Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ett in vitro-system för att mäta den trombolytiska effekten av histotripsi och ett lytiskt läkemedel

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

Histotripsy-stödda lytic leverans eller lysotripsy är under utveckling för behandling av djupa vein blodpropp. Ett in vitro-förfarande presenteras här för att bedöma effekten av denna kombinationsbehandling. Viktiga protokoll för proppmodellen, bildvägledning och bedömning av behandlingseffekt diskuteras.

Abstract

Djup ventrombos (DVT) är ett globalt hälsoproblem. Det primära tillvägagångssättet för att uppnå kärlrenalisering för kritiska hinder är kateterstyrda trombolytika (CDT). För att mildra kaustiska biverkningar och den långa behandlingstiden i samband med CDT, adjuvans och alternativa metoder är under utveckling. Ett sådant tillvägagångssätt är histotripsy, en fokuserad ultraljudsterapi för att brinna vävnad via bubbelmolnkärna. Prekliniska studier har visat stark synergi mellan histotripsy och trombolytika för blodpropp nedbrytning. Denna rapport beskriver en bänktop metod för att bedöma effektiviteten av histotripsy-stödd trombolytisk terapi, eller lysotripsy.

Blodproppar tillverkade av färskt venöst blod introducerades i en flödeskanal vars dimensioner och acoustomekaniska egenskaper efterliknar en iliofemoral ven. Kanalen var perfused med plasma och den lytiska rekombinanta vävnad-typ plasminogen aktivator. Bubbelmoln genererades i proppen med en fokuserad ultraljud källa utformad för behandling av femorala venösa blodproppar. Motoriserade positionerare användes för att översätta källfokus längs blodproppslängden. På varje insonationsplats registrerades akustiska utsläpp från bubbelmolnet passivt och strålformades för att generera passiva kavitationsbilder. Mätvärden för att mäta behandlingseffekten inkluderade blodproppsmassaförlust (övergripande behandlingseffekt) och koncentrationerna av D-dimer (fibrinolys) och hemoglobin (hemolys) i perfusatet. Det finns begränsningar för denna in vitro-design, inklusive brist på medel för att bedöma in vivo-biverkningar eller dynamiska förändringar i flödeshastigheten när blodproppen lyser. Sammantaget ger installationen en effektiv metod för att bedöma effektiviteten hos histotripsy-baserade strategier för att behandla DVT.

Introduction

Trombos är tillståndet för blodproppsbildning i ett annars friskt blodkärl som hindrar cirkulationen1,2. Venös tromboembolism har en årlig sjukvårdskostnad på $ 7-10 miljarder, med 375,000-425,000 fall i USA3. Pulmonell emboli är obstruktion av lungartären och är den allvarligaste konsekvensen av venös tromboembolism. Den primära källan till lungobstruktion är djup ven thrombi, främst från iliofemorala venösa segment4,5,6. Djup ven blodpropp (DVT) har inneboende och sviter förutom pulmonell obstruktioner, med långsiktiga komplikationer som resulterar i smärta, svullnad, bensår och lem amputationer7,8,9. För kritiska hinder är kateterstyrda trombolytika (CDT) frontlinjen för fartygsrenalisering10. Resultatet av CDT beror på ett antal faktorer, inklusive tromb ålder, plats, storlek, sammansättning, etiologi och patientrisk kategori11. Dessutom är CDT associerat med vaskulär skador, infektioner, blödningskomplikationer och lång behandlingstid10. Nästa generations enheter syftar till att kombinera mekanisk trombektomi med trombolytika (dvs. farmakomisk trombektomi)12,13. Användning av dessa enheter sänker den lytiska dosen vilket leder till minskade blödningskomplikationer och förkortad behandlingstid12,13,14 jämfört med CDT. Dessa enheter behåller fortfarande problem med hemorragiska biverkningar och ofullständigt avlägsnande av kronisk trombi15. En adjuvant strategi behövs alltså som kan ta bort tromben helt med lägre blödningskomplikationer.

Ett potentiellt tillvägagångssätt är histotripsy-stödd trombolytisk behandling, kallad lysotripsy. Histotripsy är en icke-invasiv behandling modalitet som använder fokuserad ultraljud för att nukleera bubbelmoln ivävnader 16. Bubbelaktivitet genereras inte via exogena atomkärnor, utan genom applicering av ultraljudspulser med tillräcklig spänning för att aktivera atomkärnor inneboende i vävnader, inklusive blodpropp17,18. Den mekaniska svängningen av bubbelmolnet ger stam till proppen och sönderfaller strukturen i acellulärt skräp19. Histotripsy bubbelaktivitet ger effektiv nedbrytning av indragna och orena blodproppar både in vivo och in vitro20,21,22. Tidigare studier har23,24 visat att kombinationen av histotripsy och den lytiska rekombinanta vävnadstyp plasminogenaktivatorn (rt-PA) avsevärt ökar behandlingseffekten jämfört med enbart lytisk eller histotripsy ensam. Det är hypotesen att två primära mekanismer i samband med histotripsy bubbel verksamhet är ansvariga för den förbättrade behandlingseffekten: 1) ökad fibrinolys på grund av att förbättrad lytisk leverans och 2) hemolys av röda blodkroppar inom blodproppen. Huvuddelen av blodproppsmassan består av röda blodkroppar24, och därför är spårning av erytrocytnedbrytning en bra surrogat för ablation av provet. Andra bildade blodproppselement är också sannolikt sönderdelas under histotripsy bubbel verksamhet men beaktas inte i detta protokoll.

Här beskrivs en bänktop för att behandla DVT in vitro med lysotripsy. Protokollet beskriver kritiska driftsparametrar för histotripsy källan, bedömning av behandling effektivitet och bild vägledning. Protokollet inkluderar att designa en flödeskanal för att efterlikna ett iliofemoralt venöst segment och tillverkning av hela blodproppar hos människa. Det experimentella förfarandet beskriver positionering av histotripsy källa och bildframställning array för att uppnå histotripsy exponering längs blodproppen placeras i flöde kanalen. Relevanta insoneringsparametrar för att uppnå blodproppsstörning och minimera bubbelaktivitet utanför målet definieras. Användningen av ultraljud imaging för vägledning och bedömning av bubbel verksamhet illustreras24. Mätvärden för att kvantifiera behandlingseffekten såsom blodproppsmassaförlust, D-dimer (fibrinolys) och hemoglobin (hemolys) beskrivs23,24,25,26,27. Sammantaget ger studien ett effektivt sätt att utföra och bedöma effekten av lysotripsy för att behandla DVT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

För de resultat som presenteras här drogs venöst humant blod för att bilda blodproppar efter godkännande från den lokala interna granskningsnämnden (IRB #19-1300) och skriftligt informerat samtycke från frivilligagivare 24. I det här avsnittet beskrivs ett designprotokoll för att bedöma lysotripsy-effekten. Protokollet bygger på ett tidigare arbete av Bollen et al.24.

1. Proppmodellering

OBS: Förbered blodpropparna inom 2 veckor men mer än 3 dagar före experimentdagen för att säkerställa blodproppsstabilitet och maximeraupprullningen 28. Förbered proppen efter godkännandet från den lokala institutionella granskningsnämnden.

  1. Förbered borosilikat Pasteur pipett för lagring av blodet (se Materialförteckning för specifikationer för pipetten). Borosilikatrör används på grund av materialets hydrofila natur som främjar trombocytaktivering och blodproppsupprullning29. Försegla pipettens spets via uppvärmning över en Bunsenbrännare.
  2. Dra färskt mänskligt venöst blod. Alikvot det totala blodet som dras i 2 ml steg per önskad blodpropp. Överför varje 2 ml alikvot till en Pasteur-pipett.
    OBS: Utför steg 1.2 inom cirka 3 min bloddragning så att blodet inte koaglar innan det överförs till pipetter. Se också till att den frivilliga donatorn inte finns på några läkemedel som kan förändra koaguleringskaskaden (t.ex. blodförtunnande ämnen eller trombocythämmare).
  3. Inkubera blod alikvoterna i pipetterna (lika med antalet blodproppar som krävs) i ett vattenbad i 3 timmar vid 37 °C.
  4. Förvara pipetterna i minst 3 dagar vid 4 °C för att möjliggöra indragning av propbar28. När blodpropparna dras tillbaka observeras serum för att ackumuleras på toppen av proppen i pipetten. Rt-PA-svaret på blodproppar förblir stabilt i 2 veckor efter indragning28.

2. Förberedelse av vattentank

  1. Fyll vattentanken med omvänd osmosvatten. Fodra tankens bottenyta med ett akustiskt absorberande material för att minska reflektionen av terapin eller avbildning ultraljudspulser. Använd ett vattenhanteringssystem för att avgasa och filtrera vattnet för att minimera bubbelkärnor.
    OBS: Ett sätt att filtrera vattnet är att använda ett inline-filter. Specifikationerna för den påse som används för att generera de representativa resultaten anges i materialförteckningen.
  2. Placera två värmeelement på tankens bottenyta. Värm vattnet till 37,3 °C för att uppnå maximal lytisk enzymaktivitet30.
  3. Konfigurera en flödeskanal enligt bild 1A. Flödeskanalen består av slangar, ett modellkärl med material och geometriska egenskaper som är representativa för en iliofemoral ven, en reservoar för plasma och en spruta i behållarens distalaste ände (Materialförteckning). Sprutan är ansluten till en pump för att reglera ett flöde genom kanalen under experimentet.
  4. Sänk flödeskanalen manuellt i vattentanken för att föra kanalen till fysiologisk temperatur under avgasnings-/filtrerings-/uppvärmningssteget (steg 2.1 och 2.2).

