Summary
We hebben een gegeneraliseerd protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid hoogwaardige enkelvoudige cellen te scheiden van het epitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale en volwassen muistongs.
Abstract
Celdissociatie is een essentiële procedure geweest voor studies op het niveau van de individuele cel en/of op celpopulatieniveau (bv. RNA-sequencing met één cel en primaire celcultuur). Het leveren van levensvatbare, gezonde cellen in grote hoeveelheden is van cruciaal belang en de optimale omstandigheden om dit te doen zijn weefselafhankelijk. Celpopulaties in het tongepitheel en het onderliggende mesenchyme/bindweefsel zijn heterogeen en weefselstructuren variëren in verschillende regio's en in verschillende ontwikkelingsstadia. We hebben protocollen getest voor het isoleren van cellen uit het epitheel van de muistong en mesenchym/bindweefsel in de vroege ontwikkelingsfasen [embryonale dag 12,5 (E12,5)] en jongvolwassenen (8 weken). Een schone scheiding tussen het epitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel was eenvoudig te bereiken. Het is echter van cruciaal belang om cellen verder te verwerken en te isoleren, levensvatbare gezonde cellen in grote hoeveelheden op te leveren en zorgvuldige selectie van enzymatische spijsverteringsbuffer, incubatietijd en centrifugeersnelheid en -tijd. Incubatie van gescheiden epitheel of onderliggend mesenchym/bindweefsel in 0,25% Trypsine-EDTA gedurende 30 min bij 37 °C, gevolgd door centrifugeren bij 200 x g gedurende 8 min resulteerde in een hoge opbrengst van cellen met een hoge levensvatbaarheidssnelheid (>90%) ongeacht de muisstadia en tonggebieden. Bovendien ontdekten we dat zowel gedissocieerde epitheel- als mesenchymale/bindweefselcellen van embryonale en volwassen tongen ten minste 3 uur in het celkweekmedium konden overleven zonder een significante afname van de levensvatbaarheid van de cel. De protocollen zullen nuttig zijn voor studies die de voorbereiding vereisen van geïsoleerde cellen uit muistongs in vroege ontwikkelingsstadia (E12.5) en young adult (8 weken) die celdissociatie van verschillende weefselcompartimenten vereisen.
Introduction
De zoogdiertong is een complex orgaan dat cruciaal is voor smaak, spreken en voedselverwerking. Het bestaat uit meerdere soorten sterk georganiseerde weefsels gecompartimenteerd door mesenchym / bindweefsel en bedekt met een gelaagd epitheelblad met smaakpapillen en smaakpapillen. Celpopulaties in zowel tongepitheel als mesenchym/bindweefsel zijn heterogeen. Om de functies en verdeling van een bepaald type cellen in de tong beter te begrijpen, zijn studies met gedissocieerde cellen nodig. RNA-sequencing met één cel is bijvoorbeeld een krachtige en hoge doorvoermethode voor transcriptomische profilering in afzonderlijke cellen, die is ontworpen om het transcriptoom van complex weefsel te begrijpen bij een eencellige resolutie1,2,3,4. Het is bewezen dat primaire celkweek een nuttig hulpmiddel is om de functie en differentiatie van stam-/voorlopercellen voor smaakpapillen te bestuderen5,6. Deze studies vereisen een grote hoeveelheid hoogwaardige geïsoleerde celpopulaties (bv. voldoende totaal celaantal met de juiste concentratie en hoge levensvatbaarheid).
Er is dus behoefte aan het isoleren van cellen uit verschillende regio's van de linguale weefsels en in verschillende ontwikkelingsstadia. Momenteel is er geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor celdissociatie van het tongepitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel. Hier rapporteren we een geoptimaliseerde celdissociatiemethode om cellen voor te bereiden op experimenten die een hoge kwaliteit van levende cellen vereisen, zoals voor RNA-sequencing met één cel en primaire stamcelculturen. We ontdekten dat selectie van enzymatische spijsverteringsbuffer, zachte pipetting, selectie van resuspensiemedium en optimale centrifugeertijd en snelheid cruciaal zijn om deze grote hoeveelheden hoogwaardige cellen te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Diergebruik (C57BL/6 muizen gedurende het hele onderzoek) werd goedgekeurd door de University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee en was in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines voor zorg en gebruik van dieren voor onderzoek.
1. Dierlijk gebruik
OPMERKING: Muizen werden gefokt en onderhouden in de dierenfaciliteit van de afdeling Dier- en Zuivelwetenschappen van de Universiteit van Georgia bij 22 °C onder 12 uur dag-/nachtcycli.
- Wijs de middag van de dag van vaginale plugdetectie bij muizen aan als embryonale (E) dag 0,5. Gebruik embryo's op E12.5 en postnatale muizen op de leeftijd van 8 weken voor de volgende experimenten.
2. Voorbereiding voor experiment
OPMERKING: De instrumenten die nodig zijn voor dit protocol zijn opgenomen in de tabel met materialen.
- Autoclaaf instrumenten voor het experiment. Steriliseer instrumenten met behulp van een kraalsterilisator tijdens het experiment.
- Reinig het operatiegebied, de ontleedmicroscoop en de bioveiligheidskast met 70% ethanoldoekjes. Zet het UV-licht van de bioveiligheidskast aan en houd deze 20 minuten aan voorafgaand aan de experimentele procedure.
- Bereid een enzymmengsel van 1:1 dispase (5,0 mg/ml) en collagenase (2,0 mg/ml) tot een eindconcentratie van respectievelijk 2,5 en 1,0 mg/ml en filtreer de oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm7.
- Bereid 1 ml enzymmengsel voor een volwassen tong of 0,5 ml voor een specifiek tonggebied (bijv. achterste of voorste tong).
- Bereid 2 ml enzymmengsel voor embryonale tongen.
- Maak 10 ml 2,5% BSA in 0,1 M PBS en filtreer de oplossing met een spuit van 1 ml en een spuitfilter van 0,22 μm.
- Maak 500 μL van 5% FBS in DMEM/F12.
- Maak 3 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% BSA en filtreer de oplossing met een spuit van 1 ml en een spuitfilter van 0,22 μm.
3. Scheiding van het tongepitheel van het mesenchym/onderliggend bindweefsel
- Scheiding van het epitheel van het mesenchyme van een E12.5 muistong
- Euthanaseer getimed zwangere vrouwelijke muizen die E12.5 embryo's dragen door het in een CO2-kamer te plaatsen, gevolgd door cervicale dislocatie.
OPMERKING: Muisembryo's op E12.5 worden verzameld na 12.00 uur (middag) op de 12e dag na detectie van vaginale plug in de zwangere vrouwelijke muizen. - Breng muizen over naar het operatiegebied. Maak de buik van de muis nat met 70% ethanol om te voorkomen dat bont op de operatieplaats komt.
- Open de buik met behulp van een ontleedschaar om de baarmoederhoorns bloot te leggen die embryo's dragen. Ontleed de baarmoederhoorns met behulp van een ontleedschaar en breng deze over op 15 ml verse Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
- Ontleed de embryo's (figuur 1A1) uit de baarmoederhoorns onder een ontleedmicroscoop met behulp van een minischaar en een fijne tang.
- Open de mondholte voorzichtig wijd met behulp van een fijne tang en ontleed de tong van de onderkaak met behulp van een minischaar (afbeelding 1A2).
- Was de tongen met 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
- Breng de weefsels over op 2 ml enzymmengsel van dispase (2,5 mg/ml) en collagenase (1,0 mg/ml) in een kweekschaal van 35 mm met een spatel en fijne tang in een bioveiligheidskast. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Breng tongen over op 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm en verwijder het mesenchym voorzichtig uit het epitheel van de ventrale kant met behulp van een fijne tang.
OPMERKING: Epitheelbladen kunnen tijdens de incubatie zonder mechanische kracht worden gescheiden. - Was de gescheiden epithelia en mesenchym tweemaal in 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
OPMERKING: De activiteiten van dispase en collagenase worden geremd door EDTA in de celdissociatieprocedure (stap 4.1).
- Euthanaseer getimed zwangere vrouwelijke muizen die E12.5 embryo's dragen door het in een CO2-kamer te plaatsen, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Scheiding van het tongepitheel van het onderliggende bindweefsel van volwassen muizen
- Euthanaseer de muis op de leeftijd van 8 weken door hem in een CO2-kamer te plaatsen. Bevestig dat de muis geëuthanaseerd is zonder ademhaling en forepaw-pinch reactie.
- Breng de muizen over naar het operatiegebied. Maak de muiskop nat met 70% ethanol om te voorkomen dat bont in de mondholte komt.
- Snijd de mondhoeken langs de wang met een ontleedschaar om de mondholte te openen. Ontleed de tong met de onderkaak (afbeelding 1B1) en plaats deze in een plastic schaal met een laag plasticfolie.
- Injecteer met behulp van een chirurgische tang om de tong onder een ontledende microscoop te houden het enzymmengsel van dispase (2,5 mg/ml) en collagenase (1,0 mg/ml) in de subepitheelruimte van de tong door de snijkant(figuur 1B1,pijlen) van de achterste tong.
- Injecteer 1 ml enzymmengsel gelijkmatig op de hele tong voor weefselverzameling van zowel de voorste als de achterste tong.
- Injecteer lokaal 0,5 ml enzymmengsel in de voorste tong voor weefselverzameling vanaf de tongpunt of op de achterste tong voor het verzamelen van papillaweefsel.
OPMERKING: De tong zwelt op naarmate het enzym zich ophoopt (Figuur 1B2). Zachte injectie van het enzym kan voorkomen dat druk het epitheel beschadigt en zoveel mogelijk enzym in de tong houden.
- Wikkel de tong in met plasticfolie en incubeer de tong gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Gebruik een minischaar om de tongpunt te ontleden en/of papilla te omzichtig te maken, en gebruik spatel en fijne tang om weefsel over te brengen naar 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
- Scheid het epitheel van het onderliggende bindweefsel in de enzymverteerd subepitheelruimte met behulp van een minischaar. Trim de weefsels tot een juiste grootte volgens de vereiste van downstream experimenten.
- Was het gescheiden epitheel en het onderliggende bindweefsel tweemaal in 15 ml verse steriele Tyrode-oplossing in een kweekschaal van 100 mm.
OPMERKING: De activiteiten van dispase en collagenase worden geremd door EDTA in de celdissociatieprocedure (stap 4.1).
4. Celdissociatie
OPMERKING: Het hier beschreven celdissociatieprotocol kan worden toegepast op het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel bij zowel E12.5 embryonale als 8 weken oude muizen. Om het celverlies tijdens agitatie en overdracht van celsuspensie te verminderen, gebruikt u commerciële pipettips met lage retentie of voorgecoate pipettips met 2,5% BSA bij 0,1 M PBS bij pH 7,48.
- Breng de weefsels over met spatel en fijne tang naar 3 ml 0,25% trypsine-EDTA in een nieuwe kweekschaal van 35 mm gedurende 30 minuten bij 37 °C. Roer de tissues voorzichtig om de 5 minuten met pipetpunten van 1 ml.
OPMERKING: Snijd de pipetpunt niet door, omdat de snijkant de gedissocieerde cellen fysiek kan beschadigen. - Voeg 500 μL 5% FBS toe in DMEM/F12 om de reactie te stoppen en breng het medium over naar een 5 ml laagbindende centrifugebuis.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
- S hang cellen voorzichtig opnieuw op in 3 ml DMEM/F12 met 10% FBS en 1% BSA met behulp van pipetpunten van 1 ml en filtreer de cellen met een celzeef van 70 μm, gevolgd door een 35 μm celzeef.
- Centrifugeer celsuspensie bij 200 x g gedurende 8 min bij kamertemperatuur. Verwijder het grootste deel van het medium en laat 50-300 μL als het uiteindelijke volume om cellen opnieuw op te schorten.
OPMERKING: Pas de concentratie van cellen aan volgens de vereisten van downstream-experimenten door het uiteindelijke volume van de suspensie met één cel te wijzigen.
5. Celtelling en levensvatbaarheidstest met hemocytometer
OPMERKING: Om de meetnauwkeurigheid te verbeteren, worden voor elk monster 3 technische replica's aanbevolen.
- Meng voorzichtig 5-10 μL van de eencellige suspensie met een gelijk volume Trypan blauw en voeg toe aan de hemocytometer.
OPMERKING: Reinig de hemocytometer grondig met 70% ethanol voor gebruik. Stofdeeltjes op de hemocytometer worden donkerblauw gekleurd en beïnvloeden de nauwkeurigheid van de levensvatbaarheidstest. Controleer de hemocytometer onder een microscoop. - Tel het totale celnummer, het aantal levende cellen (wit) en het aantal dode cellen (donkerblauw) gekleurd door trypanblauw(figuur 2,pijlen) respectievelijk in 4 vierkanten met 16 rasters (figuur 2) met behulp van omgekeerde microscoop met beeldvormingssysteem.
- Bereken de celconcentratie:
Celconcentratie =
- Bereken de levensvatbaarheid:
Levensvatbaarheid =
- Bereken de levensvatbaarheid:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Scheiding van het tongepitheel van het onderliggende mesenchym/bindweefsel
In de embryonale muistong is een opening in de subepitheelruimte zichtbaar na een goede enzymvertering. Epitheelbladen van sommige tongen worden tijdens de incubatie zonder mechanische kracht gescheiden.
In de volwassen muistong wordt een succesvolle enzyminjectie aangegeven door de zwelling in de geïnjecteerde gebieden (figuur 1B2), wat suggereert dat het enzym door de tong kan worden vastgehouden. Onvoldoende enzym en/of diepe naaldinbrengen in het mesenchyme en/of tongepitheelpenetratie met de naald zal een gedeeltelijke zwelling van het injectiegebied veroorzaken of helemaal geen zwelling. Na enzymvertering worden de onderliggende bindweefsels met de juiste enzymvertering los en plakkerig. Een opening in de sub-epitheelruimte is zichtbaar bij het voorzichtig optillen van de rand van het epitheelblad.
Effect van celdissociatie op totaal celaantal en levensvatbaarheid
Met stap 4 werden respectievelijk E12.5-tongen, de epitheelbladen en dunne lagen mesenchym direct onder het epitheel van tongen samengevoegd. Handmatig tellen van cellen met behulp van een hemocytometer (figuur 2) toonde aan dat het protocol in totaal 63.917 cellen opleverde met een levensvatbaarheid van 95,2% van de epitheelbladen (ongeveer0,3 mm2in grootte per tong) (figuur 1A3 ), en 294.333 cellen in totaal met een levensvatbaarheid van 96,3% van het mesenchym (ongeveer0,3mm per tong).
Met behulp van 10 volwassen tongen op de leeftijd van 8 weken werden de stukken van de epitheelbladen van de tongpunt (waar smaakpapillen dicht verdeeld zijn), epitheelbladen van circumvallaat papillen en dunne lagen bindweefsel direct onder het epitheel van circumvallaat papillen, respectievelijk samengevoegd. Een handmatig aantal cellen met behulp van de hemocytometer (figuur 2) toonde aan dat het protocol in totaal 187.333 cellen opleverde met een levensvatbaarheid van 95,4% uit epitheelbladen van tongpunt (ongeveer 0,075 mm2 in grootte per tong) (figuur 1B3), 544.000 cellen in totaal met een levensvatbaarheid van 96,3% uit epitheelbladen van circumvallaat papillen (ongeveer 0,1 mm2 in grootte per tong) (figuur 1B5), en 150.500 cellen in totaal met een levensvatbaarheid van 93% uit bindweefsel (ongeveer 0,1 mm2 in grootte per tong) (Figuur 1B6).
Figuur 1. Weefselvoorbereiding voor celdissociatie. A) Representatieve afbeeldingen van een E12.5 heel embryo (A1), dorsale weergave van de ontlede tong (A2) en epitheelbladen (A3) en mesenchym (A4) gescheiden van tongen. B) Representatieve beelden van een volwassen tong vóór (B1) en na enzyminjectie (B2). Dorsale weergave van een epitheelblad (B3) en mesenchym (B4) van tongpunt, en een epitheelblad (B5) en onderliggend bindweefsel (B6) van circumvallaat papilla. Schaalbalken: 1 mm in A1,A3, A4, B1,B2; 200 μm in A2; 100 μm in B3,B4, B5 en B6. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Representatieve beelden van geïsoleerde cellen gevisualiseerd in hemocytometer. A) Geïsoleerde cellen van epitheelbladen (A1) en mesenchym (A2) embryo's bij E12.5. B) Geïsoleerde cellen van epitheelplaten (B1) en onderliggende bindweefselkernen (B2) van circumvallaat papillen op de leeftijd van 8 weken. Stippellijnen omringen de rasters die in de rechterbovenhoek worden versterkt. Pijlen wijzen naar dode cellen bevlekt door Trypan blauw. Schaalbalken: 100 μm voor B1,B2,B3en B4; 25 μm voor krachtige beelden in de rechterbovenhoek. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tot op heden is er geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor celdissociatie van het tongepitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel. Dit huidige celdissociatieprotocol biedt een reproduceerbare procedure om een enkele celsuspensie te genereren met een hoge cel levensvatbaarheid (>90%) van tongweefsels van muizen, met inbegrip van epitheelbladen en mesenchyme/bindweefsels in zowel embryonale als postnatale stadia, ook al zijn geïsoleerde cellen van E12.5 en volwassen muizen verschillend in grootte. Geïsoleerde cellen uit het epitheel en mesenchyme van E12.5-muistongs zijn bijvoorbeeld consistent en klein in tegenstelling tot een grote variabiliteit (van klein naar groot) cellen van 8 weken oude muistong. Met het voordeel van de hoge levensvatbaarheid (>90%) van geïsoleerde cellen kan de opbrengende eencellige suspensie de downstreamexperimenten vergemakkelijken die een hoge kwaliteit van levensvatbare cellen vereisen (bv. RNA-sequencing met één cel en primaire celculturen).
Om de hoge levensvatbaarheid van cellen te garanderen, moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan verschillende belangrijke factoren. Een goede spijsverteringstijd met dispase en collagenasemengsel kan het epitheel effectief scheiden van mesenchym / onderliggend bindweefsel met behoud van de levensvatbare cellen. Een incubatietijd van 20 minuten voor de embryonale tong en een incubatietijd van 30 minuten voor de volwassen tong worden aanbevolen. Hoewel epitheelbladen gemakkelijk kunnen worden geschild na enzymvertering, wordt snijden met een schaar voor de scheiding aanbevolen, waardoor de stamcelpopulatie in het basale gebied van het tongepitheel kan behouden9. De keuze van 0,25% trypsine-EDTA boven trypsine alleen wordt sterk aanbevolen voor het scheiden van cellen, omdat 0,25% trypsine-EDTA cellen efficiënter kan scheiden en cellen in scheiding kan houden in vergelijking met de trypsine alleen. Het gebruik van op celkweek gebaseerd medium (DMEM/F12 met 10% FBS en 1% BSA) om cellen na enzymatische spijsvertering opnieuw op te schorten is cruciaal en draagt bij aan de hogere levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen in vergelijking met celsuspensiemedium (bijv. 1% BSA in 0,1 M PBS). Bovendien hebben geïsoleerde cellen in de loop van de tijd een hogere overlevingskans in dit medium: ten minste 3 uur zonder significante afname van de levensvatbaarheid van cellen. De pipettechniek is een andere kritische factor om een hoge cel levensvatbaarheid te garanderen. Het voorzichtig aspireren van het supernatant en het opnieuw opschorten van cellen met behulp van een pipet kan extra celverlies en fysieke schade aan cellen verminderen.
De concentratie van geïsoleerde cellen in een suspensie met één cel is een andere belangrijke overweging voor downstream-experimenten. In een totaal bepaald celnummer kan de celconcentratie worden aangepast op basis van het uiteindelijke volume van de geresuspendeerde oplossing. Voor de eerste studie wanneer het totale celaantal onbekend is, moet de resuspensie van geïsoleerde cellen beginnen bij een laag volume. Vervolgens kunnen geïsoleerde cellen worden verdund op basis van de vereisten van downstream-experimenten. Opmerkelijk is dat in onze op kweekmedium gebaseerde oplossing cellulaire aggregaten werden gevonden wanneer de concentratie hoger was dan 4000 cellen/μL (ongeveer 200 cellen per vierkant in hemocytometer). De optimale concentraties variëren van 500 tot 2500 cellen/μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten aangegeven.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health, subsidienummer R01DC012308 en R21DC018089 aan HXL. We danken Brett Marshall (University of Georgia, Athens, GA) en Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) voor technische bijstand en overleg over de celdissociatie; aan Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athens, GA) voor Engelse bewerking.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
