Summary
Hier wordt een syngenetische orthotopische implantatie gevolgd door een amputatieprocedure van het osteosarcoom met spontane pulmonale metastase beschreven die kan worden gebruikt voor preklinisch onderzoek van metastasebiologie en ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Abstract
De meest recente vooruitgang in de behandeling van osteosarcoom (OS) vond plaats in de jaren 1980 toen multi-agent chemotherapie werd aangetoond dat het de algehele overleving verbeterde in vergelijking met chirurgie alleen. Om dit probleem aan te pakken, is het doel van de studie om een minder bekend model van OS bij ratten te verfijnen met een uitgebreide histologische, beeldvormings-, biologische, implantatie- en amputatiechirurgische benadering die de overleving verlengt. We gebruikten een immunocompetente, gefokte Sprague-Dawley (SD), syngenetisch ratmodel met geïmplanteerde UMR106 OS-cellijn (afkomstig van een SD-rat) met orthotopische tibiale tumorimplantaten in 3 weken oude mannelijke en vrouwelijke ratten om pediatrische OS te modelleren. We ontdekten dat ratten reproduceerbare primaire en gemetastaseerde longtumoren ontwikkelen en dat ledemaatamputaties 3 weken na implantatie de incidentie van pulmonale metastase aanzienlijk verminderen en onverwachte sterfgevallen voorkomen. Histologisch gezien leken de primaire en gemetastaseerde besturingssystemen bij ratten sterk op humane OS. Met behulp van immunohistochemische methoden toont de studie aan dat ratten OS zijn geïnfiltreerd met macrofagen en T-cellen. Een eiwitexpressie-onderzoek van OS-cellen onthult dat deze tumoren ErbB-familiekinasen tot expressie brengen. Omdat deze kinasen ook sterk tot expressie komen in de meeste menselijke besturingssystemen, kan dit rattenmodel worden gebruikt om ErbB-routeremmers te testen voor therapie.
Introduction
Osteosarcoom (OS) is de meest voorkomende primaire bottumor bij kinderen, adolescenten en jonge volwassenen. De meest recente vooruitgang in de behandeling van OS vond plaats in de jaren 1980 toen multi-agent chemotherapie de algehele overleving bleek te verbeteren in vergelijking met chirurgie alleen1. OS ontwikkelt zich tijdens snelle botgroei, meestal voorkomend in lange buisvormige botten zoals dijbeen, scheenbeen en opperarmbeen. Ze worden gekenmerkt door een osteolytisch, osteoblastisch of gemengd uiterlijk met opmerkelijke periostale reactie2. Chemotherapie en chirurgische resectie kunnen de uitkomst verbeteren voor patiënten met een 5-jaarsoverleving voor 65% van de patiënten2,3. Helaas hebben hooggradige OS-patiënten met gemetastaseerde ziekte een overleving van 20%. OS dringt regionaal binnen en metastaseert voornamelijk naar de longen of andere botten en komt vaker voor bij mannen. De meest dwingende behoefte voor deze jonge patiënten is een nieuwe therapie die de levensvatbaarheid van metastasen op afstand voorkomt en elimineert.
OS preklinische modellen zijn beoordeeld4,5,6,7 en er zijn weinig beschikbare immunocompetente modellen ontwikkeld met behulp van amputatie van orthotopisch OS. In 2000 werd een belangrijk model ontwikkeld met BALB/c muizen met orthotopisch syngeneïsch OS en amputatie8. Vergeleken met dit muismodel is het rattenmodel gebaseerd op genetisch gefokte en 10 keer grotere dieren, wat tot enkele voordelen leidt. Het rat UMR106-model werd ontwikkeld op basis van een 32P geïnduceerde OS in een Sprague Dawley (SD) rat, die werd afgeleid in een cellijn9. In 2001 werd orthotopische implantatie van UMR106-01 voor het eerst beschreven in geïmplanteerde tibia's van athymische muizen met snelle, consistente primaire tumorontwikkeling en radiologische, histologische kenmerken die gemeen hebben met OS bij mensen. Pulmonale metastasen ontwikkelden en waren afhankelijk van orthotopische plaatsing van UMR106 in de botmicro-omgeving10. In 2009 hebben Yu et al.11 een reproduceerbaar orthotopisch femur OS-ratmodel vastgesteld met behulp van UMR106-cellen in grotere mannelijke SD-ratten. De succesvolle tumorimplantaties en longmetastasesnelheid bij ratten zonder amputatie waren vergelijkbaar met de hier gepresenteerde gegevens. In deze studie werd een toegevoegde amputatie aan het model uitgevoerd met behulp van jonge ratten, wat suggereerde dat de timing van primaire tumorverwijdering cruciaal is bij het modelleren van OS, vooral gerelateerd aan metastatische progressie. Met deze verfijning verbeteren amputatie en in vivo beeldvorming dit model voor preklinische studies voor de beoordeling van nieuwe geneesmiddelen voor OS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures en experimenten met ratten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Het SD rat OS cellijn UMR-106 celkweekprotocol
- Kweekcellen in DMEM, aangevuld met 10% (v/v) FBS, penicilline (10 U/ml)-streptomycine (10 U/ml) bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-atmosfeer. Voer experimenten uit met cellen met passages van 2-812.