3. Beredning av plasma- och rt-PA-blandning

  1. Före experimentdagen
    OBS: Vid förvaring vid -80 °C är plasma stabil i minst 2,5 år31 och rt-PA är stabil i minst 7 år32. Kör därför steg 3.1 när som helst inom dessa perioder för att säkerställa stabiliteten för de två komponenterna.
    1. Späd ut den rt-PA som erhållits från en tillverkare i pulverform till 1 mg/ml i sterilt vatten.
    2. Alikvot 100 μL utspädd rt-PA i 0,5 ml centrifugeringsrör och förvara dem vid -80 °C.
    3. Alikvot 35 ml färskfryst plasma av människa i 50 ml centrifuger. Förvara rören vid -80 °C.
  2. På experimentdagen
    1. Hämta plasma alikvoter från frysen. Hämta lika många alikvoter som antalet blodproppar som ska testas den dagen. Sänk ner de frysta alikvoterna i ett vattenbad vid 37 °C för att tina (~10 min).
    2. När plasman har tinat, häll den i en bägare som är triply sköljd med ultrapurevatten. Täck lätt bägarens mun med aluminiumfolie för att förhindra förorening och placera bägaren i vattenbadet. Låt folien vara tillräckligt lös för att luft ska kunna komma i kontakt med plasman.
    3. Låt plasmajämvikta vid 37 °C till atmosfärstrycket i minst 2 timmar.
    4. Ta ut de frysta rt-PA-flaskorna och lägg på is tills det behövs, med en flaska för varje experimentkörning.
    5. Gör låg geleringsagarosa (2%) i en 50 ml kolv genom att lösa upp agarosa i ultrapurevatten. Välj den totala mängden agaroslösning så att cirka 2 ml finns tillgänglig för varje prov som ska analyseras. Värm lösningen i kolven i mikrovågsugnen tills den bubblar. Fäst kolven med ett vattentätt skruvlock på. Sänk kolven i vattenbadet bredvid plasman.
      OBS: Detta steg säkerställer att agarose är tillgängligt för att säkra exponerade proppsegment för histologianalys efter histotripsy insonation.

4. Ställa in histotripsy källa och bildbehandling array

  1. Se till att de motoriserade positionerna kan styras från körmiljön på en programmeringsplattform med hjälp av riktningar och kommandon från tillverkaren. Kontrollera att systemets motorer är anslutna till lämplig port på datorn med körningsmiljön.
  2. Montera histotripsykällan på det motoriserade positioneringssystemet enligt figur 1B.
  3. Anslut histotripsy-källan till dess körelektronik (t.ex. effektförstärkare och funktionsgenerator) via lämpliga kontakter (t.ex. BNC-kablar) enligt tillverkarens specifikationer.
    OBS: Se till att den histotripsykällans körelektronik kan styras via den körmiljö som används i steg 4.1.
  4. Täck avbildningsmatrisen med ett sondskydd och fäst matrisen coaxially i bländaren på histotripsykällan enligt figur 2. Var noga med att förstå orienteringen av bildplanet i förhållande till riktningen på histotripsy källan.
  5. Anslut bildmatrisen till ett ultraljudsskanningssystem. Se till att det här systemet kan styra driften och utlösningen av avbildningsmatrisen och samla in bilddata enligt kommandona från skannerns tillverkare.
  6. Dränk ner histotripsykällan/bildmatrisen i tanken medan du avgasar enligt figur 1A. Ta försiktigt bort eventuella luftbubblor med en spruta från ytan på histotripsy-källan eller bildmatrisen.
    OBS: Sänk ner histotripsykällan och bildmatrisen helt i vatten före drift. Undvik att vidröra ytan på histotripsykällan.
  7. Hämta B-lägesbilder med en hastighet av 20 bildrutor per sekund med hjälp av avbildningsmatrisen och skannerns inbyggda kommandon. Justera bildfönstret för att säkerställa visualisering av fokus för histotripsy-källan i dessa realtidsbilder.
    OBS: Det antas att dimensionerna av den terapeutiska källans fokala region är kända.
  8. Ange driftsparametrarna för histotripsy-källan, inklusive fundamental frekvens (t.ex. 1,5 MHz), pulsrepetitionsfrekvens (t.ex. 20–100 Hz), pulsvaraktighet (t.ex. 1–20 cykler per puls) och totalt antal pulser per plats (t.ex. 100–2 000)18,23,24,33. Ändra dessa parametrar om tillräcklig propplys inte uppnås eller om bubbelaktiviteten sträcker sig bortom modellkärlets lumen. Om du vill ställa in dessa parametrar använder du protokollet från tillverkaren av källan eller använder en programmeringsplattform som kan kommunicera med källan (steg 4.3).
  9. Använd tillverkarens protokoll eller programmeringsplattform som används i steg 4.8 och kör histotripsy-källan endast vid de inställda parametrarna i avgasat vatten, utan hinder i den omgivande miljön. Öka spänningen som appliceras på histotripsy-källan tills ett bubbelmoln bildas.
  10. Använd realtidsavbildningen av steg 4.7 och justera avbildningsmatrisens position inuti den konfokala givarens öppning tills bubbelmolnet finns ungefär i mitten av bildfönstret. Bubbelmolnet är regionen hyperechoic pixlar i bildplanet (Bild 3). Dra åt skruvarna för att hålla avbildningsmatrisen stadigt i givarens öppning.
    OBS: Om matrisen är korrekt justerad bör bubbelmolnets azimuthalposition vara ungefär 0 mm i bildplanet. Bildbehandlingsmatrisen kan projiceras något från terapikällans inre yta, och därför kan bubbelmolnets räckviddsposition skilja sig från källans brännvidd.
  11. Identifiera bubbelmolnets plats i bildplanet. Tilldela fokus för histotripsy-källan som mitten av bubbelmolnet (bild 3).
  12. Registrera den detekterat brännpunkten (steg 4.11) i bildfönstret (bild 3). Ett möjligt sätt att markera brännpunkten är att placera en markör för att notera platsen i bildfönstret, om den är tillgänglig med bildplattformen.
  13. Avbryt insoneringen och ställ in spänningen som appliceras på histotripsykällan till 0 V.

