Summary
このプロトコルは、神経系の発達中にH2O2の生理的シグナル伝達役割を評価するための培養ゼブラフィッシュニューロンおよび幼虫における遺伝的にコードされた過酸化水素(H2O2)バイオセンサーの使用を記述する。それは、異なる細胞タイプに適用し、一般的な開発で活性酸素種(ROS)を研究するために実験的な治療で変更することができます。
Abstract
活性酸素種(ROS)は、正常な発達、恒常性、生理学において重要なシグナル伝達分子として確立されています。異なるROSの中で、過酸化水素(H2O2)は、細胞シグナル伝達における役割に関して最もよく特徴づけられる。H2O2は、いくつかの種の発達中に関与している。例えば、H2O2の一過性の増加は、受精後の最初の日の間にゼブラフィッシュ胚で検出された。さらに、重要な細胞H2O2源を枯渇させることは、NADPHオキシダーゼ(NOX)、生体内およびインビトロの両方で分化、軸索成長、およびレチナルガングリオン細胞(RGC)の誘導などの神経系の発達を損なう。ここでは、遺伝的にコードされたH2O2特異的バイオセンサーroGFP2-Orp1を用いて、開発中に培養されたゼブラフィッシュニューロンおよび全幼虫における細胞内H2O2レベルをイメージングする方法について説明する。このプローブは、ゼブラフィッシュの幼虫で一過性または安定して発現することができる。さらに、レシオメトリック読み出しは、遺伝子発現の差異や体積効果によるアーチファクトの検出の確率を低下させます。まず、roGFP2-Orp1を一過性発現するゼブラフィッシュ胚由来のRGCを単離し、培養する方法を示す。次に、幼虫全体を使用して、組織レベルでH2O2レベルを監視します。センサーは、H2O2の追加によって検証されています。さらに、この方法論は、組織特異的バイオセンサー発現を有するトランスジェニック動物を生成することによって、特定の細胞タイプおよび組織におけるH2O2レベルを測定するために使用することができる。ゼブラフィッシュが遺伝的および発達的操作を促進するにつれて、ここで実証されたアプローチは、脊椎動物における神経および一般的な胚発生中のH2O2の役割をテストするパイプラインとして役立つ可能性がある。
Introduction
活性酸素種(ROS)シグナル伝達は神経系1の発達および機能を調節する。重要な細胞ROS源は、過酸化水素と過酸化水素を生成する膜貫通タンパク質であるNADPHオキシダーゼ(NOX)である(H2O2)2。NOX酵素は中枢神経系(CNS)全体に見られ、NOX由来のROSは神経細胞の発達に寄与する3、4、5、6。神経幹細胞の維持と分化、神経極性の確立、神経突起伸長、およびシナプス可塑性は、ROS7、8、9、10、11の十分なレベルを必要とすることが示されている。一方、NOXesによるROSの制御不能な産生は、アルツハイマー病、多発性硬化症、および外傷性脳損傷12、13、14を含む神経変性疾患に寄与する。したがって、生理学的に関連するROSの産生は、健康な状態を維持するために重要である。
遺伝子組み換えバイオセンサーの開発は、細胞ROSの検出を大いに促進した。遺伝子組み換えバイオセンサーの重要な利点の1つは、ROS信号の時間的および空間分解能の増加であり、これらのセンサーは特異的に異なる場所を標的とすることができる。レドックス感受性GFP(roGFP)は、ROSバイオセンサーのような一種である。roGFP2-Orp1変異体は、特にそのOrp1ドメインを介してH2O2を検出し、これは酵母15、16由来のグルタチオンペルオキシレドキシンファミリータンパク質である。Orp1タンパク質の酸化は、その立体構造を変化させるためにroGFP2に移される(図1A)。このプローブは、405 nmおよび480 nm付近の2つの励起ピークと、515 nmの単一の放出ピークを示す。酸化すると、励起ピーク周辺の蛍光強度が変化する:405nm励起が増加する一方で、480nmの励起は減少する。従って、roGFP2-Orp1は、レシオメトリックバイオセンサであり、H2O2-レベルは、2つの異なる波長で励起された蛍光強度の比によって検出される(図1B)。全体的に見て、roGFP2-Orp1は、インビボで効率的に利用することができるROSイメージング用の汎用性の高いツールです。
図1: roGFP2-Orp1の模式的表現と励起スペクトル(A)は、H2O2に応答してOrp1とroGFP2の間で酸化伝達が起こり、roGFP2の立体構造変化をもたらす。(B)roGFP2-Orp1の励起スペクトルは、405 nmおよび480 nmの2つの励起ピークと515 nmの単一放出ピークを示す。H2O2による酸化の際、405nm励起は増加し、480nm励起は減少する。この結果、H2 O2の比率の読み出しが得られます。この数字は、ビランとベロウソフ(2017)16とモルガンら(2011)25から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Danio rerio(ゼブラフィッシュ)モデルシステムは、遺伝的にコード化されたバイオセンサーを適用するためのいくつかの利点を有する。胚および幼虫の光学的透明性は、生体内での非侵襲的なイメージングを可能にする。新しいイメージングツールは、より高い解像度と深い浸透を達成するために開発されています17.さらに、遺伝子操作(異所性mRNA発現、Tol2トランスジェネシス等)やゲノム編集(タレンス、CRISPR/Cas9等)の樹立されたツールがあり、トランスジェニック動物18の生成を促進する。ゼブラフィッシュの胚が母親の外で発達するにつれて、このシステムはさらに胚の容易なアクセスおよび操作を可能にする。例えば、1細胞段階の注射や薬物治療は簡単に行うことができます。
ここでは、ゼブラフィッシュを用いて、生体転写mRNAを注入してH2O2特異的バイオセンサーroGFP2-Orp1を一時的に発現させた。これらの胚は、培養ニューロンのインビトロイメージングとインビボイメージングの両方に使用することができる(図2)。ゼブラフィッシュ胚からの解剖およびメッキのレチナル神経節細胞(RGC)のプロトコルを説明し、続いて培養ニューロンにおけるH2O2-レベルを評価する。次に、共焦点顕微鏡を用いてroGFP2-Orp1発現胚および幼虫のインビボイメージング法を提示する。このアプローチは、生理学的なH2O2-レベルを決定するだけでなく、異なる発達段階または条件で起こる潜在的な変化を決定することを可能にする。全体として、このシステムは、生きた細胞および動物におけるH2O2を検出するための信頼できる方法を提供し、H2O2の発達、健康および疾患における役割を研究する。
図 2.実験アプローチの概要簡単に言えば、胚採取後、roGFP2-Orp1 mRNAを、ゼブラフィッシュ胚の1細胞期の黄身に注入する。現像胚は、インビトロ(A)および(B)インビボイメージングの両方に使用することができる。(A) GFP陽性胚は、34 hpfでのRGC採取のためのレティナを解剖するために使用される。解約されたRGCは、ZFCM(+)メディアのPDL/ラミニンコーティングカバーリップにメッキされています。成長コーンイメージングは、GMCが6〜24時間のめっき後に軸索を延長するにつれて行うことができる。細胞は、H2O2-レベルにおける潜在的変化を測定するために異なる治療を施すことができる。ここでは、RGCの成長コーンにおけるH2O2-レベル(赤色)を測定した。(B)GFP陽性胚は生体内イメージングに使用される。望ましい年齢で、胚は共焦点のイメージ投射のための35のmmガラスの底の皿に麻酔され、取付けることができる。ここでは、胚は、画像の再生のために腹孔に取り付けられている。概略図はゼブラフィッシュのレチナルの発達を示す。GGCは、残膜の最も内側の層であるガングリオン細胞層(GCL)を形成する。RGC軸索は、正中線を横切るために視神経に発達し、視神経を形成する。その後、RGC軸索は、中脳の視状体でシナプスを作るためにドーサリーに成長する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
すべての動物実験は、2020年7月24日に承認されたプロトコルを持つNIHガイドライン 2006002050に従って、パデュー動物ケアおよび使用委員会(PACUC)によって倫理的に審査され、承認されました。
1. ソリューションの準備
- E2メディア(1x)
- 表1に示す全ての成分を組み合わせることにより、100x E2A(500mL)、500x E2B(100mL)および500x E2C(100mL)溶液を調製する。オートクレーブE2A、E2BおよびE2Cのソリューション。4 °Cで保管。
- 1x E2メディアの場合:5 mLの100x E2A、500x E2Bの1mL、500x E2Cの1 mLを組み合わせます。滅菌水で500mLにボリュームを持参してください。pH を 7.0 から 7.5 に調整します。
- 長期保存のために-20 °Cで1x E2メディアストアの50 mLのアリコートを準備してください。しかし、融解時に降水が発生する可能性があります。ストック液を使用する前に、沈殿物が完全に溶解していることを確認してください。
| 解決 | コンポーネント | 量 | 濃度 |
| 100X E2A (500mL) | |||
| ナクル | 43.8 g | 1500 mM | |
| KCl | 1.88g | 50mM | |
| MgSO4 | 6 g | 100mM | |
| KH2PO4 | 1.03 g | 15mM | |
| ナ2HPO4 | 0.34 g | 5 mM | |
| 500X E2B (100 mL) | |||
| CaCl2 | 5.5グラム | 500 mM | |
| 500X E2C (100 mL) | |||
| ナフコ3 | 3 g | 350 mM | |
| 1X E2 (500 mL) | |||
| 100X E2A | 5 mL | 1X | |
| 500X E2B | 1 mL | 1X | |
| 500X E2C | 1 mL | 1X |
表1:ゼブラフィッシュ細胞培養用1x E2培地の成分。
- E3 メディア (1x)
- 表2に示すように1L滅菌水に成分を溶解し、100倍のストックを作ります。1x E3培地を作るために滅菌水でストックを希釈します。
- 0.2%メチレンブルーを加えます。1x E3媒体の20 mLの場合、40 μLのメチレンブルーを加えます。
- 蛍光イメージングのためにメチレンブルーなしで別のバッチを作ります。
| コンポーネント | 金額 (g) | 100X在庫(mM)の濃度 |
| ナクル | 29.22 | 500 |
| KCl | 1.26 | 17 |
| CaCl2 2H2O | 4.85 | 33 |
| MgSO4 7H2O | 8.13 | 33 |
表2:ゼブラフィッシュ胚を維持するための100x E3培地の成分。
- 80x生理的なストックソリューション
- 表 3に示すすべてのコンポーネントを結合します。水を加える 100 mL 溶液を作ります。すべてのコンポーネントが溶解するまで混ぜます。溶液を4°Cで保存してください。
| コンポーネント | 金額 (g) | 在庫の集中 (mM) |
| グルコース | 1.44 | 80 |
| ピルビン酸ナトリウム | 0.44 | 40 |
| CaCl2 2H2O | 0.148 | 10 |
| ヘペス | 6.1 | 256 |
表3:ゼブラフィッシュ細胞培養培地用80x生理食液の成分。
- ゼブラフィッシュ細胞培養培地(ZFCM+)
- 表4に示すすべてのコンポーネントを組み合わせて、250 mLのメディアを作ります。pH を 7.5 に調整します。0.22 μmフィルターを使用してフィルター・メディアを使用し、4°Cで保管します。
| コンポーネント | 金額 (mL) | ボリューム % |
| L-15培地(フェノールレッド付き) | 212.75 | 85.1 |
| 胎児牛血清 (FBS) | 5 | 2 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 1 | 0.4 |
| 80X生理的なソリューション | 3.125 | 1.25 |
| 水 | 28.125 | 11.25 |
表4:ゼブラフィッシュ細胞培養培地の血清および抗生物質の成分。
- ゼブラフィッシュ細胞培養用イメージング用培地(ZFCM-)
- 表5に示すすべてのコンポーネントを組み合わせて、250 mLのメディアを作ります。pH を 7.5 に調整します。0.22 μmフィルターを使用して、フィルター・メディアを使用します。
- 汚染を防ぐために、アリコート(50 mLバッチ)を単独で使用してください。4 °Cに保ちます。
| コンポーネント | 金額 (mL) | ボリューム % |
| L-15培地(フェノール赤なし) | 212.75 | 85.1 |
| 80X生理的なソリューション | 3.125 | 1.25 |
| 水 | 34.125 | 13.65 |
表5: インビトロ イメージング用の血清および抗生物質を含まないゼブラフィッシュ細胞培養培地の成分。
- 射出金型
- E3培地で1.5%アガロースを溶解します。100 x 15 mm ペトリ皿に25mLのアガロースを注ぎます。
- 表面に対して45°の角度でアガロースの上にカビを置き、スローモーションでアガロースに浮かばします。これは、気泡を避けるのに役立ちます。アガロースを冷やし、ベンチトップで固めましょう。
- 完全に固まったら、アガロースの破損を防ぐために、ゆっくりと金型を取り外します。新鮮なE3メディアを追加し、こぼれを防ぐために皿の周りにパラフィンフィルムを追加し、4°Cで保存します(図3)。
図3: 射出金型画像( A)射出プレートの製造に使用されるプラスチック型。型は、6つのランプ、1つの90°と1つの45°面を持ち、胚を所定の位置に保持します。(B)アガロース固化後の射出板を固化し、金型を除去する。スケールバー= 1 cm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. roGFP2-Orp1 mRNAの調製と注入
注:roGFP2-Orp1コンストラクトは、トビアスディック博士、DKFZ、ドイツから得られました。パデュー大学の清峰博士の研究室でpCS2+ベクターにサブクローン化された。RNaseによる劣化を防ぐためには、いくつかの予防措置を講じる必要があります。RNaseフリー試薬およびチューブは常に使用する必要があり、手袋はすべてのステップに着用する必要があり、代わりに、RNase除去用の洗浄剤で材料や表面を拭くことができます。
- NotIを使用してpCS2+/roGFP2-Orp1ベクターの3-10 μgを直線化します。
- PCR クリーンアップ キットでリニア化プラスミドを精製します。
- インビトロでは、roGFP2-Orp1 mRNAを、メーカーが提供する指示に従ってインビトロ転写キットで転写します。
- キャップ付き転写反応アセンブリ
- RNAポリメラーゼと直線化/精製DNAを氷の上に置きます。完全に溶液に入るまで、渦10x反応バッファと2倍のNTP/CAP。NTP/CAPを氷の上に保存しますが、反応を組み立てながらバッファを室温(RT)に保ちます。汚染を防ぐためにチューブを開く前にすべての試薬をタッチスピンします。
- RNaseフリー0.5 mL遠心分離管でRTで下記に示される順番でRNA合成反応を設定します。反応の最終容積は20μLである。
- 必要に応じて、10 μL のリボヌクレオチドミックス、2x NTP/CAP、ヌクレアーゼフリーウォーターをチューブに加えます。2 μL 10X反応バッファーを追加します。1~1.5 μgのリニアDNA(最大6μL)を加えます。必要に応じて、ヌクレアーゼを含まない水を加えて、20 μLの反応量を構成します。
- チューブを閉じ、渦を短時間、タッチスピンマイクロフュージ。10倍のSP6酵素ミックスを2μL加えます。マイクロフュージで指をクリックしてタッチスピンで閉じます。
- 37°Cに2〜2.5時間置きます(18時間まで行くことができます)。
注:提示された実験では、一晩で37°Cで16〜18時間のインキュベーションを行い、最良の結果を得ました。 - DNaseを1 μL加えて、DNAテンプレートを除去し、指をクリックし、スピンをタッチし、37°Cで15分間インキュベートします。
- キャップ付き転写反応アセンブリ
| 試薬 | ボリューム(μL) | 反応量 |
| 2X NTP/CAP | 10 | 1X |
| 10X反応バッファー | 2 | 1X |
| テンプレートDNA | 最大6 | 1-1.5 μg |
| ヌクレアーゼフリー水 | 20 μLを作るために追加 | |
| 10X SP6酵素ミックス | 2 | 1X |
表6:体外転写におけるroGFP2-Orp1 mRNAに対する反応セットアップ。
- RNA回収
- インビトロ転写キットに25μLの塩化リチウム(LiCl)を加えます。霜冷凍庫に-20°Cで30分以上置きます。
- 4°Cの卓上遠心分離機で最高速度で25分間スピンします。 ペレットを乱さないよう、上清を慎重に取り出して捨てます。25 μLの冷たい75%エタノールを加え、4°Cで5分間回転させます。
- 慎重に取り出し、上清を捨てます。RTでペレットエアを5分以上乾燥させます。乾燥させないでください。ヌクレアーゼフリートリスEDTA(TE)バッファ(pH 7.0)を12 μL加え、サンプルを氷の上に置いておく。
- 分光光度計でRNA濃度を測定します。0.5-1 μg/μLは通常得られる。
- フェノールレッド溶液(Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水-DPBSで0.5%フェノールレッド)とアリコート(3-5 μL)用アリコートで100 ng/μL mRNAを調製します。mRNAアリコートを80°Cで保管してください。
- mRNAのマイクロインジェクション
- 注射の日に、mRNAアリコートの1つを使用し、ゼブラフィッシュ胚注射プロトコルに従って、卵黄19を通して1細胞段階の胚にmRNAの1nLを注入する。簡単な説明を以下に示します。
- 大人の魚を繁殖し、前に説明したように胚を収集します20.
- ピペットプーラーでマイクロインジェクションニードルを引っ張ります。針の先端を鉗子で切って、10 μmの先端の開口部を作り出す。
- ステップ 1.6 で説明した射出型で胚を整列させます。
- ガラスマイクロインジェクションピペットを用いてフェノールレッドにmRNAの1nLを注入する。
- 胚を収集し、E3メディアに保管してください。
- 目的の発達段階が達成されるまで、E3培地の27°Cインキュベーターに胚を保管してください。注入された胚は 、in vitro( セクション3およびセクション4)および インビボ イメージング(セクション5)の両方に使用することができる。roGFP2-Orp1を発現する胚は、蛍光灯と青/緑色のフィルターセットを備えた規則的な解剖顕微鏡を実験する前に事前に選択することができます。
3. ゼブラフィッシュ胚由来の初代性神経節細胞培養
注: このプロトコルは、以前に公開された方法 21から適用されます。ラミナー フロー フードで手順 3.1 と 3.2 を実行します。
- カバーリップの準備
- 各実験で4~6個の培養プレートを用意します。100%エタノールで保存されている酸洗浄カバーリップ(22 x 22 mm角;0.16〜0.19 mm厚さ)を使用してください。
- 鉗子を使用して貯蔵容器からカバースリップを1つ取り除き、残留エタノールを除去するためにそれを炎上させる。
- 35mmの培養皿の中に角度を付けてカバースリップを完全に乾燥させて空気乾燥させます。
- ポリD-リジン(PDL)の働く溶液(1x)を、10xストック(5mg/mL)を滅菌水に希釈して調製します。
- 各カバースリップの中央に0.5 mg/mL PDLの100 μLを塗布し、溶液をエッジに広げないようにします。
- PDLをカバースリップで室温(RT)で20〜30分間インキュベートします。PDLが乾燥していないことを確認します。
- PDLを0.5 mLの滅菌水で3回洗います。プレートを完全に乾燥させます。
- 50xストック(1mg/mL)を1x PBSで希釈してラミニン作動液(1x)を調製します。
- PBSで20μg/mLラミニンの100 μLを各カバースリップの中央に塗布し、エッジへの溶液の拡散を避けます。
- 加湿インキュベーターで37°Cでプレートを2〜6時間インキュベートします。ラミニン溶液の乾燥は避けてください。
- 胚解離とめっきGGC
- 4つの35mm組織培養皿を準備し、4mLで充填する:70%エタノール、「E2メディア1」、「E2メディア2」、「E2メディア3」解剖の日に。食器を切り離すまで冷蔵庫に入れておきます。
- ゼブラフィッシュ胚が受精後34時間(hpf)の場合は、ラミニンでコーティングされた培養皿をインキュベーターから取り出し、1x PBSの0.5 mLでカバーリップを3回洗います。
- 最終洗浄後、各培養皿に4mLのZFCM(+)培地を加え、プレートの乾燥を避けます。
- ステップ 3.2.1 から準備されたカルチャ料理を取得します。RTに平衡化させてください。
- 4~6個のPCRチューブに15 μLのZFCM(+)培地を充填します。1つのカバースリップにメッキされる4つの目からのRMCを準備するために1つの管が必要である。
- インキュベーターからゼブラフィッシュ胚を取り出し、70%エタノールを含む35mm組織培養皿に胚を浸漬し、5〜10sで殺菌する。
- 移管ピペットを用いて、無菌E2培地を含むE2培地1皿に胚を移し、過剰なエタノールを洗浄する。
- E2メディア2皿に胚を移し、鋭い鉗子でそれらの色素を取り除く。
- 胚を最終的なE2メディア3皿に移して、分節を行う。
- 一組の細かい鉗子を使用して、前述の 22のように、レチナを解剖する。
- 鉗子の1つで卵黄の前に胚を配置し、保持し、他の鉗子で黄身嚢に後尾を取り除く。
- 鉗子で首をつかみ、脳と目をE2メディアに露出させるために頭を脱ぐ。黄身嚢を切らないようにしてください。
- 細かい鉗子の先端で、頭蓋組織を第2鉗子で下に押さえながら、頭から目をそっと転がします。隣接する組織の破片から目を隔離してください。
- ZFCM(+)を含む、以前に準備されたチューブの1つに4つの目を移します。
- P20ピペットと黄色の先端を約45回上下に軽く触色し、細胞を解色します。気泡を避けてください。
- 解体セルを持つ ZFCM(+) をカバースリップの中央に移動します。追加のカバーリップについて、手順 10 ~ 12 を繰り返します。
- 振動を吸収するためにポリスチレンの泡の棚の22 °Cのベンチトップの培養を維持する。
- めっき後6-24時間のイメージングを行う。
注:異なる培養皿に胚を移す転送ピペットを使用してください。エタノールを持ち越さないように各溶液のピペットを交換します(ステップ6-8)。
4. 培養RGCニューロンの IN VITRO イメージング
- イメージングの日(通常、細胞めっき後6〜24時間)に、顕微鏡下で細胞をチェックしてRGC軸索の成長を検証します。
- ライブセルイメージングの場合、培養皿から生細胞イメージングチャンバにカバーリップを移します。この場合、先に説明したカスタムメイドのオープンチャンバーを23.10.10.100で使用した。
- イメージング用の顕微鏡を設置します。差動干渉コントラスト(DIC)の目的、OG590ロングパスレッドフィルター、EM-CCDカメラを搭載した反転顕微鏡を使用します。
- イメージングの前に、ZFCM(+)メディアをZFCM(-)に置き換えてください。
- 細胞を10倍の目的で配置したら、高いNA油浸出目的を用いて60倍の倍率で画像を取得します。追加の 1.5 倍の倍率を使用します。
- まずDIC画像を取得します。次に、適切なフィルタセットを用いて画像roGFP2-Orp1を用いた。405/20および480/30 nm励起フィルターを備えたエキサイトroGFP2-Orp1は、発光光が二光鏡505DCXRを通過した後、535/30 nmの発光フィルタで画像を取得します。
- 最初の画像セットを撮った後、異なる治療溶液を含むメディアとメディアを交換します。pHと浸透性の変化を避けるために、イメージングの30分ごとにメディアを交換する必要があります。
5. 発生する胚の インビボ ROSイメージング
- インビボイメージングの場合、22-24 hpfからメチレンブルーなしで0.003%フェニルチオ尿素(PTU)を含むE3培地に胚を保持します。メディアを交換し、日常的に死んだ胚を取り除きます。
- 所望の年齢で、0.016%トリカインで胚を麻酔する。35mmガラス底培養皿に1%低融解アガロースで麻酔をした胚を取り付けます。胚は、画像化の対象領域に応じて、ドーサリー、腹側または横方向に配向することができる。
- アガロースが固まった後、メチレンブルー/0.016%トリカインなしでE3培地で皿を満たします。
- イメージング用の顕微鏡を設置します。反転レーザー走査コンフォーカル顕微鏡を使用してください。あるいは、アガロースドロップの上に取り付けられた胚を画像化するために、水浸漬レンズを装備した直立共焦点顕微鏡を使用します。
- 405 nmおよび488 nmの励起フィルターが付くエキサイトroGFP2-Orp1は、515-535 nmの範囲のエミッションフィルタを備えた対応する画像を取得します。
- 胚の所望の部分を通して5μmのセクション厚さのzスタックを獲得する。胚は、発達の後期段階でイメージングのために保つことができる。
- イメージング後、微細な鉗子でアガロースから胚を除去し、PTUを有するメチレンブルーフリー培地で所望の年齢になるまでインキュベーターに保管する。
6. 画像解析と処理
- 405/480の比率の価値に基づくH2O2のレベルの測定
- 画像解析に適したソフトウェアを使用します。ImageJソフトウェアは、画像解析と処理のためにここで使用されました。
- ファイルをドラッグするか、またはファイルをクリックして、イメージJソフトウェアでDIC、405/535および480/535画像を開| を開きます。まだ実行されていない場合は、[イメージ] をクリックしてイメージを 32 ビット に変換|タイプ|32 ビット。
- コントロールバー(セル本体、成長コーン、レティナなど)から自由な手のツールで関心領域(ROI)を定義します。[分析] をクリックして ROI マネージャを開| ツール|ROI マネージャー.[ROI マネージャ]タブで[追加]をクリックして、定義された ROI を追加します。
- ROI に近い領域を描画し、背景の ROI として追加します。ROI を選択し、ROI マネージャ タブの [メジャー ] をクリックして、平均バックグラウンド値を測定します。
- 測定値からの平均強度値に注意してください。「プロセス」をクリックして蛍光画像から平均背景の値を引く |数学|減算。405/535 および 480/535 の両方のイメージに対してこの手順を実行します。
- 「1」の値を480/535蛍光画像に追加し 、「0」値を除去するには、「プロセス」|数学| 比率計算の前に関数を追加します。
- [ プロセス] |画像計算機| ImageJ で関数を分割して、405/535 画像を 480/535 ピクセルで除算します。405/535 画像を 480/535 で割る画像を選択します。32 ビット出力イメージを選択します。
- 最初に比率イメージをクリックし、次に [ROI マネージャ] タブで ROI をクリックして、比率イメージに対する ROI を適用します。
- [ROI マネージャ] タブの [メジャー] をクリックして、405/535 画像と 480/535 画像の平均比率値を 測定 します。
- 適切な統計分析を実行するには、できるだけ多くのサンプルについてステップ 6.1.2~6.1.9 を実行します。
- 比率イメージの表示
注: この手順では、標本の外側の背景を減算し、画像にカラー検索テーブルを適用します。- ステップ 6.1.7.で ImageJ で比率イメージが作成されたら、[ファイル] をクリックして 32 ビットの黒い画像 を作成|新しい|イメージ.
- 新しいイメージをクリックし、次に ROI マネージャ タブの ROI をクリックして、H2O2 レベルを新しいイメージに表示する ROI を適用します。
- [編集] をクリックしてマスクを作成 |選択|マスクを作成する:
- マスク画像を255で割ってROI値を「1」に調整し、背景値は「0」になります。[ プロセス] |数学|分割 して、255 と入力します。
- [プロセス] |クリックして、マスクと比率イメージを乗算します 。画像計算機|関数を乗算 します。これにより、ROI のみを示すグレースケール比の画像が表示されます。
- [画像] をクリックしてテーブルを "Fire" に変更 |テーブルの検索 |火災.
注: [プロセス] をクリックすると、すべての画像に乗算係数を適用して比率を見やすく| 画像|乗算します。 - [イメージ] をクリックして、比率イメージを 8 ビットに変換| タイプ|8ビット。
- [分析]をクリックしてキャリブレーションバー を追加|ツール|キャリブレーションバー.
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Representative Results
培養ゼブラフィッシュRGCは1d以内に軸索を伸ばす。H2O2-バイオセンサの代表的な405/480比画像を図4Aに示す。細胞体、軸索、および成長コーンは、個々のニューロンではっきりと見えます。これらのニューロンは、H2O2変化を監視するために時間の経過とともに異なる治療を受けることができる。以前は、培養メディアに100μMH2O2を加えると比率値が増加し、このシステム(図4)24でリアルタイムの変化を検出できることを示すことがわかりました。
図4:H2O2は、roGFP2-Orp1を有する培養ゼブラフィッシュRPCにおけるイメージング(A)34hpf古いゼブラフィッシュ胚からの培養RGCニューロンの代表的な405/480 nm比画像。左側のニューロンを無血清制御培地で処理し、右側のニューロンを30分間100μMH2O2で処理した。スケールバー=10μm(B)は、野生型ゼブラフィッシュRGC成長コーンの平均H2O2レベルをコントロールまたは100μMH2O2のいずれかで処理前後に示す棒グラフ。データは、治療を制御するために正規化されました。SEM±平均データが表示され、各グループの括弧内に成長コーンの数が表示されます。二尾のウィルコクソンマッチペアの署名ランクテスト。**p = 0.0009。この図は、前回の出版物24から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
H2O2レベルは、ゼブラフィッシュ胚全体でも決定することができる(図5)。mRNAが1細胞段階で注入されると、すべての組織がroGFP2-Orp1バイオセンサーを発現する。図5Aでは、例として、2つの異なるタイムポイントでゼブラフィッシュ幼虫の頭部領域を示し、その点は、レナのH2O2レベルに焦点を当てて示した。 我々は、以前にH2O2を添加するとリアルタイムで比値が増加することを示したが、還元剤DTTの添加は、vivo24においてこの効果を逆転させる。ここでは、同じゼブラフィッシュ胚中のH2O2の基底レベルを2dpfおよび5dpfで測定した。2 dpf では、比率値は 5 dpf (p<0.0001) よりも有意に低くなっています。図5B)。さらに、各動物は、それらのレチナルH2O2含有量の異なるレベルの増加を示した(図5C)。
図5:roGFP2-Orp1を用いてゼブラフィッシュ幼虫でのインビボH2O2イメージング。 (A)DICおよび405/480 nm比画像2および5 dpfゼブラフィッシュ幼虫。ROI は、比率の値を測定するレティナ (黄色の線) として定義されます。同じ幼虫を2dpfおよび5dpfで分析した。スケールバー= 50 μm(B) 2および5 dpfゼブラフィッシュのレチナにおける平均H2O2レベルの測定。5 dpfでは、H2O2-レベルは、2 dpfと比較して、retinaにおいて有意に増加する。(C)個々の魚の測定値の折れ線グラフ。各動物は、そのレチナ中のH2O2-レベルの2から5 dpfの増加を示す。データは平均±SEMとして示され、分析された幼虫の数は各群の括弧内に示されている。二尾のウィルコクソンマッチペアはランクテスト****p<0.0001に署名しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコル全体で注意が必要な重要な手順がいくつかあります。これらの点を考えると、実験の流れが改善されると考えています。一次RGC培養では、この培養培地には抗生物質が含まれておらず、画像処理の前または中に汚染が起こり得るため、ZFCM(-)の無菌性は非常に重要である。これを避けるために、バイオセーフティキャビネット内でのみZFCM(-)を準備して使用し、新鮮なZFCM(-)メディアを定期的に作ることをお勧めします(ステップ1.5)。また、ラミニン在庫は-80 °Cに保つ必要があります。 解凍したラミニンは、常に4°Cで保管する必要があります。ラミニン溶液は、タンパク質の神経突起成長促進活性を低下させるため、室温または再凍結に保たないでください。
適切なタイミングでゼブラフィッシュのレチナを解剖することは、軸索を拡張するのに十分なRGCを得るために重要です。ゼブラフィッシュRGCは28 hpfで生まれ、32-36 hpfから始まるレティナから軸索を伸ばす。したがって、28 hpf後にRGCをプレートすることが重要であり、好ましくは32〜36hpfの間で、RGCの完全な分化を可能にする。早期の時点で調製された培養物は十分なGGCを生み出さないか、めっき後24時間以内に軸索を伸ばさない可能性のあるRMCを生じる可能性がある。30分以上イメージングする場合は、ZFCM(-)メディアの交換を強くお勧めします。このメディアはフェノールレッドを欠いているため、pHの変化は目に見えないため、考慮する必要があるかもしれません。交換メディアは、プロセス中にニューロンを外すことを避けるために非常に慎重に(ステップ4.7)。
最後に、培地をPTUでE3に変更するがメチレンブルーを含まないことは、24hpfで必要である。PTUは 、生体内 蛍光イメージングに必要な高められた幼虫の透明性のための色素沈着を防ぎます。しかし、PTUによる早期治療は、発達上の欠陥26を引き起こす可能性があります。メチレンブルーは、主に黄身から発生する自己蛍光を低減するためにE3培地から除去される(ステップ5.1)。
この方法は、H2O2の細胞質検出を可能にする。しかしながら、H2O2の細胞内区画化は局所的なシグナル伝達に寄与し、かつ細胞質H2O2-レベルは、H2O2の特異的なシグナル伝達の役割に関する十分な情報を提供しないかもしれない。roGFP2-Orp1は、遺伝子組み換えバイオセンサとして、組織特異的発現(例えば、ニューロン、アストロサイト、グリア細胞など)または特定の細胞下の位置(例えば、形質膜、ミトコンドリア、核など)を標的とすることができる。roGFP2-Orp1はGFPベースのバイオセンサであるため、他の蛍光プローブとの組合せは、緑色スペクトル外の発光波長に限定される。GFPはトランスジェネシスマーカーとして広く使用されているため、GFPベースのバイオセンサーの利用は制限され得る。この課題に対処するために、H2O2検出用の赤蛍光タンパク質が最近27に開発されている。さらに、roGFP2-Orp1は、ここで示す方法で一時的に発現される。したがって、mRNAとタンパク質発現は時間の経過とともに減衰します。我々はまだ5 dpf幼虫の信号を検出することができた。しかし、トランスジェニック魚のラインは、開発中および成人期にバイオセンサーの安定した発現のために確立される必要があります。
いくつかの色素ベースのアッセイは、細胞内ROS(例えば、H2DCF−DA)、または具体的には、H2O2(PF6-AM)28、29を検出するために利用可能である。roGFP2-Orp1のような遺伝的にコードされたバイオセンサーを使用すると、色素ベースの方法よりもいくつかの利点があります。第一に、それは、可逆性と同様に、特定の細胞内の位置で酸化的状態の両方の一過性の変化の検出を可能にする。したがって、動的な変化は、高度な空間分解能30で十分に監視されます。第二に、色素分子と比較すると、一般的に細胞または組織に対する毒性が少ない。最後に、バイオセンサは、特定の実験31のニーズを満たすためにさらに遺伝的に操作することができる。roGFP2-Orp1は、2つの励起と1つの放出ピークを有するため、比測定バイオセンサーである。H2O2との相互作用の際に、405nm励起が増加し、そして480nm励起が減少する。したがって、読み出しは、それぞれ405および480nm励起によって取得された強度値の比である。このプローブはレシオメトリックであるため、2番目のプローブの適用は、潜在的なボリューム効果を補正する必要がなくなります。さらに、このプローブは1つのポリペプチドの発現のみを伴うため、分子間蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の場合など、複数のタンパク質の差動発現の潜在的な問題に苦しんでいない。
roGFP2-Orp1はROSの生産およびシグナリングを調査するために多目的なH2O2の調査である。生細胞では、このプローブは4.8(トランスジェニックゼブラフィッシュ胚では約4)のダイナミックレンジを示す15,32。しかし, roGFP2-Orp1 の酸化還元状態は内因性チオレドキシンとグルタレドキシン系による変更の対象となります;;したがって、より敏感なプローブは、Orp1を別の酵母ペルオキシドレドキシン、Tsa233、34に置き換えることによって開発されました。roGFP2-Orp1はゼブラフィッシュ胚におけるH2O2の変化を検出するのに有用であるが、感受性は主に外因的に適用されるH2O224、31、または強力な刺激に対するより高い濃度に限定される。 例えば、slit2治療は野生型GGCではroGFP2-Orp1信号を増加させるが、nox2変異型RMC35では増加しなかった。一方、野生型とnox2変異型RGCと2dpf胚24,35の基底H2O2レベルに差はなかった。したがって、H2 O2の基底レベルまたは小さな変化を検出するには、より高い感度プローブが必要になります。
HyPerは、遺伝的にコード化された別の広く使用され、レシオメトリックH2O2-特異的バイオセンサー36である。両方のプローブの感度は似ています。しかし、roGFP2-Orp1は、H2O2の変化15に対して応答性が遅い。したがって、リアルタイムの変更を正確に検出するには、roGFP2-Orp1ではなくHyPerが必要になる場合があります。初期のHyPerバージョンはpHの変更の影響を受けますが、roGFP2-Orp1は16、36ではありません。したがって、HyPer37を使用している間にpH制御プローブ(SypHer3s)を含めるのが重要です。最新のHyPerプローブHyPer7は、既存のH2O2プローブの多くの欠点を克服しました:HyPer7は、より高いpH安定性、高輝度、高速動態、およびより高いダイナミックレンジ38を有しています。さらに、HyPer7は、インビトロおよびインビボの両方で検証され、創傷治癒38の間にゼブラフィッシュ胚の細胞内区画化およびモニタリングリアルタイムH2O2変化を示す。
ここで提示される方法論は、in vitroとin vivoの両方のROSシグナリングの役割を研究するために拡張することができます。roGFP2-Orp1発現ニューロンは、H2O2シグナル伝達に対するそれらの効果を研究するために異なる治療を受けることができる。例えば、RMCがH2O2レベルの変化にリアルタイムで反応することを示した(図4)、バイオセンサがH2O2の即時変化を検出できることを示唆した。しかし、絶対的な細胞内H2O2濃度を決定するには、システムの広範な較正が必要であろう。 バイオセンサの検出限界も不明である。さらに、細胞内のバイオセンサーの詳細な空間分布は完全には知られておらず、結果の解釈を妨げる可能性があります。さらに、roGFP2-Orp1からの正確な位置信号を決定すると、局在した細胞内シグナル伝達に寄与する部位特異的なH2O2産生があるかどうかが明らかになる。
roGFP2-Orp1を発現するトランスジェニック魚を作ることは多くの利点を有する。バイオセンサは、ゼブラフィッシュ39においてTol2トランスジェネシスを用いて細胞特異的H2O2シグナル伝達を研究するための組織特異的プロモーターの下で、遍在的に発現することができる。開発におけるH2O2の役割は、バイオセンサのユビキタス発現によって研究することができる。例えば、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚を監視して、H2 O2レベルの変化と、これらの変化が異なる発達段階にどのように寄与するかを評価することができる。一方、roGFP2-Orp1の組織特異的発現は、対象の細胞または組織におけるH2O2産生の効果に焦点を当てている。組織または細胞特異的プロモーターは、特定の細胞におけるroGFP2-Orp1の発現を駆動するために使用することができる。さらに、Gal4/UASシステムは、個々のニューロンのスパース標識にも使用できます。したがって、このアプローチは、生体内の細胞分解能でH2O2レベルを検出することができます。最後に、安定なトランスジェニックラインは、ゼブラフィッシュ胚におけるROSシグナル伝達および酸化ストレスを伴うハイスループット薬物スクリーニングに使用することができる。
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Disclosures
著者は、利益相反はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(グラントR01NS117701)、国立科学財団(グラント1146944-IOS)、インディアナ外傷性脊髄および脳損傷研究基金(グラント20000289)、パーデュー研究財団(グラント209911)、パーデュー大学研究協力副学長事務所(グラント210362)によって支援されました。ゼブラフィッシュRGC培養プロトコルを確立してくれたコーリー・J・ウィーバー博士とヘイリー・ローダー博士に感謝します。図 4 のデータを提供してくれたヘイリー・ローダーに感謝します。リア・ビアシとケニー・グエンのRGC文化の支援に感謝します。テキストを編集してくれたジェントリーに感謝します。私たちは、roGFP2-Orp1を含むpCS2+ベクターにroGFP2-Orp1と清トウ博士を提供してくれたトビアス・ディック博士に感謝します。図 2 は、Biorender.com を使用して作成されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35-mm culture dish | Sarstedt | 83-3900 | |
| 35-mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Sutter/Fisher Scientific | NC9029378 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cover glass | Corning | 2850-22 | |
| Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 25384-094 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 26140087 | |
| Glucose | Sigma Aldich | G7528 | |
| HEPES | Sigma Aldich | H4034 | |
| Injection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Inverted Microscope | Nikon | TE2000 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | 710 | |
| Leibovitz's L-15 Medium with phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 11-415-064 | |
| Leibovitz's L-15 Medium without phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 21-083-027 | |
| Low melting agarose | Promega | V2111 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| PBS | Hyclone/Fisher Scientific | SH3025601 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Phenol Red | Sigma Aldich | P0290 | |
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldich | P7629 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma Aldich | P7280 | |
| QiaQUICK PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Recombinant mouse slit2 | R&D Systems | 5444-SL-050 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldich | P5280 | |
| Steritop 0.22 µm filter | Millipore | S2GPT05RE | |
| TE Buffer | Ambion | AM9860 | |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma Aldich | E10521 | |
| Vertical Pipette Puller | David Kopf Instruments | 700C |
References
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