Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Histotripsi ve Litik İlacın Trombolitik Etkinliğini Ölçmek için Bir In vitro Sistem

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62133
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Summary

Histotripsi destekli litik doğum veya lizotripsi derin ven trombozu tedavisi için geliştirilme aşamasındadır. Bu kombinasyon tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için burada bir in vitro prosedür sunulmaktadır. Pıhtı modeli için temel protokoller, görüntü rehberliği ve tedavi etkinliğinin değerlendirilmesi tartışılır.

Abstract

Derin ven trombozu (DVT) küresel bir sağlık sorunudur. Kritik obstrüksiyonlar için damar rekanalizasyonunu elde etmek için birincil yaklaşım katetere yönelik trombolitiktir (CDT). Kostik yan etkileri ve CDT ile ilişkili uzun tedavi süresini azaltmak için adjuvan ve alternatif yaklaşımlar geliştirilmektedir. Bu yaklaşımlardan biri histotripsi, kabarcık bulut çekirdekleri yoluyla dokuyu alevlendirmek için odaklanmış bir ultrason tedavisidir. Klinik öncesi çalışmalar pıhtı bozulması için histtripsi ve trombolitikler arasında güçlü bir sinerji olduğunu göstermiştir. Bu rapor, histotripsi destekli trombolitik tedavinin veya lizotripsinin etkinliğini değerlendirmek için bir tezgah üstü yöntemi özetlemektedir.

Taze insan venöz kanından üretilen pıhtılar, boyutları ve acousto-mekanik özellikleri iliofemoral bir damarı taklit eden bir akış kanalına sokuldu. Kanal plazma ve liktik rekombinant doku tipi plazminojen aktivatör ile perfüzyona uğradı. Pıhtıda, femoral venöz pıhtıların tedavisi için tasarlanmış odaklanmış bir ultrason kaynağı ile kabarcık bulutları oluşturuldu. Pıhtı uzunluğu boyunca kaynak odağı çevirmek için motorlu pozisyonerler kullanıldı. Her insonasyon yerinde, kabarcık bulutundan kaynaklanan akustik emisyonlar pasif olarak kaydedildi ve pasif kavitasyon görüntüleri oluşturmak için ışınlandı. Tedavi etkinliğini ölçmek için metrikler arasında pıhtı kütle kaybı (genel tedavi etkinliği) ve perfüzyonda D-dimer (fibrinoliz) ve hemoglobin (hemoliz) konsantrasyonları yer aldı. Bu in vitro tasarımda, in vivo yan etkileri değerlendirmek için araç eksikliği veya pıhtı lises olarak akış hızındaki dinamik değişiklikler de dahil olmak üzere sınırlamalar vardır. Genel olarak, kurulum DVT'yi tedavi etmek için histotripsi tabanlı stratejilerin etkinliğini değerlendirmek için etkili bir yöntem sağlar.

Introduction

Tromboz, dolaşımı engelleyen sağlıklı bir kan damarında pıhtı oluşumu durumudur1,2. Venöz tromboembolizm yıllık sağlık maliyeti 7-10 milyar dolar, Amerika Birleşik Devletleri'nde 375.000-425.000 vakaile 3. Pulmoner emboli pulmoner arterin tıkanmasıdır ve venöz tromboembolinin en ciddi sonucudur. Pulmoner tıkanıklığın birincil kaynağı, öncelikle iliofemoral venöz segmentlerden4,5,6. Derin ven trombozu (DVT), akciğer tıkanıklıklarının yanı sıra, ağrı, şişlik, bacak ülserasyonları ve uzuv amputasyonları ile sonuçlanan uzun süreli komplikasyonlarla birlikte doğal sekellere sahiptir7,8,9. Kritik tıkanıklıklar için kateter yönlendirilmiş trombolitikler (CDT) damar rekanalizasyonu için ön cephe yaklaşımıdır10. CDT'nin sonucu trombüs yaşı, konumu, büyüklüğü, bileşimi, etiyolojisi ve hasta riski kategorisi11dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlıdır. Ayrıca, CDT vasküler hasar, enfeksiyonlar, kanama komplikasyonları ve uzun tedavi süresi ile ilişkilidir10. Yeni nesil cihazlar mekanik trombektomiyi trombolitiklerle (yani farmakomekanik trombektomi)birleştirmeyi amaçlamaktadır 12,13. Bu cihazların kullanımı, kanama komplikasyonlarının azalmasına yol açan litik dozrayı düşürür ve CDT'ye kıyasla tedavi süresini12,13,14 kısaltır. Bu cihazlar hala hemorajik yan etkiler ve kronik trombrombinin eksik çıkarılması sorunlarını korur15. Bu nedenle, trombüsleri daha düşük kanama komplikasyonlarıyla tamamen çıkarabilecek bir yardımcı stratejiye ihtiyaç vardır.

Potansiyel yaklaşımlardan biri histripsi destekli trombolitik tedavidir, lizotripsi olarak adlandırılır. Histotripsi, dokulardaki kabarcık bulutlarını çekirdeklendirmek için odaklanmış ultrason kullanan invaziv olmayan bir tedavi yöntemidir16. Kabarcık aktivitesi eksojen çekirdekler yoluyla değil, pıhtı17,18dahil olmak üzere dokulara çekirdek içsel etkinleştirmek için yeterli gerilime sahip ultrason darbelerinin uygulanması ile üretilir. Kabarcık bulutunun mekanik salınımı pıhtıya gerilme verir ve yapıyı hücresel döküntülere ayırır19. Histotripsi kabarcık aktivitesi, geri çekilen ve geri çekilmemiş kan pıhtılarının hem in vivo hem de in vitro20 , 21,22'nin etkili bir şekilde bozulmasını sağlar. Önceki çalışmalardahistotripsive liktik rekombinant doku tipi plazminojen aktivatörün (rt-PA) kombinasyonunun sadece litik veya histtripsi ile karşılaştırıldığında tedavi etkinliğini önemli ölçüde artırdığınıgöstermiştir. Histotripsi kabarcık aktivitesi ile ilişkili iki birincil mekanizmanın iyileştirilmiş tedavi etkinliğinden sorumlu olduğu varsayılmıştır: 1) gelişmiş litik doğuma bağlı olarak artan fibrinoliz ve 2) pıhtı içindeki kırmızı kan hücrelerinin hemolizi. Pıhtı kütlesinin büyük kısmı kırmızı kan hücrelerinden oluşur24ve bu nedenle eritrosit bozulmasını izlemek, numunenin ablasyonu için iyi bir taşıyıcıdır. Diğer oluşan pıhtı elementleri de histotripsi kabarcık aktivitesi altında parçalanır, ancak bu protokolde dikkate alınmaz.

Burada, DVT in vitro'yu lizotripsi ile tedavi etmek için bir benchtop yaklaşımı özetlenmiştir. Protokolde histotripsi kaynağının kritik çalışma parametreleri, tedavi etkinliğinin değerlendirilmesi ve görüntü rehberliği açıklanmaktadır. Protokol, iliofemoral venöz bir segmenti taklit etmek için bir akış kanalı tasarlamayı ve insan bütün kan pıhtılarını üretmeyi içerir. Deneysel prosedür, akış kanalına yerleştirilen pıhtı boyunca histtripsi maruziyetini elde etmek için histtripsi kaynağının ve görüntüleme dizisinin konumlandırılmasını özetlemektedir. Pıhtı bozulmasına ve hedef dışı kabarcık aktivitesini en aza indirmek için ilgili insonasyon parametreleri tanımlanmıştır. Kabarcık aktivitesinin yönlendirilme ve değerlendirilmesi için ultrason görüntülemenin kullanımı gösterilmiştir24. Pıhtı kütle kaybı, D-dimer (fibrinoliz) ve hemoglobin (hemoliz) gibi tedavi etkinliğini ölçmek için metrikler23 , 24,25,26,27olarak özetlenmiştir. Genel olarak, çalışma DVT tedavisinde lizotripsi etkinliğini yürütmek ve değerlendirmek için etkili bir araç sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada sunulan sonuçlar için, yerel iç inceleme kurulundan (IRB #19-1300) onay alındıktan sonra pıhtı oluşturmak için venöz insan kanı çekildi ve gönüllü bağışçılar tarafından sağlanan yazılı bilgilendirilmiş onay24. Bu bölümde, lizotripsi etkinliğini değerlendirmek için bir tasarım protokolü özetler. Protokol, Bollen ve ark.24'ünönceki bir çalışmasına dayanmaktadır.

1. Pıhtı modellemesi

NOT: Pıhtı stabilitesini sağlamak ve geri çekilmeyi en üst düzeye çıkarmak için pıhtıları 2 hafta içinde ancak deney gününden 3 günden daha önce hazırlayın28. Pıhtıyı yerel kurumsal inceleme kurulundan onay aldıktan sonra hazırlayın.

  1. Kanı depolamak için borosilikat Pasteur pipeti hazırlayın (pipet özellikleri için Malzeme Tablosu'na bakın). Trombosit aktivasyonunu ve pıhtı geri çekilmesini destekleyen malzemenin hidrofilik yapısı nedeniyle borosilikat tüpler kullanılır29. Pipet ucunu bir Bunsen brülörü üzerinde ısıtma yoluyla kapatın.
  2. Taze insan venöz kanı çizin. İstenen pıhtı başına 2 mL artışlarla çekilen toplam kanı aliquot. Her 2 mL aliquot'ı bir Pasteur pipete aktarın.
    NOT: Pipetlere aktarmadan önce kanın pıhtılaşmaması için 1.2 adımını yaklaşık 3 dakikalık kan çekimi içinde uygulayın. Ayrıca, gönüllü donörün pıhtılaşma kaskadını değiştirebilecek herhangi bir ilaç kullanmamasını sağlayın (örneğin kan sulayıcılar veya trombosit inhibitörleri).
  3. Pipetlerin içindeki kan aliquotlarını (gerekli pıhtı sayısına eşit) 37 °C'de 3 saat boyunca bir su banyosunda kuluçkaya yatırın.
  4. Pıhtıların geri çekilmesine izin vermek için pipetleri 4 °C'de en az 3 gün saklayın28. Pıhtılar geri çekilirken, serumun pipet içindeki pıhtının üstünde biriktiği gözlenecektir. Pıhtıların RT-PA yanıtı geri çekilmeden sonra 2 hafta boyunca sabit kalır28.

2. Su deposu hazırlama

  1. Su haznesini ters ozmos suyu ile doldurun. Tedavinin veya görüntüleme ultrason darbelerinin yansımasını azaltmak için tankın alt yüzeyini akustik bir emici malzeme ile hizalayın. Kabarcık çekirdeğini en aza indirmek için suyu gazdan arındırmak ve filtrelemek için bir su taşıma sistemi kullanın.
    NOT: Suyu filtrelemenin bir yolu satır içi filtre kullanmaktır. Temsili sonuçların oluşturulmasında kullanılan torbanın özellikleri Malzeme Tablosunda verilmiştir.
  2. Tankın alt yüzeyine iki ısıtma elemanı yerleştirin. Maksimum liktik enzmatik aktiviteyi elde etmek için suyu 37,3 °C'ye ısıtın30.
  3. Şekil 1A'da gösterildiği gibi bir akış kanalı kur. Akış kanalı, bir iliofemoral damarın malzeme ve geometrik özelliklere sahip bir model kap, plazma rezervuarı ve rezervuarın distal en ucunda bir şırıngdan oluşur (Malzeme Masası). Şırınna, deney sırasında kanaldan bir akışı düzenlemek için bir pompaya bağlanır.
  4. Gaz giderme/filtreleme/ısıtma aşamasında (adım 2.1 ve 2.2) kanalı fizyolojik sıcaklığa getirmek için akış kanalını su deposuna manuel olarak batırın.

3. Plazma ve rt-PA karışımının hazırlanması

  1. Deney gününden önce
    NOT: -80 °C'de depolandığında, plazma en az 2,5 yıl31 ve rt-PA en az 7 yıl32stabildir. Bu nedenle, iki bileşenin kararlılığını sağlamak için bu süreler içinde her zaman 3.1 adımını uygulayın.
    1. Bir üreticiden elde edilen rt-PA'yı toz halinde steril suda 1 mg/mL'ye seyreltin.
    2. Aliquot 100 μL seyreltilmiş rt-PA 0,5 mL santrifüj tüplere aktarın ve -80 °C'de saklayın.
    3. 50 mL santrifüj tüplerde aliquot 35 mL insan taze dondurulmuş tip O plazma. Tüpleri -80 °C'de saklayın.
  2. Deney gününde
    1. Dondurucudan plazma aliquots alın. O gün test edilecek pıhtı sayısı kadar aliquot alın. Donmuş aliquotları çözülmesi için 37 °C'de bir su banyosuna daldırın (~10 dk).
    2. Plazma çözüldükten sonra, ultra saf su ile üç ayda bir durulanan bir kabın içine dökün. Kirlenmeyi önlemek için kabın ağzını alüminyum folyo ile hafifçe kapatın ve beheri su banyosuna yerleştirin. Folyonun, havanın plazmaya temas etmesine izin sağlayacak kadar gevşek olmasına izin verin.
    3. Plazmanın 37 °C'de atmosferik basınca en az 2 saat boyunca dengelensin.
    4. Donmuş rt-PA şişelerini çıkar ve her deney çalışması için bir şişe ile ihtiyaç duyulana kadar buza yerleştirin.
    5. Agarose'u ultra saf suda eriterek 50 mL'lik bir şişede düşük jelleşme agarose (%2) yapın. Analiz edilecek her numune için yaklaşık 2 mL mevcut olacak şekilde toplam agarose çözeltisi miktarını seçin. Çözeltiyi bir mikrodalga fırında kabarcıklı olana kadar şişe halinde ısıtın. Matarayı su geçirmez bir vida kapağı ile sabitleyin. Şişeyi plazmanın yanında su banyosuna batırın.
      NOT: Bu adım, histotripsi inzozyonu sonrasında histoloji analizi için maruz kalan pıhtı segmentlerini güvence altına almak için agarose kullanılabilir olmasını sağlar.

4. Histotripsi kaynağı ve görüntüleme dizisinin kurulması

  1. Motorlu konumlayıcıların, üretici tarafından sağlanan yol tarifleri ve komutlar kullanılarak bir programlama platformunun çalışma zamanı ortamından kontrol edilebildiğinden emin olun. Sistemin motorlarının çalışma zamanı ortamıyla bilgisayarın uygun bağlantı noktasına bağlı olup olmadığını kontrol edin.
  2. Histotripsi kaynağını Şekil 1B'degösterildiği gibi motorlu konumlandırma sistemine monte edin.
  3. Histotripsi kaynağını, üretici tarafından belirtilen uygun konektörler (örneğin, BNC kabloları) aracılığıyla sürüş elektroniği (örneğin, güç amplifikatörü ve fonksiyon jeneratörü) bağlayın.
    NOT: Histotripsi kaynağının sürüş elektroniği, 4.1 adımında kullanılan çalışma zamanı ortamı üzerinden kontrol edilebildiğinden emin olun.
  4. Görüntüleme dizisini bir prob kapağı ile örtün ve şekil 2'degösterildiği gibi diziyi histotripsi kaynağının diyaframına koaksikal olarak yapıştırın. Histotripsi kaynağının yönüne göre görüntüleme düzleminin yönünü anladığından emin olun.
  5. Görüntüleme dizisini ultrason tarama sistemine bağlayın. Bu sistemin görüntüleme dizisinin çalışmasını ve tetiklemesini denetleyebildiğinden ve tarayıcının üreticisi tarafından sağlanan komutlara göre görüntüleme verilerini toplayabildiğinden emin olun.
  6. Şekil 1A'dagösterildiği gibi gazdan arındırırken histotripsi kaynağını/görüntüleme dizisini tanka batırın. Histotripsi kaynağının veya görüntüleme dizisinin yüzeyinden bir şırıng kullanarak hava kabarcıklarını yavaşça çıkarın.
    NOT: Operasyondan önce histotripsi kaynağını ve görüntüleme dizisini tamamen suya batırın. Histotripsi kaynağının yüzeyine dokunmaktan kaçının.
  7. Görüntüleme dizisini ve tarayıcının yerleşik komutlarını kullanarak saniyede 20 kare hızında B modu görüntüler elde edin. Bu gerçek zamanlı görüntülerde histotripsi kaynağının odağının görselleştirilmesini sağlamak için görüntüleme penceresini ayarlayın.
    NOT: Terapötik kaynağın odak bölgesinin boyutlarının bilindiği varsayılıyor.
  8. Histotripsi kaynağının çalışma parametrelerini ayarlayın, temel frekans (örneğin, 1,5 MHz), darbe tekrarlama frekansı (örneğin, 20-100 Hz), darbe süresi (örneğin, nabız başına 1-20 döngü) ve konum başına toplam darbe sayısı (örneğin, 100-2.000)18,23,24,33. Yeterli pıhtı lizisi elde edilemezse veya kabarcık aktivitesi model kabın lümeninin ötesine uzanıyorsa bu parametreleri değiştirin. Bu parametreleri ayarlamak için, kaynağın üreticisi tarafından sağlanan protokolü kullanın veya kaynakla iletişim kurabilen bir programlama platformu kullanın (Adım 4.3).
  9. 4.8. adımda kullanılan üreticinin protokolünü veya programlama platformunu kullanarak, histotripsi kaynağını ayarlanan parametrelerde, çevrede herhangi bir engel olmadan, yalnızca gazsız suda çalıştırın. Bir kabarcık bulut oluşana kadar histotripsi kaynağına uygulanan voltajı artırın.
  10. 4.7 adımının gerçek zamanlı görüntülemesini kullanarak, kabarcık bulut yaklaşık olarak görüntü penceresinin ortasına yerlenene kadar görüntüleme dizisinin konfokal dönüştürücü açıklığının içindeki konumunu ayarlayın. Kabarcık bulut, görüntüleme düzleminde hiperekoik piksellerin bölgesidir (Şekil 3). Görüntüleme dizisini dönüştürücü açıklığında sıkıca tutmak için vidaları sıkın.
    NOT: Dizi düzgün hizalanmışsa, kabarcık bulutunun azimuthal konumu görüntüleme düzleminde yaklaşık 0 mm olmalıdır. Görüntüleme dizisi terapi kaynağının iç yüzeyinden biraz yansıtılabilir ve bu nedenle kabarcık bulutunun aralık konumu kaynağın odak uzunluğundan farklı olabilir.
  11. Görüntüleme düzleminde kabarcık bulutunun konumunu tanımlayın. Histotripsi kaynağının odağını kabarcık bulutunun merkezi olarak atayın (Şekil 3).
  12. Algılanan odak konumunu (adım 4.11) görüntüleme penceresine kaydedin (Şekil 3). Odak konumunu işaretlemenin olası bir yolu, görüntüleme platformunda varsa, görüntüleme penceresindeki konumu not etmek için bir imleç yerleştirmektir.
  13. İnzotasyonu durdurun ve histotripsi kaynağına uygulanan voltajı 0 V olarak ayarlayın.

5. Pıhtı hazırlığı

  1. Kapalı ucu pense ile keserek pipetten pıhtıyı çıkarın. Pıhtının serumla birlikte bir Petri kabına kaymasına izin verin. Pıhtı yerinden çıkmazsa, pıhtıyı çıkarmak için salin yıkama yoluyla pipetin diğer ucundan hafifçe basınç uygulayın.
  2. Pıhtıyı neşter kullanarak 1 cm uzunluğa kesin, merkezden tek tip bir parça hedefleyin (yani pipet üst veya alt kısmında oluşan pıhtı bölümlerinden uzağa).
  3. Fazla sıvıyı çıkarmak için pıhtının kesilmiş bölümünü hafifçe lekelamak için bir temizleme mendili kullanın.
  4. Cımbız kullanarak pıhtı bölümünü hafifçe tartım ölçeğine yerleştirin ve ağırlığı kaydedin.
  5. Akış kanalını su deposundan manuel olarak çıkarın ve model kabı akış kanalından çıkarın.
  6. Pıhtıyı cımbız kullanarak model kabına yerleştirin ve model kabı tekrar akış kanalına takın.
    NOT: Pıhtının akış nedeniyle akıntıya karşı hareket etmesini önlemek için model kabın içine bir naylon çubuk yerlenebilir.
  7. Akış kanalını, hazneye göre sahnenin proksimal ucu distal tarafa göre düşük olacak şekilde tanka ovan. Aşamanın bu şekilde anglingi, 6.1. adımda plazma akış kanalından çekildiğinde kabarcıkların model kapta sıkışmasını önler.
  8. Bir pipet kullanarak rezervuara 30 mL plazma ekleyin ve sıcaklığı en az 36 ° C'ye ulaşana kadar izleyin.
  9. Rt-PA'yı (30 mL plazmada 80,4 μg, plazma rezervuarına 2,68 μg/mL) dağıtmak için bir pipet kullanın. Rezervuar içinde düzgün bir rt-PA dağılımı sağlamak için plazmayı pipetle karıştırın.

6. Akış kanalının astarı

  1. Plazma, model kabı doldurana kadar şırınna pompası aracılığıyla rezervuardan akış kanalına plazma çekin.
    NOT: Pıhtı naylon çubukla yıkanmazsa, plazmayı pıhtıyı aşağı doğru zorlamaya veya şırınnayı manuel olarak çekmeye çalışmak için 60 mL / dak'ta kısa pompa çekmeleri kullanın. Bu işlemde çekilen plazma miktarını sınırlayın veya akış kanalında 30 mL çözelti sağlamak için ek plazma/rt-PA kullanarak rezervuarı yeniden doldurun.
  2. Motorlu konumlayıcıları kullanarak, görüntüleme komut dosyasını kullanarak görüntüleme dizisini pıhtının uzunluğuna paralel hizalayın (adım 4.7). Paralel hizalama, kullanıcının pıhtının uygun şekilde yerleştirilmesini ve model kabın içindeki kabarcıkların yokluğunu görsel olarak sağlamasını sağlar.
  3. Modelleme penceresini kullanarak model kabını manuel ve görsel olarak düzleştirmeyin ve hava kabarcıklarının bulunmadığından emin olun (adım 4.7).

7. Deney prosedürü

  1. Ön tedavi
    NOT: Bu adım, pıhtı uzunluğu boyunca tek tip histtripsi maruziyeti için histotripsi kaynağı/görüntüleme dizisi için bir yol planlamaktır.
    1. Görüntüleme düzlemini pıhtının kesitine paralel olacak şekilde motorlu konumlayıcıları kullanarak görüntüleme dizisini hizalayın (yani, adım 6.2'de açıklanan yönlendirmeye dik).
    2. Görüntüleme penceresi (adım 4.7) aracılığıyla rehberlik altında, motorlu konumlayıcıları kullanarak histtripsi kaynağını pıhtının proksimal ucuna doğru hareket ettirin. Bu noktada, histotripsi kaynak konumunu, adım 4.12'deki işaretli odak noktasının pıhtının merkeziyle hizalanacak şekilde ayarlayın.
    3. Pıhtı uzunluğu boyunca insonasyon yolunu belirleyin. Bu yolu tanımlamak için, pıhtının uzunluğu boyunca üç yol noktası (yani histotripsi kabarcık aktivitesinin pıhtı içinde bulunduğu motorların konumları) 5 mm'lik artışlarla ayarlayın. Yol noktalarını, histotripsi kaynağının yol boyunca genel hareketinin sistemdeki akışla antegrad olacak şekilde hizalayın (yani, ilk yol noktası pıhtının rezervuara göre en proksimal ucundadır ve üçüncü ara nokta rezervuara göre distal konumdadır).
    4. Her bir ara noktayı tamamlamadan önce, histotripsi kaynağından 4.8. Pıhtı içinde kabarcık aktivitesi içermek için gerekirse motorlu pozisyonerleri kullanarak histotripsi kaynağının konumunu ayarlayın.
    5. Her ara noktada, 4.1 adımına benzer şekilde üretici tarafından sağlanan komutları kullanarak motor konumlarını kaydedin.
  2. Muamele
    NOT: Bu adım, pıhtıyı tedavi öncesi adımda tanımlanan yola göre uzunluğu boyunca tedavi etmek için prosedürü tanımlar.
    1. Şırıng pompasını 0,65 mL/dk'da çalıştırın ve plazmanın menisküslerinin hareket etmesini bekleyin. Bu akış hızı, iliofemoral vaskülatın neredeyse toplam tıkanmasını taklit eder24,34.
    2. 7.1.3 adımında oluşturulan yolu, sabit adım boyutuna (örneğin, 0,5 mm) sahip yerleşik ara noktalar arasındaki ara adımlarla enterpolasyona geçin. Adım boyutu, pıhtı uzunluğu (görüntüleme dizisinin yükseklik yönü) boyunca ölçülen odak bölgesinin genişliğinin yarısından daha küçük olacak şekilde seçilir. Histotripsi kaynağını, adım 4.8'de tanımlanan insonasyon parametreleriyle her yol konumunda motorlu konumlayıcılar kullanarak hareket ettirin.
    3. Görüntüleme penceresini kullanarak her yol konumunda histotripsi darbesinin uygulanması sırasında monitör/görüntü kabarcık aktivitesi (adım 4.7). Azimut ve aralıkta 15 mm'yi kaplayan görüntü boyutlarıyla görüntüyü histotripsi odağında ortala. Her yerde histotripsi darbesinin uygulanmasından önce, bir programlama platformunda bir komut dosyası oluşturarak pıhtı ve model kabının görselleştirilmesini sağlamak için B modu bir görüntü elde edin. Komut dosyasının üreticinin komutlarını kullanarak tarayıcıyla iletişim kurduğundan emin olun.
    4. Histotripsi darbesinin uygulanması sırasında, geçici35sonrası pasif kavitasyon görüntüleri oluşturmak için 7.2.3 adımında senaryoda akustik emisyonların edinimini uygulayın. Her 10 tedavi darbeden sonra bir pasif kavitasyon görüntüsü alın. Görüntüleme derinliğinin sonuna kadar 8 artımlı derinlikte 50 sabit zaman kazanç telafisi uygulayın. Pıhtıdan gelen sinyalin tamamının pencereleme nedeniyle minimum enerji kaybı ile yakalanması için uygun bir alım penceresi boyutu seçin35.
    5. Hedef dışı kabarcık bulutları varsa, dönüştürücü konumunu motorlu konumlayıcılarla yerinde ayarlayın.
      NOT: Görüntüleme dizisinin kaçırılan tetikleyicilerini izleyin. Sonraki tetiklemeden önce verilerin depolanmasının tamamlandığından emin olmak için alınan görüntüleme veri kümelerinin sayısını ayarlayın.

8. Deney sonrası prosedür

  1. Perfüzyonu yerçekimi yoluyla boşaltmak için model kabı su deposundan manuel olarak kaldırın. Pıhtının boşaltma sırasında model damardan aşağı ve dışarı hareket etmesini önlemek için akış kanalını düz tuttuğunuzdan emin olun.
  2. Plazma çözeltisini çok düşük bir akış hızında şırınna pompasından geçirerek küçük bir beherde(Şekil 4A)daha fazla analiz için tüm perfüzatı toplayın.
  3. Model kabın bağlantısını kesin ve pıhtıyı çıkarın. Gerekirse, pıhtıyı hafifçe yerinden çıkarmak için model kabına az miktarda salin enjekte edin.
  4. Pıhtıyı adım 1.2.3'e benzer şekilde silin. Pıhtı kütle kaybını değerlendirmek için pıhtıyı tartım ölçeğinde tartın.
  5. D-dimer içeriğini analiz etmek için, bir mikrosantrifüj tüpüne 100 mg aminocaproik asit ekleyin ve ardından 1 mL perfüzyon ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Örnek36içindeki D-dimer'ı ölçmek için lateks immün-türbidimetrik bir test gerçekleştirin.
  6. Hemolizi değerlendirmek için santrifüj tüplerine 1 mL perfüzyon ekleyin ve 10 dakika boyunca 610 x g'da (3.500 rpm) döndürün. Şekil 4B'degösterildiği gibi 200 μL'yi kuyu plakalarına aktarın. Absorbansı 540 nm, Şekil 4C'de (Drabkins tahlil37)okumak için bir plaka okuyucu kullanın.
  7. Histoloji değerlendirmesi
    1. Pıhtının merkezinden bir neşterle yaklaşık 2-3 mm uzunluğunda bir bölüm kesin.
    2. Bölümü bir kasete ekleyin. Histotripsi darbe yayılımının yönüne göre bölümün yönünü koruyun.
    3. Pıhtıyı yerinde sabitlemek için kasete 3.2.5 adımında hazırlanan 2 mL düşük jelleşmeli agarose çözeltisi ekleyin.
    4. Numuneyi 24 saat boyunca %10 formalin olarak sabitle. Numuneyi 24 saat sonra% 70 alkole yerleştirin ve standart hemotoksilin-eosin boyama38gerçekleştirin.

9. Pasif kavitasyon görüntü analizi

  1. Histotripsi uyarılması sırasında görüntüleme dizisinden elde edilen sinyalleri (adım 7.2.4), her tedavi yerinde kabarcık bulutu tarafından oluşturulan akustik emisyonların bir görüntüsünü oluşturmak için sağlam Capon beamformer39'u temel alan bir algoritma kullanarak işleyin.
    NOT: Nicel görüntüler oluşturmak için Haworth ve ark.35'te açıklanan adımları izleyin. Aksi takdirde, görüntüdeki her piksel değeri, ilgili her konumdaki göreli kabarcık bulut akustik enerjisini (V2birimleri) temsil etmelidir.
  2. Pıhtıyı temsil eden pikseller ile model kabını ayırt etmek için 7.2.3 adımlarında talep edilen B modu görüntüsünü segmentlere ayırın.
  3. Şekil 5B'degösterildiği gibi pasif kavitasyon görüntüsünü B modu görüntüsüyle birlikte kaydedin. Maruz kalma süresi boyunca pıhtı içindeki akustik enerjiyi özetler35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmada özetlenen protokol, dvt in vitro kurulumunda venöz pıhtı modellemesi, pıhtı bozulması için lizotripsi ve ultrason görüntülemenin ayrıntılarını vurgulamaktadır. Benimsenen prosedür, rt-PA ve histotripsi kabarcık bulut aktivitesinin kombine etkileri nedeniyle pıhtı bozulmasını değerlendirmek için gerekli adımları göstermektedir. Tezgah üstü kurulumu, venöz iliofemoral damarın özelliklerini taklit etmek için tasarlanmıştır. Şekil 1A, iliofemoral damarın akustik, mekanik ve geometrik özelliklerine sahip bir model damar göstermektedir. Pıhtı, kısmen tıkayıcı bir trombüs taklit etmek için model kabın içine yerleştirilir. Pıhtı, 0,65 mL/ dk hızında bir rezervuardan çekilen plazma ve rt-PA ile perfüzyona edilir. Bu hız, yüksek tıkalı bir gemi34'tekiyavaş akış hızı ile tutarlıdır.

Şekil 1B'de belirtildiği gibi konumlandırma sistemine 9 cm ana eksen, 7 cm minör eksen ve 6 cm odak uzaklığı ( Şekil 2A ) ile1,5MHz temel frekansta eliptik olarak odaklanmış bir dönüştürücü monte edilir. Ultrason jeli ve lateks kapakla kaplı bir görüntüleme dizisi (Şekil 2B, C) histotripsi kaynağının merkezindeki bir açıklık aracılığıyla Şekil 1A'da gösterildiği gibi dönüştürücü ile koaksikal olarak monte edilir. Motorlu pozisyonerler, model damar içindeki pıhtı uzunluğu boyunca tedavi dönüştürücü/görüntüleme dizisini çevirmek için kullanılmıştır(Şekil 1). Histotripsi kaynağına yeterli voltaj uygulanması üzerine, dönüştürücünün odak bölgesinde bir kabarcık bulutu üretilir ve Şekil 3'tegösterildiği gibi ultrason görüntüleme ile görselleştirilir. Odak konumu, görüntüleme düzlemi kullanılarak kabarcık bulutunun merkezi olarak tanımlanır (adım 4.10-4.11).

Şekil 4A iki farklı tedavi durumu için toplanan perfüzyonları göstermektedir. Kontrol olarak etiketlenen beher, sadece plazmaya maruz kalan bir pıhtının perfüzyonını içerir. Tedavi olarak etiketlenen ikinci beher, lizotripsi ile tedavi edilen pıhtının perfüzyonını içerir. Toplanan perfusatlar, protokolde belirtildiği gibi tahliller aracılığıyla hemoglobin (hemoliz metriği) ve D-dimer (fibrinoliz ölçümü) içeriğini değerlendirmek için kullanılır. Perfusates renk farkı, optik absorbans ile ölçülebilen hemoglobin konsantrasyonunda değişkenliğe neden olur. Absorbans değeri ile hemoglobin konsantrasyonu arasındaki ilişki kalibrasyon eğrisi ile belirlenebilir. 0 (boş ölçüm) ile 180 mg/mL arasında bilinen hemoglobin içeriğine sahip çözeltiler kuyu plakasına yerleştirilir ve plaka okuyucu kullanılarak üç taraflı olarak emicilik belirlenir (Şekil 4B,C). Plaka okuyucunun üst absorbans sınırı değişebilir ve çözümlerin kuyu plakasında yapılmasına a priori olarak bilinmeyebilir. Bu nedenle, kuyu plakasında 180 mg / mL'ye kadar hemoglobin konsantrasyonları yapılır, Şekil 4B. Bununla birlikte, burada kullanılan plaka okuyucu sadece 23 mg / mL'ye kadar konsantrasyonlar için emiciliği okuyabilir, Şekil 4C.

Şekil 5A, 7.2.3 adımında belirtildiği gibi histtripsi maruziyeti öncesinde B-mod görüntüleme yoluyla model damar içindeki pıhtının görselleştirilmesini göstermektedir. Bu görüntü, pasif kavitasyon görüntüsünün segmentasyonu için pıhtı konumunu belirlemek için elde edilir. Şekil 5B, histotripsi maruziyeti öncesinde elde edilen B modu görüntüsüyle birlikte kaydedilen pasif kavitasyon görüntüsünü göstermektedir. Bu şekil, histtripsi maruziyeti sırasında akustik enerjinin öncelikle pıhtının içinde bulunduğunu doğrulamaz.

Histtripsi ve litik nedeniyle tipik pıhtı bozulması Şekil 6'da belirtilmiştir. Şekil 6A,B sırasıyla tedavi edilmemiş ve lizotripsi tedavi edilen pıhtı görüntülerini göstermektedir. Histoptripsi maruz kalan örnekler için, bozulma öncelikle pasif kavitasyon görüntüleme ile izlenen kabarcık aktivitesinin gözlemlenen konumları ile tutarlı olarak pıhtı merkezi ile sınırlıdır (Şekil 5B). Bununla birlikte, litik ilavesiyle, pıhtının çevresine daha yakın bölgelerde de kitle kaybı meydana gelir. Bu ek kütle kaybının, kabarcık aktivitesi altında litiğin gelişmiş sıvı karıştırmasına bağlı olduğu varsayılır. Sıvı karıştırma, litiğin pıhtıya dağılımını ve penetrasyon derinliğini arttırır. Litik fibrinolizden sorumlu olduğundan40, kitle kaybı artar. Fibrinoliz, perfüzyon41'dekiD-dimer içeriği ölçülerek ölçülebilir.

Figure 1
Şekil 1: İnsan kanı pıhtısının lizotripsi için deneysel kurulum. (A)Kurulumun bileşenleri (1) eliptik geometriye sahip odaklanmış histotripsi kaynağı, (2) lateks kaplı görüntüleme dizisi, (3) akış kanalına bağlı model kap, (4) akış kanalı, (5) rezervuar, (6) akustik emici malzeme, (7) ısıtma elemanı ve (8) gazsız ve ısıtılmış ters ozmos suyu ile dolu su deposudur. Görüntüleme düzleminin azimut boyutu, yükseklik ve aralık boyutlarına (sayfaya) diktir. (B) Motorlu konumlandırma sistemine monte edilen histotripsi kaynağı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Ultrason kaynağı ve görüntüleme bileşenleri. (A)odaklı histotripsi kaynağı, (B) görüntüleme dizisi ve (C) görüntüleme dizisinin ultrason jeli ve lateks kapaklı bireysel yakınlaştırılmış görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Histotripsi kabarcık bulut görüntüleme dizisi kullanılarak görselleştirilmiştir. Histotripsi kaynağının odak bölgesinde bir kabarcık bulutu oluşturulur ve bir görüntüleme dizisi kullanılarak görüntülenmiştir. Haç olarak gösterilen belirlenen odak, tedavi planlaması için kaydedilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Pıhtı lizisi nedeniyle salınan hemoglobin nicelemesi. (A) Sadece plazma ile yapılan kontrol çalışmasının ardından toplanan perfüzat örnekleri (histotripsi veya litik yoktur) ve tedavi kolu, histtripsi (örneğin, 35 MPa tepe negatif basınç, 5 çevrim darbe süresi, 1,5 MHz temel frekans) ve 2,68 μg/mL lytik maruziyet. (B) 180 mg/ mL (üst sıra, en sol-en köşe) ila 0 mg / mL (alt sıra, en sağ köşe) arasında bilinen hemoglobin konsantrasyonlarının seyreltmelerini içeren kuyu plakası. Ok ucu hemoglobin konsantrasyonu azalmaya işaret eder. (C) Bu örnekler spektrofotometri yoluyla histotripsi maruziyeti nedeniyle üretilen hemoglobiyi ölçmek için standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. 0 ile 23 mg/mL arasında değişen hemoglobin konsantrasyonları için absorbans eğrisi, plaka okuyucunun daha yüksek konsantrasyonları analiz etmedeki sınırlaması nedeniyle elde edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tedavi sırasında pıhtının görüntüleri. (A) Tedavi darbesi başlamadan önce elde edilen B-mod görüntüsü, model damar içindeki pıhtı pozisyonunu gösterir. (B) Histotripsi darbesinin uygulanmasından önce elde edilen pıhtının B modu görüntüsü ile birlikte kaydedilen sıcak renk haritasında gösterilen pasif kavitasyon görüntülemesinden hesaplanan geçici enerji emisyonunun geçici görselleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Ablated pıhtının farklı tedavi koşullarında histolojisi. (A) Tedavi olmadan pıhtıyı kontrol edin. (B) Lizotripsi ile tedavi edilen pıhtı (örneğin, 35 MPa tepe negatif basınç, tek çevrim darbe süresi, 1,5 MHz temel frekans). Histotripsi darbesi bu görüntüde yukarıdan aşağıya doğru yayıldı. Pıhtının uzunluğu boyunca histotripsi kaynağının yolu (yani burada gösterilen görüntünün düzlemine dik) 7.2.3 adımında tanımlanmıştır. Mikrografların ölçeği 2 mm'dir. Burada elde edilen pıhtı bozulması derecesinin, daha uzun nabız süresine sahip insonasyon şemalarına kıyasla azaltılacağını unutmayın24. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Önerilen protokol, lizotripsinin tedavi etkinliğini ölçmek için bir model sunar. Önemli ayrıntılar tartışılmış olsa da, bu protokolün başarısı için dikkate alınması gereken bazı kritik hususlar vardır. rt-PA'nın enzymatic aktivitesi bir Arrhenius sıcaklık bağımlılığına sahiptir30. Sıcaklık aynı zamanda su ve dokudaki ses hızına katkıda bulunan bir faktördür ve sıcaklıktaki değişimler odak bölgesi geometrisinde küçük değişikliklere neden olabilir. Bu nedenle, su sıcaklığı 37 ° C'de dikkatlice düzenlenmelidir. Protokolde kullanılan rt-PA dozu (2.68 μg/mL), diğer farmakomekanik trombektomi stratejileri için klinik olarak kullanılanla tutarlıdır42. 5.8. adımda, rezervuara 30 mL plazma aktarilirken, 3.1.3 adımında 35 mL'lik bir aliquot not edilir. Bu ek plazma, atmosferik basınca denge sağlamak için 37 °C'ye ısındığında saatler boyunca buharlaşma nedeniyle plazmada kayıp olduğunu açıklamaz.

Terapi dönüştürücüslerinin odak uzaklığı, diyafram genişliği ve sıklığı odak bölgesinin boyutunu ve derinliğini belirler. Bu nedenle, dönüştürücü, bu özelliklerin hedef damarın çapı ve derinliği ile uyumlu olacak şekilde seçilmelidir (örneğin femoral damar: 2-4 cm derinlikte ve 0.6-1.2 cm çapında)43. Mekanik ablasyon kapsamı kabarcık bulutunun kapsamı ile sınırlıdır. Bu nedenle, inzotasyon parametrelerinin histotripsi kabarcık bulut davranışını değiştirmede oynadığı rolün anlaşılması kritiktir33,44,45. Akustik alanın frekansı ve gücü de orta ve aracı malzemelere (örneğin model kap) bağlı zayıflamanın büyüklüğüne dikkat edilerek seçilmelidir. Kabarcık aktivitesinin hedef damarla sınırlandırıldığından emin olmak için odak bölgesini izlemek için uygun bir görüntüleme penceresi seçilmelidir. Transdüserin çalışma parametreleri, mekanik pıhtı bozulmasını en üst düzeye çıkarırken hedef etkilerden kaçınmak için seçilmelidir. Bu protokolde kitle kaybı tedavi etkinliğinin birincil ölçüsü olarak kabul edildi. En yüksek negatif basınç veya histotripsi darbesinin süresi arttıkça kitle kaybında artışlargözlenmiştir 24,46, maksimum gözlenen kütle kaybı% 94. Araştırılan tedavi kolları için artık pıhtı varlığı terapötik etkinliğin karşılaştırılmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, trombüslerin tamamen kaldırılmasını sağlamak için insonasyon şemaları da tasarlanabilir.

Model geminin akustik empedansı (yaklaşık1,58MRayl 47,48)ve geometrik özellikleri(0,6-1,2cm çapında 43) iliofemoral venöz vaskülatın temsilcisi olmalıdır (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakınız). Polidimetilsiloksisan ve poliüretan, venöz sistemi acousto-mekanik özelliklerine göre modellemeye uygun diğer malzemelerden bazılarıdır. 7. adımda, pıhtının histotripsi maruziyetinden korunmasından kaçınmak için tüm hava kabarcıklarını model damardan çıkarmak önemlidir. Hidrofobik malzemeden oluşan örnek bir kap için kabarcık bulutları pıhtının merkezi yerine tercihen damar duvarının yakınında oluşabilir. Bu nedenle ultrason görüntüleme ile tedavi sırasında kabarcık bulutunun sürekli izlenmesi yapılmalı, gerekirse dönüştürücü yeniden konumlandırılmalıdır. Son amaçlanan pıhtı bozulmasını sağlayan histtripsi insonasyon parametrelerini (örneğin, nabız süresi ve pik basınç) belirlemek için pilot çalışmalar yapılmalıdır.

Görüntüleme dizisi, tedavi görselleştirmesi için B modu görüntülerini ve pasif kavitasyon görüntülerini yakalamak ve kabarcık aktivitesini ölçmek için kullanılır. B-mod görüntüleme, model damarın ve pıhtının görselleştirilmesine izin verir ve pasif kavitasyon görüntüleme, pıhtı ablasyonu ile ilişkili kabarcık aktivitesinin enerjisini ölçer24,49. Görüntüleme dizisinin bant genişliği, yüksek sinyal-gürültü oranıyla istenen kabarcık bulut etkinliğiyle hizalanmalıdır. Bulut içindeki kabarcıkların ataletsel çöküşüyle ilişkili tamamen geniş bant sinyalleri elde etmek için, dizinin bant genişliğidönüştürücü 50,51'intemel frekansıyla çakışmamalıdır. Histotripsi darbeleri son derece doğrusal olmayan52ve alınan sinyalde temel frekansın harmoniklerinin bulunması muhtemeldir. Görüntüleme sistemi, insonasyon boyunca tam pasif kavitasyon görüntüleme verilerinin toplanmasını sağlamak için histotripsi darbesinin kaynaktan odak bölgesine bilinen uçuş süresine göre tetiklenecek şekilde programlanmalıdır. Bu sinyaller daha sonra protokolün 7.2.3 ve 9.

Hemoliz miktarının pıhtının taşınmasına duyarlı olduğu belirtilmelidir. Bu nedenle tedaviden önce pıhtının zarar görmesini en aza indirmeye özen verilmelidir. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, histotripsi maruziyeti olsun veya olmasın tedavi edilen tüm pıhtılar için pıhtı modellemesi (adım 1) ve ön tedavi süresi (adım 6 ve 7.1) aynı olmalıdır. Hemoliz değerlendirmesinin tedavi sonrası adımında, plazmanın kendi emiciliğine sahip olduğu belirtilmelidir. Bu nedenle, standart eğrileri oluşturmak için kullanılan seyreltici (örneğin, optik emicilik ve hemoglobin) akış kanalındaki perfüzatla aynı sıvı kullanılarak oluşturulmalıdır (örneğin, bu çalışmada plazma standart eğrileri oluşturmak için seyreltici olarak kullanılmıştır).

Bu protokol, insan bütün kan pıhtılarını tedavi etmek için lizotripsinin etkinliğini ölçmek için bir tezgah üstü kurulumu sağlamayı amaçlamaktadır. Kurulumun in vitro doğası nedeniyle ortaya çıkan bazı sınırlamalar vardır. Bu protokol için kullanılan akut pıhtılar esas olarak kırmızı kan hücreleri ve fibrinden oluşuyordu ve lizotripsi yaklaşımını DVT için etkili hale getirdi. Bununla birlikte, trombüsin sonraki aşamaları, rt-PA'nın fibrin özgü doğası nedeniyle lizotripsi tedavisine direnebilecek sert bir kollajenöz ağ53 geliştirebilir. In vivo tedavi edilirken, tedavi etkinliği için birincil klinik uç nokta akışın restorasyonudur. Kitle kaybı, burada açıklanan in vitro protokolde tedavi etkinliği için birincil metrikti. Bu protokolde akış değerlendirilmemiş olsa da, renk Doppler görüntüleme, akış restorasyonunu izlemek için 7.2.4 adımında pasif kavitasyon görüntüleme ile birlikte ek olarak dahil edilebilir. Bu protokoldeki kurulum, 7.2 adımındaki tüm tedavi sırasında, yüksek oranda tıkanmış bir kaptaki akış hızını taklit eden sabit bir akış hızı kullanır. İn vivo, tedavi sırasında pıhtı parçalandıkça damar akışı artacaktır. Artan akışla ilişkili ek kesme gerilmeleri pıhtı bozulması profilini vurgulayacaktır54. In vivo hedef dışı etkiler, litik55'insistemik yönetimine bağlı kanama, kabarcık bulut aktivitesi nedeniyle damar duvarı hasarı veya vazospazm gibi bu kurulumda tespit edilemez22. Bu çalışmanın in vitro doğası, tedaviden sonra damar açıklığı veya yeniden tromboz gibi uzun vadeli sonuçları değerlendirme yeteneğini de sınırlar. Bu çalışmada litiğin yönetimi sistemik trombolitikleri taklit ederken, katetere yönlendirilmiş litikler venöz tromboz için tercih edilen müdahaledir7,14. Doku zayıflaması histtripsi alanını ve in vivo çalışmalar için görüntüleme kalitesini etkileyebilirken, burada akustik yol öncelikle gazsız sudan geçer. Kavitasyon emisyon verilerinin sağlam Capon beamformer (protokolün 9. adımı) ile işlenmesi hesaplama açısından pahalıdır ve geçici analiz sonrası için devre dışı bırakılmıştır. Diğer hüzmeformatörler (örneğin, gecikme ve toplam35 veya açısal spektrum56),daha düşük menzil çözünürlüğüyle de olsa gerçek zamanlı geri bildirim sağlamak için alternatif olarak çalıştırılabilir.

Özetle, bu protokol insan kanı pıhtılarının derin ven trombolizini elde etmek için invaziv olmayan bir yaklaşım sunar. Protokol, kan pıhtılarının modellenerek lizotripsi ile tedavi edilebilir ve tedavi sırasında eşzamanlı görüntüleme için uygun ve çoğaltılması kolay bir prosedür oluşturur. Histotripsi kabarcık bulutu üretimi, tedavi planlaması ve görüntü rehberliğini belirten protokol adımları, histotripsinin standart prosedürlere kıyasla daha etkili olduğu gösterilen meme tümörü, pankreas tümörü ve iyi huylu prostat hiperplazisinin in vitro tedavilerini araştırmak için daha fazla kullanılabilir57,58. Bu protokolde rt-PA kullanımı, litik etkinliği artırmak için histtripsi ile birlikte bu tür tümörlerin tedavisinde kullanılan diğer ilaçlara veya ilaç taşıyıcılarına genellenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant R01HL13334 tarafından finanse edildi. Yazarlar, Dr. Kevin Haworth'a Drabkin'in testine yardımcı olduğu için ve Dr. Viktor Bollen'e protokolün tasarımındaki desteği için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Dr. Adam Maxwell'e histotripsi kaynağını tasarlama konusundaki rehberliği için minnettarlar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -T., Huang, C. -Y., Hsu, C. -P., Lee, C. -Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A. Physical Properties of Tissues. Duck, F. A. , Academic Press. 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, Suppl 3 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Tags

Biyomühendislik Sayı 172 histoptripsi lizotripsi tromboliz hemoliz derin ven trombozu pasif kavitasyon görüntüleme odaklanmış ultrason akustik kavitasyon
Histotripsi ve Litik İlacın Trombolitik Etkinliğini Ölçmek için Bir In vitro Sistem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, … More

Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter