Summary
Vi har utvecklat ett generaliserat protokoll för att skilja en stor mängd högkvalitativa enstaka celler från epitel och mesenchyme /bindväv av embryonala och vuxna mus tungor.
Abstract
Celldisociation har varit ett viktigt förfarande för studier på individcellsnivå och/eller på cellpopulationsnivå (t.ex. RNA-sekvensering med en cell och primär cellkultur). Att ge livskraftiga, friska celler i stora mängder är avgörande, och de optimala förutsättningarna för att göra det är vävnadsberoende. Cellpopulationer i tungan epitel och underliggande mesenchyme/bindväv är heterogena och vävnad strukturer varierar i olika regioner och i olika utvecklingsstadier. Vi har testat protokoll för isolera celler från mus tungan epitel och mesenchyme/bindväv i de tidiga utvecklingsmässiga [embryonala dag 12,5 (E12,5)] och unga vuxna (8 veckor) stadier. En ren separation mellan epitel och underliggande mesenchyme/bindväv var lätt att åstadkomma. Men att ytterligare bearbeta och isolera celler, ge livskraftiga friska celler i stora mängder och noggrant urval av enzymatisk matsmältningsbuffert, inkubationstid och centrifugationshastighet och tid är avgörande. Inkubation av separerat epitel eller underliggande mesenkym/bindväv i 0,25% Trypsin-EDTA i 30 min vid 37 °C, följt av centrifugering vid 200 x g i 8 min resulterade i ett högt utbyte av celler med hög livskraft (>90%) oavsett musstadier och tungregioner. Dessutom fann vi att både dissocierade epitelial och mesenchymal/bindväv celler från embryonala och vuxna tungor kunde överleva i cell kultur-baserade medium för minst 3 h utan en betydande minskning av cell livskraft. Protokollen kommer att vara användbara för studier som kräver beredning av isolerade celler från mustunga vid tidig utveckling (E12.5) och unga vuxna (8-veckors) stadier som kräver celldisociation från olika vävnadsfack.
Introduction
Däggdjurstungan är ett komplext organ som är kritiskt för smak, tal och livsmedelsbearbetning. Den består av flera typer av högorganiserade vävnader som är indelade i mesenchyme/bindväv och täcks av ett stratifierat epitelpapper som innehåller smakpavalj och smaklökar. Cellpopulationer i både tungan epitel och mesenchyme/bindväv är heterogena. För att bättre förstå funktionerna och fördelningen av en viss typ av celler i tungan är studier med olika celler nödvändiga. Till exempel är RNA-sekvensering med en cell en kraftfull och hög genomströmningsmetod för transkriptionsprofilering i enskilda celler, som är utformad för att förstå transkriptionsbilden av komplex vävnad med en encellig upplösning1,2,3,4. Primär cellkultur har visat sig vara ett användbart verktyg för att studera funktionen och differentiering av stam/ stamceller för smaklökar5,6. Dessa studier kräver en stor mängd isolerade cellpopulationer av hög kvalitet (t.ex. tillräckligt totalt cellantal med rätt koncentration och hög livskraft).
Således finns det ett behov av att isolera celler från olika regioner i de språkliga vävnaderna och i olika utvecklingsstadier. För närvarande finns det inte ett detaljerat protokoll tillgängligt för cell dissociation från tungan epitel och underliggande mesenchyme/bindväv. Här rapporterar vi en optimerad celldisociationsmetod för att förbereda celler för experiment som kräver hög kvalitet på levande celler som för RNA-sekvensering med en cell och primära stamcellskulturer. Vi fann att val av enzymatisk matsmältningsbuffert, mild pipetting, val av återsuspension medium och optimal centrifugationstid och hastighet är avgörande för att generera dessa stora mängder högkvalitativa celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djuranvändning (C57BL/6 möss under hela studien) godkändes av University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee och var i enlighet med National Institutes of Health Guidelines för vård och användning av djur för forskning.
1. Djuranvändning
OBS: Möss uppföddes och underhålls i djuranläggningen vid institutionen för djur- och mejerivetenskap vid University of Georgia vid 22 °C under 12-h dag/natt cykler.
- Ange middagstid på dagen för vaginal pluggdetektering hos möss som embryonal (E) dag 0,5. Använd embryon på E12,5 och postnatala möss vid 8 veckors ålder för följande experiment.
2. Förberedelse före experiment
OBS: De instrument som krävs för detta protokoll anges i materialförteckningen.
- Autoklavinstrument före experimentet. Sterilisera instrumenten med hjälp av en pärlsteriliseringsmedel under försöket.
- Rengör operationsområdet, dissekeringsmikroskopet och biosäkerhetsskåpet med 70% etanolservetter. Slå på UV-ljuset på biosäkerhetsskåpet och håll det på i 20 minuter före experimentproceduren.
- Förbered en enzymblandning på 1:1 dispas (5,0 mg/ml) och kollagenas (2,0 mg/ml) till en slutlig koncentration på 2, 5 respektive 1,0 mg/ml och filtrera lösningen med 0,22 μm sprutfilter7.
- Förbered 1 ml enzymblandning för en vuxen tunga eller 0,5 ml för en viss region av tungan (t.ex. bakre eller främre tunga).
- Förbered 2 ml enzymblandning för embryonala tungor.
- Gör 10 ml 2,5% BSA i 0,1 M PBS och filtrera lösningen med 1 ml spruta och 0,22 μm sprutfilter.
- Gör 500 μL 5% FBS i DMEM/F12.
- Gör 3 ml DMEM/F12 innehållande 10% FBS och 1% BSA och filtrera lösningen med 1 ml spruta och 0,22 μm sprutfilter.
3. Separation av tungan epitel från mesenkym/underliggande bindväv
- Separation av epitel från mesenkymen på en E12,5 mustunga
- Avliva tidsbesprade dräktiga honmöss som bär E12,5-embryon genom att placera den i en CO2-kammare följt av livmoderhalsförskjutning.
OBS: Musembryon på E12.5 samlas in efter kl. 12.00 (eftermiddag) den tolfte dagen efter det att vaginaltugg upptäckts hos de gravida honmössen. - Överför möss till operationsområdet. Blöt mus buken med 70% etanol för att förhindra päls från att komma in i operationsplatsen.
- Öppna buken med hjälp av dissekerande sax för att exponera livmoderhornen som bär embryon. Dissekera livmoderhornen med hjälp av dissekerande sax och överför den till 15 ml färsk tyrods lösning i en 100 mm kulturrätt.
- Dissekera embryona (figur 1A1) ut från livmoderhorn under ett dissekerande mikroskop med minisax och fina tångar.
- Öppna försiktigt munhålan på vid gavel genom att använda fina tångar och dissekera av tungan från underkäken med minisax(figur 1A2).
- Tvätta tungorna med 15 ml färsk steril tyrodlösning i en 100 mm odlingsform.
- Överför vävnaderna till 2 ml enzymblandning av dispas (2,5 mg/ml) och kollagenas (1,0 mg/ml) i en 35 mm odlingsform med spatel och fina tångar i ett biosäkerhetsskåp. Inkubera i 20 min vid 37 °C.
- Överför tungor till 15 ml färsk steril tyrodlösning i en 100 mm odlingsform och ta försiktigt bort mesenkymen från epitelet från ventralsidan med fina tångar.
OBS: Epitelpapper kan separeras utan mekanisk kraft under inkubationen. - Tvätta den separerade epityren och mesenkymen två gånger i 15 ml färsk steril tyrodlösning i en 100 mm odlingsfat.
OBS: Aktiviteterna av dispase och kollagenas kommer att hämmas av EDTA i cell dissociation förfarandet (steg 4.1).
- Avliva tidsbesprade dräktiga honmöss som bär E12,5-embryon genom att placera den i en CO2-kammare följt av livmoderhalsförskjutning.
- Separation av tungan epitel från den underliggande bindväven hos vuxna möss
- Avliva musen vid 8 veckors ålder genom att placera den i en CO2-kammare. Bekräfta att musen avlivas utan andetag och forepaw-pinch svar.
- Överför mössen till operationsområdet. Blöt mushuvudet med 70% etanol för att förhindra päls från att komma in i munhålan.
- Skär hörnen av munnen längs kinden med hjälp av dissekerande sax för att öppna munhålan. Dissekera tungan med underställ (Figur 1B1) och lägg den i en plastform med ett lager plastfolie.
- Använd kirurgiska tångar för att hålla tungan under ett dissekerande mikroskop, injicera enzymblandningen av dispas (2,5 mg/ml) och kollagenas (1,0 mg/ml) i tungans subeptatelutrymme genom skäreggen (figur 1B1, pilar) på den bakre tungan.
- Injicera 1 ml enzymblandning jämnt till hela tungan för vävnadsuppsamling från både främre och bakre tungan.
- Injicera 0,5 ml enzymblandning lokalt till den främre tungan för vävnadsuppsamling från tungan spets eller till den bakre tungan för circumvallate papilla vävnad samling.
OBS: Tungan sväller när enzymet ackumuleras (Figur 1B2). Mild injektion av enzymet kan förhindra tryck från att skada epitel och hålla så mycket enzym som möjligt i tungan.
- Linda tungan med plastfolie och inkubera tungan i 30 min vid 37 °C.
- Använd minisax för att dissekera tungspetsen och/eller cirkumvallate papilla och använd spatel och fina tångar för att överföra vävnad till 15 ml färsk steril tyrodlösning i en 100 mm odlingsform.
- Separera epitel från den underliggande bindväven i det enzymsmälta subeptatelutrymmet med minisax. Trimma vävnaderna till en lämplig storlek enligt kravet på nedströmsexperiment.
- Tvätta det separerade epitelet och underliggande bindväv två gånger i 15 ml färsk steril tyrodlösning i en 100 mm odlingsform.
OBS: Aktiviteterna av dispase och kollagenas kommer att hämmas av EDTA i cell dissociation förfarandet (steg 4.1).
4. Celldisociation
OBS: Cell dissociation protokollet beskrivs här kan tillämpas på tungan epitel och mesenchyme/bindväv i både E12,5 embryonala och 8 veckor gamla möss. För att minska cellförlusten under agitation och överföring av cellfjädring, använd kommersiella pipettspetsar med låg retention eller förbelagda pipettspetsar med 2,5% BSA i 0,1 M PBS vid pH 7,48.
- Överför vävnaderna med spatel och fina tångar till 3 ml 0,25% trypsin-EDTA i en ny 35 mm odlingsform i 30 min vid 37 °C. Rör försiktigt om vävnader var 5:e minut med 1 ml pipettspetsar.
OBS: Kapa inte pipettspetsen eftersom skäreggen fysiskt kan skada de dissocierade cellerna. - Tillsätt 500 μL 5 % FBS i DMEM/F12 för att stoppa reaktionen och överföra mediet till ett 5 ml lågt bindningscentrifugrör.
- Centrifugcellsfjädring vid 200 x g i 8 min vid rumstemperatur och ta bort supernaten.
- Suspendera försiktigt cellerna i 3 ml DMEM/F12 som innehåller 10 % FBS och 1 % BSA med 1 mL pipettspetsar och filtrera cellerna med en 70 μm cellsil, följt av en cellsil på 35 μm.
- Centrifugcellsupphängning vid 200 x g i 8 min vid rumstemperatur. Ta bort det mesta av mediet och lämna 50-300 μL som den slutliga volymen för att åter suspendera celler.
OBS: Justera cellkoncentrationen enligt kraven i nedströmsexperiment genom att ändra den slutliga volymen av encellsfjädring.
5. Cellräknings- och lönsamhetstest med hemocytometer
OBS: För att förbättra mätnoggrannheten rekommenderas 3 tekniska replikat för varje prov.
- Blanda försiktigt 5-10 μL av encellsfjädringen med en lika stor mängd trypanblått och lägg till hemocytometern.
OBS: Rengör hemocytometern noggrant med 70% etanol före användning. Dammpartiklar på hemocytometern kommer att färgas i mörkblått och påverka noggrannheten i livskraftstestet. Kontrollera hemocytometern under ett mikroskop. - Räkna det totala cellnumret, antalet levande celler (vita) och antalet döda celler (mörkblå) som färgats av Trypan blue (figur 2, pilar) i 4 rutor med 16 rutnät (figur 2) med inverterat mikroskop med bildsystem.
- Beräkna cellkoncentrationen:
Cellkoncentration =
- Beräkna lönsamheten:
Livskraft =
- Beräkna lönsamheten:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Separation av tungan epitel från den underliggande mesenchyme/bindväv
I den embryonala mustungan är en lucka i det subeptaxiella utrymmet synlig efter korrekt enzymsmälta. Epitelial täcker av några tungor avskiljs utan mekaniskt styrka under inkubationen.
I den vuxna mustungan indikeras en lyckad enzyminjektion av svullnaden i de injicerade områdena (figur 1B2), vilket tyder på att enzymet kan hållas av tungan. Otillräcklig enzym och/eller djup nål insättningspunkten till mesenchyme och/eller tunga epitelial penetration med nål kommer att inducera en partiell svullnad i injektionsområdet eller ingen svullnad alls. Efter enzym matsmältningen blir de underliggande bindvävarna med korrekt enzym matsmältning lös och klibbig. Ett mellanrum i det subeptatelutrymmet är synligt när epitelplåtens kant försiktigt lyfts.
Effekten av celldisociation på totalt cellnummer och livskraft
Med steg 4, E12,5 tungor, epitelial ark och tunna lager av mesenchyme omedelbart under epitel av tungor slogs samman, respektive. Manuell cellräkning med hjälp av en hemocytometer (figur 2) visade att protokollet gav totalt 63 917 celler med en livskraft på 95,2 % från epitellakan (cirka 0,3 mm2 i storlek per tunga) (Figur 1A3) och totalt 294 333 celler med en livskraft på 96,3 % från mesenkymen (cirka 0,3 mm2 i storlek per tunga) (figur 1A4).
Med hjälp av 10 vuxna tungor vid 8 veckors ålder, bitarna av epitelial ark av tungan spetsen (där smak knoppar är tätt fördelade), epitelial ark av circumvallate papillae och tunna lager av bindväv omedelbart under epitel av circumvallate papillae poolades, respektive. Ett manuellt cellantal med hjälp av hemocytometern (figur 2) visade att protokollet gav totalt 187 333 celler med en livskraft på 95,4 % från epiteliala plåtar med tungspets (cirka 0,075 mm2 i storlek per tunga) (figur 1B3),totalt 544 000 celler med livskraft 96,3 % från epitelialplåtar av cirkumvallate papillae (cirka 0,1 mm2 i storlek per tunga) (figur 1B5) och totalt 150 500 celler med en livskraft på 93 % från bindväv (cirka 0,1 mm2 i storlek per tunga) (figur 1B6).
Figur 1. Vävnadspreparat för celldisorientering. A) Representativa bilder av ett helt embryo på E12,5 (A1),dorsala vy över den dissekerade tungan (A2)och epitelblad (A3)och mesenkym (A4)separerade från tungor. B) Representativa bilder av en vuxen tunga före (B1) och efter enzyminjektion (B2). Dorsal vy över ett epitelialark (B3) och mesenchyme (B4)av tungan spets och ett epitelial ark (B5)och underliggande bindväv (B6)av circumvallate papilla. Skalstänger: 1 mm i A1,A3, A4, B1, B2; 200 μm i A2; 100 μm i B3,B4, B5 och B6. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Representativa bilder av isolerade celler visualiseras i hemocytometer. A) Isolerade celler från epitelialark (A1)och mesenkym (A2)av embryon vid E12.5. B) Isolerade celler från epiteliala ark (B1)och underliggande bindvävskärnor (B2)av cirkumvallate papillae vid 8 veckors ålder. Streckade linjer omger rutnäten som förstärks i det övre högra hörnet. Pilar pekar på döda celler färgade av Trypan blue. Skalstänger: 100 μm för B1,B2,B3och B4; 25 μm för högeffektsbilder i övre högra hörnet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hittills har det inte funnits ett detaljerat protokoll tillgängliga för cell dissociation från tungan epitel och underliggande mesenchyme/bindväv. Detta nuvarande cell dissociation protokoll ger en reproducerbar procedur för att generera en enda cell suspension med hög cell livskraft (>90%) från mustunga vävnader, inklusive epitelial ark och mesenchyme/bindväv i både embryonala och postnatala stadier även om isolerade celler från E12.5 och vuxna möss är olika i storlek. Till exempel är isolerade celler från epitel och mesenchyme av E12,5 mustunga konsekventa och små i motsats till en stor variabilitet (från liten till stor) av celler från 8 veckor gammal mustunga. Med fördelen av den höga lönsamheten (>90%) isolerade celler kan den uppvisade encelliga suspensionen underlätta de nedströmsexperiment som kräver hög kvalitet på livskraftiga celler (t.ex. RNA-sekvensering med en cell och primära cellkulturer).
För att garantera cellernas höga livskraft måste man vara uppmärksam på flera viktiga faktorer. En korrekt matsmältningstid med dispase och collagenase blandning kan effektivt separera epitel från mesenchyme/underliggande bindväv samtidigt bevara de livskraftiga cellerna. En inkubation på 20 minuter för den embryonala tungan och en inkubation på 30 minuter för vuxentungan rekommenderas. Även om epitelialark lätt kan skalas efter enzym matsmältning, rekommenderas skärning med sax för separationen, vilket kan bevara stamcellspopulationen i det basala området av tungan epitel9. Valet av 0,25% trypsin-EDTA över trypsin ensam rekommenderas starkt för att separera celler som 0,25% trypsin-EDTA kan separera celler mer effektivt och hålla celler i separation jämfört med trypsin ensam. Användningen av cellkulturbaserat medium (DMEM/F12 som innehåller 10% FBS och 1% BSA) för att åter suspendera celler efter enzymatisk matsmältning är avgörande och bidrar till den högre livskraften hos isolerade celler jämfört med cellupphängningsmedium (t.ex. 1% BSA i 0, 1 M PBS). Dessutom har isolerade celler en högre överlevnadsgrad i detta medium över tid: minst 3 h utan signifikant minskning av cellens livskraft. Rörtekniken är en annan kritisk faktor för att säkerställa en hög cell livskraft. Att försiktigt aspirera på supernaten och återhänga celler med en pipett kan minska extra cellförlust och fysiska skador på celler.
Koncentrationen av isolerade celler i en enda cell suspension är en annan viktig faktor för nedströms experiment. I ett totalt givet cellnummer kan cellkoncentrationen justeras baserat på den slutliga volymen återanvändd lösning. För den första prövningen när totalt cellnummer är okänt bör återsuspension av isolerade celler börja med låg volym. Sedan kan isolerade celler spädas ut baserat på kraven i nedströmsexperiment. Observera, i vår kultur medium baserade lösning, cellulära aggregat hittades när koncentrationen var högre än 4000 celler/μL (cirka 200 celler per kvadrat i hemocytometer). De optimala koncentrationerna varierar från 500 till 2500 celler/μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Institutes of Health, bidragsnummer R01DC012308 och R21DC018089 till HXL. Vi tackar Brett Marshall (University of Georgia, Aten, GA) och Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) för teknisk hjälp och samråd om celldisociation; till Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Aten, GA) för engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