5. Beredning av blodproppar

  1. Ta bort proppen från pipetten genom att skära den förseglade änden med tång. Låt proppen glida in i en petriskål tillsammans med serumet. Om proppen inte lossar, tryck försiktigt från pipettens andra ände via saltlösningsspolning för att ta bort proppen.
  2. Skär proppen till 1 cm lång med en skalpell, sikta på en enhetlig bit från mitten (dvs. bort från delar av proppen som bildas upptill eller längst ner på pipetten).
  3. Använd en rengöringsservett för att försiktigt fläcka den skurna delen av proppen för att avlägsna överflödig vätska.
  4. Använd pincett, placera blodproppssektionen försiktigt på en våg och registrera vikten.
  5. Lyft manuellt ut flödeskanalen ur vattentanken och ta bort modellkärlet från flödeskanalen.
  6. Placera proppen i modellkärlet med pincett och fäst modellkärlet igen på flödeskanalen.
    OBS: En nylonstav kan placeras i modellkärlet för att förhindra att proppen rör sig nedströms på grund av flödet.
  7. Sänk flödeskanalen i tanken på ett sådant sätt att den proximala änden av stadiet i förhållande till behållaren är låg jämfört med den distala sidan. Mete av scenen på detta sätt förhindrar fångst av bubblor i modellkärlet när plasma dras genom flödeskanalen i steg 6.1.
  8. Tillsätt 30 ml plasma i behållaren med en pipett och övervaka temperaturen tills den når minst 36 °C.
  9. Använd en pipett för att dela ut rt-PA (80,4 μg i 30 ml plasma, 2,68 μg/ml) i plasmabehållaren. Rör om plasman med pipetten för att säkerställa en enhetlig rt-PA-fördelning i behållaren.

6. Priming av flödeskanalen

  1. Dra plasma i flödeskanalen från behållaren via sprutpumpen tills plasman fyller modellkärlet.
    OBS: Om proppen inte är i linje med nylonstången, använd korta pumpdragningar vid 60 ml/min för att försöka tvinga plasman nedströms proppen eller manuellt dra genom sprutan. Begränsa mängden plasma som dras i denna process eller fyll på behållaren med ytterligare plasma/rt-PA för att säkerställa 30 ml lösning i flödeskanalen.
  2. Justera avbildningsmatrisen parallellt med blodproppens längd med hjälp av bildskriptet (steg 4.7) med hjälp av de motoriserade positionerna. Den parallella justeringen gör det möjligt för användaren att visuellt säkerställa korrekt placering av proppen och frånvaron av bubblor inuti modellkärlet.
  3. Jämna ut modellkärlet manuellt och visuellt så att inga luftbubblor finns med hjälp av bildfönstret (steg 4.7).

7. Experimentförfarande

  1. Förbehandling
    Obs: Det här steget är att planera en väg för histotripsy source/imaging array för enhetlig histotripsy exponering längs blodpropp längd.
    1. Justera bildmatrisen med hjälp av de motoriserade positionerarna så att bildplanet är parallellt med tvärsnittet av proppen (dvs. vinkelrätt mot den orientering som beskrivs i steg 6.2).
    2. Under ledning via bildfönstret (steg 4.7) flyttar du histotripsykällan till proximala änden av proppen i förhållande till behållaren med hjälp av de motoriserade positionerarna. Justera vid denna punkt histotripsy-källpositionen så att den markerade brännpunkten i steg 4.12 överensstämmer med blodproppens mittpunkt.
    3. Bestäm insoneringsvägen längs blodproppslängden. För att definiera denna bana, ställ in tre waypoints längs blodproppens längd (dvs. positioner för de motorer där histotripsy bubbelaktivitet finns i proppen) i steg om 5 mm. Justera waypoints så att den totala rörelsen hos histotripsykällan längs banan är förmätend med flödet i systemet (dvs. den första waypointen är i den mest proximala änden av proppen i förhållande till behållaren, och den tredje waypointen är i distala positionen i förhållande till behållaren).
    4. Innan varje waypoint slutförs pulserar brandtest från histotripsykällan med samma insoneringsparametrar som steg 4.8 men minskar den totala exponeringen för 10 totala pulser. Justera positionen för histotripsy-källan med hjälp av de motoriserade positionerarna om det behövs, för att innehålla bubbelaktivitet i proppen.
    5. Spara motorpositionerna med hjälp av de kommandon som tillhandahålls av tillverkaren vid varje vägpunkt, liknande steg 4.1.
  2. Behandling
    OBS: Detta steg definierar proceduren för att behandla proppen längs dess längd enligt den väg som definieras i förbehandlingssteget.
    1. Kör sprutpumpen på 0,65 ml/min och vänta tills plasmans menisk rör sig. Detta flöde härmar en nästan total ocklusion av den iliofemorala vaskulaturen24,34.
    2. Interpolera den sökväg som skapats i steg 7.1.3 med mellansteg mellan de etablerade waypointsna med en fast stegstorlek (t.ex. 0,5 mm). Stegstorleken väljs för att vara mindre än hälften av fokusområdets bredd mätt längs koaglinans längd (avbildningsmatrisens höjdriktning). Flytta histotripsy-källan med motoriserade positionerare på varje banplats med insoneringsparametrar definierade i steg 4.8.
    3. Monitor/bildbubbla aktivitet under applicering av histotripsy pulsen på varje bana plats med hjälp av bildfönstret (steg 4.7). Centrera bilden på histotripsy-fokuset med bilddimensionerna som täcker 15 mm i azimut och räckvidd. Innan histotripsypulsen används på varje plats skaffar du en B-lägesbild för att tillhandahålla visualisering av proppen och modellkärlet genom att skapa ett skript i en programmeringsplattform. Se till att skriptet upprättar kommunikation med skannern med hjälp av tillverkarens kommandon.
    4. Under tillämpningen av histotripsypulsen, implementera förvärvet av akustiska utsläpp i manuset i steg 7.2.3 för att bilda passiva kavitationsbilder efter hoc35. Skaffa en passiv kavitationsbild efter var 10:e behandlingspuls. Applicera en schablonmässig tidsvinstkompensation på 50 vid 8 inkrementella djup till slutet av bilddjupet. Välj en lämplig anskaffningsfönsterstorlek så att hela signalen från proppen fångas med minimal energiförlust på grund av fönster35.
    5. Om bubbelmoln utanför målet finns, justera givarens position på plats med de motoriserade positionerarna.
      Obs: Övervaka för missade utlösare av avbildningsmatrisen. Justera antalet förvärvade bilddatauppsättningar för att säkerställa att lagringen av data slutförs innan efterföljande utlösande.

8. Förfarande efter försök

  1. Lyft manuellt ut modellkärlet ur vattentanken för att tömma perfusatet via gravitationen. Var noga med att hålla flödeskanalen utjämnad för att förhindra att proppen rör sig nedströms och ut ur modellkärlet under tömning.
  2. Samla in hela perfusatet för vidare analys i en liten bägare (figur 4A) genom att dra plasmalösning från flödeskanalen genom sprutpumpen vid ett mycket lågt flöde.
  3. Koppla bort modellkärlet och ta bort proppen. Injicera vid behov en liten mängd saltlösning i modellkärlet för att försiktigt lossa proppen.
  4. Torka av proppen på samma sätt som steg 1.2.3. Väg proppen på vågskålen för att bedöma blodproppens massförlust.
  5. För att analysera D-dimer innehållet, tillsätt 100 mg aminokaproinsyra till ett mikrocentrifugrör följt av 1 ml perfusat och blanda väl med en pipett. Utför en latex immun-grumlig analys för att kvantifiera D-dimer i provet36.
  6. För att bedöma hemolys, tillsätt 1 ml perfusat till centrifugrör och snurra vid 610 x g (3 500 varv/min) i 10 min. Kombinera 0,5 ml supernatant (koncentrat) med 0,5 ml Drabkins-lösning och låt blandningen vila vid rumstemperatur i 15 min. Överför 200 μL till brunnsplattor, enligt figur 4B. Använd en plåtläsare för att avläsa absorbans vid 540 nm, figur 4C (Drabkins-analys37).
  7. Histologi bedömning
    1. Skär en sektion från mitten av proppen på ca 2-3 mm i längd med en skalpell.
    2. Lägg till avsnittet i en kassett. Behåll orienteringen av sektionen i förhållande till riktningen för histotripsy pulsutbredning.
    3. Tillsätt 2 ml låg geleringsagaroslösning beredd i steg 3.2.5 i kassetten för att fixera proppen på plats.
    4. Fixera provet i 10% formalin i 24 timmar. Placera provet i 70% alkohol efter 24 timmar och utför standard hemotoxylin-eosin färgning38.

9. Passiv kavitation bildanalys

  1. Bearbeta de signaler som erhållits från bildmatrisen under den histotripsy excitationen (steg 7.2.4) med hjälp av en algoritm baserad på den robusta Capon beamformer39 för att skapa en bild av akustiska utsläpp som genereras av bubbelmolnet på varje behandlingsplats.
    OBS: För att generera kvantitativa bilder, följ stegen som beskrivs i Haworth et al.35. Annars ska varje pixelvärde i bilden representera den relativa akustiska bubbelmolnets energi (enheterna V2) på varje motsvarande plats.
  2. Segmentera B-lägesbilden i steg 7.2.3 för att skilja mellan pixlarna som representerar proppen och modellkärlet.
  3. Samregistrera den passiva kavitationsbilden med B-lägesbilden enligt figur 5B. Summera den akustiska energin i proppen under exponeringsperioden35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet som beskrivs i denna studie belyser detaljerna i venous blodpropp modellering, lysotripsy för blodpropp störningar och ultraljud imaging i en in vitro setup av DVT. Det antagna förfarandet visar de åtgärder som krävs för att bedöma blodproppsstörningar på grund av de kombinerade effekterna av rt-PA och histotripsy bubbelmolnaktivitet. Bänkskivan setup utformades för att efterlikna egenskaperna hos en venös iliofemoral ven ven ven. Figur 1A visar ett modellkärl som har de akustiska, mekaniska och geometriska egenskaperna hos den iliofemorala venen. Proppen placeras inuti modellkärlet för att efterlikna en delvis ocklusiv tromb. Proppen är perfused med plasma och rt-PA dras från en reservoar med en hastighet av 0,65 ml/min. Denna hastighet överensstämmer med långsam flödeshastighet i ett starkt ockluderat fartyg34.

En elliptiskt fokuserad givare med en grundfrekvens på 1,5 MHz med en 9 cm stor axel, 7 cm mindre axel och 6 cm brännvidd(figur 2A)är monterad på positioneringssystemet enligt figur 1B. En bildbehandlingsmatris täckt med ultraljudsgel och ett latexskydd (figurerna 2B, C) monteras koaxiellt med givaren som visas i figur 1A via en öppning i mitten av histotripsykällan. De motoriserade positionörerna användes för att översätta terapigivaren/bildmatrisen längs propplängden i modellkärlet (figur 1). Vid applicering av tillräcklig spänning på histotripsykällan genereras ett bubbelmoln i givarens fokusområde och visualiseras via ultraljudsavbildning, vilket visas i figur 3. Brännpunkten definieras som mitten av bubbelmolnet med hjälp av bildplanet (steg 4.10-4.11).

Figur 4A visar perfusater som samlats in för två olika behandlingsförhållanden. Bägaren märkt som kontroll innehåller perfusat av en blodpropp som utsätts för plasma ensam. Den andra bägaren märkt som behandlad innehåller perfusatet av den lysotripsy behandlade blodproppen. De insamlade perfusaterna används för att bedöma hemoglobinhalten (mått på hemolys) och D-dimer (mått på fibrinolys) genom analyser som anges i protokollet. Skillnaden i färg på perfusaterna betecknar variation i hemoglobinkoncentrationen, som kan kvantifieras via optisk absorbans. Förhållandet mellan absorbansvärde och hemoglobinkoncentration kan bestämmas genom en kalibreringskurva. Lösningar med känt hemoglobininnehåll från 0 (blank mätning) till 180 mg/ml placeras i brunnsplattan och absorbansen bestäms i tre exemplar med hjälp av plåtläsaren (Figur 4B,C). Den övre absorbansgränsen för plåtläsaren kan variera och kanske inte är känd tidigare för att göra lösningarna i brunnsplattan. Som sådan görs hemoglobinkoncentrationer upp till 180 mg/ml i brunnsplattan, figur 4B. Den plåtläsare som används här kan dock avläsa absorbans för koncentrationer upp till endast 23 mg/ml, figur 4C.

Figur 5A visar visualisering av proppen i modellkärlet via B-lägesavbildning före histotripsyexponering enligt steg 7.2.3. Denna bild förvärvas för att bestämma blodproppspositionen för segmentering av den passiva kavitationsbilden. Figur 5B visar den passiva kavitationsbilden som samregistreras med B-lägesbilden som förvärvats före histotripsyexponeringen. Denna siffra bekräftar att akustisk energi i första hand finns i proppen under histotripsy exponering.

Typiska blodproppsstörningar på grund av histotripsy och lytic anges i figur 6. Figur 6A, B visar de obehandlade respektive lysotripsy behandlade blodproppsbilderna. För prover som exponeras för histotripsy är störningar i första hand begränsade till blodproppscentret, i överensstämmelse med de observerade platserna för bubbelaktivitet som spåras med passiv kavitationsavbildning(figur 5B). Men med tillägg av lytisk uppstår massförlust också i regioner närmare blodproppens periferi. Det är hypotesen att denna ytterligare massförlust beror på förbättrad vätskeblandning av lyteln under bubbelaktivitet. Vätskeblandning ökar fördelnings- och penetrationsdjupet hos lytiken i proppen. Eftersom lytiken är ansvarig för fibrinolys40ökar massförlusten. Fibrinolys kan kvantifieras genom att mäta D-dimerhalten i perfusate41.

Figure 1
Figur 1: Experimentell inställning för lysotripsi av mänsklig blodpropp. a)Komponenterna i inställningarna är (1) fokuserad histotripsikälla med elliptisk geometri, (2) latextäckt bildsystem, (3) modellkärl fäst vid flödeskanal, (4) flödeskanal, (5) reservoar, (6) akustiskt absorberande material, (7) värmeelement och (8) vattentank fylld med avgasat och uppvärmt omvänd osmosvatten. Bildplanets azimutdimension är vinkelrät mot höjd- och intervalldimensionerna (in på sidan). B)Histotripsy-källan monterad på det motoriserade positioneringssystemet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Ultraljudskälla och bildkomponenter. Enskilda zoomade bilder av (A) fokuserade histotripsy källa, (B) bildbehandling array, och (C) bildbehandling array med ultraljud gel och latex omslag. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Histotripsy bubbelmoln visualiserat med hjälp av bildmatris. Ett bubbelmoln genereras i fokuszonen på histotripsy-källan och avbildas med hjälp av en bildmatris. Det angivna fokuset, som visas som ett kors, sparas för behandlingsplanering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4:Kvantifiering av hemoglobin som frigörs på grund av blodproppslys. (A) Perfusatprover som samlats in efter kontrollstudie med enbart plasma (ingen histotripsy eller lytisk) och behandlingsarm, histotripsy (t.ex. 35 MPa högsta undertryck, 5 cykelpuls varaktighet, 1,5 MHz fundamental frekvens) och 2,68 μg/mL lytisk exponering. (B) Väl platta som innehåller utspädningar av kända hemoglobinkoncentrationer från 180 mg/ml (översta raden, vänster-mest hörn) till 0 mg/ml (nedre raden, höger-mest hörn). Pilspetsen pekar mot minskande hemoglobinkoncentration. C)Dessa prover används för att skapa en standardkurva för att kvantifiera hemoglobin som produceras på grund av histotripsyexponering via spektrofotometri. Absorbanskurva för hemoglobinkoncentrationer från 0 till 23 mg/ml erhålls på grund av begränsning av plåtläsaren vid analys av högre koncentrationer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Bild 5:Bilder av proppen under behandlingen. (A) B-lägesbild förvärvad före behandlingspulsens början som visar blodproppens position i modellkärlet. B)Post hoc-visualisering avacoustic energiemission beräknad från passiv kavitation imaging visas i varm färgkarta samregistrerad med B-lägesbild av blodproppen förvärvats före applicering av histotripsy puls. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Histologi av den ablerade proppen under olika behandlingsförhållanden. (A) Kontrollera blodproppen utan behandling. (B) Blodpropp behandlad med lysotripsy (t.ex. 35 MPa högsta undertryck, encykelpulsens varaktighet, 1,5 MHz fundamental frekvens). Histotripsy pulsen spred sig från topp till botten i denna bild. Vägen för histotripsykällan längs blodproppens längd (dvs. vinkelrätt mot bildens plan som visas här) definieras i steg 7.2.3. Mikrografernas skala är 2 mm. Observera att graden av blodproppsstörning som uppnås här skulle minska jämfört med insonationssystem med längre pulsvaraktighet24. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det föreslagna protokollet presenterar en modell för att kvantifiera behandlingseffekten av lysotripsy. Även om de viktigaste detaljerna har diskuterats finns det vissa kritiska aspekter att ta hänsyn till för att protokollet ska lyckas. Den enzymatiska aktiviteten hos rt-PA har ett Arrhenius temperaturberoende30. Temperaturen är också en bidragande faktor till ljudets hastighet i vatten och vävnad, och temperaturvariationer kan orsaka mindre förändringar av fokuszonsgeometrin. Vattentemperaturen bör därför regleras noggrant vid 37 °C. Den dos av rt-PA som används i protokollet (2, 68 μg/ml) överensstämmer med den som används kliniskt för andra farmakekekanaliska trombektomistrategier42. I steg 5,8 överförs 30 ml plasma till behållaren medan en 35 ml alikvot noteras i steg 3.1.3. Denna ytterligare plasma står för förlust av plasma på grund av avdunstning under timmar när den värms upp till 37 °C för jämvikt till atmosfärstryck.

Fokallängden, bländarbredden och frekvensen av terapiomvandaren dikterar fokusområdets storlek och djup. Därför bör givaren väljas så att dessa egenskaper överensstämmer med målkärlets diameter och djup (t.ex. lårbensven: 2-4 cm djup och 0,6-1,2 cm i diameter)43. Omfattningen av mekanisk ablation är begränsad till bubbelmolnets omfattning. Således är en förståelse av rollinsoneringsparametrarna för att ändra histotripsy bubbelmolnbeteende avgörande33,44,45. Frekvensen och styrkan hos det akustiska fältet bör också väljas och bör också väljas med hänsyn till dämpningens omfattning på grund av medel- och mellanliggande material (t.ex. modellkärl). För att säkerställa inneslutning av bubbelaktivitet med målkärlet bör ett lämpligt bildfönster väljas för att övervaka fokuszonen. Givarens driftsparametrar bör väljas för att undvika måleffekter samtidigt som mekaniska blodproppsstörningar maximeras. I detta protokoll ansågs massförlust vara ett primärt mått på behandlingseffekt. Ökningar av massförlust har observerats eftersom toppnegativtrycket eller varaktigheten av histotripsypulsen ökas24,46, med en maximal observerad massförlust på 94%. Förekomsten av restpropp för undersökta behandlingsarmar underlättar jämförelsen av terapeutisk effekt. Insoneringssystem för att säkerställa ett totalt avlägsnande av tromben kan dock också utarbetas.

Modellkärlets akustiska impedans (cirka 1,58 MRayl47,48) och de geometriska egenskaperna (0,6-1,2 cm i diameter43) av modellkärlet bör vara representativa för den iliofemorala venösa vaskulaturen (se materialförteckning för detaljer). Polydimethylsiloxane och polyuretan är några av de andra materialen som lämpar sig för att modellera vensystemet baserat på deras akoustomekaniska egenskaper. I steg 7 är det viktigt att ta bort alla luftbubblor från modellkärlet för att undvika att skydda proppen från histotripsyexponering. För ett modellkärl av hydrofobiskt material kan bubbelmoln bildas företrädesvis nära kärlväggen istället för proppens centrum. Därför bör kontinuerlig övervakning av bubbelmolnet göras under behandlingen via ultraljudsavbildning, och givaren bör flyttas vid behov. Pilotstudier bör genomföras för att fastställa hans kortvariga insoneringsparametrar (t.ex. pulsvaraktighet och topptryck) som uppnår den slutliga avsedda blodproppsstörningen.

Bildmatrisen används för att fånga B-lägesbilder och passiva kavitationsbilder för behandlingsvisualisering och för att kvantifiera bubbelaktivitet. B-lägesavbildning möjliggör visualisering av modellkärlet och proppen, och passiv kavitationsavbildning mäter energin i bubbelaktiviteten i samband med blodproppsablation24,49. Bandbredden för avbildningsmatrisen bör anpassas till önskad bubbelmolnaktivitet med ett högt signal-till-brus-förhållande. För att erhålla rent bredbandssignaler i samband med inertial kollaps av bubblor i molnet bör matrisens bandbredd inte sammanfalla med den grundläggande frekvensen förgivaren 50,51. Histotripsy pulser är mycket nonlinear52, och det är troligt att övertoner av den grundläggande frekvensen kommer att finnas i den mottagna signalen. Bildsystemet bör programmeras att utlösas baserat på den kända flygtiden för histotripsypulsen från källan till fokuszonen för att säkerställa insamling av fullständiga passiva kavitationsavbildningsdata under hela insonationen. Dessa signaler bör sedan behandlas efter hoc i enlighet med steg 7.2.3 och 9 i protokollet.

Det bör noteras att mängden hemolys är känslig för hanteringen av proppen. Därför bör försiktighet vidtas för att minimera skador på proppen före behandling. För att säkerställa reproducerbarhet bör proppmodellering (steg 1) och förbehandlingstid (steg 6 och 7.1) vara desamma för alla blodproppar som behandlats med eller utan histotripsiexponering. I efterbehandlingssteget av hemolysbedömningen bör det noteras att plasma har sin egen absorbans. Därför bör spädningsvätskan som används för att bilda standardkurvor (t.ex. optisk absorbans kontra hemoglobin) bildas med samma vätska som används som perfusatet i flödeskanalen (t.ex. i denna studie användes plasma som spädning för att bilda standardkurvor).

Detta protokoll syftar till att tillhandahålla en bänkskiva setup för att mäta effekten av lysotripsy för att behandla mänskliga hela blodproppar. Det finns vissa begränsningar som uppstår på grund av in vitro-karaktären hos uppsättningen. De akuta blodproppar som används för detta protokoll bestod huvudsakligen av röda blodkroppar och fibrin, vilket gör metoden av lysotripsy effektiv för DVT. Senare stadier av tromb kan dock utveckla ett styvt kollagen nätverk53 som kan motstå lysotripsy behandling på grund av den fibrin-specifika karaktären av rt-PA. Vid behandling in vivo är det primära kliniska effektmåttet för behandlingseffekt återställandet av flödet. Massförlust var ett primärt mått för behandlingseffekt i in vitro-protokollet som beskrivs här. Även om flödet inte bedömdes i detta protokoll, kan färg Doppler imaging dessutom införlivas tillsammans med passiv kavitation imaging i steg 7.2.4 för att övervaka flöde restaurering. Inställningen i detta protokoll använder ett fast flödeshastighet som efterliknar flödeshastigheten i ett starkt ockluderat kärl under hela behandlingen i steg 7.2. In vivo kommer kärlflödet att öka när proppen sönderfaller under behandlingen. De extra savspänningarna i samband med ökat flöde kommer att accentuera proppnedbrytningsprofilen54. In vivo off-target effekter kan inte fastställas i denna inställning, såsom blödning på grund av systemisk administrering avlytiska 55,kärlvägg skador eller vasospasm på grund av bubbel molnaktivitet 22. In vitro-karaktären hos denna studie begränsar också förmågan att bedöma långsiktiga resultat, såsom kärlpatens eller retrombos efter behandling. Administrering av lytic i denna studie efterliknade systemiska trombolytika, medan kateter-riktade lytika är det föredragna ingripandet för venös trombos7,14. Vävnadsdämpning kan påverka histotripsifältet och bildkvaliteten för in vivo-studier, medan den akustiska vägen här främst är genom avgasat vatten. Bearbetning av kavitationsemissionsdata med den robusta Capon beamformer (steg 9 i protokollet) är beräkningsmässigt dyr och utfördes off-line för post hoc-analys. Andra strålbildare (t.ex. fördröjning och summa35 eller vinkelspektrum56) kan användas alternativt för att ge feedback i realtid, om än med minskad räckviddsupplösning.

Sammanfattningsvis presenterar detta protokoll en icke-invasiv strategi för att uppnå djup ventrombolys av mänskliga blodproppar. Protokollet upprättar ett bekvämt och lätt att replikera förfarande för modellering av blodproppar, behandling av dem med lysotripsy och samtidig avbildning under behandlingen. Protokollstegen som specificerar histotripsy bubbelmolngenerering, behandlingsplanering och bildvägledning kan vidare användas för att undersöka in vitro-behandlingar av brösttumör, bukspottskörteltumör och godartad prostatahyperplasi, där histotripsi har visat sig vara effektivare jämfört med standardprocedurer57,58. Användningen av rt-PA i detta protokoll kan generaliseras till andra läkemedel eller läkemedelsbärare som används för att behandla sådana tumörer, tillsammans med histotripsy för att öka den lytiska effekten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Författarna vill tacka Dr. Kevin Haworth för att ha hjälpt till med Drabkins analys och Dr. Viktor Bollen för hans stöd i utformningen av protokollet. Författarna är också tacksamma mot Dr. Adam Maxwell för hans vägledning om att designa histotripsy källan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Tags

Bioengineering utgåva 172 histotripsy lysotripsy trombolys hemolys djup ventrombos passiv kavitationsavbildning fokuserat ultraljud akustisk kavitation
Ett in vitro-system för att mäta den trombolytiska effekten av histotripsi och ett lytiskt läkemedel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter