Summary
我々は、胚および成体マウス舌の上皮および間線質/結合組織から大量の高品質単一細胞を解離するための一般化されたプロトコルを開発した。
Abstract
細胞解離は、個々の細胞レベルおよび/または細胞集団レベル(例えば、単一細胞RNAシーケンシングおよび一次細胞培養)での研究に不可欠な手順であった。大量に生存可能で健康な細胞を産出することは重要であり、そのために最適な条件は組織依存である。舌上皮および基礎となる間質/結合組織における細胞集団は異種であり、組織構造は異なる領域および異なる発達段階で異なる。我々は、初期発達[胚性12.5日目(E12.5)]および若年成人(8週間)段階でマウス舌上皮および間葉/結合組織から細胞を単離するためのプロトコルを試験した。上皮と下層の間質/結合組織との間のきれいな分離は容易に達成した。しかし、さらに細胞を処理して単離するには、生存可能な健康細胞を大量に生成し、酵素消化バッファー、インキュベーション時間、遠心分離の速度と時間を慎重に選択することが重要です。分離した上皮または基になる間葉系/結合組織を37°Cで30分間0.25%トリプシン-EDTAでインキュベーションし、続いて200xgで8分間遠心し、高い生存率(>90%)で細胞の高収率をもたらしたマウスのステージと舌の領域に関係なく。さらに、胚性および成体の舌からの解離された上皮および間葉/結合組織細胞の両方が、細胞生存率の有意な減少なしに少なくとも3時間細胞培養ベースの培地で生存できることを発見した。このプロトコルは、初期発達(E12.5)および若年成人(8週間)段階で異なる組織コンパートメントからの細胞解離を必要とするマウス舌からの単離細胞の調製を必要とする研究に有用である。
Introduction
哺乳類の舌は、味、話す、および食品処理に不可欠な複雑な器官である。それは間葉/結合組織によって区分され、味乳頭および味覚芽を含む階層化された上皮シートによって覆われる高度に組織化された組織の複数のタイプで構成される。舌上皮と間質/結合組織の両方の細胞集団は不均一である。舌の特定のタイプの細胞の機能と分布をよりよく理解するためには、解き分け細胞を用いた研究が必要である。例えば、単一細胞RNAシーケンシングは、個々の細胞における転写プロファイリングのための強力かつハイスループットな方法であり、単一細胞分解能1、2、3、4における複雑な組織の転写物を理解するように設計されている。一次細胞培養は、味覚芽5,6の幹細胞/前駆細胞の機能と分化を研究するのに有用なツールであることが証明されている。これらの研究は、大量の高品質の単離された細胞集団(例えば、適切な濃度および高い生存率を有する十分な総細胞数)を必要とする。
したがって、言語組織の異なる領域から、異なる発達段階で細胞を分離する必要があります。現在、舌上皮および基礎となる間質/結合組織からの細胞解離に利用できる詳細なプロトコルはない。ここでは、単一細胞RNAシーケンシングや一次幹細胞培養など、高い品質の生細胞を必要とする実験のために細胞を調製するための最適化された細胞解離方法を報告する。我々は、酵素消化バッファー、穏やかなピペット、再懸濁培地の選択、および最適な遠心分離時間と速度の選択は、これらの大量の高品質の細胞を生成するために重要であることを発見しました。
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Protocol
動物の使用(研究を通じてC57BL / 6マウス)は、ジョージア大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認され、研究のための動物のケアと使用のための国立健康ガイドライン研究所に従っていました。
1. 動物の使用
注:マウスは、ジョージア大学動物酪農科学科の動物施設で、12時間/夜間サイクルの下で22°Cで飼育および維持しました。
- マウスにおける膣プラグ検出の日の正午を胚(E)日0.5として指定する。E12.5で胚を使用し、生後マウスを生後8週で以下の実験に使用する。
2. 実験前の準備
注: このプロトコルに必要なインストゥルメントは、 資料一覧に記載されています。
- 実験前のオートクレーブ楽器。実験中にビーズ滅菌器を使用して器具を殺菌します。
- 70%エタノールワイプを使用して、外科領域、解剖顕微鏡、およびバイオセーフティキャビネットを洗浄します。バイオセーフティキャビネットのUVライトをオンにし、実験手順の前に20分間オンにします。
- 1:1ディスパーゼ(5.0 mg/mL)とコラゲナーゼ(2.0 mg/mL)の酵素混合物を最終濃度2.5と1.0mg/mLにそれぞれ調製し、0.22 μmシリンジフィルター7を使用して溶液をフィルター処理します。
- 成人の舌に対して1 mL、または特定の舌の領域(例えば、後部、または前舌)に対して0.5mLの酵素混合物を調製する。
- 胚性舌用酵素混合物2 mLを調製する。
- 0.1 M PBS で 2.5% BSA の 10 mL を作り、1 mL シリンジと 0.22 μm シリンジフィルターを使用して溶液をフィルターします。
- DMEM/F12で5%FBSの500 μLを作ります。
- 10%FBSと1%BSAを含むDMEM/F12の3mLを作り、1 mLシリンジと0.22 μmのシリンジフィルターを使用して溶液をフィルタリングします。
3. 間質/下層の結合組織からの舌上皮の分離
- E12.5マウス舌間質からの上皮の分離
- E12.5胚を運ぶ時安楽死させた妊婦マウスは、それをCO2 チャンバーに入れ、その後子宮頸部脱臼を行う。
注:E12.5のマウス胚は、妊娠中の雌マウスの膣プラグを検出した後、12日目の午後12時(午後)の後に収集されます。 - マウスを手術領域に移す。70%エタノールを使用してマウスの腹部を濡らし、毛皮が操作部位に入るのを防ぎます。
- 胚を運ぶ子宮の角を露出させるために解剖ハサミを使用して腹部を開きます。はさみを解剖して子宮の角を解剖し、100mmの培養皿で新鮮なタイロードの溶液を15mLに移します。
- ミニハサミと細かい鉗子を用いて、子宮角から胚(図1A1)を解剖する。
- 細かい鉗子を使用して口腔を慎重に大きく開き、ミニハサミを使って下顎から舌を解剖する(図1A2)。
- 100 mm の培養皿で 15 mL の新鮮な滅菌タイローデの溶液を使用して舌を洗浄します。
- 生安全キャビネットにヘラと細かい鉗子を備えた35mm培養皿で、ジスパーゼ(2.5mg/mL)とコラゲラーゼ(1.0mg/mL)の酵素混合物の2 mLに組織を移します。37°Cで20分間インキュベートします。
- 100mm培養皿で15mLの新鮮な滅菌タイローデの溶液に舌を移し、細かい鉗子を使用して腹側から上皮から間食物を静かに取り除きます。
注:上皮シートは、インキュベーション中に機械的な力なしで分離することができます。 - 分離した上皮と間質を15mLの新鮮な滅菌タイローデ溶液で100mm培養皿で2回洗浄します。
注意:ジスパーゼおよびコラゲナーゼの活動は、細胞解離手順(ステップ4.1)においてEDTAによって阻害される。
- E12.5胚を運ぶ時安楽死させた妊婦マウスは、それをCO2 チャンバーに入れ、その後子宮頸部脱臼を行う。
- 成体マウスの下層の結合組織からの舌上皮の分離
- マウスをCO2 チャンバーに入れることで、8週齢でマウスを安楽死させる。マウスが呼吸なしで安楽死させられ、前足ピンチ応答であることを確認します。
- マウスを手術領域に移す。毛皮が口腔に入るのを防ぐために70%エタノールを使用してマウスヘッドを濡らします。
- 口腔を開くために解剖ハサミを使用して頬に沿って口の角をカットします。下顎(図1B1)で舌を解剖し、ラップの層を持つプラスチック皿に入れます。
- 手術用鉗子を使用して舌を解剖顕微鏡で保持し、後舌の切り刃(図1B1、矢印)を通して舌の上皮下腔にディスパーゼ(2.5mg/mL)とコラゲターゼ(1.0mg/mL)の酵素混合物を注入する。
- 前舌と後舌の両方から組織を採取するために、1 mLの酵素混合物を舌全体に均等に注入します。
- 乳頭組織の周回採取のために、舌の先端または後舌からの組織採取のために前舌に0.5mLの酵素混合物を局所的に注入する。
注:酵素が蓄積するにつれて舌が膨らむ(図1B2)。酵素の穏やかな注入は、上皮を損傷する圧力を防ぎ、舌でできるだけ多くの酵素を保つことができます。
- ラップで舌を包み、37°Cで30分間舌をインキュベートします。
- ミニハサミを使用して舌の先端や乳頭を周回し、ヘラと細かい鉗子を使用して100mm培養皿で新鮮な滅菌チローデの溶液の15 mLに組織を移します。
- ミニハサミを使用して、酵素消化サブ上皮空間の下層の結合組織から上皮を分離します。下流の実験の要件に従って、組織を適切なサイズにトリミングします。
- 分離した上皮と根底にある結合組織を15mLの新鮮な滅菌タイローデの溶液を100mm培養皿で2回洗浄します。
注意:ジスパーゼおよびコラゲナーゼの活動は、細胞解離手順(ステップ4.1)においてEDTAによって阻害される。
4. 細胞解離
注:ここで説明する細胞解離プロトコルは、E12.5胚性マウスと8週齢マウスの両方で、舌上皮および間質/結合組織に適用することができます。細胞懸濁液の攪拌および移送中の細胞損失を低減するために、pH 7.4 8で0.1 M PBSで2.5%BSAで市販の低保持ピペットチップまたはプレコーティングされたピペットチップを使用してください。
- 37°Cで30分間新しい35 mm培養皿で、ヘラとファイン鉗子を使用して0.25%トリプシンEDTAの3 mLに組織を移します。 1 mLピペットチップで5分ごとに組織を穏やかに攪拌します。
注意:切削刃は解体細胞に物理的に損傷を与える可能性があるため、ピペットチップは切断しないでください。 - DMEM/F12に5%FBSの500 μLを加えて反応を停止し、培地を5 mLの低結合遠心分離管に移します。
- 遠心分離機細胞懸濁液を室温で8分間200xgで、上清を除去する。
- 1mLのピペットチップを使用して10%FBSと1%BSAを含むDMEM/F12の3mLのセルを穏やかに再中断し、70 μmの細胞ストレーナーを使用して細胞をフィルタリングし、続いて35 μmの細胞ストレーナーを使用します。
- 遠心分離機細胞懸濁液を室温で8分間200xgで懸濁した。ほとんどの培地を取り出し、50~300 μLを最終容積のままにして、細胞を再中断します。
注: 単一細胞懸濁液の最終容積を変更して、下流実験の要件に従って細胞の濃度を調整します。
5. ヘモサイトメーターを用いた細胞計数と生存率試験
注: 測定精度を向上させるために、各サンプルに対して 3 つの技術的な複製が推奨されます。
- 1細胞懸濁液の5~10μLを同量のトリパンブルーと軽く混ぜ、ヘモサイトメーターに加えます。
注:使用前に70%エタノールを使用して十分にヘモサイトメーターを清掃してください。血球体の塵粒子は濃い青色で染色され、生存率試験の精度に影響を与えます。顕微鏡で、ヘモサイトメーターを確認してください。 - 細胞総数、生細胞数(白)、トリパンブルーで染色された死細胞数(濃い青色)を、それぞれ16グリッド(図2)を有する4つの正方形(図2)で、画像化システムを用いた反転顕微鏡を用いた。
- 細胞濃度を計算します。
細胞濃度 =
- 実行可能性を計算します。
生存率=
- 実行可能性を計算します。
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Representative Results
基礎間質/結合組織からの舌上皮の分離
胚性マウス舌では、適切な酵素消化後に上皮下腔の隙間が見える。一部の舌の上皮シートは、インキュベーション中に機械的な力なしで分離されます。
成人マウス舌では、注入された領域の腫脹(図1B2)によって酵素注射が成功したことを示しており、これは、酵素が舌によって保持され得ことを示唆している。間葉系および/または舌上皮の針による浸透への酵素および/または深部注射が不十分な場合、注射領域の部分的な腫脹を誘発するか、全く腫脹を起こさない。酵素消化後、適切な酵素消化を有する根底にある結合組織が緩んで粘着性になる。上皮シートの端を穏やかに持ち上げると、上皮下空間の隙間が見える。
細胞の解離が細胞総数と生存率に及ぼす影響
ステップ4では、E12.5舌、上皮シート、および舌の上皮のすぐ下に間質の薄い層がそれぞれプールされた。ヘモサイトメーターを用いた手動セルカウント(図2)は、このプロトコルが上皮シートから95.2%の生存率を有する合計で63,917個の細胞を生み出したことを実証した(約0.3mm2の大きさ 1舌当り)(図1A3)、および間分母から96.3%の生存率を有する合計294,333細胞(舌当たり約0.3mm2の大きさ)(図1A4)。
生後8週で10個の成体舌を使用して、舌先端の上皮シート(味覚芽が密に分布している場所)、乳頭周回の上皮シート、および乳頭乳頭の周頭のすぐ下に結合組織の薄い層の破片をそれぞれプールした。ヘモサイトメーターを使用した手動セル数(図2)は、このプロトコルが舌先端の上皮シートから95.4%の生存率を有する合計で187,333個の細胞を生み出したことを実証した(図1B3)、合計544,000細胞 乳頭回りの上皮シート(1舌当たり約0.1mm2)から96.3%(図1B5)、結合組織から93%の生存率を有する合計150,500細胞(舌当たりのサイズは約0.1mm2)(図1B6)。
図 1.細胞解離のための組織製剤。A) E12.5全胚(A1)の代表的な画像、解剖された舌の後ろ側図(A2)および上皮シート(A3)および間葉(A4)が舌から分離した。B)(B1)前及び酵素注射後の成人舌の代表的な画像(B2)。舌先端の上皮シート(B3)及び間葉(B4)の後視、及び上皮シート(B5)及び下層結合組織(B6)の周回乳頭の図。スケールバー:A1で1ミリメートル、A3、A4、B1、B 2;A 200 μm で200μm;B3、B4、B5、およびB6で100μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.単離細胞の代表的な画像を、ヘモサイトメーターで可視化した。A)E12.5における胚の上皮シート(A1)および間線葉(A2)から単離された細胞。B)上皮シート(B1)および8週齢における乳頭周回の基礎となる結合組織コア(B2)から単離された細胞。破線は、右上隅に増幅されたグリッドを囲みます。矢印は、トリパンブルーで染色された死んだ細胞を指しています。スケールバー:100 μm(B1、B2、B3、およびB4)右上隅の高出力画像の場合は25μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在までに、舌上皮および基礎となる間質/結合組織からの細胞解離に関する詳細なプロトコルは利用できていない。この現在の細胞解離プロトコルは、高い細胞生存率(>90%)を有する単一細胞懸濁液を生成する再現可能な手順を提供するE12.5と成体マウスからの単離された細胞が異なるにもかかわらず、胚および出生後の両方の段階で上皮シートおよび間葉/結合組織を含むマウスの舌組織から。例えば、E12.5マウス舌の上皮および間質から単離された細胞は、8週齢のマウス舌からの細胞の大きな変動(小さいから大きいものまで)とは対照的に、一貫しており、小さい。高い生存率(>90%)の利点を有する単離された細胞の、得られた単一細胞懸濁液は、生存細胞の高品質を必要とする下流実験を容易にすることができる(例えば、単一細胞RNAシーケンシングおよび一次細胞培養)。
細胞の高い生存率を保証するためには、いくつかの重要な要因に注意が払われなければなりません。ディスパーゼとコラゲナーゼ混合物を用いた適切な消化時間は、生存細胞を維持しながら、効果的に間葉/下層の結合組織から上皮を分離することができます。胚舌の20分インキュベーションと成人舌の30分インキュベーションをお勧めします。酵素消化後に上皮シートを容易に剥離できるが、分離のためにはさみで切断することが推奨され、舌上皮9の基底領域の幹細胞集団を維持する可能性がある。0.25%トリプシン-EDTAは、トリプシン-EDTAが細胞をより効率的に解離し、トリプシン単独と比較して細胞を分離し続けることができるので、トリプシンよりも0.25%トリプシン-EDTAの選択は、細胞を解離するために強く推奨されています。酵素消化後に細胞を再中断する細胞培養ベースの培地(DMEM/F12)(10%FBSおよび1%BSAを含む)の使用は極めて重要であり、細胞懸濁液培地(例えば、0.1MPBSにおける1%BSA)と比較して単離細胞の高い生存率に寄与する。さらに、単離された細胞は、この培地において、時間の経過とともに高い生存率を有する:少なくとも3時間、細胞生存率の有意な低下無し。ピペット技術は、高い細胞生存率を確保するためのもう一つの重要な要素です。ピペットを使用して上澄み細胞を穏やかに吸引し、再懸濁させる細胞は、余分な細胞の損失および細胞への物理的損傷を減らすことができます。
単一細胞懸濁液中の単離細胞の濃度は、下流実験に対するもう一つの重要な考慮事項である。与えられた全細胞数において、細胞濃度は、再懸濁液の最終体積に基づいて調節することができる。総細胞数が不明な最初の試験では、単離された細胞の再懸濁は少量で始まるべきである。次いで、分離細胞を下流実験の要件に基づいて希釈することができる。注目に、当社の培地ベースの溶液では、濃度が4000細胞/μL(ヘモサイトメーターでは1平方あたり約200細胞)を超えたときに細胞凝集体が見つかりました。最適濃度は500~2500細胞/μLです。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所、助成番号R01DC012308、R21DC018089によってHXLに支援されました。ブレット・マーシャル(ジョージア大学、アテネ、GA)とエゴン・ランヒニ(10X GENOMICS、プレザントン、CA)に感謝し、細胞解離に関する技術支援と相談を行いました。フランシスカ・ギブソン・バーンリー(ジョージア大学、アテネ、ジョージア州)に英語編集。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
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