falta de medios para evaluar los efectos secundarios in vivo o los cambios dinámicos en la velocidad de flujo a medida que el coágulo se lisa. En general, la configuración proporciona un método eficaz para evaluar la eficacia de las estrategias basadas en la histotricia para tratar la TVP.

Introduction

La trombosis es la condición de formación de coágulos en un vaso sanguíneo por lo demás sano que obstruye la circulación1,2. El tromboembolismo venoso tiene un costo anual de atención médica de $ 7-10 mil millones, con 375,000-425,000 casos en los Estados Unidos3. La embolia pulmonar es la obstrucción de la arteria pulmonar y es la consecuencia más grave del tromboembolismo venoso. La principal fuente de obstrucción pulmonar son los trombos venosos profundos, principalmente de los segmentos venosos iliofemorales4,5,6. La trombosis venosa profunda (TVP) tiene secuelas inherentes además de las obstrucciones pulmonares, con complicaciones a largo plazo que resultan en dolor, hinchazón, ulceraciones de piernas y amputaciones de extremidades7,8,9. Para las obstrucciones críticas, los trombolíticos dirigidos por catéter (CDT) son el enfoque de primera línea para la recanalización de vasos10. El resultado de la CDT depende de una serie de factores, incluida la edad del trombo, la ubicación, el tamaño, la composición, la etiología y la categoría de riesgo del paciente11. Además, la CDT se asocia con daño vascular, infecciones, complicaciones hemorrágicas y un largo tiempo de tratamiento10. Los dispositivos de próxima generación tienen como objetivo combinar la trombectomía mecánica con trombolíticos (es decir, la trombectomía farmacomecánica)12,13. El uso de estos dispositivos reduce la dosis lítica, lo que reduce las complicaciones hemorrágicas y acorta el tiempo de tratamiento12,13,14 en comparación con CDT. Estos dispositivos aún conservan problemas de efectos secundarios hemorrágicos y eliminación incompleta de trombos crónicos15. Por lo tanto, se necesita una estrategia adyuvante que pueda eliminar el trombo por completo con complicaciones hemorrágicas más bajas.

Un enfoque potencial es el tratamiento trombolítico asistido por histotricia, conocido como lisotricia. La histotricia es una modalidad de tratamiento no invasiva que utiliza ultrasonido enfocado para nuclear nubes de burbujas en los tejidos16. La actividad de la burbuja no se genera a través de núcleos exógenos, sino mediante la aplicación de pulsos ecográficos con tensión suficiente para activar núcleos intrínsecos a los tejidos, incluido el coágulo17,18. La oscilación mecánica de la nube de burbujas imparte tensión al coágulo, desintegrando la estructura en desechos acelulares19. La actividad de la burbuja de histotricia proporciona una degradación efectiva de los coágulos sanguíneos retraídos y notractados tanto in vivo como in vitro20,21,22. Estudios previos handemostrado 23,24 que la combinación de histotricia y el activador lítico recombinante del plasminógeno tipo tejido (rt-PA) aumenta significativamente la eficacia del tratamiento en comparación con el lítico solo o la histotricia sola. Se plantea la hipótesis de que dos mecanismos principales asociados con la actividad de la burbuja de histotricia son responsables de la mejora de la eficacia del tratamiento: 1) aumento de la fibrinólisis debido a una mayor administración lítica, y 2) hemólisis de los glóbulos rojos dentro del coágulo. La mayor parte de la masa del coágulo está compuesta por glóbulos rojos24y, por lo tanto, el seguimiento de la degradación de los eritrocitos es un buen sustituto para la ablación de la muestra. Es probable que otros elementos de coágulos formados también se desintegren bajo la actividad de la burbuja de histotricia, pero no se consideran en este protocolo.

Aquí, se describe un enfoque de sobremesa para tratar la TVP in vitro con lisotricia. El protocolo describe los parámetros operativos críticos de la fuente de histotricia, la evaluación de la eficacia del tratamiento y la guía de imágenes. El protocolo incluye el diseño de un canal de flujo para imitar un segmento venoso iliofemoral y la fabricación de coágulos de sangre total humana. El procedimiento experimental describe el posicionamiento de la fuente de histotricia y la matriz de imágenes para lograr la exposición a la histotricia a lo largo del coágulo colocado en el canal de flujo. Se definen parámetros de insonación relevantes para lograr la interrupción del coágulo y minimizar la actividad de burbujas fuera del objetivo. Se ilustra el uso de imágenes ecográficas para orientación y evaluación de la actividad de las burbujas24. Las métricas para cuantificar la eficacia del tratamiento, como la pérdida de masa de coágulos, el dímero D (fibrinólisis) y la hemoglobina (hemólisis) se describen23,24,25,26,27. En general, el estudio proporciona un medio eficaz para ejecutar y evaluar la eficacia de la lisotricia para tratar la TVP.

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Protocol

Para los resultados presentados aquí, se extrajo sangre humana venosa para formar coágulos después de la aprobación de la junta de revisión interna local (IRB # 19-1300) y el consentimiento informado por escrito proporcionado por donantes voluntarios24. Esta sección describe un protocolo de diseño para evaluar la eficacia de la lisotricia. El protocolo se basa en un trabajo previo de Bollen et al.24.

1. Modelado de coágulos

NOTA: Prepare los coágulos dentro de las 2 semanas, pero más de 3 días antes del día del experimento para garantizar la estabilidad del coágulo y maximizar la retracción28. Prepare el coágulo después de la aprobación de la junta de revisión institucional local.

  1. Prepare la pipeta pasteur de borosilicato para almacenar la sangre (consulte la Tabla de materiales para conocer las especificaciones de la pipeta). Los tubos de borosilicato se utilizan debido a la naturaleza hidrófila del material que promueve la activación plaquetaria y la retracción del coágulo29. Selle la punta de la pipeta mediante calentamiento sobre un quemador Bunsen.
  2. Extraer sangre venosa humana fresca. Alícuota la sangre total extraída en incrementos de 2 ml por coágulo deseado. Transfiera cada alícuota de 2 ml a una pipeta Pasteur.
    NOTA: Ejecute el paso 1.2 dentro de aproximadamente 3 minutos de la extracción de sangre para que la sangre no se coagule antes de transferirla a las pipetas. Además, asegúrese de que el donante voluntario no esté tomando ningún medicamento que pueda alterar la cascada de coagulación (por ejemplo, anticoagulantes o inhibidores de plaquetas).
  3. Incubar las alícuotas de sangre dentro de las pipetas (igual al número de coágulos requeridos) en un baño de agua durante 3 h a 37 °C.
  4. Guarde las pipetas durante un mínimo de 3 días a 4 °C para permitir la retracción de los coágulos28. A medida que los coágulos se retraen, se observará que el suero se acumula en la parte superior del coágulo dentro de la pipeta. La respuesta rt-PA de los coágulos permanece estable durante 2 semanas después de la retracción28.

2. Preparación del tanque de agua

  1. Llene el tanque de agua con agua de ósmosis inversa. Forre la superficie inferior del tanque con un material absorbente acústico para reducir la reflexión de la terapia o los pulsos de ultrasonido por imágenes. Utilice un sistema de manejo de agua para desgasificación y filtrar el agua para minimizar los núcleos de burbujas.
    NOTA: Una forma de filtrar el agua es usando un filtro en línea. Las especificaciones de la bolsa utilizada para generar los resultados representativos se dan en la Tabla de Materiales.
  2. Coloque dos elementos calefactores en la superficie inferior del tanque. Calentar el agua a 37,3 °C para conseguir la máxima actividad enzimática lítica30.
  3. Configure un canal de flujo como se muestra en la Figura 1A. El canal de flujo consiste en tubos, un recipiente modelo con material y propiedades geométricas representativas de una vena iliofemoral, un reservorio para plasma y una jeringa en el extremo más distal del reservorio(Tabla de materiales). La jeringa se conecta a una bomba para regular un flujo a través del canal durante el experimento.
  4. Sumerja manualmente el canal de flujo en el tanque de agua para llevar el canal a la temperatura fisiológica durante la etapa de desgasificación/filtrado/calentamiento (pasos 2.1 y 2.2).

3. Preparación de plasma y mezcla de rt-PA

  1. Antes del día del experimento
    NOTA: Cuando se almacena a -80 °C, el plasma es estable durante al menos 2,5 años31 y rt-PA es estable durante al menos 7 años32. Por lo tanto, ejecute el paso 3.1 en cualquier momento dentro de estos períodos para garantizar la estabilidad de los dos componentes.
    1. Diluir el rt-PA obtenido de un fabricante en forma de polvo a 1 mg/ml en agua estéril.
    2. Alícuota 100 μL de rt-PA diluido en tubos centrífugos de 0,5 ml y guárdelos a -80 °C.
    3. Alícuota de 35 ml de plasma humano fresco congelado tipo O en tubos centrífugos de 50 ml. Conservar los tubos a -80 °C.
  2. El día del experimento
    1. Recupere las alícuotas de plasma del congelador. Recupere tantas alícuotas como el número de coágulos que se analizará ese día. Sumergir las alícuotas congeladas en un baño de agua a 37 °C para descongelar (~10 min).
    2. Una vez que el plasma se haya descongelado, viértalo en un beaker que se enjuaga por triplicado con agua ultrapura. Cubra ligeramente la boca del beaker con papel de aluminio para evitar la contaminación y coloque el beaker en el baño de agua. Permita que la lámina esté lo suficientemente suelta como para permitir que el aire entre en contacto con el plasma.
    3. Deje que el plasma se equilibre a 37 °C a la presión atmosférica durante al menos 2 h.
    4. Saque los viales de rt-PA congelados y colóquelo en hielo hasta que sea necesario, con un vial para cada experimento realizado.
    5. Hacer agarosa de baja gelificación (2%) en un matraz de 50 ml, disolviendo la agarosa en agua ultrapura. Elija la cantidad total de solución de agarosa de modo que haya aproximadamente 2 ml disponibles para cada muestra a analizar. Calentar la solución en matraz en un microondas hasta que burbujee. Asegure el matraz con una tapa de tornillo impermeable. Sumerja el matraz en el baño de agua junto con el plasma.
      NOTA: Este paso garantiza que la agarosa esté disponible para asegurar los segmentos de coágulos expuestos para el análisis histológico después de la insonación de histotricia.

4. Configuración de la fuente de histotricia y la matriz de imágenes

  1. Asegúrese de que los posicionadores motorizados se puedan controlar desde el entorno de tiempo de ejecución de una plataforma de programación, utilizando las instrucciones y los comandos proporcionados por el fabricante. Compruebe que los motores del sistema están conectados al puerto apropiado del equipo con el entorno de tiempo de ejecución.
  2. Monte la fuente de histotricia en el sistema de posicionamiento motorizado como se muestra en la Figura 1B.
  3. Conecte la fuente de histotricia a su electrónica de conducción (por ejemplo, amplificador de potencia y generador de funciones) a través de los conectores apropiados (por ejemplo, cables BNC) según lo especificado por el fabricante.
    NOTA: Asegúrese de que la electrónica de conducción de la fuente de histotricia se pueda controlar a través del entorno de tiempo de ejecución utilizado en el paso 4.1.
  4. Cubra la matriz de imágenes con una cubierta de sonda y fije la matriz coaxialmente en la abertura de la fuente de histotricia como se muestra en la Figura 2. Asegúrese de comprender la orientación del plano de imagen en relación con la orientación de la fuente de histotricia.
  5. Conecte la matriz de imágenes a un sistema de escaneo de ultrasonido. Asegúrese de que este sistema pueda controlar el funcionamiento y la activación de la matriz de imágenes, y recopilar datos de imágenes, según los comandos proporcionados por el fabricante del escáner.
  6. Sumerja la fuente de histotricia/matriz de imágenes en el tanque mientras se desgasificación como se muestra en la Figura 1A. Retire suavemente cualquier burbuja de aire con una jeringa de la superficie de la fuente de histotricia o la matriz de imágenes.
    NOTA: Sumerja la fuente de histotricia y la matriz de imágenes completamente en agua antes de la operación. Evite tocar la superficie de la fuente de histotricia.
  7. Adquiera imágenes en modo B a una velocidad de 20 fotogramas por segundo utilizando la matriz de imágenes y los comandos integrados del escáner. Ajuste la ventana de imágenes para garantizar la visualización del enfoque de la fuente de histotricia en estas imágenes en tiempo real.
    NOTA: Se supone que se conocen las dimensiones de la región focal de la fuente terapéutica.
  8. Establezca los parámetros de funcionamiento de la fuente de histotricia, incluida la frecuencia fundamental (por ejemplo, 1,5 MHz), la frecuencia de repetición de pulsos (por ejemplo, 20-100 Hz), la duración del pulso (por ejemplo, 1-20 ciclos por pulso) y el número total de pulsos por ubicación (por ejemplo, 100-2.000)18,23,24,33. Modifique estos parámetros si no se logra suficiente lisis del coágulo o si la actividad de la burbuja se extiende más allá de la luz del vaso modelo. Para establecer estos parámetros, utilice el protocolo proporcionado por el fabricante del origen o utilice una plataforma de programación que pueda comunicarse con el origen (paso 4.3).
  9. Utilizando el protocolo del fabricante o la plataforma de programación utilizada en el paso 4.8, ejecute la fuente de histotricia en los parámetros establecidos solo en agua desgaseada, sin ninguna obstrucción en el entorno circundante. Aumente el voltaje aplicado a la fuente de histotricia hasta que se forme una nube de burbujas.
  10. Utilizando la imagen en tiempo real del paso 4.7, ajuste la posición de la matriz de imágenes dentro de la abertura del transductor confocal hasta que la nube de burbujas se encuentre aproximadamente en el centro de la ventana de la imagen. La nube de burbujas es la región de píxeles hiperecoicos en el plano de imagen(Figura 3). Apriete los tornillos para sujetar la matriz de imágenes firmemente en la abertura del transductor.
    NOTA: Si la matriz está alineada correctamente, la posición azimutal de la nube de burbujas debe ser de aproximadamente 0 mm en el plano de imagen. La matriz de imágenes puede proyectarse ligeramente desde la superficie interna de la fuente de terapia y, por lo tanto, la posición del rango de la nube de burbujas puede diferir de la distancia focal de la fuente.
  11. Identifique la ubicación de la nube de burbujas en el plano de imágenes. Asigne el foco de la fuente de histotricia como el centro de la nube de burbujas (Figura 3).
  12. Registre la ubicación focal detectada (paso 4.11) en la ventana de imágenes(Figura 3). Una forma posible de marcar la posición focal es colocar un cursor para anotar la ubicación en la ventana de imágenes, si está disponible con la plataforma de imágenes.
  13. Suspenda la insonación y establezca el voltaje aplicado a la fuente de histotricia a 0 V.

5. Preparación del coágulo

  1. Retire el coágulo de la pipeta cortando el extremo sellado con alicates. Deje que el coágulo se deslice en una placa de Petri junto con el suero. Si el coágulo no se desprende, aplique suavemente presión desde el otro extremo de la pipeta a través de un lavado salino para eliminar el coágulo.
  2. Corte el coágulo a 1 cm de longitud con un bisturí, con el objetivo de obtener una pieza uniforme desde el centro (es decir, lejos de las secciones del coágulo formadas en la parte superior o inferior de la pipeta).
  3. Use una toallita de limpieza para secar la sección cortada del coágulo suavemente para eliminar el exceso de líquido.
  4. Con pinzas, coloque la sección del coágulo suavemente sobre una báscula de pesaje y registre el peso.
  5. Levante manualmente el canal de flujo fuera del tanque de agua y retire el recipiente modelo del canal de flujo.
  6. Coloque el coágulo en el recipiente modelo con pinzas y vuelva a conectar el recipiente modelo al canal de flujo.
    NOTA: Se puede colocar una varilla de nylon dentro del recipiente modelo para evitar que el coágulo se mueva río abajo debido al flujo.
  7. Baje el canal de flujo hacia el tanque de tal manera que el extremo proximal de la etapa en relación con el reservorio sea bajo en comparación con el lado distal. La pesca de la etapa de esta manera evita la captura de burbujas en el recipiente modelo cuando el plasma se extrae a través del canal de flujo en el paso 6.1.
  8. Agregue 30 ml de plasma al depósito con una pipeta y controle la temperatura hasta que alcance al menos 36 ° C.
  9. Utilice una pipeta para dispensar el rt-PA (80,4 μg en 30 ml de plasma, 2,68 μg/ml) en el reservorio plasmático. Revuelva el plasma con la pipeta para asegurar una distribución uniforme de rt-PA dentro del depósito.

6. Cebado del canal de flujo

  1. Extraiga el plasma en el canal de flujo desde el depósito a través de la bomba de jeringa hasta que el plasma llene el recipiente modelo.
    NOTA: Si el coágulo no está al ras con la varilla de nylon, use extracciones cortas de la bomba a 60 ml / min para tratar de forzar el plasma aguas abajo del coágulo o extraiga manualmente a través de la jeringa. Limite la cantidad de plasma extraído en este proceso o rellene el reservorio utilizando plasma/rt-PA adicional para asegurar 30 ml de solución en el canal de flujo.
  2. Usando los posicionadores motorizados, alinee la matriz de imágenes paralelamente a la longitud del coágulo usando el script de imágenes (paso 4.7). La alineación paralela permite al usuario garantizar visualmente la colocación adecuada del coágulo y la ausencia de burbujas dentro del recipiente modelo.
  3. Nivele el recipiente modelo manualmente y asegúrese visualmente de que no haya burbujas de aire presentes utilizando la ventana de imágenes (paso 4.7).

7. Procedimiento experimental

  1. Pre-tratamiento
    NOTA: Este paso consiste en planificar una ruta para la fuente de histotricia/ matriz de imágenes para una exposición uniforme a la histotricia a lo largo de la longitud del coágulo.
    1. Alinee la matriz de imágenes utilizando los posicionadores motorizados de modo que el plano de imagen sea paralelo a la sección transversal del coágulo (es decir, perpendicular a la orientación descrita en el paso 6.2).
    2. Bajo guía a través de la ventana de imágenes (paso 4.7), mueva la fuente de histotricia al extremo proximal del coágulo en relación con el reservorio utilizando los posicionadores motorizados. En este punto, ajuste la posición de la fuente de histotricia de tal manera que el punto focal marcado en el paso 4.12 se alinee con el centro del coágulo.
    3. Determine la ruta de insonación a lo largo de la longitud del coágulo. Para definir este camino, establezca tres puntos de referencia a lo largo de la longitud del coágulo (es decir, posiciones de los motores donde la actividad de la burbuja de histotricia está contenida dentro del coágulo) en incrementos de 5 mm. Alinee los waypoints de tal manera que el movimiento general de la fuente de histotricia a lo largo del camino sea anterógrado con el flujo en el sistema (es decir, el primer waypoint está en el extremo más proximal del coágulo en relación con el reservorio, y el tercer waypoint está en la posición distal en relación con el reservorio).
    4. Antes de finalizar cada waypoint, pruebe los pulsos de fuego de la fuente de histotricia con los mismos parámetros de insonación que el paso 4.8, pero reduzca la exposición general a 10 pulsos totales. Ajuste la posición de la fuente de histotricia utilizando los posicionadores motorizados si es necesario, para contener la actividad de la burbuja dentro del coágulo.
    5. En cada punto de referencia, guarde las posiciones del motor utilizando los comandos proporcionados por el fabricante, similar al paso 4.1.
  2. Tratamiento
    NOTA: Este paso define el procedimiento para tratar el coágulo a lo largo de su longitud de acuerdo con la ruta definida en el paso previo al tratamiento.
    1. Ejecute la bomba de la jeringa a 0,65 ml/min y espere a que el menisco del plasma se mueva. Este caudal imita una oclusión casi total de la vasculatura iliofemoral24,34.
    2. Interpole la ruta creada en el paso 7.1.3 con pasos intermedios entre los puntos de referencia establecidos con un tamaño de paso fijo (por ejemplo, 0,5 mm). El tamaño del paso se elige para ser más pequeño que la mitad del ancho de la región focal medido a lo largo de la longitud del coágulo (dirección de elevación de la matriz de imágenes). Mueva la fuente de histotricia utilizando posicionadores motorizados en cada ubicación de la ruta con parámetros de insonación definidos en el paso 4.8.
    3. Monitoree/imagine la actividad de la burbuja durante la aplicación del pulso de histotricia en cada ubicación de la ruta utilizando la ventana de imágenes (paso 4.7). Centrar la imagen en el foco de histotricia con las dimensiones de la imagen que cubren 15 mm en el acimut y el rango. Antes de la aplicación del pulso de histotricia en cada ubicación, adquiera una imagen en modo B para proporcionar visualización del coágulo y el vaso modelo, mediante la creación de un script en una plataforma de programación. Asegúrese de que el script establece comunicación con el escáner mediante los comandos del fabricante.
    4. Durante la aplicación del pulso de histotricia, implementar la adquisición de emisiones acústicas en el guión en el paso 7.2.3 para formar imágenes de cavitación pasiva post hoc35. Adquirir una imagen de cavitación pasiva después de cada 10 pulsos de tratamiento. Aplique una compensación de ganancia de tiempo plana de 50 a 8 profundidades incrementales hasta el final de la profundidad de imagen. Elija un tamaño de ventana de adquisición adecuado de modo que toda la señal del coágulo se capture con una pérdida mínima de energía debido a la ventana35.
    5. Si hay nubes de burbujas fuera del objetivo, ajuste la posición del transductor in situ con los posicionadores motorizados.
      NOTA: Supervise los desencadenadores perdidos de la matriz de imágenes. Ajuste el número de conjuntos de datos de imágenes adquiridos para garantizar que el almacenamiento de datos se complete antes de la activación posterior.

8. Procedimiento posterior al experimento

  1. Levante manualmente el recipiente modelo fuera del tanque de agua para drenar el perfusato por gravedad. Asegúrese de mantener el canal de flujo nivelado para evitar que el coágulo se mueva río abajo y fuera del recipiente modelo durante el drenaje.
  2. Recoja todo el perfusato para su posterior análisis en un pequeño beaker(Figura 4A)extrayendo la solución de plasma del canal de flujo a través de la bomba de la jeringa a un caudal muy bajo.
  3. Desconecte el vaso modelo y retire el coágulo. Si es necesario, inyecte una pequeña cantidad de solución salina en el vaso modelo para desalojar suavemente el coágulo.
  4. Limpie el coágulo de manera similar al paso 1.2.3. Pesar el coágulo en la báscula de pesaje para evaluar la pérdida de masa del coágulo.
  5. Para analizar el contenido del dímero D, agregue 100 mg de ácido aminocaproico a un tubo de microcentrífuga seguido de 1 ml de perfusato y mezcle bien con una pipeta. Realizar un ensayo inmuno-turbidimétrico de látex para cuantificar el dímero D dentro de la muestra36.
  6. Para evaluar la hemólisis, agregue 1 ml de perfusato a los tubos de la centrífuga y gire a 610 x g (3.500 rpm) durante 10 min. Combine 0,5 ml de sobrenadante (concentrado) con 0,5 ml de solución de Drabkins y deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min. Transfiera 200 μL a las placas de pozos, como se muestra en la Figura 4B. Utilice un lector de placas para leer la absorbancia a 540 nm, Figura 4C (ensayo de Drabkins37).
  7. Evaluación histología
    1. Corte una sección del centro del coágulo de aproximadamente 2-3 mm de longitud con un bisturí.
    2. Agregue la sección a un casete. Mantener la orientación de la sección en relación con la dirección de propagación del pulso de histotricia.
    3. Agregue 2 ml de solución de agarosa de baja gelificación preparada en el paso 3.2.5 en el cassette para fijar el coágulo en su lugar.
    4. Fijar la muestra en formalina al 10% durante 24 h. Colocar la muestra en alcohol al 70% después de 24 h y realizar tinción estándar de hemotoxilina-eosina38.

9. Análisis pasivo de imágenes de cavitación

  1. Procese las señales adquiridas de la matriz de imágenes durante la excitación de la histotricia (paso 7.2.4) utilizando un algoritmo basado en el robusto formador de haz Capon39 para crear una imagen de las emisiones acústicas generadas por la nube de burbujas en cada lugar de tratamiento.
    NOTA: Para generar imágenes cuantitativas, siga los pasos descritos en Haworth et al.35. De lo contrario, cada valor de píxel en la imagen debe representar la energía acústica relativa de la nube de burbujas (unidades de V2)en cada ubicación correspondiente.
  2. Segmente la imagen en modo B adquirida en los pasos 7.2.3 para distinguir entre los píxeles que representan el coágulo y el recipiente del modelo.
  3. Co-registre la imagen de cavitación pasiva con la imagen de modo B como se muestra en la Figura 5B. Sume la energía acústica dentro del coágulo durante el período de exposición35.

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Representative Results

El protocolo descrito en este estudio destaca los detalles del modelado de coágulos venosos, la lisotricia para la interrupción del coágulo y las imágenes de ultrasonido en una configuración in vitro de TVP. El procedimiento adoptado demuestra los pasos necesarios para evaluar la interrupción del coágulo debido a los efectos combinados de la rt-PA y la actividad de la nube de burbujas de histotricia. La configuración de la mesa de trabajo fue diseñada para imitar las características de una vena venosa iliofemoral. La Figura 1A muestra un vaso modelo que tiene las propiedades acústicas, mecánicas y geométricas de la vena iliofemoral. El coágulo se coloca dentro del vaso modelo para imitar un trombo parcialmente oclusivo. El coágulo se perfunde con plasma y rt-PA extraído de un reservorio a una velocidad de 0,65 ml/ min. Esta velocidad es consistente con la velocidad de flujo lenta en un recipiente altamente ocluido34.

Un transductor elípticamente enfocado de frecuencia fundamental de 1,5 MHz con un eje mayor de 9 cm, un eje menor de 7 cm y una distancia focal de 6 cm(Figura 2A)está montado en el sistema de posicionamiento como se indica en la Figura 1B. Una matriz de imágenes cubierta con gel de ultrasonido y una cubierta delátex (Figuras 2B,C)se monta coaxialmente con el transductor como se muestra en la Figura 1A a través de una abertura en el centro de la fuente de histotricia. Los posicionadores motorizados se utilizaron para traducir el transductor de terapia / matriz de imágenes a lo largo de la longitud del coágulo dentro del vaso modelo(Figura 1). Tras la aplicación de suficiente voltaje a la fuente de histotricia, se genera una nube de burbujas en la región focal del transductor y se visualiza a través de imágenes de ultrasonido, como se muestra en la Figura 3. La posición focal se define como el centro de la nube de burbujas utilizando el plano de imagen (pasos 4.10-4.11).

La Figura 4A muestra los perfusatos recolectados para dos condiciones de tratamiento diferentes. El beaker etiquetado como control contiene perfusato de un coágulo expuesto solo al plasma. El segundo beaker etiquetado como tratado contiene el perfusato del coágulo tratado con lisotricia. Los perfusatos recolectados se utilizan para evaluar el contenido de hemoglobina (métrica de hemólisis) y Dímero D (métrica de fibrinólisis) a través de ensayos según lo especificado en el protocolo. La diferencia de color de los perfusados denota variabilidad en la concentración de hemoglobina, que se puede cuantificar a través de la absorbancia óptica. La relación entre el valor de absorbancia y la concentración de hemoglobina se puede determinar a través de una curva de calibración. Las soluciones con contenido conocido de hemoglobina que van desde 0 (medición en blanco) hasta 180 mg / ml se colocan en la placa del pozo y la absorbancia se determina por triplicado utilizando el lector de placas(Figura 4B,C). El límite superior de absorbancia del lector de placas puede variar y puede no conocerse a priori para hacer las soluciones en la placa del pozo. Como tal, las concentraciones de hemoglobina de hasta 180 mg / ml se hacen en la placa del pozo, Figura 4B. Sin embargo, el lector de placas utilizado aquí puede leer la absorbancia para concentraciones de hasta 23 mg / ml solamente, Figura 4C.

La Figura 5A muestra la visualización del coágulo dentro del vaso modelo a través de imágenes en modo B antes de la exposición a la histotricia como se especifica en el paso 7.2.3. Esta imagen se adquiere para determinar la posición del coágulo para la segmentación de la imagen de cavitación pasiva. La Figura 5B muestra la imagen de cavitación pasiva co-registrada con la imagen en modo B adquirida antes de la exposición a la histotricia. Esta cifra confirma que la energía acústica está contenida principalmente dentro del coágulo durante la exposición a la histotricia.

La interrupción típica del coágulo debido a la histotricia y el lítico se indican en la Figura 6. La Figura 6A,B muestra las imágenes de coágulos no tratadas y tratadas con lisotricia, respectivamente. Para las muestras expuestas a histotricia, la interrupción se restringe principalmente al centro del coágulo, de acuerdo con las ubicaciones observadas de la actividad de la burbuja rastreada con imágenes de cavitación pasiva(Figura 5B). Sin embargo, con la adición de lítico, la pérdida de masa también ocurre en regiones más cercanas a la periferia del coágulo. Se plantea la hipótesis de que esta pérdida de masa adicional se debe a una mayor mezcla de fluidos del lítico bajo la actividad de la burbuja. La mezcla de fluidos aumenta la distribución y la profundidad de penetración del lítico en el coágulo. Dado que el lítico es responsable de la fibrinólisis40,la pérdida de masa aumenta. La fibrinólisis se puede cuantificar midiendo el contenido de dímero D en el perfusato41.

Figure 1
Figura 1:Configuración experimental para la lisotricia del coágulo sanguíneo humano. (A) Los componentes de la configuración son (1) fuente de histotricia enfocada con geometría elíptica, (2) matriz de imágenes cubierta de látex, (3) vaso modelo unido al canal de flujo, (4) canal de flujo, (5) depósito, (6) material absorbente acústico, (7) elemento calefactor y (8) tanque de agua lleno de agua de ósmosis inversa desgasificada y calentada. La dimensión azimutal del plano de imagen es perpendicular a las dimensiones de elevación y rango (en la página). (B) La fuente de histotricia montada en el sistema de posicionamiento motorizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Fuente de ultrasonido y componentes de imagen. Imágenes individuales ampliadas de (A) fuente de histotricia enfocada, (B) matriz de imágenes y (C) matriz de imágenes con gel de ultrasonido y cubierta de látex. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Nube de burbujas de histotricia visualizada utilizando una matriz de imágenes. Se genera una nube de burbujas en la zona focal de la fuente de histotricia y se toma una imagen utilizando una matriz de imágenes. El foco designado, que se muestra como una cruz, se guarda para la planificación del tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Cuantificación de la hemoglobina liberada debido a la lisis del coágulo. (A) Muestras de perfusato recogidas tras el estudio de control con plasma solo (sin histotricia ni lítica), y brazo de tratamiento, histotricia (por ejemplo, presión negativa máxima de 35 MPa, duración del pulso de 5 ciclos, frecuencia fundamental de 1,5 MHz) y exposición lítica de 2,68 μg/ml. (B) Placa de pozo que contiene diluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina que van desde 180 mg/ ml (fila superior, esquina más a la izquierda) a 0 mg / ml (fila inferior, esquina más a la derecha). La punta de flecha apunta hacia la disminución de la concentración de hemoglobina. (C) Estas muestras se utilizan para crear una curva estándar para cuantificar la hemoglobina producida debido a la exposición a la histotricia a través de espectrofotometría. La curva de absorbancia para concentraciones de hemoglobina que oscila entre 0 y 23 mg/ml se obtiene debido a la limitación del lector de placas en el análisis de concentraciones más altas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes del coágulo durante el tratamiento. ( A )Imagenen modo B adquirida antes del inicio del pulso de tratamiento que muestra la posición del coágulo dentro del vaso modelo. (B) Visualización post-hoc de la emisión de energía acustica calculada a partir de imágenes de cavitación pasiva mostradas en mapa de color caliente co-registrado con la imagen en modo B del coágulo adquirido antes de la aplicación del pulso de histotricia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Histología del coágulo ablacionado bajo diferentes condiciones de tratamiento. (A) Coágulo de control sin tratamiento. (B) Coágulo tratado con lisotricia (por ejemplo, presión negativa máxima de 35 MPa, duración del pulso de ciclo único, frecuencia fundamental de 1,5 MHz). El pulso de histotricia se propagó de arriba a abajo en esta imagen. La ruta para la fuente de histotricia a lo largo de la longitud del coágulo (es decir, perpendicular al plano de la imagen que se muestra aquí) se define en el paso 7.2.3. La escala de las micrografías es de 2 mm. Tenga en cuenta que el grado de interrupción del coágulo alcanzado aquí se reduciría en comparación con los esquemas de insonación con una mayor duración del pulso24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo propuesto presenta un modelo para cuantificar la eficacia del tratamiento de la lisotricia. Si bien se han discutido los detalles clave, hay ciertos aspectos críticos a considerar para el éxito de este protocolo. La actividad enzimática de rt-PA tiene una dependencia de la temperatura de Arrhenius30. La temperatura también es un factor que contribuye a la velocidad del sonido en el agua y el tejido, y las variaciones en la temperatura pueden causar alteraciones menores de la geometría de la zona focal. Por lo tanto, la temperatura del agua debe regularse cuidadosamente a 37 ° C. La dosis de rt-PA utilizada en el protocolo (2,68 μg/ml) es consistente con la empleada clínicamente para otras estrategias de trombectomía farmacomecánica42. En el paso 5.8, 30 ml de plasma se transfieren al reservorio, mientras que una alícuota de 35 ml se observa en el paso 3.1.3. Este plasma adicional representa la pérdida de plasma debido a la evaporación en el transcurso de horas cuando se calienta a 37 ° C para el equilibrio con la presión atmosférica.

La distancia focal, el ancho de apertura y la frecuencia del transductor de terapia dictan el tamaño y la profundidad de la región focal. Por lo tanto, el transductor debe elegirse de tal manera que estas características se alineen con el diámetro y la profundidad del vaso objetivo (por ejemplo, vena femoral: 2-4 cm de profundidad y 0,6-1,2 cm de diámetro)43. La extensión de la ablación mecánica está restringida a la extensión de la nube de burbujas. Por lo tanto, una comprensión del papel que desempeñan los parámetros de insonación en la modificación del comportamiento de la nube de burbujas de histotricia es crítica33,44,45. La frecuencia y la intensidad del campo acústico también deben elegirse teniendo en cuenta la magnitud de la atenuación debida a materiales medios e intermedios (por ejemplo, modelo de recipiente). Para garantizar el confinamiento de la actividad de la burbuja con el vaso objetivo, se debe elegir una ventana de imagen adecuada para monitorear la zona focal. Los parámetros de funcionamiento del transductor deben elegirse para evitar efectos fuera del objetivo al tiempo que se maximiza la interrupción mecánica del coágulo. En este protocolo, la pérdida de masa se consideró una métrica primaria de la eficacia del tratamiento. Se han observado aumentos en la pérdida de masa a medida que la presión negativa máxima o la duración del pulso de histotricia se incrementan24,46,con una pérdida de masa máxima observada del 94%. La presencia de coágulos residuales para los brazos de tratamiento investigados facilita la comparación de la eficacia terapéutica. Sin embargo, también se pueden idear esquemas de insonación para garantizar la eliminación total del trombo.

La impedancia acústica (aproximadamente 1,58 MRayl47,48) y las propiedades geométricas (0,6-1,2 cm de diámetro43) del vaso modelo deben ser representativas de la vasculatura venosa iliofemoral (ver Tabla de Materiales para más detalles). El polidimetilsiloxano y el poliuretano son algunos de los otros materiales adecuados para modelar el sistema venoso en función de sus propiedades acusto-mecánicas. En el paso 7, es importante eliminar todas las burbujas de aire del recipiente modelo para evitar proteger el coágulo de la exposición a la histotricia. Para un vaso modelo de material hidrófobo, las nubes de burbujas pueden formarse preferentemente cerca de la pared del vaso en lugar del centro del coágulo. Por lo tanto, el monitoreo continuo de la nube de burbujas debe realizarse durante el tratamiento a través de imágenes de ultrasonido, y el transductor debe reposicionarse si es necesario. Se deben realizar estudios piloto para determinar los parámetros de insonación de la histotricia (por ejemplo, la duración del pulso y la presión máxima) que logran la interrupción final del coágulo prevista.

La matriz de imágenes se utiliza para capturar imágenes en modo B e imágenes de cavitación pasiva para la visualización del tratamiento y para cuantificar la actividad de las burbujas. Las imágenes en modo B permiten la visualización del vaso modelo y el coágulo, y las imágenes de cavitación pasiva miden la energía de la actividad de la burbuja asociada con la ablación del coágulo24,49. El ancho de banda de la matriz de imágenes debe alinearse con la actividad deseada de la nube de burbujas con una alta relación señal-ruido. Para obtener señales puramente de banda ancha asociadas con el colapso inercial de burbujas dentro de la nube, el ancho de banda de la matriz no debe coincidir con la frecuencia fundamental del transductor50,51. Los pulsos de histotricia son altamente no lineales52, y es probable que armónicos de la frecuencia fundamental estén presentes en la señal recibida. El sistema de imágenes debe programarse para que se active en función del tiempo de vuelo conocido del pulso de histotricia desde la fuente hasta la zona focal para garantizar la recopilación de datos completos de imágenes de cavitación pasiva a lo largo de la insonación. Estas señales deben procesarse post hoc como se describe en los pasos 7.2.3 y 9 del protocolo.

Cabe señalar que la cantidad de hemólisis es sensible al manejo del coágulo. Por lo tanto, se debe tener cuidado para minimizar el daño al coágulo antes del tratamiento. Para garantizar la reproducibilidad, el modelado de coágulos (paso 1) y el tiempo previo al tratamiento (pasos 6 y 7.1) deben ser los mismos para todos los coágulos tratados con o sin exposición a histotricia. En la etapa posterior al tratamiento de la evaluación de la hemólisis, debe tenerse en cuenta que el plasma tiene su propia absorbancia. Por lo tanto, el diluyente utilizado para formar curvas estándar (por ejemplo, absorbancia óptica vs. hemoglobina) debe formarse utilizando el mismo fluido utilizado que el perfusato en el canal de flujo (por ejemplo, en este estudio, el plasma se utilizó como diluyente para formar curvas estándar).

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una configuración de sobremesa para medir la eficacia de la lisotricia para tratar los coágulos de sangre total humana. Existen ciertas limitaciones que surgen debido a la naturaleza in vitro de la configuración. Los coágulos agudos utilizados para este protocolo consistieron principalmente en glóbulos rojos y fibrina, lo que hace que el enfoque de la lisotricia sea efectivo para la TVP. Sin embargo, las etapas posteriores del trombo pueden desarrollar una red colágena rígida53 que puede resistir el tratamiento de lisotricia debido a la naturaleza específica de la fibrina de rt-PA. Cuando se trata in vivo, el criterio de valoración clínico primario para la eficacia del tratamiento es la restauración del flujo. La pérdida de masa fue una métrica primaria para la eficacia del tratamiento en el protocolo in vitro descrito aquí. Aunque el flujo no se evaluó en este protocolo, las imágenes Doppler en color se pueden incorporar adicionalmente junto con las imágenes de cavitación pasiva en el paso 7.2.4 para monitorear la restauración del flujo. La configuración en este protocolo utiliza un caudal fijo, imitando el caudal en un recipiente altamente ocluido, durante todo el tratamiento en el paso 7.2. In vivo, el flujo vascular aumentará a medida que el coágulo se desintegre durante el tratamiento. Las tensiones de cizallado adicionales asociadas con el aumento del flujo acentuarán el perfil de degradación del coágulo54. No se pueden determinar efectos fuera del objetivo in vivo en esta configuración, como sangrado debido a la administración sistémica delítico 55,daño en la pared del vaso o vasoespasmo debido a la actividad de la nube deburbujas 22. La naturaleza in vitro de este estudio también limita la capacidad de evaluar los resultados a largo plazo, como la permeabilidad de los vasos o la retrombosis después del tratamiento. La administración de líticos en este estudio imitó los trombolíticos sistémicos, mientras que los líticos dirigidos por catéter son la intervención preferida para la trombosis venosa7,14. La atenuación tisular puede afectar el campo de la histotricia y la calidad de las imágenes para los estudios in vivo, mientras que aquí la ruta acústica es principalmente a través del agua desgasifada. El procesamiento de los datos de emisión de cavitación con el robusto formador de haz Capon (paso 9 del protocolo) es computacionalmente costoso y se realizó fuera de línea para el análisis post hoc. Otros formadores de haz (por ejemplo, retardo y suma35 o espectro angular56)se pueden operar alternativamente para proporcionar retroalimentación en tiempo real, aunque con una resolución de rango reducida.

En resumen, este protocolo presenta un enfoque no invasivo para lograr la trombólisis venosa profunda de los coágulos sanguíneos humanos. El protocolo establece un procedimiento conveniente y fácil de replicar para el modelado de coágulos de sangre, el tratamiento de ellos con lisotricia y la obtención simultánea de imágenes durante el tratamiento. Los pasos del protocolo que especifican la generación de nubes de burbujas de histotricia, la planificación del tratamiento y la guía de imágenes se pueden utilizar para investigar tratamientos in vitro de tumores de mama, tumores pancreáticos e hiperplasia prostática benigna, donde la histotricia ha demostrado ser más efectiva en comparación con los procedimientos estándar57,58. El uso de rt-PA en este protocolo se puede generalizar a otros medicamentos o portadores de medicamentos que se utilizan para tratar dichos tumores, junto con la histotricia para aumentar la eficacia lítica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, Subvención R01HL13334. Los autores desean agradecer al Dr. Kevin Haworth por ayudar con el ensayo de Drabkin y al Dr. Viktor Bollen por su apoyo en el diseño del protocolo. Los autores también están agradecidos con el Dr. Adam Maxwell por su orientación sobre el diseño de la fuente de histotricia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioingeniería Número 172 histotricia lisotricia trombólisis hemólisis trombosis venosa profunda imágenes de cavitación pasiva ultrasonido enfocado cavitación acústica
Un sistema in vitro para medir la eficacia trombolítica de la histotricia y un fármaco lítico
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Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

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