Summary
Qui, viene descritto un impianto ortotopico singenico seguito da una procedura di amputazione dell'osteosarcoma con metastasi polmonari spontanee che può essere utilizzato per l'indagine preclinica della biologia delle metastasi e lo sviluppo di nuove terapie.
Abstract
Il più recente progresso nel trattamento dell'osteosarcoma (OS) si è verificato nel 1980 quando la chemioterapia multi-agente ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza globale rispetto alla sola chirurgia. Per affrontare questo problema, lo scopo dello studio è quello di perfezionare un modello meno noto di OS nei ratti con un approccio chirurgico istologico, di imaging, biologico, di impianto e amputazione completo che prolunga la sopravvivenza. Abbiamo usato un modello di ratto singenico Sprague-Dawley (SD) immunocompetente e surclassato con linea cellulare UMR106 OS impiantata (proveniente da un ratto SD) con impianti di tumore tibiale ortotopico in ratti maschi e femmine di 3 settimane per modellare il sistema operativo pediatrico. Abbiamo scoperto che i ratti sviluppano tumori polmonari primari e metastatici riproducibili e che le amputazioni degli arti a 3 settimane dopo l'impianto riducono significativamente l'incidenza di metastasi polmonari e prevengono morti inaspettate. Istologicamente, le OS primarie e metastatiche nei ratti erano molto simili alla OS umana. Usando metodi immunoistochimici, lo studio mostra che la OS di ratto è infiltrata con macrofagi e cellule T. Un'indagine sull'espressione proteica delle cellule OS rivela che questi tumori esprimono chinasi della famiglia ErbB. Poiché queste chinasi sono anche altamente espresse nella maggior parte dei sistemi operativi umani, questo modello di ratto potrebbe essere utilizzato per testare gli inibitori della via ErbB per la terapia.
Introduction
L'osteosarcoma (OS) è il tumore osseo primario più comune nei bambini, negli adolescenti e nei giovani adulti. Il più recente progresso nel trattamento della OS si è verificato nel 1980 quando la chemioterapia multi-agente ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza globale rispetto alla sola chirurgia1. La OS si sviluppa durante la rapida crescita ossea, che si verifica in genere nelle ossa tubolari lunghe come femore, tibia e omero. Sono caratterizzati da un aspetto osteolitico, osteoblastico o misto con notevole reazione periostale2. La chemioterapia e la resezione chirurgica possono migliorare l'esito per i pazienti con una sopravvivenza a 5 anni per il 65% deipazienti 2,3. Sfortunatamente, i pazienti con OS di alto grado con malattia metastatica hanno una sopravvivenza del 20%. La OS invade a livello regionale e metastatizza principalmente ai polmoni o ad altre ossa ed è più diffusa nei maschi. Il bisogno più impellente per questi giovani pazienti è una nuova terapia che prevenga ed elimini la vitalità delle metastasi a distanza.
I modelli pre-clinici della OS sono stati esaminati4,5,6,7 e sono stati sviluppati pochi modelli immunocompetenti disponibili che utilizzano l'amputazione della OS ortotopica. Nel 2000, un modello importante è stato sviluppato utilizzando topi BALB / c con OS singenico ortotopico e amputazione8. Rispetto a questo modello murino, il modello di ratto si basa su animali geneticamente allevati e 10 volte più grandi che portano ad alcuni vantaggi. Il modello umR106 di ratto è stato sviluppato da un sistema operativo indotto da 32P in un ratto Sprague Dawley (SD), che è stato derivato in una linea cellulare9. Nel 2001, l'impianto ortotopico di UMR106-01 è stato descritto per la prima volta in tibie impiantate di topi atimici con sviluppo rapido e coerente del tumore primario e caratteristiche radiologiche e istologiche in comune con la OS nell'uomo. Le metastasi polmonari si sono sviluppate e dipendevano dal posizionamento ortotopico di UMR106 nel microambiente osseo10. Nel 2009, Yu et al.11 hanno stabilito un modello di ratto con sistema operativo ortotopico del femore riproducibile utilizzando cellule UMR106 in ratti SD maschi più grandi. Il successo degli impianti tumorali e il tasso di metastasi polmonari nei ratti senza amputazione erano simili ai dati qui presentati. In questo studio, è stata eseguita un'amputazione aggiuntiva al modello utilizzando ratti giovani, il che ha suggerito che i tempi di rimozione del tumore primario sono cruciali nella modellazione della OS, in particolare in relazione alla progressione metastatica. Con questo perfezionamento, l'amputazione e l'imaging in vivo migliorano questo modello per gli studi pre-clinici per la valutazione di nuovi farmaci per la OS.
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Protocol
Tutte le procedure e gli esperimenti che coinvolgono i ratti sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Il protocollo di coltura cellulare UMR-106 della linea cellulare SD rat OS
- Cellule di coltivazione in DMEM, integrate con il 10% (v/v) di FBS, penicillina (10 U/mL)-streptomicina (10 U/mL) a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2. Eseguire esperimenti utilizzando celle con passaggi di 2-812.
2. Iniezione intratibiale del protocollo delle cellule OS
NOTA: le ratte SD gravide accoppiate nel tempo partoriscono nella struttura animale e a 3 settimane di età vengono utilizzate cucciolate (poiché la linea cellulare UMR 106 è sinergica con i ratti SD, non è necessaria alcuna irradiazione).
- Induzione
- Posizionare il ratto in una camera di induzione di medie dimensioni e indurre l'anestesia con il 2% -3% di isoflurano. Monitorare continuamente l'animale per la profondità dell'anestesia di riflesso al pizzico della punta, alla frequenza respiratoria e al carattere.
- Inserire il naso nel naso. Fissare con nastro adesivo, se necessario.
- Rimuovere i peli sulla gamba destra fino all'addome ventrale e dorsale inferiore con tagliacapelli o utilizzare un agente depilatorio. Posizionare il ratto in posizione supina.
- Strofinare l'area chirurgica in modo asettico utilizzando etanolo al 70% e diluire clorexidina acetato o betadina diluita. Inizia intorno all'area del ginocchio e strofina con un movimento circolare sia prossimale che distale. Ripetere questo passaggio tre volte. Nessun drappo viene utilizzato per l'impianto del tumore.
- Applicare lubrificante per gli occhi in entrambi gli occhi del ratto per prevenire l'essiccazione corneale causata dall'anestesia. Posizionare il topo su una piastra riscaldante a bassa temperatura. Assicurarsi che il ratto abbia una temperatura corporea normale (37 °C) e una frequenza respiratoria normale.
- Chirurgia
- Accendere l'isoflurano a ~ 1,5% -2% (per manutenzione). Assicurarsi che l'animale si trovi su un piano adeguato di anestesia per mancanza di un riflesso del pizzico della punta. In caso contrario, aumentare la percentuale di isoflurano al 2,5%.
- Contrassegnare un ago sterile (circa 22 G) a 10 mm dalla punta per la guida della profondità da inserire.
- Inserire l'ago 10 mm verso il basso nella diafisi della tibia inserendo il ginocchio piegato nel mezzo del plateau tibiale, estendendo l'ago attraverso la metafisi nella diafisi usando un leggero movimento simile a un trapano per fare un'apertura. Rimuovere l'ago.
- Caricare la sospensione cellulare nella siringa Hamilton direttamente prima dell'iniezione nella tibia. Per fare questo, mescolare delicatamente le cellule prima di aspirare nella siringa poiché la gravità fa sì che le cellule si depositino sul fondo del tubo.
NOTA: le celle possono essere conservate in un tubo da 1,5 a 2 mL (a temperatura ambiente) prima di aspirare nella siringa Hamilton (100 μL) dopo un'attenta miscelazione. Le cellule possono essere mantenute a temperatura ambiente per 2-3 ore durante la procedura di impianto. Controllare sempre la vitalità cellulare delle cellule nel tubo prima e poi dopo la sessione di impianto. L'esclusione blu di trypan è il metodo più semplice per la valutazione della vitalità cellulare. - Una volta attraversato l'osso con il primo ago, inserire un secondo ago (di diametro più piccolo contrassegnato anche a 10 mm) ago attaccato alla siringa Hamilton da 100 μL caricata con cellule. Assicurarsi di inserire l'ago fino al segno di 10 mm nello stesso foro che si estende nella diafisi.
- Scaricare delicatamente 20 μL di 75.000 cellule OS in sospensione in PBS nella diafisi e nella cavità midollare.
NOTA: l'ago non deve oscillare nell'osso e deve sentirsi sicuro. Se l'ago si muove facilmente, la corteccia potrebbe essere stata attraversata alla diafisi. Ripetere nuovamente l'inserimento per ottenere un posizionamento più solido prima dell'iniezione delle cellule. - Rimuovere l'ago hamilton dall'osso.
NOTA: Se si forma una piccola goccia di sangue, applicare una leggera pressione. Se si forma una chiara goccia di liquido nel sito di puntura, l'ago potrebbe non essere stato esteso abbastanza lontano nell'osso e la sospensione delle cellule tumorali potrebbe essere fuoriuscita attraverso il foro. Registra questo nelle note ma in generale, l'impianto del tumore avrà successo. Con l'esperienza, la procedura di impianto del tumore dovrebbe richiedere 5 minuti per ratto. Con l'esperienza, l'impianto tumorale delle cellule nell'osso diventerà più facile. L'iniezione accidentale di cellule nel muscolo intorno all'osso, non può portare al microambiente tumorale necessario per le metastasi polmonari.
- Guarigione
- Assicurarsi che il ratto sia normotermico. Metti il topo in una gabbia con una piastra riscaldante posta sotto la gabbia per il recupero.
- Dopo essere completamente sveglio, mobile e respirando bene, iniettare ai ratti buprenorfina (1,0-1,2 mg/kg SC).
NOTA: Per ottenere l'accesso alla buprenorfina, verificare con l'istituzione per vedere le opzioni per l'approvazione attraverso il personale veterinario per effettuare l'ordine. - Sposta i ratti in gabbie pulite e monitora una volta al giorno, ogni settimana.
3. Misurazione e monitoraggio
- Misurare la dimensione del tumore 9-10 giorni dopo l'impianto e poi ogni 2 giorni fino a 3 settimane dopo l'impianto per stabilire un tasso di crescita. Misurare il diametro massimo della tibia utilizzando una pinza elettronica o manuale. Memorizza i dati in un foglio di calcolo con una formula per calcolare il volume del tumore. Misurare la controlaterale (non tibia impiantata) come linea di base.
NOTA: I diametri degli arti posteriori impiantati sono usati come surrogato per le dimensioni del tumore. Gli arti posteriori sono misurati perpendicolarmente all'asse lungo della tibia al diametro maggiore per due misurazioni, ventrale/dorsale e media/laterale sull'arto. Il volume tumorale stimato è calcolato dalla formula11: Volume tumorale (mm3) = diametro maggiore (mm) x diametro più piccolo (mm)2/2. - Considerare i ratti per l'amputazione di sopravvivenza o il trattamento chemioterapico quando i tumori si avvicinano a 15 mm nella dimensione più grande o 3 settimane dopo l'impianto del tumore. L'arto controlaterale misura circa 7-9 mm nella maggior parte dei ratti a questa età.
4. Somministrazione endovenosa di doxorubicina
- Anestetizzare i ratti con il 2% di isoflurano. Preparare la pelle sulla vena giugulare con tre lavaggi chirurgici usando betadina e alcol come descritto13.
- Sotto un'attenta dissezione, visualizzare la vena giugulare destra o sinistra. Inserire l'ago nel muscolo sovrastante e quindi dirigere verso la testa del ratto nel lume della vena giugulare come viene visualizzato nella vena giugulare anteriore al muscolo pettorale.
- Quando l'ago viene inserito nella vena giugulare, prelevare delicatamente il sangue nella siringa per garantire il corretto inserimento. È possibile credere che l'ago sia attraverso la vena, ma l'ago è sotto la vena e non nel lume. Se la vena giugulare diventa troppo piccola per le iniezioni quando si seziona contundente per esporre la vena giugulare, utilizzare l'altra vena giugulare per l'iniezione.
- Iniettare doxorubicina (2 mg/kg) lentamente per 1 minuto in un volume di 100-150 μL. La soluzione può essere visualizzata per via endovenosa nella vena giugulare durante il parto.
- Iniettare volumi simili di soluzione salina normale nei ratti di controllo.
- Rimuovere l'ago e applicare una leggera pressione sulla vena con una garza sterile.
- Chiudere l'incisione cutanea utilizzando 3-4 clip per ferite. Rimuovere le clip a 7-10 giorni dopo l'iniezione.
NOTA: i ratti di solito non cercano di rimuovere le clip metalliche, ma mordono e rimuovono le suture. Il metodo di iniezione giugulare è preferibile alle iniezioni della vena della coda per la doxorubicina poiché qualsiasi farmaco che fuoriesce al di fuori del vaso provoca necrosi della coda che può richiedere l'amputazione della coda.
5. Protocollo di amputazione dell'arto posteriore
- Induzione
- Posizionare il ratto in una camera di induzione di medie dimensioni e indurre l'anestesia con il 2% -4% di isoflurano. Monitorare continuamente il ratto per la profondità dell'anestesia.
NOTA: La camera di induzione viene scavata in un contenitore di carbone e tutti gli altri gas vengono rimossi da un tavolo a tiraggio basso utilizzato per la chirurgia. - Inserire il naso in un naso. Fissare con nastro adesivo, se necessario.
NOTA: questa procedura viene eseguita su una tabella di down-draft per eliminare i gas volatili in eccesso (cioè isoflurano). - Rimuovere i peli sulla gamba destra fino all'addome ventrale e dorsale inferiore con tagliacapelli o utilizzare un agente depilatorio. Posizionare il ratto in posizione supina.
- Strofinare l'area chirurgica in modo asettico utilizzando etanolo al 70% e diluire clorexidina acetato o betadina diluita. Preparare la pelle per l'intervento chirurgico dal centro del polpaccio all'area della pelle appena sopra l'articolazione dell'anca dell'addome inferiore destro. Strofinare la gamba prossimale e l'area distale circonferenzialmente. Ripetere questo passaggio tre volte.
- Applicare il lubrificante per gli occhi in entrambi gli occhi del ratto. Assicurarsi che il ratto abbia una temperatura corporea normale (37 °C) e segni vitali normali. Monitorare e regolare la temperatura corporea utilizzando una piastra riscaldante collegata a un monitor della sonda di temperatura rettale.
- Posizionare il ratto in una camera di induzione di medie dimensioni e indurre l'anestesia con il 2% -4% di isoflurano. Monitorare continuamente il ratto per la profondità dell'anestesia.
- Chirurgia
- Attivare l'isoflurano all'1,5%-3% (manutenzione). Monitorare la profondità anestetica, compresa la reazione al pizzico della punta, la frequenza respiratoria e il carattere. Regolare la velocità di isoflurano secondo necessità per mantenere un piano di anestesia appropriato.
NOTA: La frequenza respiratoria durante l'anestesia dovrebbe essere compresa tra 50-100 respiri al minuto. Respiri profondi e poco frequenti sono un'indicazione che il ratto è troppo profondamente anestetizzato. - Apri confezioni e tende sterili per strumenti e indossa guanti sterili. Fare attenzione a mantenere la sterilità per tutta la durata della procedura. Gli strumenti chirurgici sterili di base necessari includono, supporto per la lama del bisturi, pinza, emostati, portaago, forbici e applicatore di clip per ferite.
- Tirare la gamba del ratto attraverso lo sfiato del drappo chirurgico sterile. Assicurarsi che l'animale si trovi su un piano adeguato di anestesia tramite il riflesso del pizzico della punta.
- Usando una lama di bisturi o forbici chirurgiche, fare un'incisione cutanea circonferenziale appena prossimale al soffocamento (articolazione del ginocchio).
- Deglove l'arto posteriore usando una garza o una dissezione smussata per esporre l'arteria femorale e la vena sulla superficie ventrale-mediale dell'arto posteriore.
- Ligate i vasi usando 4-0 suture assorbibili a livello del femore medio e transetto distalmente.
- Blocca la vena distalmente per ridurre le perdite durante la dissezione muscolare.
NOTA: La muscolatura circonferenziale sarà transettata distale al livello della legatura del vaso dell'arteria femorale e dei muscoli elevati dal femore al livello dell'articolazione coxofemorale. - Usando la dissezione smussata, abdicare l'articolazione dell'anca con rotazione laterale verso l'esterno.
- Trova la testa del femore e disarticolatela dall'acetabolo. Tagliare qualsiasi tessuto rimanente mantenendo la gamba attaccata al corpo.
- Dare un blocco di spruzzi all'acetabolo e al nervo sciatico con circa 6 mg / kg di Ropivacaina.
- Chiudere la muscolatura sopra l'acetabolo usando una semplice sutura interrotta (4-0, sutura riassorbibile).
NOTA: Ulteriore 0,5% di bupivacaina o lidocaina (0,15-0,2 mg totali) può essere iniettato in diversi siti lungo lo strato muscolare chiuso (infiltrazione locale/blocco schizzi). - Opporsi e chiudere i bordi della pelle utilizzando clip avvolte poste a parte ogni 5-10 mm.
- Attivare l'isoflurano all'1,5%-3% (manutenzione). Monitorare la profondità anestetica, compresa la reazione al pizzico della punta, la frequenza respiratoria e il carattere. Regolare la velocità di isoflurano secondo necessità per mantenere un piano di anestesia appropriato.
- Guarigione
- Posizionare il ratto in una gabbia di recupero pulita con supporto termico utilizzando una piastra riscaldante posta sotto la gabbia.
NOTA: Per prevenire l'ipertermia, la piastra riscaldante non deve essere a diretto contatto con l'animale e non deve superare i 40 °C. - Monitorare l'animale fino a quando non si riprende completamente ed è normotermico (37,5-39 °C).
NOTA: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non è completamente cosciente e severamente sdraiato e si muove facilmente intorno alla gabbia. - Dopo essere completamente sveglio, mobile e respirando bene, iniettare ai ratti buprenorfina (1,0-1,2 mg/kg SC).
NOTA: La somministrazione di buprenorfina in un ratto anestetizzato può compromettere il recupero. - Somministrare 10 mL di soluzione di Ringer lattato a caldo per via sottocutanea tra le scapole.
- Sposta i ratti nella gabbia pulita e riunisciti con i conspecifici.
- Monitorare tutti gli animali due volte al giorno per il mese successivo per segni di dolore e angoscia, tra cui piloerezione, postura curva o inappetenza o segni di infezione del sito di incisione, tra cui eritema, secrezione purulenta o deiscenza della ferita.
NOTA: Ad oggi non abbiamo osservato segni clinici (come infezioni) a seguito di recupero post-operatorio in nessuno degli animali. Solo un ratto ha avuto una deiscenza con punti di sutura, dopo di che sono state utilizzate clip per ferite per chiudere le ferite senza ulteriori problemi. - Somministrare buprenorfina o meloxicam ad animali che presentano segni clinici di dolore a dosi pubblicate in consultazione con un veterinario di animali da laboratorio.
- Somministrare antibiotici (cioè cefalosporina) ad animali che presentano segni clinici di dolore a dosi pubblicate in consultazione con un veterinario di animali da laboratorio.
NOTA: Tutti gli animali che mostrano segni prolungati di dolore o angoscia che non migliorano con analgesici o animali che mostrano segni di infezione che non rispondono agli antibiotici devono essere sottoposti a eutanasia umana.
- Posizionare il ratto in una gabbia di recupero pulita con supporto termico utilizzando una piastra riscaldante posta sotto la gabbia.
6. Imaging con raggi X
- Dopo l'impianto del tumore, visualizzare le tibie e i polmoni in modo non invasivo per rilevare la crescita del tumore utilizzando i raggi X con una macchina progettata per i roditori.
- Anestetizzare i ratti come fatto in precedenza.
- Scatta immagini con ingrandimento 3x per 6 s a 25 kV.
- Elaborare la pellicola utilizzando il processore a raggi X. Anche le radiografie possono essere scansionate digitalmente.
7. Procedura di autopsia
- Eutanasia dei ratti con CO2. Confermare la morte per mancanza di battito cardiaco e prelevare immediatamente 3 ml di sangue dal cuore per campioni di siero o plasma.
- Aprire il torace e l'addome per l'esame.
- Isolare la trachea e cannulare con un catetere (18 G). Per fissare il catetere nella trachea, legare una sutura di seta attorno a entrambe le trachee con il catetere.
- Collegare il catetere per infusione a una siringa da 3 o 5 ml. Infondere formalina o soluzione salina per gonfiare delicatamente i lobi polmonari per migliori campioni di istologia. Durante l'infusione, i polmoni si gonfiano e consentono una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari.
- Esaminare, sezionare e pesare tutti gli organi toracici e addominali selezionati (come fegato, reni).
- Fissare gli organi in formalina per istopatologia o congelare su ghiaccio secco, 2-metilbutano o azoto liquido.
- Per la valutazione dell'espressione proteica utilizzando western blot, fare lisati di tessuti congelati. Gli anticorpi che reagiscono con i tessuti di ratto sono dettagliati13.
8. Immunoistochimica
- Elaborare il tessuto primario del sistema operativo, incorporarlo nella paraffina e sezionarlo per la colorazione immunoistochimica.
- Recuperare l'antigene dopo la deparaffinazione utilizzando tampone citrato (pH 6,0). Incubare in 0,3% H2O2 in metanolo per 30 minuti per estinguere la perossidasi endogena.
- Bloccare le sezioni di paraffina spesse 5 μm usando siero normale.
- Incubare con anticorpi primari anti-CD68 e CD3 (vedi tabella) durante la notte a 4 °C.
- Risciacquare le sezioni in PBS e incubarle in polimero HRP utilizzando un kit di rilevamento.
NOTA: L'immunocolorazione è stata sviluppata con diaminobenzidina come cromogeno.
9. Western blotting
- Lisare le cellule UMR-106 in 200-300 μL di tampone di lisi14 per eseguire l'elettroforesi su gel standard e il western blotting.
- Utilizzare gel Bis-Tris dal 4% al 12%.
- Incubare in anticorpi primari anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actina o anti-topo β2-AR (vedi tabella) e anticorpo secondario legato alla perossidasi di rafano.
- Aggiungere il substrato chemiluminescente. Esporre le membrane alla pellicola a raggi X.
NOTA: i livelli di β-actina vengono utilizzati come controlli di carico.
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Representative Results
Per questi studi sul sistema operativo vengono utilizzati ratti immunocompetenti SD di razza SD, che offre un modello animale con un sistema immunitario intatto. Abbiamo utilizzato la linea cellulare UMR106 di ATCC, sviluppata da cellule che erano inizialmente isolate da un sistema operativo da un ratto SD. Abbiamo impiantato le cellule in ratti SD, fornendo così un modello singenico per OS. Le cellule UMR106 vengono impiantate nella tibia di ratti SD maschi e femmine di 3 settimane, simulando un modello di OS pediatrico. Inoltre, l'impianto ortotopico di cellule UMR106 direttamente nella metafisi/diafisi della tibia fornisce un microambiente tumorale rilevante.
Quando si impiantano cellule tumorali, un ago deve essere inserito correttamente attraverso il plateau tibiale (Figura 1) con l'angolo corretto (parallelo all'albero osseo) estendendo la punta dell'ago di circa 10 mm nella cavità centrale dell'osso. Con questa procedura, il 95% (52/55) dei ratti ha sviluppato tumori nelle tibie distali al ginocchio. Con l'esperienza dell'iniezione tibiale, il 100% dei ratti ha sviluppato tumori. In un gruppo di ratti che non sono stati amputati, i volumi medi di tumore nei maschi erano 504 mm3 a 3 settimane e 1195 mm3 a 5 settimane dopo l'impianto. Nelle femmine, i volumi tumorali sono in media di 285 mm3 a 3 settimane e 495 mm3 a 5 settimane dopo l'impianto.
Sono state confrontate due coorti di ratti, compresi quelli con amputazione (23 ratti) (Figura 2) e quelli senza amputazione (29 ratti). Entrambe le coorti sono state eutanasizzate a 7 settimane dopo l'impianto per esaminare le metastasi tumorali ai polmoni. Nel gruppo di amputazione (3/23) i ratti hanno sviluppato metastasi polmonari. Questi tre ratti sono morti o sono stati sottoposti a eutanasia entro 24 ore dall'intervento chirurgico a causa di complicazioni post-operatorie. Due ratti sono morti per anestesia prolungata mentre il chirurgo stava imparando il metodo. Un ratto ha sviluppato una deiscenza ed è stato sottoposto a eutanasia il giorno seguente. I polmoni di questi tre ratti sono stati valutati e tre piccole metastasi (>1 mm) sono state trovate istologicamente. I 20 ratti sopravvissuti non avevano metastasi polmonari 7 settimane dopo l'impianto. Ciò ha indicato che le amputazioni post-impianto di 3 settimane sono adeguate per ridurre il numero di ratti con metastasi polmonari. In un secondo gruppo di 29 ratti che non avevano la procedura di amputazione, 26/29 ratti avevano metastasi polmonari coerenti con i dati precedentemente pubblicati11. Non abbiamo visto alcun modello nella dimensione o nel numero di metastasi in questi ratti. La maggior parte dei ratti ha più di 10 metastasi grossolanamente visibili di 2-7 mm di diametro che sono state facilmente campionate durante l'autopsia. Occasionalmente, i ratti avevano metastasi ancora più grandi fino a 10 mm di diametro. È importante impiantare cellule UMR106 con un basso numero di passaggi, poiché gli studi hanno dimostrato che le cellule con numero di passaggio 10 o superiore diventano più aggressive e metastatizzano già a 2-3 settimane dopo l'impianto. La ragione della natura non è nota ma la speculazione è che le cellule in coltura potrebbero sviluppare mutazioni che favoriscono le metastasi.
Oltre alla chirurgia di amputazione, un altro perfezionamento dei metodi includeva l'imaging a raggi X per la sorveglianza del tumore o all'autopsia. Questo metodo consente al ricercatore di confermare l'invasione del tumore osseo nei ratti in anestesia. Il metodo di radiografia planare può essere utilizzato anche su arti recentemente amputati o arti fissi di formalina. Il metodo è veloce (5 minuti per ratto) e poco costoso ($ 2-5 / ratto) rispetto alla tomografia computerizzata (CT). Per il monitoraggio in vivo, richiede che i ratti siano anestetizzati durante l'imaging. La Figura 3 mostra la morfologia dettagliata osservata dall'imaging a raggi X di due arti precedentemente amputati. Questo metodo illumina la natura osteolitica e osteoblastica di questi tumori. Si noti l'interruzione della normale architettura corticale ossea della tibia e del perone in entrambi gli esempi (frecce bianche). La Figura 4 illustra la morfologia radiografica dei polmoni con e senza metastasi. L'imaging a raggi X può rivelare rapidamente al laboratorio la necessità dell'eutanasia per prevenire inutili morti spontanee.
I tumori primari e metastatici al polmone sono istologicamente simili alla OS umana che presentano morfologia tumorale sia osteolitica che osteoblastica. Nella OS di ratto, la morfologia del tumore sia osteolitico che osteoblastico è confermata dall'istopatologia dell'arto amputato in Figura 5 e Figura 6. Si noti che l'osso corticale è assente in questo esempio e anche l'osso adiacente viene sostituito o fortificato da un nuovo osso tessuto (esostosi) orientato perpendicolarmente all'albero esistente della corteccia. Isole di osteoidi immaturi (materiale extracellulare amorfo) sono mostrate all'interno dell'esempio tumorale. Inoltre, la morfologia microscopica delle metastasi polmonari, alcune con osso mineralizzato, e gli emboli vascolari tumorali sono mostrati nella Figura 7.
L'amputazione degli arti con OS aumenta la sopravvivenza nei ratti. I ratti possono morire spontaneamente a causa di metastasi polmonari ospitate per più di 7 settimane dopo l'impianto. L'uso dell'amputazione può consentire l'ulteriore indagine della terapia del cancro standard o mirata in questo modello. L'allungamento del tempo tra l'impianto del tumore e l'amputazione aumenterà l'incidenza delle metastasi.
La doxorubicina è un agente chemioterapico usato per trattare la OS nell'uomo. Nei ratti, la doxorubicina può essere somministrata tramite iniezioni giugulari13 o un catetere15 come descritto qui. L'iniezione giugulare richiede 5-10 minuti per ratto, ma assicura la somministrazione della dose nella vena esposta. Nel complesso, le iniezioni giugulari sono molto più riproducibili rispetto alle iniezioni della vena della coda di ratto. Se la doxorubicina fuoriesce nel derma durante le iniezioni della vena della coda, può verificarsi necrosi della coda e prevenire ulteriori trattamenti. In questo studio, cinque ratti sono stati trattati con una dose di 2 mg/kg di doxorubicina ed eutanasia 48 ore dopo l'iniezione per indagare sulla morte cellulare nei tumori come mostrato nella Figura 5A,B.
Cinque ratti di controllo trattati con soluzione salina sono stati anche valutati per selezionare anticorpi che possono essere utilizzati per immunostain le cellule immunitarie nei sistemi operativi di ratto. Qui, due anticorpi sono stati testati per la reattività immunitaria. Per gli studi di immunoistochimica, i tumori sono stati fissati in formalina per 48-72 ore e poi spostati al 70% di etanolo per ridurre il cross-linking proteico che si verifica nella formalina. L'immunoistochimica è stata eseguita per gli infiltrati delle cellule immunitarie nei tumori primari della OS e immunocolorata per i macrofagi (CD68) e le cellule T (CD3). La Figura 8 mostra due esempi di immunostains di infiltrati di cellule immunitarie all'interno del microambiente tumorale.
Sono stati inoltre esplorati i potenziali bersagli per l'intervento terapeutico. Dopo l'amputazione degli arti con tumori, i campioni di OS di ratto sono stati congelati per il futuro isolamento proteico. In questo studio, abbiamo scoperto che le cellule UMR106 esprimono le proteine del percorso della famiglia ErbB. Western blots eseguiti su lisati proteici cellulari UMR106 dimostrano l'espressione di ErbB2, EGFR, ErbB4 e altre proteine che interagiscono con queste vie (Figura 9).
Figura 1: Tibia con ago per l'impianto del tumore inserito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Tibia durante la procedura di amputazione con la pelle rimossa (A), arteria femorale esposta e vena (B), con muscolo elevato dal femore (C), e in un ratto 3 settimane dopo l'intervento chirurgico di amputazione (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Radiografia a raggi X delle zampe destre dopo amputazione (ex vivo) da due ratti con OS. Si noti la natura osteolitica e osteoblastica del tumore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini a raggi X dei polmoni del ratto. (A) senza metastasi polmonari. (B) con metastasi polmonari della OS. (C) correlazione alla patologia grossolana delle metastasi in un polmone gonfiato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: (A) Istopatologia della OS con il 90% delle cellule che mostrano morte cellulare nel tumore della tibia 48 ore dopo una dose di 2 mg/kg di doxorubicina. (B) Morte delle cellule tumorali (freccia) nella OS primaria tibiale a 48 ore dopo una dose di 2 mg/kg di doxorubicina. Si noti che l'angolo in alto a destra e a sinistra ha celle vitali. (C) Invasione della OS nell'osso corticale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: (A)Istopatologia della OS che ha sostituito le cellule del midollo osseo e si è infiltrata nelle cortecce della tibia. Si noti la nuova crescita ossea reattiva accompagnata in quanto è stratificata all'esterno e perpendicolare alla corteccia preesistente. (B)Esame di potenza superiore delle cellule tumorali OS adiacenti a un'isola di osso. (C) Esame di maggiore potenza delle cellule OS incorporate nella matrice extracellulare da rosa a blu (osteoide). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: (A) Metastasi polmonari multiple in ratto con impianto di tumore alla tibia. (B)Cellule tumorali OS in un embolo in un piccolo vaso di ramo dell'arteria polmonare adiacente a un bronchiolo sotto il vaso. (C) Alcune metastasi polmonari contengono isole di osso mentre altre metastasi sono più cellulari. (D) Maggiore potere delle metastasi con cellule OS mescolate con isole di osso mineralizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immunoistochimica dei macrofagi (A) CD68 immunocoloranti e (B) immunocoloranti cellule T che mostrano cellule CD3 positive nella OS nella tibia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Proteine della via ErbB espresse in cellule UMR106 OS da tumori della tibia. I lisati da tumori primari sono stati esaminati per l'espressione proteica dalla via di trasduzione del segnale della famiglia ErbB, inclusi I recettori ErbB2, EGFR, ErbB4, AKT, ERK1/2 e β2-adrenergici con actina come controllo del carico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I ratti con impianti tibiali OS sviluppano tumori misurabili entro 3 settimane dopo l'impianto. Se gli arti con tumori vengono amputati 3 settimane dopo l'impianto, l'incidenza di metastasi polmonari si riduce in modo significativo. I sistemi operativi sono sia osteolitici che osteoblastici. I ratti senza amputazione sviluppano metastasi polmonari multiple e di dimensioni variabili, osservate mediante radiografia o necroscopia entro 7 settimane dall'impianto. EGFR, ErbB2 ed ErbB4 sono espressi in OS UMR106 di ratto, simile a OS16umano,17,18. Le cellule T CD3 e i macrofagi sono facilmente rilevabili nella OS con metodi immunoistochimici. Le iniezioni di vena giugulare sono preferite alla vena della coda per la somministrazione di doxorubicina chemioterapica, un farmaco somministrato ai pazienti con OS. Il metodo qui descritto è un'amputazione coxofemorale completa. Questa procedura è un perfezionamento e potrebbe essere considerata per sostituire il metodo chirurgico di rimozione del tumore (osteotomia femorale) in cui l'osso viene tagliato lasciando un moncone per il paziente8. Lo studio suggerisce una rimozione completa degli arti per ridurre la probabilità di dolore e complicanze post-chirurgiche.
Ci sono una serie di passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, è importante notare il passaggio delle cellule tumorali e utilizzare il passaggio inferiore delle cellule per gli studi per mantenere il modello coerente da esperimento a esperimento. Le cellule di passaggio più vecchie diventano più aggressive con il tempo in coltura. In secondo luogo, l'uso dell'ago di dimensioni appropriate e della siringa Hamilton aiuterà a iniettare correttamente le cellule nella tibia ad un volume molto piccolo di 20 μL, un volume determinato come ottimale e non ha causato perdite. In terzo luogo, il chirurgo deve inizialmente praticare la disarticolazione quando esegue necropsie su ratti di età simile per apprendere la meccanica della procedura. Quarto, per il successo dell'amputazione, mantenere la termoregolazione e limitare il tempo di intervento chirurgico. Un chirurgo esperto può completare l'amputazione in 15 minuti.
È stato osservato che ilmpianto di cellule nella tibia è notevolmente migliorato quando è stato utilizzato un ago da foro più grande per fare l'apertura iniziale seguita dall'inserimento di un ago per siringa Hamilton più piccolo. Questo protegge la siringa Hamilton da rotture e ottundimenti nel tempo. Le siringhe Hamilton possono avere volumi fino a 10 μL. Le siringhe da 1 mL di tubercolina non sarebbero abbastanza accurate per l'impianto di 20 μL. La stessa siringa hamilton è stata utilizzata per tutti i ratti impiantati in un giorno, ma sono stati lavati tra le procedure chirurgiche di ciascun ratto. Evitare l'autoclave delle siringhe Hamilton in quanto sono soggette a rotture. Alla fine del procedimento, lavarlo con soluzione salina (10 volte) e poi con etanolo al 100% (10 volte) e lasciarlo asciugare con lo stantuffo rimosso per conservare.
La pelle e le suture sottocutanee sono state inizialmente utilizzate per chiudere l'incisione, ma un ratto è stato trovato con deiscenza il giorno dopo l'intervento chirurgico. L'uso di clip per ferite e colla chirurgica per chiudere l'incisione ha migliorato il metodo. Con questa raffinatezza, nessun altro ratto ha avuto una tale complicazione post-operatoria. L'inclusione della radiografia dei polmoni mediante raggi X affina questo modello per dimostrare le metastasi polmonari nei ratti consentendo l'eutanasia tempestiva e previene morti inaspettate. Le immagini a raggi X ci permettono di determinare la natura osteolitica e osteoblastica di questi sistemi operativi di ratto, simili ai sistemi operativi umani.
Un livello moderato di competenza chirurgica è necessario per eseguire la procedura di amputazione. Il passo più difficile è la dissezione nella muscolatura per localizzare l'articolazione coxofemorale. L'ingrandimento e una buona illuminazione sono importanti durante questo passaggio. L'esperienza chirurgica può essere raggiunta con la pratica su animali che sono stati eutanasizzati. Dopo circa 10 ratti, il chirurgo dovrebbe essere sicuro di amputare un arto con OS da un ratto vivo in anestesia.
I metodi esistenti per rimuovere gli arti con sarcomi nei topi e nei ratti si basano sulla rimozione della tibia tagliando l'osso del femore e la muscolatura a metà asta e lasciando il moncone8. Anche se, questo può essere utile per alcune indagini, in questo studio, è stata tentata la rimozione completa della gamba. La procedura è risultata soddisfacente e non ha offerto complicazioni post-chirurgiche. Nei ratti con un moncone dell'arto posteriore, potrebbe esserci più dolore post-chirurgico alla pelle, ai muscoli o ai nervi. Lasciando un moncone, i ratti potevano raggiungere e accedere al sito chirurgico. I ratti fanno molto bene dopo l'amputazione e deambulano bene nella gabbia con un arto posteriore.
I vantaggi dell'amputazione completa degli arti includono la rimozione del tumore primario prima che diventi troppo grande e doloroso per il ratto. È importante sottolineare che la rimozione del tumore primario aiuterà a controllare le metastasi tumorali primarie al polmone. I ratti con amputazione possono essere ulteriormente studiati al fine di testare l'efficacia di nuove terapie sulle cellule tumorali circolanti nel sangue o nelle micrometastasi nei capillari dei polmoni o di altre ossa.
C'è una sostanziale necessità di sviluppo di nuove terapie antitumorali per la OS e altri sarcomi, in particolare terapie che hanno attività farmacologica contro la progressione metastatica. Rispetto alle nuove terapie sviluppate per altri tumori, le terapie per la OS purtroppo non sono progredite in molti decenni. In risposta a questo problema, una riunione di leader chiave ed esperti in OS e metastasi convocata per sviluppare linee guida per migliorare lo sviluppo di farmaci OS19. Secondo i suggerimenti del gruppo, sono stati avviati studi per migliorare il modello pre-clinico del ratto, un modello meno noto di OS. In sintesi, l'amputazione e l'imaging perfezionano il modello pre-clinico del ratto per un ulteriore utilizzo da parte della comunità di ricerca sul sarcoma. La procedura di amputazione consentirà una migliore sopravvivenza del paziente per più mesi consentendo la valutazione dell'efficacia di nuovi trattamenti su micrometastasi o tumori dormienti o di testare la tossicità dei trattamenti con un modello con una migliore longevità.
In sintesi, forniamo il vantaggio di questo modello di sistema operativo. I ratti immunocompetenti SD surbrizzati sono utilizzati per fornire un modello sinergico con linea cellulare UMR106 OS impiantata isolata da un sistema operativo di ratto SD. Il tumore primario e metastatico è istologicamente simile alla OS nell'uomo. I ratti giovani maschi e femmine sono utilizzati per gli studi di impianto del tumore UMR106 che modellano il sarcoma pediatrico. Il posizionamento ortotopico delle cellule impiantate viene effettuato direttamente nella tibia per un microambiente tumorale pertinente. Il tumore primario metastatizza al polmone e le metastasi possono essere monitorate mediante imaging in vivo con metodo a raggi X. La OS di ratto esprime proteine in comune con la OS umana, come ErbB2. Rispetto al sistema operativo del cane, il modello di ratto consente di utilizzare contemporaneamente un numero maggiore di animali. I ratti sono 10 volte più grandi dei topi per facilità di iniezioni tibiali, chirurgia, imaging, prelievi di sangue e biopsia. La longevità dei ratti è più assicurata con l'amputazione e questo modello può combinare terapia neoadiuvante, amputazione e terapia adiuvante consentendo una migliore sopravvivenza del paziente consentendo la valutazione dell'efficacia dei trattamenti su micrometastasi o tumori dormienti. La valutazione della tossicità fuori bersaglio può anche essere valutata in questo modello in cui i ratti possono essere trattati con terapie antitumorali come la doxorubicina e monitorati a lungo termine per la tossicità cardiaca indotta da doxorubicina o la recidiva della OS. Ciò consentirebbe il test di agenti cardio-protettivi in un modello con sistema operativo.
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Disclosures
Nessuna divulgazione da dichiarare.
Acknowledgments
Finanziamento NIH attraverso il National Cancer Institute, sovvenzione # CA228582. Shun Ishiyama sta attualmente ricevendo una sovvenzione da Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
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