2. Intratibiale injectie van OS-cellen protocol
OPMERKING: Tijdgebonden zwangere SD-ratten bevallen in de dierenfaciliteit en op de leeftijd van 3 weken worden nesten gebruikt (aangezien UMR 106-cellijn syngenetisch is voor SD-ratten, is er geen bestraling nodig).
- Inductie
- Plaats de rat in een middelgrote inductiekamer en induceer anesthesie met 2% -3% isofluraan. Controleer het dier continu op de diepte van de anesthesie door reflex tot teen knijpen, ademhalingsfrequentie en karakter.
- Steek de neus in de neuskegel. Indien nodig vastzetten met tape.
- Verwijder het haar op het rechterbeen tot aan de ventrale en de dorsale onderbuik met een tondeuse of gebruik ontharingsmiddel. Plaats de rat in rugligging.
- Schrob het operatiegebied aseptisch met 70% ethanol en verdun chloorhexidineacetaat of verdun betadine. Begin rond het gebied van de knie en scrub in een cirkelvormige beweging, zowel proximaal als distaal. Herhaal deze stap drie keer. Er wordt geen gordijn gebruikt voor tumorimplantatie.
- Breng oogglijmiddel aan in beide ogen van de rat om uitdroging van het hoornvlies veroorzaakt door anesthesie te voorkomen. Plaats de rat op een verwarmingskussen met lage temperatuur. Zorg ervoor dat de rat een normale lichaamstemperatuur (37 °C) en een normale ademhalingsfrequentie heeft.
- Chirurgie
- Schakel isofluraan in bij ~1,5%-2% (voor onderhoud). Zorg ervoor dat het dier zich op een adequaat niveau van anesthesie bevindt door het ontbreken van een teenknijperreflex. Zo niet, verhoog dan het isofluraanpercentage tot 2,5%.
- Markeer een steriele naald (ongeveer 22 G) op 10 mm van de punt voor geleiding van de diepte om in te brengen.
- Steek de naald 10 mm naar beneden in de diafyse van het scheenbeen door de gebogen knie in het midden van het tibiale plateau binnen te gaan en de naald door de metafyse in de diafyse uit te strekken met behulp van een lichte boorachtige beweging om een opening te maken. Verwijder de naald.
- Laad de celsuspensie in de Hamilton-spuit direct voor injectie in het scheenbeen. Om dit te doen, mengt u de cellen voorzichtig voordat u in de spuit trekt, omdat de zwaartekracht de cellen in de bodem van de buis laat bezinken.
OPMERKING: Cellen kunnen worden bewaard in een buis van 1,5 tot 2 ml (bij kamertemperatuur) voordat ze na zorgvuldig mengen in de Hamilton-spuit (100 μL) worden getrokken. Cellen kunnen tijdens de implantatieprocedure gedurende 2-3 uur op kamertemperatuur worden gehouden. Controleer altijd de cel levensvatbaarheid van cellen in de buis voor en dan na de implantatiesessie. Trypan blauwe uitsluiting is de gemakkelijkste methode voor de beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen. - Zodra het bot is doorkruist met de eerste naald, plaatst u een tweede naald (naald met kleinere diameter die ook op 10 mm is gemarkeerd) die is bevestigd aan de Hamilton-spuit van 100 μL geladen met cellen. Zorg ervoor dat u de naald tot de markering van 10 mm in hetzelfde gat steekt dat zich uitstrekt in de diafyse.
- 20 μL van 75.000 OS-cellen suspensie in PBS voorzichtig in de diafyse en mergholte lozen.
OPMERKING: De naald mag niet wiebelen in het bot en moet veilig aanvoelen. Als de naald gemakkelijk beweegt, kan de cortex bij de diafyse zijn doorkruist. Herhaal het inbrengen opnieuw om een stevigere plaatsing te krijgen voor de injectie van cellen. - Verwijder de Hamiltonnaald van het bot.
OPMERKING: Als zich een kleine druppel bloed vormt, oefen dan lichte druk uit. Als zich duidelijke vloeistofdruppel vormt op de punctieplaats, is de naald mogelijk niet ver genoeg in het bot uitgeschoven en is de tumorcelsuspensie mogelijk teruggelekt door het gat. Noteer dit in de notities, maar over het algemeen zal tumorimplantatie succesvol zijn. Met ervaring moet de tumorimplantatieprocedure 5 minuten per rat duren. Met ervaring zal de tumorimplantatie van cellen in het bot gemakkelijker worden. Accidentele injectie van cellen in de spier rond het bot, kan niet leiden tot de tumor micro-omgeving die nodig is voor pulmonale metastase.
- Terugwinning
- Zorg ervoor dat de rat normotherme is. Plaats de rat in een kooi met een verwarmingskussen onder de kooi geplaatst voor herstel.
- Na volledig wakker, mobiel en goed ademen, injecteert u de ratten met Buprenorfine (1,0-1,2 mg / kg SC).
OPMERKING: Om toegang te krijgen tot Buprenorfine, neem contact op met de instelling om opties voor goedkeuring via het veterinaire personeel te zien om de bestelling te plaatsen. - Verplaats de ratten terug naar schone kooien en controleer één keer per dag, elke week.
3. Meting en monitoring
- Meet de tumorgrootte 9-10 dagen na de implantatie en vervolgens elke 2 dagen tot 3 weken na de implantatie om een groeisnelheid vast te stellen. Meet de maximale diameter van het scheenbeen met behulp van een elektronische of handmatige remklauw. Sla de gegevens op in een spreadsheet met een formule om het tumorvolume te berekenen. Meet het contralaterale (niet geïmplanteerde scheenbeen) als basislijn.
OPMERKING: De geïmplanteerde achterklepdiameters worden gebruikt als surrogaat voor tumorgrootte. De achterpoten worden loodrecht op de tibia lange as gemeten bij de grootste diameter voor twee metingen, ventraal / dorsaal en media / lateraal op de ledemaat. Het geschatte tumorvolume wordt berekend met de formule11: Tumorvolume (mm3) = grootste diameter (mm) x kleinste diameter (mm)2/2. - Overweeg de ratten voor overlevingsamputatie of chemotherapiebehandeling wanneer tumoren 15 mm naderen in de grootste afmeting of 3 weken na tumorimplantatie. De contralaterale ledemaat meet ongeveer 7-9 mm bij de meeste ratten op deze leeftijd.
4. Doxorubicine intraveneuze toediening
- Verdoof de ratten met 2% isofluraan. Bereid de huid over de halsader met drie chirurgische wasbeurten met betadine en alcohol zoals beschreven13.
- Visualiseer onder zorgvuldige dissectie de rechter- of linker halsader. Steek de naald in de bovenliggende spier en richt vervolgens naar de kop van de rat in het jugulaire aderlumen zoals het wordt gevisualiseerd in de halsader anterieur aan de borstspier.
- Wanneer de naald in de halsader wordt ingebracht, trekt u voorzichtig bloed in de spuit om een goede inbrenging te garanderen. Het is mogelijk om te geloven dat de naald door de ader is, maar de naald bevindt zich onder de ader en niet in het lumen. Als de halsader te klein wordt voor injecties bij stompe ontleding om de halsader bloot te leggen, gebruik dan de andere halsader voor de injectie.
- Injecteer doxorubicine (2 mg/kg) langzaam gedurende 1 minuut in een volume van 100-150 μL. De oplossing kan tijdens de bevalling intraveneus in de halsader worden gevisualiseerd.
- Injecteer vergelijkbare volumes normale zoutoplossing bij controleratten.
- Verwijder de naald en oefen zachte druk uit op de ader met een steriel gaasje.
- Sluit de huidincisie met behulp van 3-4 wondclips. Verwijder de clips 7-10 dagen na de injectie.
OPMERKING: Ratten proberen meestal geen metalen clips te verwijderen, maar zullen bijten en hechtingen verwijderen. De jugulaire injectiemethode heeft de voorkeur boven staartaderinjecties voor doxorubicine, omdat elk medicijn dat buiten het vat lekt necrose van de staart veroorzaakt waarvoor staartamputatie nodig kan zijn.
5. Amputatieprotocol voor de achterpoten
- Inductie
- Plaats de rat in een middelgrote inductiekamer en induceer anesthesie met 2% -4% isofluraan. Controleer de rat continu op de diepte van de anesthesie.
OPMERKING: De inductiekamer wordt naar een houtskoolbus gebracht en alle andere gassen worden verwijderd door een down-draft tabel die wordt gebruikt voor een operatie. - Steek de neus in een neuskegel. Indien nodig vastzetten met tape.
OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd op een down-draft tabel om overtollige vluchtige gassen (d.w.z. isofluraan) op te ruimen. - Verwijder het haar op het rechterbeen tot aan de ventrale en de dorsale onderbuik met een tondeuse of gebruik ontharingsmiddel. Plaats de rat in rugligging.
- Schrob het operatiegebied aseptisch met 70% ethanol en verdun chloorhexidineacetaat of verdun betadine. Bereid de huid voor op een operatie van het midden van de kuit tot het huidgebied net boven het heupgewricht van de rechter onderbuik. Schrob het been proximaal en het distale gebied omcirkeld. Herhaal deze stap drie keer.
- Breng het oogglijmiddel aan in beide ogen van de rat. Zorg ervoor dat de rat een normale lichaamstemperatuur (37 °C) en normale vitale functies heeft. Bewaak en regel de lichaamstemperatuur met behulp van een verwarmingskussen dat is aangesloten op een rectale temperatuurvoelermonitor.
- Plaats de rat in een middelgrote inductiekamer en induceer anesthesie met 2% -4% isofluraan. Controleer de rat continu op de diepte van de anesthesie.
- Chirurgie
- Zet isofluraan aan bij 1,5%-3% (onderhoud). Controleer op verdovingsdiepte, inclusief reactie op teenknijpen, ademhalingsfrequentie en karakter. Pas de snelheid van isofluraan indien nodig aan om een geschikt niveau van anesthesie te behouden.
OPMERKING: Ademhalingsfrequentie tijdens anesthesie moet tussen 50-100 ademhalingen per minuut liggen. Diepe, onregelmatige ademhalingen zijn een indicatie dat de rat te diep verdoofd is. - Open steriele instrumentenpakketten en gordijnen en trek steriele handschoenen aan. Zorg ervoor dat u de steriliteit behoudt gedurende de duur van de procedure. Basis steriele chirurgische instrumenten die nodig zijn, zijn onder meer scalpelbladhouder, tang, hemostaten, naaldhouder, schaar en wondclip-applier.
- Trek de poot van de rat door de opening van het steriele chirurgische gordijn. Zorg ervoor dat het dier zich op een adequaat niveau van anesthesie bevindt via een teenknijperreflex.
- Maak met behulp van een scalpelmes of chirurgische schaar een omtrekkende, cutane incisie net proximaal aan de stifle (kniegewricht).
- Deglove de achterste ledemaat met behulp van gaas of stompe dissectie om de dijbeenslagader en ader bloot te leggen op het ventraal-mediale oppervlak van de achterpoot.
- Lireer de vaten met behulp van 4-0 absorbeerbare hechtingen ter hoogte van het middendijbeen en transect distaal.
- Klem de ader distaal vast om lekkage tijdens spierdissectie te verminderen.
OPMERKING: Omtrekkende musculatuur zal distaal worden getransecteerd naar het niveau van ligatie van het femorale slagadervat en spieren verhoogd van het dijbeen tot het niveau van het coxofemorale gewricht. - Gebruik stompe dissectie om het heupgewricht te abducteren met laterale naar buiten gerichte rotatie.
- Zoek de kop van het dijbeen en disarticuleer het van het acetabulum. Snijd het resterende weefsel af dat het been aan het lichaam vasthoudt.
- Geef een spatblok aan het acetabulum en de heupzenuw met ongeveer 6 mg/kg Ropivacaïne.
- Sluit de musculatuur over het acetabulum met behulp van een eenvoudige onderbroken hechting (4-0, absorbeerbare hechting).
OPMERKING: Extra 0,5% bupivacaïne of lidocaïne (0,15-0,2 mg totaal) kan worden geïnjecteerd op verschillende plaatsen langs de gesloten spierlaag (lokale infiltratie / spatblok). - Verzet en sluit de randen van de huid met behulp van wondclips die om de 5-10 mm uit elkaar worden geplaatst.
- Zet isofluraan aan bij 1,5%-3% (onderhoud). Controleer op verdovingsdiepte, inclusief reactie op teenknijpen, ademhalingsfrequentie en karakter. Pas de snelheid van isofluraan indien nodig aan om een geschikt niveau van anesthesie te behouden.
- Terugwinning
- Plaats de rat in een schone herstelkooi met warmteondersteuning met behulp van een verwarmingskussen dat onder de kooi is geplaatst.
OPMERKING: Om hyperthermie te voorkomen, mag het verwarmingskussen niet in direct contact staan met het dier en mag het niet hoger zijn dan 40 °C. - Controleer het dier totdat het volledig herstelt en normotherme is (37,5-39 °C).
OPMERKING: Het dier mag niet onbeheerd worden achtergelaten totdat het volledig bewust en streng ligt en gemakkelijk door de kooi beweegt. - Na volledig wakker, mobiel en goed ademen, injecteert u de ratten met Buprenorfine (1,0-1,2 mg / kg SC).
OPMERKING: Het geven van buprenorfine bij een verdoofde rat kan het herstel belemmeren. - Dien 10 ml warme ringer-oplossing met lactatie subcutaan toe tussen de schouderbladen.
- Verplaats de ratten terug naar de schone kooi en herenig je met soortgenoten.
- Controleer alle dieren tweemaal daags voor de volgende maand op tekenen van pijn en angst, waaronder piloerection, gebogen houding of onopvallendheid of tekenen van infectie op de incisieplaats, waaronder erytheem, etterende afscheiding of wonddehiscentie.
OPMERKING: Tot op heden hebben we bij geen van de dieren klinische symptomen (zoals infecties) waargenomen na postoperatief herstel. Slechts één rat had een dehiscentie met hechtingen, waarna wondklemmen werden gebruikt om wonden zonder verdere problemen te sluiten. - Dien buprenorfine of meloxicam toe aan dieren met klinische symptomen van pijn bij gepubliceerde doses in overleg met een dierenarts voor proefdieren.
- Dien antibiotica (d.w.z. cefalosporine) toe aan dieren die klinische symptomen van pijn vertonen bij gepubliceerde doses in overleg met een dierenarts voor proefdieren.
OPMERKING: Alle dieren die langdurige tekenen van pijn of angst vertonen die niet verbeteren met pijnstillers of dieren die tekenen van infectie vertonen die niet reageren op antibiotica, moeten op humane wijze worden geëuthanaseerd.
- Plaats de rat in een schone herstelkooi met warmteondersteuning met behulp van een verwarmingskussen dat onder de kooi is geplaatst.
6. Beeldvorming met röntgenfoto's
- Na tumorimplantatie, beeld de tibia's en longen niet-invasief in om tumorgroei te detecteren met behulp van röntgenfoto's met een machine die is ontworpen voor knaagdieren.
- Verdoof de ratten zoals eerder gedaan.
- Maak foto's met 3x vergroting gedurende 6 s bij 25 kV.
- Verwerk de film met behulp van de röntgenprocessor. Röntgenfoto's kunnen ook digitaal worden gescand.
7. Obductie procedure
- Euthanaseer de ratten met CO2. Bevestig de dood door gebrek aan hartslag en trek onmiddellijk 3 ml bloed uit het hart voor serum- of plasmamonsters.
- Open de thorax en de buik voor onderzoek.
- Isoleer de luchtpijp en cannulaat met een (18 G) katheter. Om de katheter in de luchtpijp te bevestigen, bindt u een zijden hechtdraad rond beide luchtpijpen met de katheter.
- Sluit de infusiekatheter aan op een spuit van 3 of 5 ml. Infundeer formaline of zoutoplossing om de longkwabben voorzichtig op te blazen voor betere histologische monsters. Bij infusie zullen de longen opzwellen en een betere visualisatie van pulmonale metastasen mogelijk maken.
- Onderzoek, ontleed en weeg alle geselecteerde thoracale en abdominale organen (zoals lever, nieren).
- Fixeer de organen in formaline voor histopathologie of bevries op droogijs, 2-methylbutaan of vloeibare stikstof.
- Voor de evaluatie van eiwitexpressie met behulp van western blot, maak lysaten van bevroren weefsels. Antilichamen die reageren met rattenweefsels zijn gedetailleerd13.
8. Immunohistochemie
- Verwerk het primaire OS-weefsel, insluiten in paraffine en sectie het voor immunohistochemische kleuring.
- Haal het antigeen na deparaffinisatie op met citraatbuffer (pH 6,0). Incubeer in 0,3% H2O2 in methanol gedurende 30 minuten om endogene peroxidase te doven.
- Blokkeer de 5 μm dikke paraffinesecties met normaal serum.
- Incubeer met primaire anti-CD68- en CD3-antilichamen (zie tabel) gedurende de nacht bij 4 °C.
- Spoel de secties in PBS en incubeer ze in HRP-polymeer met behulp van een detectiekit.
OPMERKING: Immunostaining werd ontwikkeld met diaminobenzidine als een chromogeen.
9. Western blotting
- Lyseer de UMR-106-cellen in 200-300 μL lysisbuffer14 om standaard gel-elektroforese en western blotting uit te voeren.
- Gebruik 4% tot 12% Bis-Tris gels.
- Incubate in anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actine of anti-muis β2-AR primair antilichaam (zie tabel) en mierikswortel peroxidase-gebonden secundair antilichaam.
- Voeg het chemiluminescente substraat toe. Stel de membranen bloot aan röntgenfilm.
OPMERKING: β-actine niveaus worden gebruikt als belastingscontroles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunocompetente SD-gefokte ratten worden gebruikt voor deze OS-studies, die een diermodel bieden met een intact immuunsysteem. We hebben de UMR106-cellijn van ATCC gebruikt, ontwikkeld uit cellen die aanvankelijk werden geïsoleerd uit een OS van een SD-rat. We implanteerden de cellen in SD-ratten en leverden zo een syngenetisch model op voor OS. UMR106-cellen worden geïmplanteerd in het scheenbeen van 3 weken oude mannelijke en vrouwelijke SD-ratten, waarbij een pediatrisch OS-model wordt gesimuleerd. Bovendien geeft de orthotopische implantatie van UMR106-cellen direct in de tibiametafyse /diafyse een relevante tumormicro-omgeving.
Bij het implanteren van tumorcellen moet een naald correct door het tibiale plateau (figuur 1) worden ingebracht onder de juiste hoek (evenwijdig aan de botschacht) waardoor de naaldpunt ongeveer 10 mm in de centrale holte van het bot wordt verlengd. Met deze procedure ontwikkelde 95% (52/55) van de ratten tumoren in tibias distale tot aan de knie. Met tibiale injectie-ervaring ontwikkelde 100% van de ratten tumoren. In een groep ratten die niet werden geamputeerd, waren de gemiddelde tumorvolumes bij mannen 504 mm3 na 3 weken en 1195 mm3 na 5 weken na implantatie. Bij vrouwen zijn de tumorvolumes gemiddeld 285 mm3 na 3 weken en 495 mm3 na 5 weken na implantatie.
Twee cohorten ratten werden vergeleken, waaronder die met amputatie (23 ratten) (figuur 2) en die zonder amputatie (29 ratten). Beide cohorten werden 7 weken na implantatie geëuthanaseerd om tumormetastase naar de longen te onderzoeken. In de amputatiegroep (3/23) ontwikkelden ratten longmetastasen. Deze drie ratten stierven of werden binnen 24 uur na de operatie geëuthanaseerd als gevolg van complicaties na de operatie. Twee ratten stierven aan langdurige anesthesie terwijl de chirurg de methode leerde. Eén rat ontwikkelde een dehiscentie en werd de volgende dag geëuthanaseerd. Longen van deze drie ratten werden geëvalueerd en drie kleine metastasen (>1 mm) werden histologisch gevonden. De overlevende 20 ratten hadden 7 weken na de implantatie geen longmetastasen. Dit gaf aan dat amputaties na implantatie 3 weken voldoende zijn om het aantal ratten met pulmonale metastase te verminderen. In een tweede groep van 29 ratten die de amputatieprocedure niet hadden, hadden 26/29 ratten longmetastasen die consistent waren met de eerder gepubliceerde gegevens11. We zagen geen patroon in de grootte of het aantal uitzaaiingen bij deze ratten. De meeste ratten hebben meer dan 10 grof zichtbare metastasen met een diameter van 2-7 mm die gemakkelijk konden worden bemonsterd tijdens obductie. Af en toe hadden ratten nog grotere metastasen met een diameter tot 10 mm. Het is belangrijk om UMR106-cellen met een laag passagegetal te implanteren, omdat de studies hebben aangetoond dat de cellen met een passagenummer van 10 of hoger agressiever worden en al 2-3 weken na implantatie uitzaaien. De reden voor de aard is niet bekend, maar de speculatie is dat de cellen in cultuur mutaties kunnen ontwikkelen die metastase bevorderen.
Naast de amputatiechirurgie omvatte een andere verfijning van de methoden de röntgenbeeldvorming voor tumorsurveillance of bij obductie. Met deze methode kan de onderzoeker bottumorinvasie bij ratten onder anesthesie bevestigen. De planaire radiografiemethode kan ook worden gebruikt op recent geamputeerde ledematen of formaline-gefixeerde ledematen. De methode is snel (5 min per rat) en goedkoop ($ 2-5 / rat) in vergelijking met computertomografie (CT). Voor in vivo monitoring moeten de ratten tijdens de beeldvorming worden verdoofd. Figuur 3 toont de gedetailleerde morfologie van röntgenfoto's van twee eerder geamputeerde ledematen. Deze methode verlicht de osteolytische en osteoblastische aard van deze tumoren. Let op de verstoring van de normale botcorticale architectuur van het scheenbeen en het kuitbeen in beide voorbeelden (witte pijlen). Figuur 4 illustreert de radiografische morfologie van longen met en zonder uitzaaiingen. Beeldvorming door röntgenfoto's kan het laboratorium snel de noodzaak van euthanasie onthullen om onnodige spontane sterfgevallen te voorkomen.
Primaire en gemetastaseerde tumoren naar de longen zijn histologisch vergelijkbaar met humane OS die zowel osteolytische als osteoblastische tumormorfologie vertonen. In de rat OS wordt zowel osteolytische als osteoblastische tumormorfologie bevestigd door histopathologie van geamputeerde ledematen in figuur 5 en figuur 6. Merk op dat het corticale bot in dit voorbeeld afwezig is en dat het aangrenzende bot ook wordt vervangen of versterkt door nieuw geweven bot (exostosen) dat loodrecht op de bestaande schacht van de cortex is georiënteerd. Eilanden van onrijpe osteoide (amorf extracellulair materiaal) worden getoond in het tumorvoorbeeld. Bovendien wordt de microscopische morfologie van de longmetastasen, sommige met gemineraliseerd bot, en tumor vasculaire emboli weergegeven in figuur 7.
Ledemaatamputatie met OS verhoogt de overleving bij ratten. Ratten kunnen spontaan sterven als gevolg van pulmonale metastase die langer dan 7 weken na implantatie wordt gehuisvest. Het gebruik van amputatie kan het verdere onderzoek van standaard of gerichte kankertherapie in dit model mogelijk maken. Het verlengen van de tijd tussen tumorimplantatie en amputatie zal de incidentie van metastase verhogen.
Doxorubicine is een chemotherapeutisch middel dat wordt gebruikt om OS bij mensen te behandelen. Bij ratten kan doxorubicine worden gegeven via jugulaire injecties13 of een katheter15 zoals hier beschreven. De jugulaire injectie vereist 5-10 minuten per rat, maar verzekert de afgifte van de dosis in de blootgestelde ader. Over het algemeen zijn jugulaire injecties veel reproduceerbaarder in vergelijking met de aderinjecties van de rattenstaart. Als doxorubicine tijdens staartaderinjecties in de dermis lekt, kan necrose van de staart optreden en verdere behandelingen voorkomen. In deze studie werden vijf ratten behandeld met een dosis van 2 mg/kg doxorubicine en 48 uur na injectie geëuthanaseerd om celdood in de tumoren te onderzoeken zoals weergegeven in figuur 5A(B).
Vijf controleratten behandeld met zoutoplossing werden ook geëvalueerd om antilichamen te selecteren die kunnen worden gebruikt om immuuncellen in rat-besturingssystemen te immunosmeren. Hier werden twee antilichamen getest op immuunreactiviteit. Voor immunohistochemische studies werden tumoren gedurende 48-72 uur in formaline gefixeerd en vervolgens verplaatst naar 70% ethanol om eiwitverknoping die optreedt in formaline te verminderen. Immunohistochemie werd uitgevoerd voor immuuncelinfiltraten in primaire OS-tumoren en immunostained voor macrofagen (CD68) en T-cellen (CD3). Figuur 8 toont twee voorbeelden van immunostains van immuuncelinfiltraten in de micro-omgeving van de tumor.
De mogelijke doelen voor therapeutische interventie werden ook onderzocht. Na amputatie van ledematen met tumoren werden os-monsters van ratten ingevroren voor toekomstige eiwitisolatie. In deze studie ontdekten we dat UMR106-cellen de ErbB-familieroute-eiwitten tot expressie brengen. Western blots uitgevoerd op UMR106-celeiwitlysaten tonen de expressie van ErbB2, EGFR, ErbB4 en andere eiwitten die interageren met deze routes(figuur 9).
Figuur 1: Scheenbeen met ingebrachte tumorimplantatienaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Tibia tijdens amputatieprocedure met verwijderde huid (A), blootgestelde dijbeenslagader en ader (B), met spier verhoogd van het dijbeen (C), en bij een rat 3 weken na amputatiechirurgie (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Röntgenfoto van rechterbenen na amputatie (ex vivo) van twee ratten met OS. Let op de osteolytische en osteoblastische aard van de tumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Röntgenfoto's van de rattenlongen. (A) zonder longmetastasen. (B) met OS pulmonale metastase. (C) correlatie met grove pathologie van metastasen in een opgeblazen long. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: (A) Histopathologie van OS met 90% van de cellen die celdood vertonen in de tibiatumor 48 uur na een dosis van 2 mg/kg doxorubicine. BTumorceldood (pijl) in tibiale primaire OS bij 48 uur na een dosis van 2 mg / kg doxorubicine. Merk op dat de rechter- en linkerbovenhoek levensvatbare cellen bevat. (C) OS invasie in corticale bot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: (A) Histopathologie van OS die de beenmergcellen heeft vervangen en geïnfiltreerd in de cortices van het scheenbeen. Let op de bijbehorende reactieve nieuwe botgroei omdat deze buiten en loodrecht op de reeds bestaande cortex is gelaagd. B) Onderzoek met een hoger vermogen van OS-tumorcellen grenzend aan een eiland van bot. (C)Hoger vermogen onderzoek van OS-cellen ingebed in roze tot blauwe extracellulaire matrix (osteoid). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: (A) Meerdere pulmonale metastasen bij ratten met tibia tumor implantatie. (B)Tumor OS-cellen in een embolus in een klein longslagadervertakkingsvat grenzend aan een bronchiole onder het vat. Sommigepulmonale metastasen bevatten boteilanden, terwijl andere metastasen meer cellulair zijn. (D) Hogere kracht van metastasen met OS-cellen vermengd met eilanden van gemineraliseerd bot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Immunohistochemie van (A) CD68 immunostaining macrofagen en (B) immunostaining T-cellen met CD3-positieve cellen in OS in het scheenbeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: ErbB pathway eiwitten tot expressie gebracht in UMR106 OS cellen van tibia tumoren. Lysaten uit primaire tumoren werden onderzocht op eiwitexpressie van erbb-familie signaaltransductieroute, waaronder ErbB2, EGFR, ErbB4, AKT, ERK1/2 en β2-adrenerge receptoren met actine als belastingscontrole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ratten met OS tibiale implantaten ontwikkelen meetbare tumoren tegen 3 weken na implantatie. Als ledematen met tumoren 3 weken na implantatie worden geamputeerd, is de incidentie van longmetastase aanzienlijk verminderd. Besturingssystemen zijn zowel osteolytisch als osteoblastisch. Ratten zonder amputatie ontwikkelen longmetastasen die meervoudig en variabel zijn, waargenomen door radiografie of bij obductie tegen 7 weken na implantatie. EGFR, ErbB2 en ErbB4 worden uitgedrukt in rat UMR106 OS, vergelijkbaar met het menselijke OS16,17,18. CD3 T-cellen en macrofagen worden gemakkelijk gedetecteerd in OS door immunohistochemische methoden. Jugulaire aderinjecties hebben de voorkeur boven staartader voor de levering van chemotherapie doxorubicine, een medicijn dat wordt gegeven aan OS-patiënten. De hier beschreven methode is een volledige coxofemorale amputatie. Deze procedure is een verfijning en kan worden beschouwd als vervanging van de tumorverwijderende chirurgische methode (femorale osteotomie) waarbij het bot wordt doorgesneden en een stomp voor de patiënt achterblijft8. De studie suggereert een volledige verwijdering van ledematen om de kans op postoperatieve pijn en complicaties te verminderen.
Er zijn een aantal kritische stappen in dit protocol. Ten eerste is het belangrijk om de passage van tumorcellen te noteren en om lagere passage van cellen te gebruiken voor de studies om het model consistent te houden van experiment tot experiment. De oudere passagecellen worden agressiever met de tijd in cultuur. Ten tweede zal het gebruik van de naald van de juiste grootte en de Hamilton-spuit helpen bij het correct injecteren van de cellen in het scheenbeen met een zeer klein volume van 20 μL, een volume dat als optimaal wordt bepaald en geen lekkage heeft veroorzaakt. Ten derde moet de chirurg in eerste instantie disarticulatie oefenen bij het doen van obducties op vergelijkbare oudere ratten om de mechanica van de procedure te leren. Ten vierde, voor het succes van amputatie, handhaaf thermoregulatie en beperk de operatietijd. Een ervaren chirurg kan de amputatie in 15 minuten voltooien.
Er werd waargenomen dat dei mplantatie van cellen in het scheenbeen sterk verbeterde wanneer een grotere boornaald werd gebruikt om de eerste opening te maken, gevolgd door het inbrengen van een Hamilton-spuitnaald met kleinere boring. Dit beschermt de Hamilton-spuit tegen breuk en afstomping na verloop van tijd. Hamilton spuiten kunnen volumes hebben zo klein als 10 μL. De tuberculinespuiten van 1 ml zouden niet nauwkeurig genoeg zijn voor de implantatie van 20 μL. Dezelfde Hamilton-spuit werd gebruikt voor alle ratten die op een dag werden geïmplanteerd, maar werden gewassen tussen de chirurgische ingrepen van elke rat. Vermijd het autoclaveren van de Hamilton spuitspuiten omdat ze gevoelig zijn voor breuk. Was het aan het einde van de procedure met zoutoplossing (10 keer) en vervolgens met 100% ethanol (10 keer) en laat het drogen met de zuiger verwijderd om op te slaan.
Huid en onderhuidse hechtingen werden aanvankelijk gebruikt om de incisie te sluiten, maar één rat werd de dag na de operatie met dehiscentie gevonden. Het gebruik van wondclips en chirurgische lijm om de incisie te sluiten, verbeterde de methode. Met deze verfijning hadden geen andere ratten een dergelijke postoperatieve complicatie. De opname van de radiografie van de longen door röntgenfoto's verfijnt dit model om longmetastase bij ratten aan te tonen, waardoor euthanasie tijdig is en onverwachte sterfgevallen voorkomt. Röntgenfoto's stellen ons in staat om de osteolytische en osteoblastische aard van deze ratten-besturingssystemen te bepalen, vergelijkbaar met menselijke besturingssystemen.
Een matig niveau van chirurgische expertise is noodzakelijk om de amputatieprocedure uit te voeren. De moeilijkste stap is de dissectie in de musculatuur om het coxofemorale gewricht te lokaliseren. Vergroting en goede verlichting zijn belangrijk tijdens deze stap. Chirurgische expertise kan worden bereikt met oefening op dieren die zijn geëuthanaseerd. Na ongeveer 10 ratten moet de chirurg er zeker van zijn om een ledemaat met OS van een levende rat onder anesthesie te amputeren.
Bestaande methoden om ledematen met sarcomen bij muizen en ratten te verwijderen, zijn gebaseerd op het verwijderen van het scheenbeen door het dijbeenbot en de musculatuur halverwege de schacht te snijden en de stomp te verlaten8. Hoewel dit nuttig kan zijn voor sommige onderzoeken, werd in deze studie geprobeerd de volledige beenverwijdering te verwijderen. De procedure bleek bevredigend en bood geen postoperatieve complicaties. Bij ratten met een stomp van de achterpoten kan er meer postoperatieve huid-, spier- of zenuwpijn zijn. Door een stronk achter te laten, konden ratten rond de operatieplaats reiken en toegang krijgen tot de operatieplaats. Ratten doen het heel goed na amputatie en ambuleren goed in de kooi met één achterpoot.
Voordelen van volledige amputatie van ledematen zijn het verwijderen van de primaire tumor voordat deze te groot en pijnlijk wordt voor de rat. Belangrijk is dat verwijdering van de primaire tumor zal helpen bij het beheersen van primaire tumormetastase naar de longen. Ratten met amputatie kunnen verder worden bestudeerd om de werkzaamheid van nieuwe therapieën op circulerende tumorcellen in het bloed of in de micrometastasen in haarvaten van de longen of andere botten te testen.
Er is een aanzienlijke behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe kankertherapieën voor OS en andere sarcomen, met name therapeutica die medicamenteuze activiteit hebben tegen gemetastaseerde progressie. Vergeleken met de nieuwe therapieën die voor andere kankers zijn ontwikkeld, zijn de therapieën voor OS helaas in vele decennia niet vooruitgegaan. Als reactie op dit probleem kwam een bijeenkomst van belangrijke leiders en experts op het gebied van os en metastase bijeen om richtlijnen te ontwikkelen voor een betere ontwikkeling van os-geneesmiddelen19. Volgens de suggesties van het panel werden studies opgezet om het preklinische model van de rat te verbeteren, een minder bekend model van OS. Samenvattend, amputatie en beeldvorming verfijnt het preklinische model van ratten voor verder gebruik door de sarcoomonderzoeksgemeenschap. De amputatieprocedure zal een verbeterde overleving van de patiënt gedurende meerdere maanden mogelijk maken, waardoor de werkzaamheid van nieuwe behandelingen op micrometastasen of slapende tumoren kan worden geëvalueerd of om te testen op toxiciteit van behandelingen met een model met een betere levensduur.
Samenvattend bieden we het voordeel van dit OS-model. Immunocompetente SD-gefokte ratten worden gebruikt om een syngenetisch model te bieden met geïmplanteerde UMR106 OS-cellijn geïsoleerd uit een SD-rat OS. De primaire en gemetastaseerde tumor is histologisch vergelijkbaar met OS bij mensen. Juveniele mannelijke en vrouwelijke ratten worden gebruikt voor UMR106 tumorimplantatiestudies die pediatrisch sarcoom modelleren. Orthotopische plaatsing van geïmplanteerde cellen gebeurt direct in het scheenbeen voor een relevante tumormicro-omgeving. De primaire tumor metastaseert naar de longen en de metastasen kunnen worden gevolgd door in vivo beeldvorming met röntgenmethode. De rat OS drukt eiwitten uit die gemeenschappelijk zijn met menselijke OS, zoals ErbB2. In vergelijking met het honden-OS maakt het rattenmodel het mogelijk om grotere aantallen dieren tegelijkertijd te gebruiken. Ratten zijn 10 keer groter dan muizen voor het gemak van tibiale injecties, chirurgie, beeldvorming, bloedafnames en biopsie. De levensduur van ratten is meer verzekerd met amputatie en dit model kan neoadjuvante therapie, amputatie en adjuvante therapie combineren, waardoor een verbeterde overleving van de patiënt mogelijk is, waardoor de effectiviteit van behandelingen op micrometastasen of slapende tumoren kan worden geëvalueerd. Off-target toxiciteitsevaluatie kan ook worden beoordeeld in dit model, waarbij ratten kunnen worden behandeld met kankertherapie zoals doxorubicine en op lange termijn kunnen worden gecontroleerd op door doxorubicine geïnduceerde cardiale toxiciteit of herhaling van OS. Dit zou het testen van cardio-beschermingsmiddelen in een model met OS mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen openbaarmaking te verklaren.
Acknowledgments
NIH-financiering via het National Cancer Institute, subsidie # CA228582. Shun Ishiyama ontvangt momenteel een subsidie van Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B.
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P.
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
