Summary
Vi har udviklet en generaliseret protokol til at adskille en stor mængde af høj kvalitet enkeltceller fra epitel og mesenchyme / bindevæv af embryonale og voksne mus tunger.
Abstract
Celleafstyrering har været en væsentlig procedure for undersøgelser på individcelleniveau og/eller på cellepopulationsniveau (f.eks. sekvensering af enkeltcellet RNA og primær cellekultur). Det er afgørende at give levedygtige, sunde celler i store mængder, og de optimale betingelser for at gøre det er vævsafhængige. Cellepopulationer i tungeepitelet og underliggende mesenchym/bindevæv er heterogene, og vævsstrukturerne varierer i forskellige regioner og på forskellige udviklingsstadier. Vi har testet protokoller for isolering af celler fra musetungepitelet og mesenchym/bindevæv i de tidlige udviklingsstadier [embryonal dag 12.5 (E12.5)] og unge voksne (8 uger) stadier. En ren adskillelse mellem epitel og underliggende mesenchym / bindevæv var let at opnå. Men for yderligere at behandle og isolere celler, giver levedygtige raske celler i store mængder, og omhyggelig udvælgelse af enzymatisk fordøjelse buffer, inkubationstid, og centrifugering hastighed og tid er kritiske. Inkubation af adskilt epitel eller underliggende mesenchym/bindevæv i 0,25% Trypsin-EDTA i 30 min ved 37 °C, efterfulgt af centrifugering ved 200 x g i 8 min. resulterede i et højt udbytte af celler ved en høj levedygtighed (>90%) uanset musestadierne og tungeregionerne. Desuden fandt vi, at både dissociated epitel og mesenchymal / bindevævsceller fra embryonale og voksne tunger kunne overleve i cellen kultur-baserede medium i mindst 3 timer uden et betydeligt fald i celle levedygtighed. Protokollerne vil være nyttige til undersøgelser, der kræver forberedelse af isolerede celler fra musetunger ved tidlig udvikling (E12.5) og unge voksne (8-ugers) stadier, der kræver celleafkobling fra forskellige vævsrum.
Introduction
Pattedyrets tunge er et komplekst organ, der er kritisk for smag, tale og fødevareforarbejdning. Det består af flere typer af velorganiseret væv opdelt af mesenchym / bindevæv og dækket af et stratificeret epitelark, der indeholder smag papiller og smagsløg. Cellepopulationer i både tunge epitel og mesenchym / bindevæv er heterogene. For bedre at forstå funktionerne og fordelingen af en bestemt type celler i tungen er undersøgelser ved hjælp af dissocierede celler nødvendige. For eksempel er enkeltcellet RNA-sekventering en kraftfuld og højoverførselsmetode til transskriptionsprofilering i individuelle celler, som er designet til at forstå transskriptionen af komplekst væv ved en enkeltcellet opløsning1,2,3,4. Primærcellekultur har vist sig at være et nyttigt redskab til at studere stamcellers funktion og differentiering for smagsløg5,6. Disse undersøgelser kræver en stor mængde isolerede cellepopulationer af høj kvalitet (f.eks. tilstrækkeligt samlet celleantal med korrekt koncentration og høj levedygtighed).
Der er således behov for at isolere celler fra forskellige regioner i det lingualvæv og på forskellige udviklingsstadier. I øjeblikket er der ikke en detaljeret protokol til rådighed for celle dissociation fra tungen epitel og underliggende mesenchyme / bindevæv. Her rapporterer vi en optimeret celleafkoblingsmetode til at forberede celler til eksperimenter, der kræver en høj kvalitet af levende celler, f.eks. til enkeltcelle-RNA-sekventering og primære stamcellekulturer. Vi fandt, at valg af enzymatisk fordøjelsesbuffer, blid pipetting, valg af resuspensionsmedium og optimal centrifugeringstid og hastighed er afgørende for at generere disse store mængder celler af høj kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrefoder (C57BL/6 mus i hele undersøgelsen) blev godkendt af University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee og var i overensstemmelse med National Institutes of Health Guidelines for care and use of animals til forskning.
1. Anvendelse af dyr
BEMÆRK: Mus blev opdrættet og vedligeholdt i dyre- og mejerividenskabsafdelingens dyre- og mejerividenskabsafdeling ved University of Georgia ved 22 °C under 12-timers dag/nat-cyklusser.
- Udpeg middag på dagen for påvisning af vaginale stik i mus som embryonal (E) dag 0,5. Brug embryoner ved E12.5 og postnatal mus ved 8 uger til følgende forsøg.
2. Forberedelse før forsøg
BEMÆRK: De instrumenter, der kræves til denne protokol, er anført i materialeoversigten.
- Autoklave instrumenter før eksperimentet. Steriliser instrumenter ved hjælp af en perlesterilisator under forsøget.
- Rengør det kirurgiske område, dissekere mikroskopet og biosikkerhedsskabet ved hjælp af 70% ethanolservietter. Tænd UV-lyset fra biosikkerhedsskabet, og hold det tændt i 20 minutter før forsøgsproceduren.
- Der fremstilles en enzymblanding på 5,0 mg/mL og kollagen (2,0 mg/mL) til en endelig koncentration på henholdsvis 2,5 og 1,0 mg/mL, og opløsningen filtreres med 0,22 μm sprøjtefilter7.
- Der fremstilles 1 mL enzymblanding til en voksen tunge eller 0,5 mL til et bestemt tungeområde (f.eks. bagdel eller forreste tunge).
- Der fremstilles 2 mL enzymblanding til embryonale tunger.
- Der fremstilles 10 ml 2,5% BSA i 0,1 M PBS, og opløsningen filtreres med 1 ml sprøjte og 0,22 μm sprøjtefilter.
- Lav 500 μL på 5% FBS i DMEM/F12.
- Der fremstilles 3 ml DMEM/F12, der indeholder 10% FBS og 1% BSA, og opløsningen filtreres med 1 ml sprøjte og 0,22 μm sprøjtefilter.
3. Adskillelse af tungeepitelet fra mesenchymet/det underliggende bindevæv
- Adskillelse af epitel fra mesenchymet af en E12.5 musetunge
- Aflive tidsindstillede gravide hunmus med E12.5 embryoner ved at placere det i et CO2 kammer efterfulgt af cervikal dislokation.
BEMÆRK: Musefostre på E12.5 indsamles efter kl. 12 (eftermiddag) den 12. dag efter påvisning af vaginalt stik i de gravide hunmus. - Overfør mus til det kirurgiske område. Våd musen maven ved hjælp af 70% ethanol for at forhindre pels i at komme ind på driftsstedet.
- Åbn maven ved hjælp af dissekerende saks for at udsætte livmoderhornene, der bærer embryoner. Dissekere livmoderhornene ved hjælp af dissekerende saks og overfør den til 15 ml frisk Tyrodes opløsning i en 100 mm kulturret.
- Disseker embryonerne (Figur 1A1) ud fra livmoderhorn under et dissekerende mikroskop ved hjælp af minisaks og fine pincet.
- Åbn forsigtigt mundhulen bredt ved hjælp af fine pincet og disseker tungen fra underkæbbet ved hjælp af minisaks(Figur 1A2).
- Vask tungerne med 15 ml frisk steril Tyrodes opløsning i en 100 mm dyrkningsskål.
- Vævene overføres til 2 mL enzymblanding af dispase (2,5 mg/mL) og kollagen (1,0 mg/mL) i en 35 mm dyrkningsskål med spatel og fine pincet i et biosikkerhedsskab. Inkuber i 20 min ved 37 °C.
- Overfør tunger til 15 ml frisk steril Tyrodes opløsning i en 100 mm dyrkningsskål, og fjern forsigtigt mesenchymet fra epitelet fra ventralsiden med fine pincet.
BEMÆRK: Epitelplader kan adskilles uden mekanisk kraft under inkubationen. - Den adskilte epithelia og mesenchym vaskes to gange i 15 ml frisk steril Tyrodes opløsning i en 100 mm kulturret.
BEMÆRK: Aktiviteterne i dispase og kollagen vil blive hæmmet af EDTA i celledissociationsproceduren (trin 4.1).
- Aflive tidsindstillede gravide hunmus med E12.5 embryoner ved at placere det i et CO2 kammer efterfulgt af cervikal dislokation.
- Adskillelse af tungeepitelet fra det underliggende bindevæv fra voksne mus
- Aflive musen ved 8 uger ved at placere den i en CO2 kammer. Bekræft, at musen er aflivet uden vejrtrækninger og forepaw-pinch svar.
- Overfør musene til det kirurgiske område. Våd musehovedet ved hjælp af 70% ethanol for at forhindre pels i at komme ind i mundhulen.
- Skær hjørnerne af munden langs kinden ved hjælp af dissekering saks til at åbne mundhulen. Disseker tungen med mandible(Figur 1B1)og læg den i en plastikskål med et lag plastfolie.
- Brug kirurgiske pincet til at holde tungen under et dissekerende mikroskop, injicere enzymblandingen af dispase (2,5 mg/mL) og kollagen (1,0 mg/mL) i det sub-epiteliske rum i tungen gennem skærkanten (Figur 1B1, pile) af den bageste tunge.
- Der injiceres 1 mL enzymblanding jævnt på hele tungen til vævsindsamling fra både forreste og bageste tunge.
- Der injiceres 0,5 mL enzymblanding lokalt på den forreste tunge til vævsindsamling fra tungespidsen eller til den bageste tunge til omkreds af papillavævsindsamling.
BEMÆRK: Tungen vil svulme op, efterhånden som enzymet akkumuleres (Figur 1B2). En blid injektion af enzymet kan forhindre tryk i at beskadige epitelet og holde så meget enzym som muligt i tungen.
- Tungen ombrydes med plastfolie, og tungen inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- Brug minisaks til at dissekere tungespidsen og/eller omkredse papillaen, og brug spatel og fine pincet til at overføre væv til 15 ml frisk steril Tyrodes opløsning i en 100 mm kulturret.
- Adskil epitelet fra det underliggende bindevæv i det enzymfordrede subepitele rum ved hjælp af minisaks. Trim vævene til en passende størrelse i henhold til kravet om downstream-forsøg.
- Det adskilte epitel og det underliggende bindevæv vaskes to gange i 15 ml frisk steril Tyrode-opløsning i en 100 mm kulturret.
BEMÆRK: Aktiviteterne i dispase og kollagen vil blive hæmmet af EDTA i celledissociationsproceduren (trin 4.1).
4. Celleafkobling
BEMÆRK: Den her beskrevne protokol om celleafkobling kan anvendes på tungeepitelet og mesenchymet/bindevævet i både E12.5 embryonale og 8 uger gamle mus. For at reducere celletabet under omrøring og overførsel af celleaffjedring skal du bruge kommercielle pipettespidser med lav retention eller forbelagte pipettespidser med 2,5% BSA i 0,1 M PBS ved pH 7,48.
- Vævene overføres med spatel og fin pincet til 3 mL på 0,25% trypsin-EDTA i en ny 35 mm dyrkningsskål i 30 minutter ved 37 °C. Omrør forsigtigt væv hvert 5. minut med 1 mL pipettespidser.
BEMÆRK: Rørspidsen må ikke skæres over, da skærkanten fysisk kan beskadige de dissociated celler. - Der tilsættes 500 μL på 5% FBS i DMEM/F12 for at stoppe reaktionen og overføre mediet til et 5 mL lavt bindende centrifugerør.
- Centrifuge celleaffjedring ved 200 x g i 8 minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten.
- Forsigtigt suspendere celler i 3 mL DMEM/F12, der indeholder 10% FBS og 1% BSA ved hjælp af 1 mL pipettespidser og filtrerer cellerne ved hjælp af en 70 μm cellesien, efterfulgt af en 35 μm cellestængel.
- Centrifuge celleaffjedring ved 200 x g i 8 minutter ved stuetemperatur. Fjern det meste af mediet og lad 50-300 μL være det sidste volumen for at suspendere cellerne igen.
BEMÆRK: Juster cellekoncentrationen i overensstemmelse med kravene i downstream-eksperimenter ved at ændre det endelige volumen af enkeltcelleaffjedring.
5. Celletællings- og levedygtighedstest ved hjælp af hæmocytometer
BEMÆRK: For at forbedre målenøjagtigheden anbefales 3 tekniske replikater for hver prøve.
- Bland forsigtigt 5-10 μL af enkeltcelleaffjedringen med et lige stort trypanblåt og tilsæt på hæmocytometeret.
BEMÆRK: Rengør hæmometeret grundigt ved hjælp af 70% ethanol før brug. Støvpartikler på hæmocytometeret vil blive farvet i mørkeblå og påvirke nøjagtigheden af levedygtighedstesten. Tjek hæmometeret under et mikroskop. - Det samlede cellenummer, antallet af levende celler (hvid) og antallet af døde celler (mørkeblå), der farves af trypanblå (Figur 2, pile) i henholdsvis 4 kvadrater med 16 gitre (Figur 2) ved hjælp af omvendt mikroskop med billedsystem.
- Beregn cellekoncentrationen:
Cellekoncentration =
- Beregn levedygtigheden:
Levedygtighed =
- Beregn levedygtigheden:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adskillelse af tungeepitelet fra det underliggende mesenchym/bindevæv
I den embryonale musetunge er et hul i det sub-epitelrum synligt efter korrekt enzym fordøjelse. Epitelplader af nogle tunger adskilles uden mekanisk kraft under inkubationen.
I voksenmusetungen indikeres en vellykket enzymindsprøjtning af hævelsen i de injicerede områder (Figur 1B2), hvilket tyder på, at enzymet kan holdes af tungen. Utilstrækkelig indføring af enzym og/eller dyb nål i mesenchymet og/eller tungens epitelindtrængning med nål vil medføre en delvis hævelse af injektionsområdet eller slet ingen hævelse. Efter enzym fordøjelsen, de underliggende bindevæv med korrekt enzym fordøjelsen bliver løs og klæbrig. Et hul i det subepitele rum er synligt, når du forsigtigt løfter kanten af epitelpladen.
Effekt af celleafkobling på det samlede celletal og levedygtighed
Med trin 4, E12.5 tunger, epitelplader, og tynde lag af mesenchyme umiddelbart under epitel af tunger blev samlet, henholdsvis. Manuel celletælling ved hjælp af et hæmocytometer (figur 2) viste, at protokollen gav i alt 63.917 celler med en levedygtighed på 95,2% fra epitelpladerne (ca. 0,3 mm2 i størrelse pr. tunge ) (Figur 1A3) og 294.333 celler i alt med en levedygtighed på 96,3% fra mesenchymet (ca. 0,3 mm2 i størrelse pr. tunge)(figur 1A4).
Ved hjælp af 10 voksne tunger ved 8 uger blev stykkerne af tungespidsens epitelplader (hvor smagsløgene er tæt fordelt), epitelplader af circumvallate papillae og tynde lag bindevæv umiddelbart under epitelet af circumvallate papillae henholdsvis samlet. Et manuelt celleantal ved hjælp af hæmocytometeret (figur 2) viste, at protokollen gav i alt 187.333 celler med en levedygtighed på 95,4% fra epitelplader af tungespids (ca. 0,075 mm2 i størrelse pr. tunge) (Figur 1B3), 544.000 celler i alt med en levedygtighed 96,3% fra epitelplader af circumvallate papillae (ca. 0,1 mm2 i størrelse pr. tunge) (figur 1B5) og 150.500 celler i alt med en levedygtighed på 93% fra bindevæv (ca. 0,1 mm2 i størrelse pr. tunge) (Figur 1B6).
Figur 1. Vævsforberedelse til celleafkobling. A) Repræsentative billeder af et E12.5 hele embryon (A1),dorsal visning af dissekeret tunge (A2) og epitelplader (A3) og mesenchym (A4)adskilt fra tunger. B) Repræsentative billeder af en voksen tunge før (B1) og efter enzymindsprøjtning (B2). Dorsal visning af et epitelark (B3)og mesenchym (B4)af tungespidsen og et epitelark (B5)og underliggende bindevæv (B6)af circumvallate papilla. Skalastænger: 1 mm i A1, A3, A4, B1, B2; 200 μm i A2; 100 μm i B3, B4, B5 og B6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative billeder af isolerede celler visualiseret i hæmocytometer. A)Isolerede celler fra epitelplader (A1)og mesenchym (A2)af embryoner ved E12.5. B)Isolerede celler fra epitelplader (B1)og underliggende bindevævskerner (B2) af circumvallate papillae ved 8 ugers alderen. Stiplede linjer omkranser de gitre, der forstærkes i øverste højre hjørne. Pile peger på døde celler farves af Trypan blå. Skalastænger: 100 μm for B1,B2, B3og B4; 25 μm for billeder med høj effekt i øverste højre hjørne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til dato har der ikke været en detaljeret protokol til rådighed for celle dissociation fra tungen epitel og underliggende mesenchyme / bindevæv. Denne aktuelle protokol til celleafstyrering giver en reproducerbar procedure til generering af en suspension af en enkelt celle med en høj celles levedygtighed (>90%) fra musetungevæv, herunder epitelplader og mesenchym/bindevæv på både embryonale og postnatale stadier, selv om isolerede celler fra E12.5 og voksne mus er forskellige i størrelse. For eksempel er isolerede celler fra epitel og mesenchym af E12.5 musetunger konsekvente og små i modsætning til en stor variation (fra lille til stor) af celler fra 8 uger gammel musetunge. Med fordelen ved den høje levedygtighed (>90%) af isolerede celler kan den gav enkeltcellesuspension lette downstream-eksperimenter, der kræver høj kvalitet af levedygtige celler (f.eks. RNA-sekventering af en enkelt celle og primære cellekulturer).
For at sikre cellernes høje levedygtighed skal der lægges stor vægt på flere vigtige faktorer. En ordentlig fordøjelsestid med dispase og kollagenblanding kan effektivt adskille epitelet fra mesenchym / underliggende bindevæv og samtidig bevare de levedygtige celler. En 20 minutters inkubation til fostertungen og en 30 minutters inkubation til voksentungen anbefales. Selvom epitelplader let kan skrælles efter enzym fordøjelse, anbefales det at skære med en saks til adskillelsen, hvilket kan bevare stamcellepopulationen i tungeepitelets basale område9. Valget af 0,25% trypsin-EDTA over trypsin alene anbefales stærkt til dissociering af celler, da 0,25% trypsin-EDTA kan adskille celler mere effektivt og holde celler i adskillelse sammenlignet med trypsin alene. Brugen af cellekulturbaseret medium (DMEM/F12, der indeholder 10% FBS og 1% BSA) til at suspendere celler igen efter enzymatisk fordøjelse er afgørende og bidrager til isolerede cellers højere levedygtighed sammenlignet med celleaffjedringsmedium (f.eks. 1% BSA i 0,1 M PBS). Derudover har isolerede celler en højere overlevelsesrate i dette medium over tid: mindst 3 timer uden signifikant fald i cellelevedygtighed. Pipetting-teknikken er en anden kritisk faktor for at sikre en høj celle levedygtighed. Hvis du forsigtigt aspirerer supernatanten og suspenderer cellerne igen ved hjælp af en pipette, kan det reducere ekstra celletab og fysisk skade på cellerne.
Koncentrationen af isolerede celler i en enkelt celle suspension er en anden vigtig overvejelse for downstream eksperimenter. I et givet celletal kan cellekoncentrationen justeres på basis af det endelige volumen af genbrugt opløsning. For det første forsøg, hvor det samlede celletal er ukendt, skal genopstpensionen af isolerede celler starte ved et lavt volumen. Derefter kan isolerede celler fortyndes baseret på kravene til downstream-eksperimenter. Bemærk, at der i vores kulturmediebaserede opløsning blev fundet cellulære aggregater, da koncentrationen var højere end 4000 celler/μL (ca. 200 celler pr. kvadrat i hæmocytometer). De optimale koncentrationer varierer fra 500 til 2500 celler/μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health, tilskud nummer R01DC012308 og R21DC018089 til HXL. Vi takker Brett Marshall (University of Georgia, Athen, GA) og Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) for teknisk bistand og høring vedrørende celleafmærkningen; til Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athen, GA) for engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
