Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kemisk dimerisering-induceret protein kondensater på telomerer

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62173
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Denne protokol illustrerer et kemisk induceret protein dimerization system til at skabe kondensater på kromatin.  Dannelsen af promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ på telomerer med kemisk dimerizers er demonstreret. Dråbevækst, opløsning, lokalisering og sammensætning overvåges med levende cellebilleddannelse, immunofluorescence (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).

Abstract

Kromatin-associerede kondensater er impliceret i mange nukleare processer, men de underliggende mekanismer forbliver undvigende. Denne protokol beskriver et kemisk induceret protein dimeriseringssystem til at skabe kondensater på telomerer. Den kemiske dimerizer består af to forbundne ligands, der hver især kan binde sig til et protein: Halo ligand til Halo-enzym og trimethoprim (TMP) til henholdsvis E. coli dihydrofolat reduktase (eDHFR). Fusion af Halo enzym til en telomere protein ankre dimerizers til telomerer gennem kovalent Halo ligand-enzym bindende. Binding af TMP til eDHFR rekrutterer eDHFR-smeltet fase, der adskiller proteiner til telomerer og fremkalder kondensatdannelse. Da TMP-eDHFR interaktion er ikke-kovalent, kan kondens vendes ved hjælp af overskydende gratis TMP til at konkurrere med dimerizeren til eDHFR-binding. Et eksempel på at fremkalde promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ dannelse på telomerer og bestemmelse kondensat vækst, opløsning, lokalisering og sammensætning er vist. Denne metode kan let tilpasses til at fremkalde kondensater på andre genomiske steder ved at smelte Halo til et protein, der direkte binder sig til den lokale kromatin eller til dCas9, der er målrettet mod det genomiske græshoppe med en guide RNA. Ved at tilbyde den tidsmæssige opløsning, der kræves til enkeltcellet levende billeddannelse, samtidig med at faseadskillelsen i en population af celler til biokemiske analyser opretholdes, er denne metode velegnet til sondering af både dannelsen og funktionen af kromatin-associerede kondensater.

Introduction

Mange proteiner og nukleinsyrer gennemgår væske væske væskefaseadskillelse (LLPS) og samler sig selv i biomolekyllære kondensater for at organisere biokemi i cellerne1,2. LLPS af kromatinbindende proteiner fører til dannelse af kondensater, der er forbundet med specifikke genomiske loci og er impliceret i forskellige lokale kromatinfunktioner3. For eksempel, LLPS af HP1 protein ligger til grund for dannelsen af heterochromatin domæner til at organisere genomet4,5, LLPS af transskription faktorer danner transskription centre til at regulere transskription6, LLPS af spirende mRNAs og multi-sex kamme protein genererer histone locus organer til at regulere transskription og behandling af histone mRNAs7.  På trods af mange eksempler på kromatin-associerede kondensater, der opdages, forbliver de underliggende mekanismer for kondensatdannelse, regulering og funktion dårligt forstået. Især dannes ikke alle kromatin-associerede kondensater gennem LLPS , og omhyggelige evalueringer af kondensatdannelse i levende celler er stadig nødvendige8,9. For eksempel er HP1-protein i musen vist sig kun at have en svag evne til at danne flydende dråber i levende celler og heterochromatin foci opfører sig som kollapset polymer globules10. Derfor er værktøjer til at fremkalde de novo kondensater på kromatin i levende celler ønskelige, især dem, der tillader brug af levende billeddannelse og biokemiske analyser til at overvåge kinetikken af kondensatdannelse, de fysiske og kemiske egenskaber af de resulterende kondensater og de cellulære konsekvenser af kondensatdannelse.

Denne protokol rapporterer et kemisk dimeriseringssystem til at fremkalde proteinkondenater på kromatin11 (Figur 1A). Dimerizeren består af to forbundne protein-interagerende ligands: trimethoprim (TMP) og Halo ligand og kan dimerisere proteiner smeltet til cognate receptorer: Escherichia coli dihydrofolat reduktase (eDHFR) og en bakteriel alkyldehalogenase enzym (Halo enzym), henholdsvis12. Samspillet mellem Halo ligand og Halo enzym er kovalent, så Halo enzym kan bruges som anker ved at smelte det til en kromatin-bindende protein til at rekruttere en fase-adskille protein smeltet til eDHFR til kromatin. Efter den første rekruttering passerer den øgede lokale koncentration af den fase, der adskiller protein, den kritiske koncentration, der er nødvendig for faseadskillelse, og nukleter således et kondensat ved ankeret (figur 1B). Ved at sammensmelte fluorescerende proteiner (f.eks. mCherry og eGFP) til eDHFR og Halo kan nukleation og vækst af kondensater visualiseres i realtid med fluorescensmikroskopi. Da samspillet mellem eDHFR og TMP er ikke-kovalent, kan overskydende gratis TMP tilføjes for at konkurrere med dimerizeren til eDHFR-binding. Dette vil derefter frigive faseadskillelsesproteinet fra ankeret og opløse det kromatin-tilknyttede kondensat.

