Summary
詳細な指示は、リアルタイムの定量的な等温核酸増幅を実行するために、多くの低コストヒーターと互換性のあるオープンソースのモジュラー蛍光計を構築するために提供されています。
Abstract
核酸を検出して定量する従来の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に依存し、アンプリコンの蛍光検出を統合した高価なサーモサイクラーを使用する必要があります。等温核酸増幅技術により、熱循環の必要性がなくなります。しかし、リアルタイムで定量的な結果を得るには、蛍光ベースの製品の検出が必要です。蛍光検出機能を内蔵したポータブル等温ヒーターが市販されています。ただし、これらのデバイスのコストは、リソース制限のある設定での普及に対する重大な障壁です。ここでは、市販のコンポーネントから構築されたモジュラー、低コストの蛍光計の設計と組み立てのためのプロトコルを説明します。コンパクトな3Dプリントハウジングに囲まれたフルオリメーターは、市販のヒートブロックの上にPCRチューブを保持するように設計されています。ここで説明したフルオリメーターは、フッ素イソチオシアネート(FITC)色素を検出するように最適化されましたが、リアルタイム核酸増幅反応でレポーターとして一般的に使用される染料で使用するためにシステムを変更することができます。このシステムの臨床的応用性は、市販キットに提供される陽性対照DNAを検出するためのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)とSARS-CoV-2 RNAの臨床的に有意義なレベルの検出のための逆転転写ループ媒介等熱増幅(RT-LAMP)の2つの等温増幅技術でリアルタイム核酸検出を行うことによって実証される。
Introduction
等温増幅技術は核酸の検出に広く用いられている。熱サイクルを必要とする従来のPCRアプローチと比較して、等温増幅は核酸増幅を単一の温度で起こすことができるので、結果の速い結果とインヒビター1、2のよりよい許容範囲を可能にする。等温増幅のもう一つの重要な利点は、計測の複雑さの軽減です。ほとんどの等温増幅反応は、例えば横流またはゲル電気泳動3,4による、蛍光モニタリングまたはエンドポイント検出による熱ブロックおよび検出モダリティ(リアルタイム検出)を必要とするのみである。リアルタイム蛍光検出は、特異的な二本鎖DNA配列の存在下で活性化する二本鎖DNAまたはクエンチ蛍光プローブの存在下で活性化する蛍光をインターカレーションすることによって生成される蛍光の検出によって達成される。
市販のベンチトップ等温フッ素計が存在する一方で、アッセイの実装に対するカスタマイズが欠けているものが多い。たとえば、多くのデバイスでは、特定の消耗品や会社が提供する消耗品を必要とするか、優先ベンダーを推奨するか、またはプロプライエタリなソフトウェアを使用して、アドバタイズされた結果を得ることができます。これらのシステムの大部分は5,000米ドル以上の費用がかかり、リソース制限のある設定での広範な使用に対する重大な障壁となっています。さらに、低資源環境のユーザーは、過酷な環境条件、スペアパーツのサプライチェーンの弱さ、メンテナンスや修理に必要な特殊なツールのために、高資源の設定のために設計された機器を維持するための課題に直面しています5.このニーズを満たすために、ここでは2つのオプション構成を備えたコンパクトな3Dプリントハウジング(図1A-C)で囲まれた既製のコンポーネントから構築されたモジュラーおよび低コストの蛍光計の設計と組み立てについて説明します。このデバイスの最初の構成は、市販のガラスフィルターと二色鏡を使用して過剰なバックグラウンドライトをブロックし、組み立てコストは$ 830 USDです。これらのフィルターは、蛍光ベースのイメージングシステムで一般的に使用されているが、高価な高級光学フィルター箔を交換することは、核酸検出6を可能にすることが以前に示されていた。フッ素計の2番目の構成はこれらの安価なフィルターを組み込み、二色性ミラーをφ1/2"ビームスプリッターに置き換え、システム全体のコストを830ドルから450米ドルに削減します。
アセンブリの代表的なイメージは 、図 1 および 図 2の最初の構成に示されていますが、2 番目の構成の類似のイメージは 補足ファイル 6に示されています。特殊な光学アライメントの必要性を避けるために、光学系は各光学部品を配置する指定された領域を有し、比較的ローエンドの3Dプリンタで作ることができるので、設計の広く使用することを可能にする。2 つのコンフィギュレーションの構造とアセンブリの唯一の違いは、3D 印刷に使用されるファイルと、エンクロージャに配置される光学部品です。両方のシステムの 3D プリントエンクロージャの外部寸法は同じです。2 つのシステムのコスト比較を表 1に示します。
図1Aに示すように、小さなフォームファクタを維持するために、蛍光計はΦ1/2"(〜12.5mm)の光学系で構成され、PCRチューブの上部を通して信号を測定するために配置されたコンパクトな照明および検出と結合される。図1のシステムは、リアルタイム核酸増幅反応7,8でレポーターとして一般的に使用されているFITCおよびSYBRおよびSYTO-9のような密接に関連する色素を含む、それぞれ490 nmおよび525 nm付近のピーク励起および発光波長を有する色素を検出するように設計されている。励起源、光学フィルター、検出器は、必要に応じて異なる蛍光色素と互換性のある成分を容易に置換することができます。核酸増幅反応は、通常PCRチューブで行われ、フルオリメーターは、PCRチューブを保持する市販のヒートブロック(図1D)の上に配置され、等温反応のリアルタイムモニタリングを可能にするように設計されています。適切な熱ブロックは、ほとんどの生物医学研究所で利用可能であり、500米ドル未満で購入することができます。
イメージング技術を制御するための低コストのケアポイントを提供するシングルボードコンピュータの使用は、以前に実証されています9.このプロトコルでは、単一ボードのコンピュータを搭載したグラフィカル ユーザー インターフェイス (図 1D)を使用して、リアルタイムのデータログの記録と、注意の時点での結果の表示を容易にするため、ラップトップ コンピュータがデータを処理または視覚化する必要がなくなります。蛍光測定は、I2Cプロトコルを介して光センサからマイクロコントローラに転送され、シリアル通信を通じてシングルボードコンピュータに提供されました。照明とデータ転送のための電気接続は、小型化されたブレッドボード上の配線とはんだ付けによって提供され、専用のプリント基板(PCB)の必要性を否定しました。フルオロメーターを実行するために必要なソフトウェアは、オープンソースのソフトウェアフレームワークを通じて利用可能であり、デバイスを実行するために必要なコードは 、補足のコーディングファイルに提供されています。完全な蛍光計は$450から$830 USDの間で組み立てることができ、結果はそれが核酸のリアルタイムの等温増幅を監視するために正確で信頼性の高い蛍光測定を提供することを示す。
Protocol
1. 準備手順:3D印刷とはんだ付け
メモ: このプロトコルで説明されている光学系は、標準のドライブロックヒーター用に設計されています。
- 最初のコンフィギュレーションを作成するには、それぞれ 補足ファイル 1、2、 および 3 として提供される CAD ファイルを 3D プリントします。
- 2 番目の構成を作成するには、それぞれ、補足ファイル 3、4、および 5として提供される CAD ファイルを 3D プリントします。
メモ:これらの部品はサポートで印刷されるように設計されています。本ガイドでは、110°Cまでの温度に供した後もその形態を維持できる黒色ポリカーボネートフィラメントを使用しています。 一般に、著しい変形を伴わない所望の等温反応の温度に加熱できる材料を使用することができる。内部反射と周囲光干渉の影響を最小限に抑えるには、黒色または別の暗い色のマテリアルをお勧めします。 - 2つのサンプルを並列監視するために、2つの光からデジタルへのセンサ評価モジュールを用意します。センサーテストボードの1枚で、R4抵抗を取り外し、PCBのR4領域の右側パッドから、PCBのR1領域の上部パッドにジャンパー線をはんだ付けします。これにより、センサーのI2Cアドレスが変更され、両方のセンサーを同時に測定できるようになります。
メモ:使用されるセンサーは、USBアダプタボードと光センサーを含むセンサーテストボードの2つのPCBで構成されています。このデバイスにはセンサーテストボードのみが必要です。 - 2 つの発光ダイオード(LED)のそれぞれにはんだ線。LEDの「1」と表示されたパッドに赤線(正の線)を接続し、LEDの「2」とラベル付けされたパッドの黒いワイヤー(マイナス線)を接続します。LEDの背面に薄い熱接着剤を塗布し、LEDをエンドキャップの上部に置き、熱接着剤が治癒するまで待ちます。エンドキャップの反対側にヒートシンクを追加します。
注:エンクロージャにシールされる前にLEDをテストする場合は、適切な青色光遮断眼保護具を着用してください。 - 2番目の構成を作成するには、青い励起ホイルシートから2つの1/4インチの直径円と、はさみまたはカミソリの刃を持つ黄色いエミッションホイルシートから4つの1/4インチ直径円をカットします。
- 「LCD_Screen_Holder.stl」部分の斜線部分の4つの穴のそれぞれにM2.5六角形のインサートを押します。
2. 光学式アセンブリ
- 長さ 3/16 インチの 4~40 ねじインサートを、Optics_Enclosure_Bottom.stl パーツの上部の穴に挿入します。 図 2Aに示すように、長さ 1/4 インチの 4~40 ねじインサートを 3D プリント部品の他のすべての穴に配置します。
- センサーテストボードをハウジングの上部キャビティに挿入し、5本のピンをデバイスの中心軸に向けて最も近い位置に向けます。3/16 インチ長の 4-40 ネジで、センサーのテスト ボードの穴を通して固定します (図 2B)。
- 20 mm焦点距離レンズの1つを、凸側をデバイスの底面に向け、テストボードから離れた位置にあるセンサーテストボードの下のセクションに置きます(図2C)。
- 最初の構成を作成するには、ロングパスフィルタを前のステップの20 mm焦点距離レンズ(図2D)の下のセクションに配置します。2 番目の構成を作成するには、レンズの下のセクションに 2 つの黄色のエミッション フィルターホイルを配置します。
- 最初の構成を作成するには、製造元が指定したフィルターの向きを観察しながら、二色鏡を包みの中心近くの斜めのセクションに配置します(図2E)。2 番目のコンフィギュレーションを作成するには、梁分割線を対角断面に配置します。ビームスプリッターに特定の方向は必要ありません。
- 2番目の20mm焦点距離レンズを、デバイスの上部を向いた凸側の二色性ミラー(またはビームスプリッター、構成に応じて)の下のセクションに配置します(図2F)。
- 最初の構成を作成するには、励起フィルタを二色性鏡の右側のセクションに配置し、矢印が二色性鏡に向かっていることを確認します(図2G)。2 番目の構成を作成するには、1 つの青い励振フィルターホイルをビーム スプリッターの右側のセクションに配置します。
- 15mm焦点距離レンズを励起フィルタの右側に置き、凸側を二色鏡に向ける(図2H)。
- 印刷物の残りのセクションに LED を配置し、LED をダイクロアス ミラー(または設定に応じてビーム スプリッタ)に向けて配置します。LEDからリードする2本のワイヤが、印刷がしっかりと閉じられるように、凹んだチャンネルに挿入されていることを確認します。
- 3D プリントパーツの反対側に対して、手順 2.3 ~ 2.9 を繰り返します(図 2I)。
- エンケースの上半分の押し出し部分を包み込みの下半分の凹んだ溝に入れることで、印刷物の上に印刷物の空の側を閉じます。2つのプリントされた部品を、長さ3/8インチの4~40ネジで固定します(図2J)。
注意:印刷された2つの部品が完全に閉じていない場合、外の励起光が光学ハウジングから脱出する可能性があります。適切なシールが得られるまで、適切な青色光遮断眼保護が着用されていることを確認します。余分な光が逃げ出さないまで、エンクロージャを再シールします。
3. エレクトロニクスおよびタッチスクリーンアセンブリ
- 2つのミニブレッドボードを接続し、マイクロコントローラをブレッドボードの1つに置きます。マイクロコントローラのmicroUSBポートが外側に向かっていることを確認します。
- LED 変調を接続するには、LED (+) ドライバの CTL ピンをマイクロコントローラのデジタル ピンに接続し、LED ドライバの LED (-) ピンをマイクロコントローラの GND ピンに接続します。
- ブレッドボードの裏にあるプラスチックカバーを取り外します。ブレッドボードの粘着箱を3Dプリントパーツに押し込み、プリント部分の裏面部分の内側にパンボードを取り付けますLCD_Screen_Holder。
- 液晶ディスプレイ(LCD)スクリーンホルダーを、組み立てたブレッドボードを内側に取り付け、セクション2に組み立てた光学エンクロージャに1インチ長の4-40ネジで固定します。
- LED 電源装置を接続するには、LED ドライバーの LED (+) ピンを、最初の LED の正のワイヤーに接続します。最初のLEDの負のワイヤーをブレッドボードの2番目のLEDの正のワイヤーに接続します。2 番目の LED の負の線を LED ドライバの LED (-) ピンに接続します。
メモ:第1LEDまたは第2LEDの順序は任意です。 - LEDドライバの電源を接続するには、10 V電源の正と負の線をLEDドライバのVIN+ピンとVIN-ピンに接続します。(2ピンアダプターにバレルジャックを使用しました。
- センサーテストボードの電源とデータ転送を接続します。センサーテストボードのピンは、SCK、SDA、VDUT、GND の4つのピンのみ使用されます。男性のジャンパーワイヤーに4ピンの女性を取り、液晶ホルダー印刷の右上の隙間からミニブレッドボードにライトデジタルセンサーテストボード上のそれらのピンを接続します。
- ブレッドボードでは、マイクロコントローラの3.3 Vピンと両方のテストボードのVDUTピンの間の接続が適切であることを確認します。マイクロコントローラのGNDピンと両方のテストボードのGNDピン。マイクロコントローラのアナログ4(A4)ピンと両方のテストボードのSDAピン。そして、マイクロコントローラのアナログ5(A5)ピンと両方のテストボードのSCKピン。
メモ:I2C通信が光センサに使用されているため、両方のセンサーのSCKピンとSDAピンは両方ともマイクロコントローラの同じピンにルーティングできます。 - シングルボードコンピュータを4本のM2.5ネジでLCDスクリーンホルダーに固定します。シングルボードコンピュータのHDMIポートと電源アダプタポートが上向きに向き、シングルボードコンピュータが3Dプリント部品の中央に配置されていることを確認します。
- タッチスクリーンの指示に従ってタッチスクリーンディスプレイをシングルボードコンピュータに接続し、シングルボードコンピュータのHDMIポートをタッチスクリーンのHDMIポートに接続します。
4. ソフトウェアのインストール
- Web エディタをインストールして使用し、 補足コーディング ファイル 1 に用意されているカスタム スケッチ "MiniFluorimeter_2Diode.ino" をマイクロコントローラにアップロードします。ライブラリマネージャを使用して、"ClosedCube OPT3002"ライブラリがインストールされていることを確認します。
- led_A_pin変数をステップ 3.3 (電子回路およびタッチスクリーンアセンブリセクション) で使用したデジタルピンの番号に変更します。
- 蛍光測定を取得する際に、可変 ExposureTime の値を変更して、LED がオンになる時間をミリ秒単位で調整します。変数led_A_Intervalの値を変更して、LED エクスポージャーの間隔をミリ秒単位で調整します。
- エクスポージャー中の LED の明るさを調整するには、変数led_Powerを 0 ~ 1 の間の数値に変更します。ゼロは明るさの最大量を与え、1つは明るさの最小量を与える。
- 3.5インチディスプレイに付属のメーカーの指示に従って、タッチスクリーンを介してディスプレイを制御する機能をオンにします。
注: 必要に応じて、3.5 インチの画面をタッチスクリーン機能のないモニタとして使用でき、シングルボード コンピュータの USB ポートにキーボードとマウスを接続して、シングルボード コンピュータを制御できます。 - 補足コーディング ファイル 2からシングルボード コンピューター上の目的の場所に"MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py"ファイルをダウンロードします。
- 単一ボード コンピュータに Python の動作バージョンがインストールされていることを確認します。Python 3.7 は提供された Python モジュールで使用されましたが、提供されたスクリプトに適切な変更を加えて、任意の安定した Python バージョンを使用できます。Python プログラムに必要なライブラリをシングルボード コンピュータにインストールします。
- 変数measurement_timeを、計測を行う時間の長さに変更します。プログラムは、取得を終了し、目的の時間が経過した後に終了します。GUI では、ユーザインタフェースのボタンを使用して取得を終了することもできます。
- 変数のシリアルポートを、接続されているマイクロコントローラのシリアルアドレスに変更します。
5. リアルタイム蛍光データの記録
- 市販のヒートブロックをオンにして、所望の温度に達するようにします。
- ほとんどのシングルボードコンピュータ購入で提供される標準の5 V電源でシングルボードコンピュータに電力を供給します。マイクロUSBからUSBケーブルで、シングルボードコンピュータをマイクロコントローラに接続します。
- タッチスクリーンを使用して、提供されている Python スクリプトを開きます。measurement_timeとシリアルポート変数を目的の値に変更します。変数 outputFilepath を、プログラムが生成するデータファイルの名前に変更します。ファイル名が '.xlsx' で終わることを確認します。
- 監視する反応を含む2本のPCRチューブをヒートブロックに入れます。PCRチューブの配置は、フッ素計がヒートブロックに配置されると、蛍光計の光学チャネルと一致していることを確認します。
- フルオロメーターの各光学チャネルから押し出す4つのペグの間を中心にPCRチューブをヒートブロックの上に置きます。最適な測定のために、3Dプリントされた蛍光計がヒートブロックの井戸にしっかりと取り付けられていることを確認してください。
- フッ素計をしっかりと取り付け、LED用の電源アダプタを差し込みます。
- タッチスクリーンを使用して Python プログラムを起動します。グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) が LCD 画面に表示され、リアルタイム蛍光を測定します。
- GUI 上でユーザーに表示される両方の PCR チューブについて、リアルタイム蛍光測定を時間経過に応じて観察します。
- ユーザが決定した実験時間が経過した後、取得は停止する。ユーザー定義の場所に保存されている出力データ ファイルの測定値を表示します。測定を早めに終了するには、ユーザーインターフェイスの「取得停止」というボタンをクリックします。
Representative Results
組み立て後、FITC染料の希釈シリーズから蛍光を測定することで、蛍光計の性能を検証することができます。 図3Aでは、フルオロメーターの第1構成の両チャンネルで1x PBSで調製した濃度0、20、40、60、および80pg/μLのFITC色素の測定値を示しています。各サンプルを、20の間隔で1.5 sのLED露出で3回測定した。蛍光計の両方のチャネルは、所望の範囲にわたって線形応答を示す。
蛍光計の臨床的適用性は、市販のドライヒートブロックと共にシステムを使用して、RPAとRT-LAMPの2つの等温増幅技術で増幅を行うことによってさらに実証された。
図3B は、標準の市販キットで提供され、製造業者の指示に従って調製されたキット陽性対照DNAに対する50μLのリアルタイムRPA陽性および陰性対照反応の39°C増幅中に測定されたベースライン減蛍光時間の経過を示しています。比較的低レベルの蛍光を生み出すRPA反応を、励起光のより良い抑制を達成する蛍光計の第1構成を用いて測定した。
図3C は、張らら10、およびRabeおよびCepko11で説明したN2、E1、およびAs1eプライマーセットを利用した65°CにおけるカスタムRT-LAMPアッセイのタイムコース測定を示す。RT-LAMP反応は、より多くの蛍光を生成し、第2の低コストの蛍光計構成を用いて測定した。オリゴヌクレオチドを1mM濃度で2x TEバッファーで購入し再懸濁した。前方内側プライマー(FIP)および後方インナープライマー(BIP)オリゴを、高速液体クロマトグラフィー精製で注文した。各プライマーセット(N2、E1、およびAs1e)を組み合わせて、FIPの40 μL、BIPの40 μL、F3の5 μL、B3の5 μL、LFの10 μL、LBの10 μL、および1x TEバッファーの890 μLの1000 μLを作った。各RT-LAMP反応を組み立てるには、各プライマーセットの1μLを50x蛍光色素の0.5 μLに加え、2xマスターミックスの12.5 μLを加え、反応量はメーカーの指示ごとにヌクレアーゼを含まない水で最大20μLまで持ち出しました。SARS-CoV-2 RNA制御はヌクレアーゼを含まない水で1μLあたり10、100、または1,000コピーの濃度に連続して希釈し、5μLを加えて25μLの全反応量を加えました。全ての実験で使用した無標的制御(NTC)はヌクレアーゼを含まない水であった。RT-LAMP反応は、分子生物学グレードの鉱物油の25 μLで重ね合わせていました。
RPAおよびRT-LAMP反応は、0.2 mLの低プロファイル8チューブPCRストリップの2つのウェルに組み立てられ、超クリアフラットキャップでキャップされました。各RPAおよびRT-LAMP反応は三重で実行された。すべての試験において、ミニ蛍光計はDNA増幅に関連する蛍光レベルの時間的増加を定量化した。
図1:ヒートブロックの上に光学ハウジングと組み立てられたミニチュア蛍光計(A)1つの検出チャネルに配置された光学部品を示す光学ハウジングの図。(B)組み立て後のミニチュア蛍光計の第1構成の図。(C)光学部品を1つの検出チャネルに配置した光学ハウジングの写真。(D)市販のヒートブロックの上に置かれた組み立てられたミニチュア蛍光計の写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ミニチュア蛍光計の組み立てと電気制御図A-J)最初のシステム構成のための3Dプリント光学ハウジング内の光学部品のステップバイステップの配置。(K)両方の構成のミニチュア蛍光計の電気的図。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ミニチュア蛍光計で得られた代表的な測定値(A)は、両方のチャネルでの蛍光とFITC色素濃度の測定を行い、所望のダイナミックレンジ全体で線形応答を示しています。(B)リアルタイム蛍光対時間市販キットの正と負のコントロールの正と負の制御の増幅。増幅は、陽性制御に対して期待どおりに起こる。(C)SARS-CoV-2 RNAの50、500、および5000コピーの等温増幅のためのリアルタイム蛍光とカスタムRT-LAMPアッセイからのNTCサンプル。増幅は、アッセイの検出限界付近で期待どおりに起こる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| システム1 | システム2 | |||
| アイテム | 量 | 合計価格 (米ドル) | 量 | 合計価格 (米ドル) |
| 光学部品 | ||||
| レンズ | 6 | 158.14 | 6 | 158.14 |
| ミラー | 2 | 244.56 | 2 | 60 |
| 光学フィルタ | 4 | 200 | 6 | 5 |
| 小計 | 602.7 | 小計 | 223.14 | |
| 照明と検出 | ||||
| LED | 2 | 72.62 | 2 | 72.62 |
| LEDドライバ | 1 | 11.49 | 1 | 11.49 |
| フォトダイオード | 2 | 50 | 2 | 50 |
| 小計 | 134.11 | 小計 | 134.11 | |
| エレクトロニクスとディスプレイ | ||||
| アルドゥイノナノ | 1 | 20.7 | 1 | 20.7 |
| ラズベリーパイ | 1 | 35 | 1 | 35 |
| 液晶画面 | 1 | 25 | 1 | 25 |
| ミニブレッドボード | 1 | 4 | 1 | 4 |
| 10V電源 | 1 | 8.6 | 1 | 8.6 |
| 小計 | 93.3 | 小計 | 93.3 | |
| 総コスト (USD) | 830.11 | 450.55 | ||
表1:ミニチュア蛍光計の2つの構成のコスト比較。
補足ファイル1:System1_Optics_Enclosure_Top.stlこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl、およびこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3:LCD_Screen_Holder.stl このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4:System2_Optics_Enclosure_Top.stl このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル5:System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl、およびこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル6:System2_BuildInstructions.pdfこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:MiniFluorimeter_2Diode.inoこのコーディングファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル2:MiniFluorimeter_2Diode_GUI.pyこのコーディングファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここで説明するのは、等温増幅反応の定量的蛍光検出用のオープンソース、低コスト、モジュラー、ポータブル蛍光計です。オープンソースプロジェクトは、すぐに入手できる交換部品で迅速かつ安価なメンテナンスを促進し、モジュラー設計に基づいてシステムをニーズに合わせて柔軟に調整できます。このプロトコルは、機械、光学、電気部品を組み立て、光学的性能を検証するプロセスを記述します。さらに、蛍光計の柔軟性が、温度、体積、蛍光要件が大きく異なる2種類の等温増幅アッセイを監視する、RPA exoおよびRT-LAMPが実証された。RPAは、50μLの反応で39°Cで行われ、蛍光発生のための配列特異的FAMタグ付きプローブを利用し、RT-LAMPは25μL反応量で65°Cで行われ、インターカレーション色素を使用して増幅されたDNAの存在を報告します。蛍光測定は、フラットキャップを備えたPCRチューブの上部を通して行われるため、蛍光計は両方のアッセイ量から蛍光を検出することができ、熱要件は選択された市販のヒートブロックによってのみ制限されます。さらに、RT-LAMPで生成される蛍光強度は、蛍光信号生成の色素対プローブベースの方法により、RPAで生成されたものよりもほぼ桁違いの大きさです。しかし、選択された光学センサーのダイナミックレンジは両方の信号を検出して定量することができ、ベースライン減算アルゴリズムはこれらの違いを考慮して信頼性の高い蛍光測定値を生成します。
技術普及を容易にし、潜在的な維持費を最小にするために、さまざまな設定で広く利用できるヒーターと互換性のあるモジュラー設計が採用された。現在のプロトコルでは、共通のドライブロックヒーターが使用されました。同じ光学および電気設計は他の市販のヒーターのために容易に合わせることができる。別のドライブロックヒーターを使用する場合は、3Dハウジング設計の最小限の変更が必要になります。具体的には、光学エンクロージャSTLファイルの底ペグは、他の商用ヒートブロックの井戸と適切に一致するように変更する必要があります。例に示すエンクロージャは比較的ローエンドの 3D プリンタ ( 資料表を参照) で印刷されていますが、プリンタの解像度や印刷の許容値が光学部品やねじ込み部品に対応できるように注意してください。提供されるSTLファイルでは、0.01-0.02インチの許容値が、メーカーが指定した寸法に基づいて、半径方向および軸方向の光学部品の両側に追加されました。これにより、すべての光学部品が印刷物内にしっかりと収まり、エンクロージャが余分な光の侵入や逃げ出しを完全に遮断します。ねじ付き挿入物に適切に押し込まれるように、CAD ファイルの製造元が提供する直径から 0.01~0.02 インチの同様の許容差を差し引いた。
RPA反応は、最初の蛍光計構成を使用して正常に監視され、RT-LAMP反応はどちらの構成でも監視することができました。第1構成の改善された迷光拒絶反応は、RPA反応における蛍光プローブによって生成される低レベルの蛍光を監視するために必要であった。これに対し、RT-LAMPは信号生成用にインターカレーション色素を利用し、写真フィルター箔を用いた第2構成の低ダイナミックレンジと互換性のある蛍光強度が高くなる。ユーザーは、蛍光シグナル生成元素間測定または蛍光プローブと一致する蛍光計構成を選択する必要があります。
このシステムの1つの制限は、標準的な壁の出口を通して動力を与えられる市販の熱ブロックによって加熱が提供される点である。このシステムは、他のグループ12によって示されるようにポータブルおよび充電式バッテリーパックを組み込むことによって、電気への信頼性の高いアクセスを欠く領域での使用のためにさらに開発することができる。もう一つの制限は、システムの比較的低いスループットであり、一度に2つのサンプルの同時蛍光測定を可能にする。エンクロージャーの複数のプリントを同じヒート・ブロックの上に配置して、スループットを向上させることができます。しかし、使用される光センサーは4つのユニークなI2Cアドレスしか持たなかった。これにより、同時に測定できるサンプルの最大数が 4 に制限されます。スループットをさらに向上させるためには、一意のI2Cアドレス数が多い別の光センサーが必要です。
Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
チェルシー・スミス、メーガン・チャン、エミリー・ニューシャム、サイ・ポール、クリストファー・ゴーのサンプル準備に感謝します。著者らはキャロライン・ノクソンの原稿改訂に感謝する。この研究のための資金は、IAVIとUSAIDの間の賞AID-OAA-A16-00032の下でIAVI研究助成金CCID 9204を通じてUSAIDによってアメリカ国民から提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED - 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
References
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- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
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