Vi brugte dette værktøj til at fremkalde de novo promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ dannelse på telomerer i telomerase-negative kræftceller, der bruger en alternativ forlængelse af telomerer (ALT) vej til telomere vedligeholdelse13,14.  PML nukleare organer er membran-mindre rum involveret i mange nukleare processer15,16 og er entydigt lokaliseret til ALT telomerer til at danne APBs, for ALT telomere-associerede PML organer17,18. Telomerer klynge i APBs, formentlig at give reparation skabeloner til homology-rettet telomere DNA syntese i ALT19. Faktisk telomere DNA syntese er blevet påvist i APBs og APBs spiller afgørende roller i berige DNA reparation faktorer på telomerer20,21. De mekanismer, der lå til grund for APB-samling og telomereklynger i APB'er, var imidlertid ukendte. Da telomereproteiner i ALT-celler er unikt modificeret af små allestedsnærværende-lignende modifikator (SUMOs)22, indeholder mange APB-komponenter sumoylationssteder 22,23,24,25 og / eller SUMO-interagerende motiver (SIMMs)26,27 og SUMO-SIM-interaktioner driver faseadskillelse28, vi hypotese, at sumoylation på telomerer fører til berigelse af SUMO / SIM indeholdende proteiner og SUMO-SIM interaktioner mellem disse proteiner fører til faseadskillelse.  PML protein, som har tre sumoylation steder og en SIM-site, kan rekrutteres til sumoylated telomerer til at danne APBs og sammensmeltning af flydende APBs fører til telomerer klyngedannelse. For at teste denne hypotese brugte vi det kemiske dimeriseringssystem til at efterligne sumoylationsinduceret APB-formation ved at rekruttere SIM til telomerer (Figur 2A)11. GFP er smeltet sammen til Haloenzym til visualisering og til telomerebindende protein TRF1 for at forankre dimerizeren til telomerer. SIM er smeltet til eDHFR og mCherry. Kinetik af kondensatdannelse og dråbefusionsinduceret telomereklynger følges med levende cellebilleddannelse.  Faseadskillelse vendes ved at tilføje overskydende gratis TMP for at konkurrere med eDHFR-binding. Immunfluorescence (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH) anvendes til at bestemme kondensatsammensætning og telomerisk forening. Rekruttering af SIM beriger SUMO på telomerer, og de inducerede kondensater indeholder PML og er derfor APB'er. Rekruttering af en SIM mutant, der ikke kan interagere med SUMO ikke berige SUMO på telomerer eller fremkalde fase adskillelse, hvilket indikerer, at den grundlæggende drivkraft for APB kondens er SUMO-SIM interaktion. Enig med denne observation, polySUMO-polySIM polymerer, der smeltede til en TRF2 bindende faktor RAP1 kan også fremkalde APB dannelse29. Sammenlignet med polySUMO-polySIM fusionssystemet, hvor faseadskillelse forekommer, så længe der produceres nok proteiner, fremkalder den kemiske dimeriseringsmetode, der præsenteres her, faseadskillelse efter behov og giver dermed bedre tidsmæssig opløsning til at overvåge kinetik af faseadskillelse og telomereklyngningsproces. Derudover tillader dette kemiske dimeriseringssystem rekruttering af andre proteiner til at vurdere deres evne til at fremkalde faseadskillelse og telomereklynger. For eksempel kan et uordnet protein rekrutteret til telomerer også danne dråber og klynge telomerer uden at fremkalde APB dannelse, hvilket tyder telomere klyngedannelse er uafhængig af APB kemi og kun er afhængig af APB flydende ejendom11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion af forbigående cellelinjer

  1. Kultur U2OS acceptor celler på 22 x 22 mm glas coverslips (til live imaging) eller 12 mm diameter cirkulære coverslips (for IF eller FISK) belagt med poly-D-lysin i 6-brønd plade med vækst medium (10% foster kvæg serum og 1% Penicillin-Streptomycin opløsning i DMEM), indtil de når 60-70% sammenløb.
  2. Udskift vækstmedium med 1 mL transfection medium (vækstmedium uden Penicillin-Streptomycin opløsning) før transfektion.
  3. For hver transfektionstrønde tilsættes 4 μL transfection reagens til 150 μL reducerede serummedier, vortex i 10 sekunder og inkuberes derefter i 5 minutter.
  4. For hver brønd, tilføje Halo konstruere plasmid (Halo-GFP-TRF1 eller Halo-TRF1) og eDHFR konstruere plasmid (mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutant) på en 1:1 masse ratio (0,5 μg Halo konstruere plasmid med 0,5 μg eDHFR konstruere plasmid) til 150 μL reduceret serum medier, dropwise, mix ved pipetting.
    BEMÆRK: Mærkerne er relativt små (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD), og der blev ikke observeret nogen effekt på faseadskillelse. Men ved hjælp af mutanter som SIM mutant bruges her for at sikre, at fase adfærd er følsom over for mutationer ikke tags anbefales. SIM er fra PIASx28,30. SIM-sekvens er AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. SIM mutant genereres ved mutering af SIM aminosyrer VIDL til VADA28, og sekvensen er AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Vi deponerede vores plasmider for at addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM mutant.
  5. Tilsæt 150 μL transfection reagens -reduceret serum medieblanding til 150 μL reduceret serum medier med DNA, dråbevis, mix ved pipettering, inkubere i 5 minutter.
  6. Tilsæt 300 μL transfection reagens-DNA-blanding til celler, dropwise og derefter placere celler tilbage til inkubator.
  7. Vent 24-48 timer før levende billeddannelse, immunofluorescence (IF) eller fluorescens in situ hybridisering (FISH).

2. Dimerization på telomerer

  1. Dimerizers opløses i dimethylsuloxid ved 10 mM, og opbevares i mikrocentrifugrør af plast ved −80 °C til langtidsopbevaring.
    BEMÆRK: I stedet for at bruge dimerizer med TMP direkte forbundet med Halo (TMP-Halo, TH), dimerizer TMP-NVOC-Halo (TNH), der har en lysfølsom linker, 6-nitroveratryl oxycarbonyl (NVOC), mellem TMP og Haloligand anvendes31. Dette skyldes, at det tager mindre tid for TNH (~ 5 minutter) at sprede sig ind i cellen end TH (~ 20 minutter). Resultater vist her kan også opnås ved hjælp af TH. Når du bruger TNH, skal du passe på ikke at udsætte dimerizeren for lys for at undgå NOVC-kavalergang. Håndter TNH i et mørkt rum med en svag rødt lyslampe, opbevar dimerizeren i ravplastrør og pak beholderen med TNH eller behandlede celler med aluminiumsfolie. Billedbehandling TNH med DIC er sikkert.
  2. Tag en aliquot på 10 mM dimerizer fra -80 °C og fortynd i billedmedie til en lagerkoncentration på 10 μM og opbevares ved −20 °C.
  3. Når dimerizers er klar til brug, fortyndes de fra 10 μM-lageropløsning til en endelig arbejdskoncentration på 100 nM i vækstmedium (til fast billeddannelse) eller billedmedie. Behandle celler med 100 nM dimerizers (endelig koncentration) på scenen for levende billeddannelse eller inkubation i 4-5 timer for immunfluorescence (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).
    BEMÆRK: Koncentrationen af dimerizers, der anvendes, påvirker dimeriseringseffektiviteten og dermed faseadskillelsen. Dimerizerkoncentrationen, der giver maksimal dimeriseringseffektivitet, afhænger af celletype og ankerproteinkoncentration, så den skal bestemmes til forskellige eksperimenter. En enkel måde er at inkubere celler, der udtrykker ankerproteinet og mCherry-eDHFR (uden at smelte til fasen, der adskiller protein eller smeltet til en ikke-faseadskillende mutant) og identificere dimerizerkoncentrationen, hvor den højeste mCherry-intensitet ved ankeret opnås. En mere systematisk tilgang er at inkubere celler, der kun udtrykker ankeret med forskellige koncentrationer af dimerizers og derefter med et Halo-bindefarvestof for at hjælpe med at bestemme dimerizerkoncentrationen, hvor Halo-bindingsfarveintensiteten begynder at plateau (dvs. alle Halo-fusionerede ankre er optaget af dimerizeren og ikke mere tilbage til Halo-bindingsfarvefarvet)32.
  4. For at vende dimerisering inkuberes celler med dimerizers i 2-5 timer (med eller uden levende billeddannelse), eller indtil den ønskede dråbestørrelse er opnået, og der tilføjes 100 μM gratis TMP (endelig koncentration) fortyndet i billedmedie til celler.

3. Immunofluorescence (HVIS)

  1. Frø 105 celler på 12 mm diameter cirkulære dækglas belagt med poly-D-lysin i 6-brønd plade. Derefter transfect de to plasmider (Halo-GFP-TRF1 med mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutant) og vente i 24-48 timer, før du fortsætter med at immunofluorescence.
    BEMÆRK: Vent mere end en dag efter transfektion kan opnå højere udtryk.
  2. Fortynd dimerizers med vækstmedium for at nå en endelig koncentration på 100 nM, tilsæt fortyndede dimerizers til celler og inkuberes ved 37 °C i 4-5 timer.
    BEMÆRK: Faseadskillelse induceres hurtigt efter tilsætning af dimerizers (< 30 minutter). Længere inkubation hjælper dråber grovere i større størrelser. Efter dråbevækst med live imaging kan bruges til at bestemme den tid, det tager for dråber at nå en ønsket tilstand.
  3. Fix celler i PBS opløsning, der indeholder 4% formaldehyd og 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur til permeabilize celler. Vask cellerne 3 gange med PBS.
    BEMÆRK: Efter dette trin kan den sættes på pause, og celler kan opbevares ved 4 °C i op til en uge.
    Forsigtig: Formaldehyd er skadeligt ved indånding, og hvis det sluges, irriterer det også øjne, åndedrætssystem og hud og er en mulig kræftrisiko. Behov for at bære personlige værnemidler, brug kun i en kemisk røghætte. Læg den også i en affaldsbeholder efter brug, kassér den ikke i vasken.
  4. Vaskeovertræk to gange med 50 μL TBS-Tx og en gang med 50 μL Antistoffortynding Buffer (AbDil). TBS-Tx blev lavet af TBS, 0,1% Triton X-100 og 0,05% Na-azide. AbDil blev lavet af TBS-Tx, 2% BSA og 0,05% Na-azide.
  5. Inkuber hver coverlip med 50 μL primær anti-PML (1:50 fortynding i AbDil) / anti-SUMO1 (1:200 fortynding i AbDil) / anti-SUMO2/3 antistof (1:200 fortynding i AbDil) ved 4 °C i et befugtet kammer natten over. mCherry antistof kan også anvendes (1:200 fortynding i AbDil) til at hjælpe med at opdage mCherry signal til FISK.
    BEMÆRK: FISK slukker mCherry fluorescerende signal, hvilket gør det vanskeligt at skelne celler transfected med mCherry plasmid fra dem, der ikke transfected i FISH eksperimenter. Brug af mCherry antistof anbefales. Alternativt kan man lave en stabil cellelinje, der udtrykker eDHFR indeholdende protein.
  6. Vask coverlips 3 gange med AbDil at fjerne ubundet primært antistof.
  7. Inkuber celler med sekundært antistof [anti-mus IgG (H + L) sekundært antistof konjugeret med Alexa Fluor 647 for PML og SUMO, anti-kanin IgG (H + L) sekundært antistof konjugeret med Alexa Fluor 555 for mCherry, begge ved 1:1000 fortynding i AbDil] i 1 time i mørk boks ved stuetemperatur.
  8. Vask coverlips 3 gange med TBS-Tx.
  9. Etiketslide, fortynd DAPI i monteringsmedier for at nå DAPI's endelige koncentration på 1 μg/mL. Sæt derefter 2 μL fortyndet DAPI på diaset. Vend coverlips over og placere dem på DAPI drop, aspire ekstra væske fra kanten af coverlip.
  10. Seal med neglelak, lad det tørre og skyl fra toppen af coverlip med vand. Gem i fryseren til billedbehandling.

4. Fluorescens in situ hybridisering (FISK)

  1. Frø 105 celler på 12 mm diameter cirkulære dækglas belagt med poly-D-lysin i 6-brønd plade. Transfekte celler med Halo-TRF1 og mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutant plasmids og vent i 24-48 timer, før du fortsætter til FISH. Dimeriseringstrinnet er det samme som beskrevet i 3.2.
    BEMÆRK: Her er TRF1 ikke smeltet sammen med GFP, så den grønne kanal frigøres til telomere DNA-sonde.
  2. Fix celler med 4% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og vask 4 gange med PBS. For IF-FISH skal du fortsætte til IF-protokollen herfra og efter vask af sekundært antistof i IF (3.8), anbringe celler med 4% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og vask tre gange med PBS.
  3. Dehydratdæksler i en ethanolserie (70%, 80%, 90%, 2 minutter hver).
  4. Inkuber coverlips med 488-telC PNA sonde (1:2000-forhold) i 5 μL hybridiseringsopløsning ved 75 °C i 5 minutter. Hybridiseringsopløsning indeholder 70% deioniseret formamid, 10 mM Tris (pH 7.4), 0,5% blokerende reagens. Inkuber derefter natten over i et befugtet kammer ved stuetemperatur.
  5. Vaskedæksler med vaskebuffer (70% formamid, 10 mM Tris) 2 minutter i 3 gange ved stuetemperatur og monter med 1 μg/mL DAPI i monteringsmedier til billeddannelse.
    BEMÆRK: FISH-protokollen er en offentliggjort protokol33'34.

5. Live imaging

  1. Når cellerne er klar til billeddannelse, monteres coverslips i magnetiske kamre med celler, der vedligeholdes i 1 mL billedmedie uden phenolrødt på et opvarmet stadium i et miljøkammer.
  2. Opsætning af mikroskop og miljøkontrolapparat. Billeder blev erhvervet med en roterende disk konfokal mikroskop med en 100x 1,4 NA mål, en Piezo Z-Drive, en elektron multiplicere opladning-koblet enhed (EMCCD) kamera, og en laser fusionere modul udstyret med 455, 488, 561, 594 og 647 nm lasere kontrolleret af billedbehandling software. Udgangskræfter for alle lasere måles i fiberafslutningen.
  3. Find celler med lyst GFP-signal på telomerer og diffust lokaliseret mCherry-signal i nukleoplasmaet. Find omkring 20 celler, huske hver position med x, y, z information og oprette parametre for tid bortfalder billeddannelse med 0,5 μm afstand for i alt 8 μm i Z og 5-minutters tidsinterval for 2-4 timer for både GFP og mCherry kanaler. Brug 30% af 594 nm og 50% af 488 nm effektintensitet, med eksponeringstider på 200 ms og kamera få 300.
    BEMÆRK: Laserenhedernes udgangseffekt er 20 mW. Bright GFP foci angiver større ankerstørrelse, som lettere kan nukleate kondensater. Find celler med en bred vifte af mCherry signal, fordi fase adskillelse afhænger af SIM-koncentration i cellen. Celler med for svagt eller for lyst mCherry-signal fases muligvis ikke adskilt. For at undgå fotografering må du ikke bruge for meget lasereffekt eller for lang eksponeringstid.
  4. Start billeddannelse og tag engangssløjfe som fordæmpning. Sæt billeddannelsen på pause, og tilsæt 0,5 mL billedbehandlingsmedier, der indeholder 15 μL på 10 μM dimerizer, til billedbehandlingskammeret på scenen, så den endelige dimerizerkoncentration er 100 nM. Fortsæt billeddannelsen.
  5. Når du er klar til at vende dimerisering, skal billeddannelsen sættes på pause, tilføje 0,5 mL billedbehandlingsmedier, der indeholder 2 μL 100 mM lager TMP, til billedbehandlingskammeret på scenen for at få 100 μM TMP endelig koncentration. Fortsæt billedceller i 1-2 timer.

6. Fast billeddannelse

  1. Samme mikroskop oprettet som levende billeddannelse, scene opvarmning er ikke nødvendig. Brug 488 nm til at afbilde telomere FISH, 561 nm for mCherry IF og 647 nm for PML eller SUMO IF.
    BEMÆRK: Hvis ikke bruger en mCherry antistof, bare direkte billede mCherry protein, men signal måske dim på grund af slukning i FISK.  Brug stadig 561 nm i stedet for 594 nm laser til billede mCherry for at undgå signal bleed-through af Cy5 til mCherry.
  2. Find omkring 30-50 celler med rødt signal (mCherry eller mCherry IF) for at vælge for transfected celler.
  3. Billeder blev taget med 0,3 μm afstand for i alt 8 μm i Z til indsamling af flere signaler. Brug 80 % af 647 nm, 80 % af 561 nm og 70 % af 488 nm effektintensitet med eksponeringstider på 600 ms og kameraforøgelse på 300.

7. Behandl time-lapse billeder

  1. Definer binær for telomerer
    Vælg én celle med alle tids- og z-stack-oplysninger, vælg kun GFP-kanalen, og opret et binært lag ved at definere tærskel. Juster de nedre og øvre værdier af tærsklen og brug funktioner som "Glat", "Clean" og "Fyld huller" for at se, hvor godt tærsklen opfanger de ønskede objekter gennem alle tid punkter.
  2. Træk baggrund fra
    Vælg alle kanaler, tegne rektangel Region of Interest (ROI) på baggrunden (bortset fra cellen). Definer dette investeringsafkast som baggrund, og træk derefter baggrundsintensiteten fra.
  3. Link telomere binær til telomere intensitet
    Vælg telomer binary og link den til GFP-kanal til beregning af GFP-intensitet i de binære objekter som telomerintensitet.
  4. Beregn telomernummer og intensitet over tid
    Angiv, hvilke oplysninger der skal eksporteres, f.eks. Brug figurplotsoftware til at læse den eksporterede tabel og generere tal for telomerenummer og telomereintensitet (opsummer intensiteten over lydstyrken i hver telomere og derefter gennemsnit over alle telomerer i en celle) over tid.

8. Behandl billeder med fast celle

  1. Definer binær for APB'er
    Vælg transfected celler til analyse ved at lede efter signal i 561nm kanal. Efter proceduren i 7.1 skal du definere tærskel i både GFP-kanalen (telomere DNA FISH) og Cy5-kanal (PML eller SUMO IF) for at generere binære til henholdsvis telomerer og PML-organer eller SUMO. Flet GFP og Cy5 binære lag og skabe et nyt lag, der indeholder partikler, der både har GFP og Cy5 signal til at repræsentere co-lokalisering af PML krop på telomerer, således APBs.
  2. Beregn EFTERLYS/SUMO-nummer og -intensitet
    Træk billedbaggrunden fra efter 7,2. Knyt det binære APB/SUMO-lag til Cy5-kanalen efter 7,3. Beregn APB/SUMO-nummer og -intensitet. Eksport- og plotdata efter 7.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative billeder af telomerisk lokalisering af SUMO identificeret ved telomere DNA FISH og SUMO protein IF er vist i figur 2. Celler med SIM rekruttering beriget SUMO1 og SUMO 2 / 3 på telomerer i forhold til celler med SIM mutant rekruttering. Dette indikerer, at SIM dimerization-induceret SUMO berigelse på telomerer afhænger af SUMO-SIM interaktioner.

En repræsentativ tid bortfalder film af TRF1 og SIM efter dimerization er vist i Video 1. Snapshots på fire tidspunkter vises i figur 3A. SIM blev med succes rekrutteret til telomerer og både SIM og TRF1 foci blev større og lysere, som forudsagt for flydende dråbedannelse og vækst (Figur 1B). Desuden blev der observeret fusion af TRF1 foci (figur 3B), hvilket førte til telomereklynger som vist i det reducerede telomeretal (Figur 3E) og øget telomerintensitet over tid (figur 3D). I modsætning hertil blev SIM mutant rekrutteret til telomerer efter dimerization, men ikke fremkalde nogen dråbedannelse eller telomere klyngedannelse, som telomere intensitet ikke vokse og telomere nummer ikke reducere (Figur 3C, D, E, Video 2). Dette indikerer, at faseadskillelse og dermed telomereklynger er drevet af SUMO-SIM-interaktioner.

Tilbageførsel af faseadskillelse og telomereklynger efter tilføjelse af overskydende gratis TMP vises i video 3. Snapshots på fire tidspunkter vises i figur 4A. Enig med den forventede kondensat opløsning og de-klyngedannelse af telomerer, telomere antal steg, og telomere intensitet faldt over tid (Figur 4B, C).

Repræsentative billeder af APBs identificeret ved telomere DNA FISH og PML protein IF er vist i figur 5. Celler med SIM rekrutteret har flere APBs end celler med SIM mutant rekrutteret, tyder dimerization-induceret kondensater er faktisk APBs.

Tallene her viser repræsentative billeder. For statistisk analyse med flere celler henvises til Zhang et. al., 202011.

Figure 1
Figur 1: Kemisk dimerisering for at fremkalde kromatin-associerede kondensater. (A) Dimeriseringsskematisk: Dimerizeren består af to forbundne ligands, TMP og Halo, der interagerer med henholdsvis eDHFR og Haloenzym. Faseadskillende protein er smeltet sammen til mCherry og eDHFR, og kromosomforankrproteinet er smeltet sammen til Halo og GFP. (B) Før tilsætning dimerizer (øverst til venstre kerne), de fleste kromosom anker proteiner (grønne firkanter) er lokaliseret til kromosomer og en lille mængde anker proteiner er diffust lokaliseret i nukleoplasma. Fase, der adskiller proteiner, der skal rekrutteres (lilla stjerner) og faseadskillende partnere (proteiner, der vil kondensere med fasen, der adskiller protein, røde trekanter) er diffust lokaliseret i nukleoplasmaet. Efter tilsætning dimerizers (top-højre kerne), fase adskiller proteiner dimerized til anker protein på kromosomer og i nukleoplasma. Der kan være nogle overskydende fase adskiller proteiner i nucleoplasma, afhængigt af den relative koncentration af ankerprotein, fase adskiller protein og dimerizer anvendes. Efter dimerisering (nederste højre kerne) fører øget lokal koncentration af fasen, der adskiller proteiner ved ankeret, til faseadskillelse og dannelsen af kromatin-tilknyttede kondensater. Faseadparerende partnere beriges ved ankeret på grund af co-kondensering med eDHFR-smeltet fase, der adskiller protein. Ankerproteiner, der ikke er direkte bundet til kromatinen, kan beriges ved ankeret på grund af dimerisering til fasen, der adskiller protein. Efter at have tilføjet overskydende gratis TMP for at konkurrere med dimerizeren om eDHFR-binding (nederste venstre kerne), frigives faseadskillende protein fra kromatinen, og kondensatet opløses. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: SUMO beriges efter rekruttering af SIM til telomerer med dimerizers. (A) Dimeriseringsskematisk i dette eksperiment: SIM (eller SIM mutant) er smeltet sammen til mCherry og eDHFR, og TRF1 er smeltet sammen til Halo og GFP. (B) En repræsentativ celle for telomere DNA FISH og SUMO1 IF efter rekruttering af SIM. Bunden er binært lag identificere telomerer, SUMO1 og antallet af colocalized SUMO1 og telomere DNA foci. Skalastænger: 5 μm. (C) En repræsentativ celle til telomere DNA FISH og SUMO1 IF efter rekruttering af SIM mutant. Nederst er det binære lag af de billeder, der anvendes til at identificere antallet af colocalized SUMO1 og telomere DNA foci. Skalastænger: 5 μm. (D) En repræsentativ celle til telomere DNA FISH og SUMO2/3 IF efter rekruttering af SIM. Nederst er det binære lag, der identificerer telomerer, SUMO2/3, og antallet af colocalized SUMO2/3 og telomere DNA foci. Skalastænger: 5 μm. (E) En repræsentativ celle til telomere DNA FISH og SUMO2/3 IF efter rekruttering af SIM mutant. Nederst er det binære lag af de billeder, der anvendes til at identificere antallet af colocalized SUMO2/3 og telomere DNA foci. Skalastænger: 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Dimerization-induceret faseadskillelse driver telomereklyngen. (A) Snapshots af TRF1-GFP og SIM-mCherry før og efter tilsætning af 100 nM dimerizer (endelig koncentration). Nederst er telomere binære lag identificeret fra TRF1-GFP. Skalastænger: 5 μm. (B) En fusionshændelse efter rekruttering af SIM til telomerer. Skalastænger: 2 μm. Tidsinterval: 5 min. (C) Snapshots af TRF1-GFP og SIM mutant-mCherry før og efter tilsætning af 100 nM dimerizer (endelig koncentration). Nederst er telomere binære lag identificeret fra TRF1-GFP. Skalastænger: 5 μm. (D) Gennemsnitlig telomerintensitet (opsummer intensiteten over volumenet i hver telomere og derefter gennemsnit over alle telomerer i en celle) over tid efter rekruttering af SIM (grøn, for celle i figur 3A) og SIM mutant (blå, for celle i figur 3C). (E) Telomere nummer over tid efter rekruttering sim (grøn, for celle i figur 3A) og SIM mutant (blå, for celle i figur 3C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Tilbageførsel af kondens og telomereklynger. (A) Snapshots af TRF1-GFP og SIM-mCherry efter tilsætning af 100 μM TMP (endelig koncentration) til celler med kondensater dannet i 3 timer. Nederst er telomere binære lag identificeret fra TRF1-GFP. Skalastænger: 5 μm. (B) Gennemsnitlig telomerintensitet (opsummer intensiteten over volumenet i hvert telomere og derefter gennemsnit over alle telomerer i en celle) over tid for celle i figur 4A. (C) Telomere nummer over tid for celle i figur 4A. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Dimeriseringsfremkaldte kondensater er APBs. (A) En repræsentativ celle til telomere DNA FISH og PML IF efter rekruttering af SIM. Nederst er det binære lag, der identificerer telomerer, PML-organer og antallet af colocalized PML og telomere DNA foci, dvs. Skalastænger: 5 μm. (B) En repræsentativ celle til telomere DNA FISH og PML IF efter rekruttering af SIM mutant. Nederst er det binære lag af de billeder, der anvendes til at identificere antallet af colocalized PML og telomere DNA foci, dvs. Skalastænger: 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Rekruttering af SIM med dimerizers til telomerer drev fase adskillelse og telomere klyngedannelse. Live imaging af SIM-mCherry, TRF1-GFP, og fusionere kanaler før og efter tilføjelse af 100 nM dimerizer (endelig koncentration). Skalastænger: 5 μm. Tidsinterval: 5 min. Tid som vist. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Rekruttering af SIM mutant kan ikke drive faseadskillelse og telomere klyngedannelse. Live imaging af SIM mutant-mCherry, TRF1-GFP og fusionere kanaler før og efter tilføjelse af 100 nM dimerizer (endelig koncentration). Skalastænger: 5 μm. Tidsinterval: 5 min. Tid som vist. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Tilbageførsel af kondens og telomere klyngedannelse. Levende billeddannelse af SIM-mCherry, TRF1-GFP og fletkanaler efter tilsætning af 100 μM TMP (endelig koncentration) til celler med kondensater dannet i 3 timer. Skalastænger: 5 μm. Tidsinterval: 5 min. Tid som vist. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol demonstrerede dannelse og opløsning af kondensater på telomerer med et kemisk dimeriseringssystem. Kinetik af faseadskillelse og dråbefusionsinduceret telomereklynger overvåges med levende billeddannelse. Kondensat lokalisering og sammensætning bestemmes med DNA FISH og protein IF.

Der er to vigtige trin i denne protokol. Den første er at bestemme protein og dimerizer koncentration. Succesen med at fremkalde lokal faseadskillelse ved et genomisk græshoppe afhænger af stigningen i den lokale koncentration af den fase, der adskiller protein over den kritiske koncentration for faseadskillelse (Figur 1B). Den globale koncentration af den fase, der adskiller protein, skal være høj nok til, at der er proteiner nok til at blive koncentreret lokalt. Koncentrationen af den fase, der adskiller protein, kan ikke være for høj, så den globale faseadskillelse er opstået eller let kan induceres.  Anker DNA-længden (eller størrelsen af den modificerede kromatin, som ankerproteinet binder sig til) og koncentrationen af Halo-fusioneret ankerprotein bestemmer størrelsen af nucleation center ved maksimal dimerization effektivitet. Jo større ankerstørrelsen er, jo let er det at nukleate kondensater. Dimeriseringseffektiviteten påvirkes af mængden af dimerizers i forhold til mængden af ankerproteiner. For få dimerizers kan ikke besætte alle de tilgængelige ankerproteiner, mens for mange dimerizers resulterer i ikke-produktiv binding af eDHFR til de overskydende dimerizers snarere end til dem på ankerproteinet. Dimerizer koncentration, sammen med anker DNA længde og koncentration af Halo-fusioneret anker protein, kan bruges til at bestemme den kritiske koncentration, der kræves for nucleating lokal fase adskillelse. En systematisk tilgang til at variere disse parametre (anker DNA-længde, ankerproteinkoncentration, faseadskillelsesproteinkoncentration og dimerizerkoncentration) kan bruges til at kortlægge et flerdimensionelt fasediagram. Men hvis interessen ikke er i kortlægning fase diagram, men danner kromatin associeret kondensater som demonstreret her, er det meget nemt at blot vælge celler med lyse Halo-GFP signal (større anker størrelse) og celler med en bred vifte af lysstyrke for mCherry-eDHFR (forskellige fase adskiller proteinkoncentration) til billede med dimerizer koncentration for maksimal dimerisering bestemmes i protokol 2.3. Det andet kritiske skridt er at undgå fotobleaching i live imaging. Forskellig fra den globale fase adskillelse, hvor dråber (lyse mCherry foci mærkning af fase adskiller protein) vil opstå efter fase adskillelse, lokale kondensation på genomiske steder kan ikke let ses ved at dømme tilstedeværelsen af mCherry foci. Dette skyldes, at rekruttering af protein alene, uden fase adskillelse, til genomisk loci vil resultere i dannelsen af mCherry lokale foci. Faseadskillelse sker efter rekruttering, så mCherry foci fortsætter med at blive større og lysere efter indledende rekruttering. Den fase separation-induceret berigelse kan forekomme i GFP kanal (anker protein) samt, på grund af dimerization af anker protein til fase adskillelse protein. Derfor bør ændring af fysiske egenskaber (størrelse og intensitet) af foci over tid i stedet for tilstedeværelsen af foci bruges til at bedømme fase adskillelse. Selv om det kan være vanskeligt at differentiere dimerization eller fase separation-induceret berigelse af mCherry (bytteprotein) foci, berigelse af GFP (anker protein) foci kun opstår, hvis der er fase adskillelse (Figur 3D). Derfor kan berigelsen af ankerprotein bruges til nemt at bedømme faseadskillelse. Photobleaching skyldes høj lasereffekt eller lang eksponeringstid under billeddannelse gør det vanskeligere at bedømme faseadskillelse fra levende billeddannelse og bør derfor undgås så meget som muligt ved at justere billeddannelsestilstanden. Bemærk, at stigninger i foci intensitet og størrelse over tid er karakteristika for LLPS, men kan ikke bruges som det eneste bevis for LLPS. I det her fremlagte tilfælde blev dråbefusion brugt som bevis for dannelsen af flydende dråber, som muligvis ikke forekommer for mindre antal ankre eller færre mobile ankre. Uden dråbefusion kan andre metoder såsom diffusion af kondensatkomponenter og følsomhed over for små molekyleforstyrrelser anvendes til yderligere at bekræfte kondensatdannelse8,9,11.

Selvom dette kemiske dimeriseringssystem gør tidsmæssig opløsning nødvendig for at overvåge faseadskillelse i levende celler, mangler det rumlig opløsning på celle- og subcellulært niveau. Takket være dimerizers modulære design er det muligt at lave lysfølsomme dimerizers ved at fastgøre en fotocage til TMP, hvilket gør linkeren lysfølsom eller begge12,32,35. Ved blot at skifte dimerizers inden for samme konstruerede celle baggrund for forskellige applikationer, høj rumlig og tidsmæssig kontrol af dimerization, vending af dimerization, eller begge med lys kan opnås. Vi forestiller os med disse lysfølsomme dimerizers, vil det være i stand til at styre fase adskillelse med høj rumlig og tidsmæssig præcision. Sammenlignet med de tilgængelige optogenetiske værktøjer til at kontrollere faseadskillelse gennem lysfølsomme proteiner36,37, er en ulempe ved det kemiske dimeriseringssystem, at det kun kan vende faseadskillelse én gang. Dette system kan dog opretholde vedvarende rekruttering og dermed faseadskillelse uden lys, hvilket gør det mere egnet til langsigtede live imaging applikationer såsom at følge dråbevækst eller cellulære konsekvenser af faseadskillelse. Hertil kommer, at evnen til at behandle en population af celler uden lys gør det bekvemt for biokemiske assays såsom dem, der er nødvendige for at bestemme kondensat sammensætning eller ændringer i genom organisation.

Denne metode kan let tilpasses til at fremkalde kondensater andre steder på genomet. Man kan blot identificere et protein, der binder sig til den genomiske placering af interesse og smelte det til Halo for at bruge det som et anker (Figur 1B). Alternativt kan man kombinere dette med CRISPR og fusionere dCas9 til Halo og bruge guide RNA'er til at forankre Halo til det genomiske loci af interesse38. Derudover kan man forankre Halo til et ektopisk DNA-array (f.eks. LacO), der er integreret i genomet ved at smelte Halo til målproteinet (f.eks. LacI). Man kan derefter bruge en bottom-up tilgang til at vurdere et proteins evne til at fase adskilt lokalt på kromatin, hvordan dets faseadskillelsesevne påvirkes af proteinafkortninger, mutationer eller postoversættelsesændringer, eller hvordan kondensatet påvirker lokale funktioner som kromatinmodifikation, replikation eller transskription. For at opsummere kan dette kemiske dimeriseringssystem bruges til at fremkalde en bred vifte af kondensater på forskellige kromatinplaceringer og er særligt velegnet til at undersøge, hvordan materialeegenskaberne og den kemiske sammensætning af kromatin-associerede kondensater bidrager til kromatinfunktioner ved at kombinere langsigtet levende billeddannelse med biokemiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health (1K22CA23763201 til H.Z., GM118510 til D.M.C.) og Charles E. Kaufman foundation til H.Z. Forfatterne vil gerne takke Jason Tones for korrekturlæsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific 28906 Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate VWR 10861-554
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-101
Anti-mCherry antibody Abcam Ab183628
Anti-PML antibody Santa Cruz sc966
Anti-SUMO1 antibody Abcam Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody Cytoskeleton Asm23
Blocking Reagent Roche 11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML  VWR 89511-258
Circle Cover Slips Thermo Scientific 3350
Confocal microscope  Nikon MQS31000
DAPI Fisher Scientific D1306
Dimethyl Sulphoxide  Sigma-Aldrich 472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10017CV
EMCCD Camera iXon Life  897
Ethanol Fisher Scientific 4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Gibco A4766801
Formamide, Deionized MilliporeSigma 46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Laser merge module  Nikon NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668027
Figure plotting software, MATLAB The MathWorks
Microscope Slide Box Fisher Scientific 34487
Nail Polish Fisher Scientific 50-949-071
Imaging software, NIS-Elements  Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 51985091
Parafilm Bemis 13-374-12
PBS 10x, pH 7.4 Fisher Scientific 70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X Gibco 15140122
Piezo Z-Drive  Physik Instrumente (PI) 91985
Pipet Tips VWR 10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides Fisher Scientific 22-037-246
Poly-D-Lysine solution Sigma-Aldrich A-003-E
Sodium Azide Fisher Scientific BP922I-500
Spinning disk Yokogawa CSU-X1
Square Cover Slips Thermo Scientific 3305
TBS 10x solution Fisher Scientific BP2471500
TelC-Alexa488 PNA Bio F1004
TMP Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
TNH Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
Tris Solution Fisher Scientific 92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution MilliporeSigma 64-846-350ML Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories NC9524612

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

Tags

Biologi Udgave 170 kondensater væske-væske fase adskillelse kemisk dimerizer lokal kondens telomerer PML nukleare organ
Kemisk dimerisering-induceret protein kondensater på telomerer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, R., Chenoweth, D. M., Zhang,… More

Zhao, R., Chenoweth, D. M., Zhang, H. Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres. J. Vis. Exp. (170), e62173, doi:10.3791/62173 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter