Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.

Abstract

بروتينات الميسين ربط والتفاعل مع أكتين خيوط (F-أكتين) وتوجد في الكائنات الحية عبر شجرة phylogenetic. يتم تكييف بنيتها وخصائصها الأنزيمية للوظيفة الخاصة التي تنفذها في الخلايا. Myosin 5a يمشي بشكل عملي على F-actin لنقل الميلانوسومات والحويصلات في الخلايا. وعلى العكس من ذلك، يعمل الميوسين غير العضلي 2b كخيوط ثنائية القطب تحتوي على ما يقرب من 30 جزيء. يتحرك F-actin من القطبية المعاكس نحو وسط خيوط، حيث جزيئات الميوسين تعمل بشكل غير متزامن لربط أكتين، ونقل السكتة الدماغية السلطة، وتفكك قبل تكرار الدورة. غير عضلة ميوزين 2B، جنبا إلى جنب مع غيرها من الميوزين 2 isoforms غير عضلة، والأدوار التي تشمل الالتصاق الخلية، السيتوكينيس، وصيانة التوتر. يمكن دراسة قياس الميوسينيز عن طريق إجراء فحوصات الحركة المختبرية باستخدام البروتينات المنقى. في مقايسة خيوط أكتين المزلقة ، ترتبط الميوسين بسطح غطاء المجهر وتناسل الفلورسنت المسمى F-actin ، والذي يمكن تتبعه. في جزيء واحد / فرقة المقايسة الحركة، ومع ذلك، لا بد F-actin إلى coverlip ويلاحظ حركة جزيئات الميوسين المسمى الفلورسنت على F-actin. في هذا التقرير، يتم تحديد تنقية الميوسين المؤتلف 5a من خلايا Sf9 باستخدام الكروماتوغرافيا التقاربية. بعد ذلك ، نحدد اثنين من المقايسات المستندة إلى المجهر الفلوري: المقايسة خيوط actin المزلقة ونقس الحركة المقلوب. من هذه المقايسات، يمكن استخراج معلمات مثل سرعات نقل أكتين وأطوال وسرعات تشغيل جزيء واحد باستخدام برنامج تحليل الصور. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنيات لدراسة حركة خيوط واحدة من الميوزين غير العضلي 2 isoforms، التي نوقشت هنا في سياق 2B ميوسين غير عضلي. يمثل سير العمل هذا بروتوكولا ومجموعة من الأدوات الكمية التي يمكن استخدامها لدراسة جزيء واحد وديناميكيات الفرقة من الميوسين غير العضلي.

Introduction

الميوسين هي البروتينات الحركية التي تمارس القوة على خيوط أكتين باستخدام الطاقة المستمدة من التحلل المائي الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)1. Myosins تحتوي على الرأس والرقبة ، والذيل المجال. يحتوي مجال الرأس على منطقة ربط أكتين بالإضافة إلى موقع ربط ATP والتحلل المائي. وتتكون مجالات الرقبة من الزخارف IQ، والتي ترتبط سلاسل الضوء، كالمودولين، أو كالمودولين مثل البروتينات2،3. منطقة الذيل لديها العديد من الوظائف المحددة لكل فئة من الميوسين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر إلى تضاؤل سلسلتين ثقيلتين، وربط جزيئات البضائع، وتنظيم الميوسين عن طريق التفاعلات الأوتينهيبيتورية مع نطاقات الرأس1.

خصائص متحركة من الميوسين تختلف اختلافا كبيرا بين الطبقات. وتشمل بعض هذه الخصائص نسبة الواجب (جزء من دورة myosin الميكانيكية التي لا بد أن المايوسين actin) و processivity (قدرة المحرك على اتخاذ خطوات متعددة على مسارها قبل مفرزة)4. تم تحديد أكثر من 40 فئة من الميوسين على أساس تحليلات التسلسل5،6،7،8. تصنف المايوسينات من الفئة 2 على أنها "تقليدية" لأنها كانت أول من درس. جميع الطبقات الأخرى من الميوسين، لذلك، تصنف على أنها "غير تقليدية".

Myosin 5a (M5a) هو فئة 5 myosin وهو محرك معالجي ، مما يعني أنه يمكن أن يتخذ خطوات متعددة على طول actin قبل الانفصال. لديها نسبة واجب عالية، مما يدل على أنها تنفق جزءا كبيرا من دورتها الميكانيكية ملزمة actin9،10،11،12،13،14. على غرار الميوسينات الأخرى ، تحتوي السلسلة الثقيلة على مجال محرك N-terminal يتضمن كلا من ربط actin وموقع التحلل المائي ATP متبوعا بمنطقة الرقبة التي تعمل كذراع ذراع ، مع ستة زخارف IQ ترتبط بالسلاسل الخفيفة الأساسية (ELC) والكالمودولين (CaM)15. تحتوي منطقة الذيل على α-helical ملفوف-لفائف، والتي تغمغم جزيء، تليها منطقة ذيل كروي للشحن ملزمة. حركيته تعكس مشاركتها في نقل الميلانوسومات في الخلايا الصباغية و الشبكية endoplasmic في الخلايا العصبية Purkinje16,17. ويعتبر M5A نقل البضائع النموذجية المحرك18.

فئة 2 myosins، أو الميوسين التقليدية، وتشمل الميوسين أن تقلص الطاقة من الهيكل العظمي، والقلب، والعضلات الملساء بالإضافة إلى الميوزين غير العضلي 2 (NM2) isoforms، NM2a، 2B، و 2C19. وNM2 isoforms موجودة في السيتوبلازم لجميع الخلايا ولها أدوار مشتركة في السيتوكينيس، التصاق، مورفوجينيسيس الأنسجة، وهجرة الخلايا19،20،21،22. تناقش هذه الورقة بروتوكولات الميوسين التقليدية في سياق الميوزين غير العضلي 2b (NM2b)23. NM2b، بالمقارنة مع M5a، لديها نسبة واجب منخفض وأبطأ أنزيميا معماكس V من 0.2 ق-123 مقارنة ماكسV M5a من ≈18 ق-124. وتجدر الإشارة إلى أن بنيات NM2b المبتورة برأسين لا تتحرك بسهولة بشكل عملي على actin؛ بدلا من ذلك، كل لقاء مع actin النتائج في السكتة الدماغية السلطة تليها فصافر من جزيء25.

NM2b يحتوي على سلسلتين ثقيلتين myosin، كل مع مجال الرأس كروي واحد، واحد رافعة الذراع (مع ELC واحد وسلسلة ضوء تنظيمية واحدة (RLC)،)، وقضيب ملفوف α-helical-لفائف / المجال الذيل، ما يقرب من 1100 الأحماض الأمينية طويلة، أن يقلل من هذه السلسلتين الثقيلة. وينظم النشاط الأنزيمي والدولة الهيكلية من NM2b عن طريق الفوسفور من RLC23. NM2b unphosphorylated، في وجود ATP والقوة الأيونية الفسيولوجية (ما يقرب من 150 mM الملح)، ويعتمد تشكيل المدمجة حيث جعل الرأسين المشاركة في التفاعل غير المتماثل والذيل طيات مرة أخرى فوق رؤوس في مكانين23. في هذه الحالة، لا يتفاعل الميوسين بقوة مع أكتين ولديه نشاط أنزيمي منخفض جدا. على الفوسفور RLC بواسطة كيناز سلسلة ضوء الميوسين المعتمدة على كالمودولين (MLCK) أو كيناز البروتين المرتبط برو ، يمتد الجزيء ويرتبط مع الميوسينات الأخرى عبر منطقة الذيل لتشكيل خيوط ثنائية القطب من حوالي 30 جزيء ميوزين23. الفوسفور المذكورة أعلاه من RLC يؤدي أيضا إلى زيادة النشاط ATPase أكتين تنشيط NM2b من قبل ما يقرب من أربع مرات26،27،28. هذا الترتيب خيوط ثنائي القطب, يضم العديد من المحركات الميوسين في كل نهاية, هو الأمثل لأدوار في انكماش وصيانة التوتر, حيث يمكن نقل خيوط أكتين مع القطبية معارضة بالنسبة لبعضها البعض23,29. وبناء على ذلك، وقد ثبت NM2b لتكون بمثابة مجموعة من المحركات عند التفاعل مع أكتين. العدد الكبير من المحركات داخل هذه خيوط تسمح خيوط NM2b للتحرك بشكل عملي على خيوط أكتين، مما يجعل في عملية خيوط المختبر ممكن لتوصيف29.

في حين تم إحراز تقدم في فهم دور الميوسين في الخلية، هناك حاجة لفهم خصائصها الفردية على مستوى البروتين. لفهم تفاعلات أكتوميوسين على مستوى تفاعل بسيط بين البروتين والبروتين ، بدلا من داخل الخلية ، يمكننا التعبير عن وتنقية الميوسين المؤتلف للاستخدام في الدراسات المختبرية. نتائج مثل هذه الدراسات ثم إبلاغ علماء الأحياء الميكانيكية حول الخصائص الفيزيائية الحيوية من الميوسين محددة التي تدفع في نهاية المطاف العمليات الخلوية المعقدة12،13،14،25،29. عادة، يتم إنجاز ذلك عن طريق إضافة علامة تقارب إلى بناء myosin كامل الطول أو مبتورة وتنقية عبر الكروماتوغرافيا تقارب29،30،31. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن هندسة البناء ليشمل الفلوروفور القابل للتكويد وراثيا أو علامة لوضع العلامات على البروتين مع الفلوروفور الاصطناعي. عن طريق إضافة مثل هذه التسمية الفلورسنت، يمكن إجراء دراسات التصوير جزيء واحد لمراقبة ميكانيكا اليوسين والحركية.

بعد تنقية, يمكن أن تتميز الميسين في عدة طرق. ويمكن قياس النشاط ATPase من خلال أساليب colorimetric، وتوفير نظرة ثاقبة استهلاك الطاقة الشاملة وتقارب أكتين من المحرك تحت ظروف مختلفة32. لمعرفة المزيد عن التماثل الميكانيكي لحركيته ، هناك حاجة إلى مزيد من التجارب. تفصل هذه الورقة طريقتين في المختبر تعتمدان على المجهر الفلوري ويمكن استخدامهما لتوصيف الخصائص المتحركة لبروتين الميوسين المنقى.

أول هذه الطرق هو المقايسة خيوط أكتين المزلقة ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الخصائص الكمية لفرقة محركات الميوسين ، وكذلك دراسة جودة دفعة من البروتين النقي33. على الرغم من أن هذه الورقة تناقش استخدام المجهر الكلي الانعكاس الداخلي (TIRF) لهذا المقايسة، يمكن إجراء هذه التجارب بشكل فعال باستخدام مجهر مضان واسع المجال مجهز بكاميرا رقمية، توجد عادة في العديد من المختبرات34. في هذا المقايسة، يتم إرفاق طبقة مشبعة من محركات الميوسين إلى غطاء. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام النيتروسليلوز، والأجسام المضادة، والأغشية، SiO2-اشتقاق السطوح (مثل تريميثيلكلوروسيلين)، من بين أمور أخرى29،33،35،36،37،38. يتم تمرير خيوط أكتين المسمى Fluorescently من خلال غرفة coverslip ، التي يرتبط عليها actin إلى الميوسين المرفق بالسطح. عند إضافة ATP (وkinases في دراسة NM2) ، يتم تصوير الغرفة لمراقبة نقل خيوط الأكتين بواسطة الميوسين المرتبط بالسطح. تتبع البرمجيات يمكن استخدامها لربط سرعة وطول كل مزلق actin خيوط. يمكن أن توفر برامج التحليل أيضا مقياسا لعدد خيوط actin المتحركة والقرطاسية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد جودة إعداد الميوسين المعطى. ويمكن أيضا أن تكون نسبة خيوط المتوقفة عمدا تحويرها الربط السطحي من أكتين إلى البروتينات الأخرى وقياسها لتحديد الاعتماد على تحميل من39الميوسين . لأن كل خيوط أكتين يمكن أن تدفعها عدد كبير من المحركات المتاحة، وهذا المقايسة قابلة للاستنساخ جدا، مع السرعة النهائية المقاسة يجري قوية للاضطرابات مثل التعديلات في تركيز الميوسين بدءا أو وجود عوامل إضافية في الحل. وهذا يعني أنه يمكن تعديلها بسهولة لدراسة نشاط الميوسين في ظل ظروف مختلفة، مثل الفوسفور المتغيرة، ودرجة الحرارة، والقوة الأيونية، و لزوجة الحل، وآثار الحمل الناجم عن الحبال السطحية. على الرغم من أن عوامل مثل الميسين قوية الربط "رؤساء القتلى" غير قادر على التحلل المائي ATP يمكن أن يسبب خيوط أكتين المتوقفة، توجد أساليب متعددة للتخفيف من هذه القضايا والسماح لقياسات دقيقة. خصائص الحركية من الميوسين تختلف اختلافا كبيرا عبر الطبقات، واعتمادا على الميسين محددة المستخدمة، وسرعة مزلق خيوط أكتين في هذا المقايسة يمكن أن تختلف من أقل من 20 نانومتر / ثانية (myosin 9)40،41،وحتى 60،000 نانومتر / ثانية (Characean myosin 11)42.

المقايسة الثانية عكس هندسة مزلق actin خيوط المقايسة12. هنا ، يتم إرفاق خيوط الأكتين بسطح الغطاء ويتم تصور حركة جزيئات واحدة من M5a أو خيوط ثنائية القطب فردية من NM2b. يمكن استخدام هذا المقايسة لتحديد أطوال وسرعات تشغيل جزيئات الميوسين المفردة أو خيوطها على actin. غطاء مغطى بمجمع كيميائي يمنع الربط غير المحدد ويميز السطح في نفس الوقت، مثل البيوتين البولي إيثيلين غليكول (البيوتين-PEG). إضافة مشتقات avidin المعدلة ثم يعبي السطح ويتم تمرير أكتين البيوتينات من خلال الغرفة، مما أدى إلى طبقة من F-actin ملزمة بشكل ثابت إلى أسفل الغرفة. وأخيرا، يتم تدفق الميوسين المنشط والمسمي بالفلورسنت (عادة 1-100 nM) من خلال الغرفة، والتي يتم تصويرها بعد ذلك لمراقبة حركة الميوسين فوق خيوط الأكتين الثابتة.

تمثل هذه الطرائق أساليب سريعة وقابلة للاستنساخ يمكن استخدامها لدراسة ديناميكيات كل من الميوسين غير العضلي والعضلات. يحدد هذا التقرير الإجراءات لتنقية وتوصيف كل من M5a و NM2b ، مما يمثل الميوسين غير التقليدي والتقليدي ، على التوالي. ويلي ذلك مناقشة لبعض التعديلات الخاصة بالميسين، والتي يمكن إجراؤها لتحقيق التقاط الحركة بنجاح في نوعي المقايسة.

التعبير والبيولوجيا الجزيئية
يجب استنساخ cDNA لmيوزين من الفائدة على ناقلات pFastBac1 المعدلة التي ترميز إما لC-محطة FLAG-tag (DYKDDDDK) إذا كان التعبير عن M5a-HMM, أو علامة FLAG N-المحطة إذا أعرب عن جزيء كامل الطول من NM2b23,43,44,45,46. C-محطة FLAG-العلامات على NM2b النتائج في تقارب ضعف البروتين للعمود العلم تقارب. في المقابل، البروتين N-terminally FLAG الموسومة عادة يربط جيدا إلى العمود العلم تقارب23. يحتفظ البروتين الموسوم بشكل نهائي بالنشاط الأنزيمي والنشاط الميكانيكي والتنظيم المعتمد على الفوسفور23.

في هذه الورقة، تم استخدام ماوس مبتور M5a meromyosin الثقيلة (HMM) مثل بناء مع GFP بين العلامة FLAG وC-terminus من سلسلة الميوزين الثقيلة. لاحظ أنه على عكس NM2b، يمكن وضع علامة على M5a-HMM بنجاح وتنقيته باستخدام علامات FLAG N-أو C-terminal وفي كلتا الحالتين سيكون البناء الناتج نشطا. تم اقتطاع سلسلة M5a الثقيلة في الأحماض الأمينية 1090 ويحتوي على ثلاثة وصلة الأحماض الأمينية (GCG) بين GFP ومنطقة ملفوف لفائف من M5a47. لم يتم إضافة رابط إضافي بين GFP و FLAG-tag. M5a-HMM شارك في التعبير مع كالمودولين. وقد شارك في التعبير عن بناء NM2b البشري الكامل الطول مع ELC و RLC. تم دمج N-termini من RLC مع GFP عبر رابط من خمسة أحماض أمينية (SGLRS). تعلق مباشرة إلى العلامة FLAG كان HaloTag. بين هالوتاغ والنهاء ن من سلسلة الميسين الثقيلة كان رابط مصنوع من اثنين من الأحماض الأمينية (AS).

تم تنقية كل من الاستعدادات الميوسين من لتر واحد من ثقافة الخلية Sf9 المصابة بفيروس baculo في كثافة حوالي 2 × 106 خلايا / مل. تعتمد أحجام الفيروس الكولو لكل وحدة فرعية على تعدد عدوى الفيروس كما تحددها تعليمات الشركة المصنعة. في حالة M5a ، كانت الخلايا مصابة بفيروسين باكولو مختلفين - واحد للكالمودولين ، وواحد لسلسلة M5a الثقيلة. في حالة NM2b ، كانت الخلايا مصابة بثلاثة فيروسات مختلفة - واحد ل ELC ، واحد ل RLC ، وواحد لسلسلة NM2b الثقيلة. للمختبرات التي تعمل مع مجموعة متنوعة من الميوسين (أو غيرها من البروتينات متعددة التعقيد)، وهذا النهج هو كفاءة لأنه يسمح للعديد من تركيبات من سلاسل الثقيلة والخفيفة والسلاسل الخفيفة المستخدمة عادة مثل كالمودولين يمكن أن تكون مشتركة مع العديد من سلاسل ثقيلة myosin مختلفة. تم الانتهاء من جميع أعمال الخلية في خزانة السلامة البيولوجية مع تقنية معقمة مناسبة لتجنب التلوث.

للتعبير عن كل من M5a و NM2b ، تم جمع خلايا Sf9 المنتجة للميوسين المؤتلف بعد يومين إلى 3 أيام من العدوى ، عن طريق الطرد المركزي ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم الحصول على الكريات الخلية عن طريق الطرد المركزي خلايا SF9 المصابة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 2800 × ز. يتم تفصيل عملية تنقية البروتين أدناه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنقية البروتين

  1. تحلل الخلايا واستخراج البروتين
    1. إعداد مخزن استخراج 1.5x استنادا إلى الجدول 1. تصفية وتخزين عند 4 °C.
    2. بدء ذوبان الكريات الخلية على الجليد. بينما الكريات هي ذوبان الجليد, تكملة 100 مل من استخراج العازلة مع 1.2 m M dithiothreitol (DTT), 5 ميكروغرام / مل ليوبيتين, 0.5 ميكرومتر فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) واثنين من أقراص مثبطة البروتيز. ابق على الجليد.
    3. بمجرد ذوبان بيليه، إضافة 1 مل من المخزن المؤقت استخراج تكملة لكل 10 مل من ثقافة الخلية. على سبيل المثال، إذا تشكلت الكريات الخلية من 500 مل من ثقافة الخلية، ثم إضافة 50 مل من ملحق استخراج العازلة إلى بيليه.
    4. Sonicate الكريات الخلية مع الاحتفاظ بها على الجليد. لكل بيليه، استخدم الشروط التالية: 5 ق ON، 5 ق OFF، مدة 5 دقائق، السلطة 4-5.
    5. جمع كل lysate متجانسة في كوب وإضافة ATP (0.1 M حل الأسهم؛ pH 7.0) بحيث التركيز النهائي من ATP هو 1 mM. يحرك المزيج لمدة 15 دقيقة في غرفة باردة. ينأى ATP الميسين النشط عن أكتين، مما يسمح بفصله في خطوة الطرد المركزي التالية. ولذلك، فمن الضروري المضي قدما إلى الخطوة التالية على الفور لتقليل إمكانية استنفاد ATP وإعادة ربط إلى actin.
    6. طرد مركزي للlysates في 48،000 × ز ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية. في حين أن هذا يحدث، تبدأ غسل 1-5 مل من الطين 50٪ من راتنج تقارب مكافحة FLAG (لبيليه شكلت من 1 لتر من الخلايا) مع 100 مل الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. على سبيل المثال، ل5 مل من الراتنج، اغسل 10 مل من الطين بنسبة 50٪. في خطوة الغسيل النهائية، إعادة إنفاق الراتنج مع 1-5 مل من برنامج تلفزيوني مع حجم كاف لخلق الطين 50٪.
    7. بعد الطرد المركزي lysate، والجمع بين supernatant مع الطين الراتنج غسلها والصخور بلطف في غرفة باردة لمدة 1-4 ساعة. أثناء الانتظار، قم بإجراء المخازن المؤقتة الموضحة في الجدول 1 وإبقائها على الجليد.
  2. إعداد تنقية تقارب FLAG
    1. الطرد المركزي الحل في الخطوة 1.7 في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. الراتنج سوف تكون معبأة في الجزء السفلي من الأنبوب. دون إزعاج الراتنج، وإزالة supernatant.
    2. إعادة إنفاق الراتنج في 50 مل من العازلة A كما هو مفصل في الجدول 1 والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. دون إزعاج الراتنج، وإزالة supernatant.
    3. إعادة إنفاق الراتنج في 50 مل من المخزن المؤقت B كما هو مفصل في الجدول 1 والطرد المركزي عند 500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى وإعادة إنفاق الراتنج في 20 مل من المخزن المؤقت B. ثم، مزيج الراتنج والعازلة جيدا عن طريق عكس بلطف أنبوب باليد ما يقرب من 10 مرات.
  3. البروتين الغبطة والتركيز
    1. جعل 30 مل من Elution العازلة كما هو موضح في الجدول 1 والسماح لها البرد على الجليد.
    2. إعداد عمود elution في غرفة باردة. صب بلطف الطين الراتنج في العمود. اغسل العمود بأحجام عمود 1-2 من Buffer B كما حزم الراتنج في الأسفل، مما يضمن عدم جفاف الراتنج.
    3. تدفق 1 مل من العازلة Elution من خلال الراتنج وجمع تدفق من خلال في أنبوب 1.5 مل. كرر ذلك بحيث يتم جمع 12، 1 مل كسور.
    4. عند هذه النقطة، إجراء اختبار برادفورد الخام على الكسور لتحديد نوعيا الكسور التي هي الأكثر تركيزا48. على صف واحد من لوحة 96 جيدا، ماصة 60 ميكرولتر 1x برادفورد كاشف. كما يتم جمع الكسور، مزيج 20 ميكرولتر من كل جزء لكل بئر. تلوين أزرق أغمق يشير إلى الكسور الأكثر تركيزا.
    5. في أنبوب 50 مل، وجمع البروتين المتبقية عن طريق pipetting بلطف المخزن المؤقت Elution المتبقية من خلال العمود، للافراج عن أي ميوزين المتبقية ملزمة الراتنج في تدفق العمود. وسيتركز هذا التدفق في الخطوة التالية. تأكد من أن الراتنج يتم تجديده لإعادة استخدامه وتخزينه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    6. تجمع الكسور الثلاثة الأكثر تركيزا وزيادة تركيز التدفق من خلال في أنبوب 50 مل، فضلا عن الكسور المتبقية 1 مل باستخدام أنبوب التركيز MWCO 100،000. قم بتحميل العينة المجمعة على أنبوب التركيز والطرد المركزي عند 750 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وكرر حتى يتم تركيز جميع البروتين المتبلور إلى حجم نهائي يبلغ حوالي 0.5-1 مل.
      ملاحظة: يسمح حجم المسام هذا بالاحتفاظ بجزيئات الميوسين ، التي تحتوي على كتل عدة أضعاف قطع الوزن الجزيئي. سلاسل الضوء لا تزال ملزمة بإحكام إلى المجالات الحركية خلال هذا الوقت من التركيز، كما تم التحقق من خلال أداء SDS-PAGE هلام electrophoresis على المنتج النهائي.
  4. غسيل الكلى وتجميد الفلاش
    1. جعل 2 L من المخزن المؤقت غسيل الكلى، كما هو موضح في الجدول 1. قم بتحميل العينة في كيس غسيل الكلى أو الغرفة و dialyze بين عشية وضحاها في الغرفة الباردة. لاحظ أن تكوين مخازن غسيل الكلى يختلف عن NM2b و M5a.
      ملاحظة: في حالة NM2b، الغرض من هذه الخطوة غسيل الكلى هو تشكيل خيوط myosin في العازلة قوة الأيونية منخفضة. ثم يوفر ترسيب هذه الخيوط خطوة تنقية إضافية ويسمح بتركيز العينة. لذلك، سيكون هناك عجل أبيض مرئي في غرفة غسيل الكلى في اليوم التالي. وسيتم جمع هذه الخيوط عن طريق الطرد المركزي وإزالة الطابعة في الخطوة 5-1. في حالة M5a-HMM ، بعد غسيل الكلى بين عشية وضحاها ، سيكون البروتين نقيا بما يكفي للاستخدام في المقايسات اللاحقة. يمكن تنفيذ المزيد من خطوات تنقية مثل الترشيح هلام أو الكروماتوغرافيا تبادل الأيونية، إذا لزم الأمر. للتعافي M5a بعد غسيل الكلى، انتقل إلى الخطوة 5.2.
  5. يتعافى الميسين بعد غسيل الكلى
    1. بالنسبة إلى NM2b، قم بتفريغ العينة بأكملها بعناية من كيس غسيل الكلى أو الغرفة والطرد المركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 49000 × ز لجمع خيوط الميوسين. تجاهل supernatant وإضافة التخزين المخزن المؤقت تدريجيا إلى بيليه كما هو موضح في الجدول 1 حتى يذوب. لطيف صعودا وهبوطا pipetting يساعد على تليين بيليه. عادة، وهذا لا يتطلب أكثر من 500 ميكرولتر لكل أنبوب. بعد التأكد من أن بيليه يذوب تماما في العازلة تخزين قوة الأيونية عالية، يمكن تنفيذ خطوة الطرد المركزي إضافية (15 دقيقة في 49،000 × ز) لإزالة المجاميع غير المرغوب فيها إذا لزم الأمر، لأن الميوسين الآن أن تكون غير مكتملة وستبقى في supernatant.
    2. بالنسبة إلى M5a-HMM، اجمع العينة بأكملها بعناية من غرفة غسيل الكلى والطرد المركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 49000 × ز في حالة وجود أي مجاميع غير مرغوب فيها. خذ الناسخ الخارق
  6. تحديد التركيز وتجميد الفلاش
    1. لتحديد تركيز المنتج، قم بقياس الامتصاص باستخدام مطياف ضوئي عند الأطوال الموجية 260 و280 و290 و320 نانومتر. حساب التركيز في ملغم / مل (جملغ / مل) مع المعادلة 1, حيث يمثل A280 امتصاص في 280 نانومتر و A320 يمثل امتصاص في 320 نانومتر. يمكن تحويل التركيز الناتج في ملغم / مل إلى ميكرومتر من جزيئات الميوسين مع المعادلة 2، حيث M هو الوزن الجزيئي للبروتين بأكمله (بما في ذلك السلاسل الثقيلة والسلاسل الخفيفة والفلوروفوريس وجميع العلامات).
      جملغم / مل = (A280 - A320) / ε (1)
      جزيئات ميكرومتر = 1000cملغم/مل/م (2)
      ملاحظة: إذا كان تخفيف ضروري، ثم يجب أن يتم ذلك في عازلة قوة الأيونية عالية. يمكن تحديد معامل الانقراض (ε) عن طريق استيراد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين إلى برنامج مثل ExPASy. العائد النموذجي للM5a-HMM هو ما يقرب من 0.5-1 مل من البروتين 1-5 ملغم / مل وNM2b كامل الطول هو 0.5-1 مل من 0.5-2 ملغ / مل. معامل الانقراض ل M5a-HMM المستخدمة في هذه الورقة كان 0.671. معامل الانقراض لNM2b المستخدمة في هذه الورقة كان 0.611.
    2. تخزين الميوسين المنقى في واحدة من الطريقتين. Aliquot بين 10-20 ميكرولتر في أنبوب رقيقة الجدران، مثل أنبوب تفاعل سلسلة البلمرة، وإسقاط الأنبوب في وعاء من النيتروجين السائل لتجميد فلاش. بدلا من ذلك، ماصة مباشرة بين 20-25 ميكرولتر من الميوسين في النيتروجين السائل وتخزين الخرز المجمدة من البروتين في أنابيب التبريد العقيمة. وفي كلتا الحالتين، يمكن تخزين الأنابيب الناتجة في -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل للاستخدام في المستقبل.
      ملاحظة: منذ كل من المقايسات الحركة الموصوفة أدناه تتطلب كميات صغيرة جدا من البروتين، والتخزين في aliquots الصغيرة، كما هو موضح، هو اقتصادي.

2. مزلق actin خيوط المقايسة

  1. إعداد غطاء الغطاء
    1. جعل حل نيتروسيلولوس 1٪ في خلات أميل.
    2. احصل على طبق زراعة نسيج (150 × 25 مم) وأضف ورق فلتر دائري (قطره 125 مم) إلى أسفل الطبق.
    3. تحميل ثمانية رقم 1.5 سمك 22 مم coverslips مربع على رف ويغسل مع ما يقرب من 2-5 مل من الإيثانول 200 واقية تليها 2-5 مل من الماء المقطر (DH2O). كرر خطوة الغسيل هذه، وتنتهي بالماء. ثم، الجافة coverlips تماما باستخدام خط الهواء المصفاة أو N2-خط.
    4. تأخذ واحدة coverslip وماصة ببطء 10 ميكرولتر من محلول نيتروسيلولوس 1٪ على طول حافة واحدة من زلة. ثم، في حركة واحدة على نحو سلس، تشويه عبر بقية coverslip باستخدام الجانب من طرف ماصة 200 ميكرولتر على نحو سلس من جانب. وضع هذا coverslip على طبق زراعة الأنسجة مع الجانب النيتروسليلوز حتى. كرر للأغطية المتبقية والسماح لهم لتجف أثناء إعداد الكواشف المتبقية واستخدام coverlips في غضون 24 ساعة بعد الطلاء.
  2. إعداد الغرفة
    1. امسح شريحة المجهر بورق عدسة بصري لتنظيف الحطام الكبير. قطع قطعتين من الشريط على الوجهين، ما يقرب من 2 سم في الطول.
    2. ضع قطعة واحدة على طول منتصف الحافة الطويلة لشريحة المجهر. تأكد من محاذاة حافة الشريط مع حافة الشريحة. ضع القطعة الثانية من الشريط تقريبا 2 مم تحت القطعة الأولى من الشريط بحيث تكون متوازية ومتوائمة. وهذا يخلق غرفة تدفق التي يمكن أن تعقد ما يقرب من 10 ميكرولتر من الحل (انظر الشكل 1).
    3. خذ واحدة من الأغطية المغلفة بالنيتروسليلوز من الجزء 1. عصا بعناية coverslip على الشريط بحيث الجانب المغلفة مع nitrocellulose هو إجراء اتصال مباشر مع الشريط ، (انظر الشكل 1). باستخدام تلميح ماصة، اضغط برفق لأسفل على واجهة شريط الشرائح لضمان أن غطاء الغطاء قد التزم بشكل صحيح بالشريحة. قطع الشريط الزائد معلقة على حافة الشريحة مع شفرة حلاقة.
  3. إعداد أكتين
    1. جعل 20 ميكرومتر F-أكتين عن طريق البلمرة أكتين كروي (G-أكتين) في البلمرة العازلة (50 MM KCl, 2 م م MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (درجة الحموضة 7.0)) في 4 °C بين عشية وضحاها.
    2. تمييع F-actin إلى 5 ميكرومتر في العازلة الحركة (20 م MOPS, 5 م م MgCl2, 0.1 م EGTA, 1 mM DTT (درجة الحموضة 7.4)). تسمية مع ما لا يقل عن 1.2x الضرس الزائد من رودامين-phalloidin. ترك (مغطاة رقائق الألومنيوم) لمدة 2 ساعة على الأقل على الجليد. ويمكن استخدام هذا لمدة تصل إلى 1-2 أشهر، وتخزينها على الجليد.
  4. أداء الميوسين 5a مزلق actin خيوط المقايسة
    ملاحظة: في هذا القسم، يتم توفير تفاصيل الفحص المزلق myosin 5a (HMM).
    1. إعداد حلول ل 5a myosin الموصوفة في الجدول 2 والاحتفاظ بها على الجليد.
    2. تدفق في 10 ميكرولتر من 5A ميوزين (50-100 nM) من خلال غرفة التدفق وانتظر لمدة 1 دقيقة.
    3. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملغم / مل BSA في 50 ميجابايت مع 1 MM DTT ("الملح المنخفض" العازلة). كرر هذا الغسيل مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد الغسيل الثالث. استخدم ركن ورق الأنسجة أو ورق التصفية لتكتيل المحلول عبر القناة عن طريق وضع ركن الورق برفق عند مخرج غرفة التدفق.
    4. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    5. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول أكتين الأسود (5 ميكرومتر F-أكتين، 1 ميكرومتر كالمودولين، و 1 MM ATP في 50 ميجابايت مع 1 MM DTT) للقضاء على "رؤساء القتلى"، كما نوقش في قسم المناقشة.
      1. ماصة الحل مع حقنة 1 مل و 27 إبرة G لقص خيوط أكتين قبل إدخال الحل إلى الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين وانتظر دقيقة واحدة بعد المرة الثالثة. ما يقرب من 20 أحداث pipetting كافية.
      2. لأداء تدور "الرأس الميت" ، إضافة كمية من القياسات القياسية F -actin إلى ميوزين في وجود 1 MM ATP و 1 mM MgCl2 بتركيز ملحي قدره 500 mM. ثم أجهزة الطرد المركزي الفائق في 480،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. الميسين الميت سيكون في بيليه
    6. تدفق في 50 ميكرولتر من 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT و 1 MM ATP لاستنفاد غرفة خيوط أكتين الحرة.
    7. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين لاستنفاد غرفة أي ATP.
    8. تدفق في 10 ميكرولتر من 20 nM رودامين أكتين (Rh-Actin) حل يحتوي على 1 MM DTT في 50 م م م MB وانتظر لمدة 1 دقيقة للسماح لصرامة ملزمة من خيوط أكتين إلى 5a myosin تعلق على سطح coverlip.
    9. غسل مع 10 ميكرولتر من 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT لغسل خيوط Rh-Actin غير ملزمة إلى السطح. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    10. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي.
    11. تسجيل الصور على المجهر الفلوري باستخدام الطول الموجي الإثارة من 561 نانومتر لتصور Rh-Actin. وقت التعرض المناسب هو 200 مللي ثانية في 1.4 كيلوواط طاقة الليزر لمدة اقتناء مجموع 0.5-1 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من أن معدل الاستحواذ يتم قياسه بشكل مناسب إلى سرعة خيوط الحركة. يعتبر معدل إطار الاستحواذ أحد الاعتبارات الهامة قبل جمع البيانات لاستخدامها مع برامج التتبع. ستؤدي حركات subpixel بين الإطارات إلى المبالغة في تقدير السرعة ، ويلزم حركات عدة مئات من النانومتر للحصول على قيم دقيقة. يتميز معدل الامتلاك الأمثل باقتناز actin لمسافة بكسل واحدة على الأقل بين الإطارات. في حالة المجهر TIRF المستخدمة للتصوير هنا، يترجم هذا عتبة إلى 130 نانومتر. لذلك، يجب تصوير الميوسين المتوقع أن يسافر 1 ميكرومتر/ثانية بمعدل 5 إطارات/ثانية (فاصل زمني 0.2 ثانية) لتحقيق 200 نانومتر من الحركة بينما يتطلب الميوسين المتوقع أن يسافر 10 نانومتر/ثانية 0.05 إطار/ثانية (فترات 20 ثانية). ولذلك يمكن تقليص البيانات في هذه المرحلة إذا لزم الأمر (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
  5. أداء غيرmuscle ميوزين 2b مزلق actin خيوط المقايسة
    ملاحظة: في هذا القسم، يتم توفير تفاصيل المقايسة مزلق myosin 2b كامل الطول. غيرmuscle myosin 2b مزلق actin خيوط بروتوكول المقايسة يختلف عن بروتوكول 5A myosin في خطوات معينة. تأكد من استخدام المخازن المؤقتة الصحيحة لكل من هذه الخطوات. على سبيل المثال، يتطلب الفحص NM2b مرفق من الميوسين إلى coverlip في المخزن المؤقت الملح عالية بينما يمكن إرفاق M5a إلى غطاء في مخازن الملح عالية أو منخفضة. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم مقايسة خيوط أكتين المزلق M5a تركيز أقل من الميسين للتخفيف من تكرار خيوط أكتين التي تتفكك أثناء الاستحواذ.
    1. إعداد حلول لNM2b كما هو موضح في الجدول 2 والاحتفاظ بها على الجليد.
    2. تدفق في 10 ميكرولتر من ميوسين غير عضلي 2b (0.2 ميكرومتر) في 500 متر موتورز العازلة (MB) ("الملح العالي" العازلة) و 1 م dithiothreitol (DTT) من خلال غرفة التدفق وانتظر لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: مخازن الملح العالية ينفصم خيوط الميوزين والسماح لمرفق جزيئات الميوسين واحد إلى السطح، كما يمكن أن يبوليمر ميوسين 2B غير عضلة في خيوط بتركيز أيوني <150 mM.
    3. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملغم / مل ألبوم مصل البقري (BSA) في 500 ميجابايت مع 1 MM DTT ("الملح العالي" العازلة) كما هو موضح في الجدول 2. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد الغسيل الثالث. استخدم زاوية ورقة نسيج أو ورقة تصفية لتكتيل الحل من خلال القناة.
    4. غسل مع 10 ميكرولتر من 500 ميجابايت مع 1 MM DTT كما هو موضح في الجدول 2. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    5. تدفق في 10 ميكرولتر من حل أكتين السوداء على النحو المبين في الجدول 2 للقضاء على "رؤساء القتلى"، كما نوقش كذلك في قسم المناقشة. يحتوي محلول الأكتين الأسود على 5 ميكرومتر من F-actin غير المصنفة ، و 1-10 nM MLCK ، و 1 mM ATP ، و 0.2 m M CaCl2، و 1 μM CaM ، و 1 mM DTT في 50 m M NaCl العازلة للفوسفورات غير العضلية الميوسين 2b على سطح الغرفة.
      1. ماصة الحل مع حقنة 1 مل و 27 إبرة G لقص خيوط أكتين قبل إدخال الحل إلى الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين وانتظر دقيقة واحدة بعد المرة الثالثة. تقريبا، 20 أحداث pipetting كافية.
    6. تدفق في 50 ميكرولتر من 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT و 1 MM ATP لاستنفاد غرفة خيوط أكتين الحرة.
    7. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين لاستنفاد غرفة أي ATP.
    8. تدفق في 10 ميكرولتر من 20 nM Rh-Actin الحل الذي يحتوي على 1 MM DTT في 50 م MB وانتظر لمدة 1 دقيقة للسماح لصرامة ملزمة من خيوط أكتين إلى 2B ميوسين غير عضلي تعلق على سطح coverlip.
    9. غسل مع 10 ميكرولتر من 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT لغسل خيوط Rh-Actin غير ملزمة إلى السطح. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    10. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي. لغيرmuscle myosin 2b مزلق actin خيوط المقايسة، المخزن المؤقت النهائي يشمل أيضا كالمودولين، CaCl2،وسلسلة ضوء كيناز الميوسين لتوفير الفوسفور الكامل من 2B ميوسين nonmuscle أثناء التصوير بالفيديو. 0.7٪ ميثيلسليلوز يمكن أيضا أن تدرج في المخزن المؤقت النهائي إذا كانت خيوط أكتين مقيدة فقط فضفاضة أو ليست ملزمة إلى السطح. هذا هو مزيد من المناقشة في قسم المناقشة.
    11. تسجيل الصور على المجهر الفلوري باستخدام الطول الموجي للإثارة من 561 نانومتر. وقت التعرض المناسب هو 200 مللي ثانية في 1.4 كيلوواط طاقة الليزر لمدة اقتناء مجموع 0.5 -3دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من أن معدل الاستحواذ يتم قياسه بشكل مناسب إلى سرعة خيوط الحركة. يعتبر معدل إطار الاستحواذ أحد الاعتبارات الهامة قبل جمع البيانات لاستخدامها مع برامج التتبع. ستؤدي حركات subpixel بين الإطارات إلى المبالغة في تقدير السرعة ، ويلزم حركات عدة مئات من النانومتر للحصول على قيم دقيقة. يتميز معدل الامتلاك الأمثل باقتناز actin لمسافة بكسل واحدة على الأقل بين الإطارات. في حالة المجهر TIRF المستخدمة للتصوير هنا، يترجم هذا عتبة إلى 130 نانومتر. لذلك، يجب تصوير الميوسين المتوقع أن يسافر 1 ميكرومتر/ثانية بمعدل 5 إطارات/ثانية (فاصل زمني 0.2 ثانية) لتحقيق 200 نانومتر من الحركة بينما يتطلب الميوسين المتوقع أن يسافر 10 نانومتر/ثانية 0.05 إطار/ثانية (فترات 20 ثانية). ولذلك يمكن أخذ عينات من البيانات في هذه المرحلة، إذا لزم الأمر (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).

3. جزيء واحد TIRF المقايسة

  1. إعداد غطاء الغطاء
    1. تقسيم مسحوق المخزون إلى 10 ملغ aliquots (في أنابيب 1.5 مل) من ميثوكسي-بيغ سيلان (mPEG) و 10 ملغ aliquots من البيوتين-بيغ-سيلان (bPEG). يخزن عند -20 درجة مئوية في حاوية مغلقة وخالية من الرطوبة ويستخدم في غضون 6 أشهر.
    2. تحميل ثمانية رقم 1.5H (عالية الدقة) سمك 22 ملم coverslips مربع على رف ويغسل مع 2-5 مل من الإيثانول 200 واقية تليها 2-5 مل من الماء المقطر. كرر خطوة الغسيل هذه، وتنتهي بالماء. ثم، وتجفيف الأغطية تماما باستخدام خط الهواء أو N2 والبلازما نظيفة مع الأرجون لمدة 3 دقائق.
    3. ضع الأغطية النظيفة على ورق الفلتر (90 مم) في طبق زراعة الأنسجة (100 × 20 مم) واحتضنها في فرن 70 درجة مئوية أثناء تنفيذ الخطوات التالية.
      ملاحظة: يمكن استبدال تنظيف البلازما مع طرق التنظيف الكيميائية الأخرى49.
    4. إعداد 80٪ حل الإيثانول مع DH2O وضبط درجة الحموضة إلى 2.0 باستخدام HCl. إضافة 1 مل من هذا إلى 10 ملغ aliquot من mPEG و 1 مل إلى 10 ملغ aliquot من bPEG. دوامة لتذوب، والتي لا ينبغي أن يستغرق أكثر من 30 ثانية.
    5. خذ 100 ميكرولتر من محلول bPEG وأضف 900 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ (درجة الحموضة 2.0). هذا الحل هو 1 ملغم/ مل bPEG. ثم، وجعل حل كل من PEGs على النحو التالي، والاختلاط بدقة.
      1. 200 ميكرولتر من 10 ملغم/مل من المليغرام (التركيز النهائي: 2 ملغم/مل).
      2. 10 ميكرولتر من 1 ملغم/مل bPEG (التركيز النهائي: 10 ميكروغرام/مل).
      3. 790 ميكرولتر من محلول الإيثانول 80٪ (درجة الحموضة 2.0).
    6. أخرجي قطع الأغطية من الفرن الاستغناء بعناية 100 ميكرولتر من محلول PEG على مركز كل غطاء، وضمان أن السطح العلوي فقط هو الرطب. ثم ضعي القسائم في الفرن واحتضني لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
    7. عندما تبدأ الأغطية في الظهور بمظهر دائري ، مع دوائر صغيرة واضحة عبر السطح ، قم بإزالتها من الفرن.
    8. غسل كل غطاء مع الإيثانول 100٪، الجافة مع خط الهواء، ووضعها مرة أخرى في الفرن. احتضان فقط للوقت اللازم لإنشاء غرف في الخطوة 2.
  2. إعداد الغرفة
    1. تنظيف شريحة المجهر لاستخدامها في صنع الغرفة. قطع قطعتين من الشريط على الوجهين، ما يقرب من 2 سم في الطول.
    2. ضع قطعة واحدة على طول منتصف الحافة الطويلة لشريحة المجهر. تأكد من محاذاة حافة الشريط مع حافة الشريحة. ضع القطعة الثانية من الشريط تقريبا 2 مم تحت القطعة الأولى من الشريط بحيث تكون متوازية ومتوائمة.
    3. خذ واحدة من الأغطية الوظيفية من الفرن (تم إنشاؤها في 3.1). عصا بعناية coverslip على الشريط بحيث الجانب المغلفة PEG هو وجهه لأسفل وإجراء اتصال مباشر مع الشريط، كما هو مبين في الشكل 1. باستخدام تلميح ماصة، اضغط برفق لأسفل على واجهة شريط الشرائح لضمان أن غطاء الغطاء قد التزم بشكل صحيح بالشريحة.
    4. قطع الشريط الزائد معلقة على الشريحة مع شفرة حلاقة. يمكن استخدام هذه الغرف على الفور أو وضعها بشكل زوجي في أنبوب سعة 50 مل وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. من المهم تخزين فورا أو السطح سوف تتحلل.
  3. أداء الفحص المجهري myosin 5a TIRF
    1. إعداد الحلول لميوسين 5a المقايسة الحركة مقلوب وصفها في الجدول 3 والاحتفاظ بها على الجليد.
    2. اغسل الغرفة ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 mM DTT.
    3. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملغم / مل BSA في 50 ميجابايت مع 1 MM DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد الغسيل الثالث. استخدم زاوية ورقة نسيج أو ورقة تصفية لتكتيل الحل من خلال القناة.
    4. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    5. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin في 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT وانتظر لمدة 1 دقيقة.
    6. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    7. تدفق في 10 ميكرولتر من البيوتينيلات رودامين أكتين (bRh-Actin) التي تحتوي على 1 MM DTT في 50 MM MB وانتظر لمدة 1 دقيقة. لهذه الخطوة، استخدم طرف ماصة كبيرة بالملل وتجنب الأنابيب صعودا وهبوطا للحد من القص من خيوط أكتين الفلورسنت لضمان أن خيوط أكتين طويلة يمكن إرفاقها إلى السطح (20-30 ميكرومتر أو أكثر). بديل فعال هو قطع مخروط طرف ماصة القياسية (مع فتح ≈1-1.5 ملم).
    8. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    9. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي مع 10 nM myosin 5a المضافة، ثم تحميل فورا على المجهر TIRF وتسجيل بعد العثور على التركيز الأمثل لTIRF طريقة التصوير. مرات التعرض بين 100-200 مللي ثانية مناسبة في 1.4 كيلوواط طاقة الليزر لactin وGFP المسمى ميوزين. وقت الاقتناء المناسب لتحليل السرعة هو 3 دقائق.
  4. أداء غير عضلة ميوزين 2b TIRF الفحص المجهري
    ملاحظة: في هذا القسم، يتم توفير تفاصيل المقايسة TIRF myosin 2b غير الميوسين باستخدام خيوط بلمرة وفوسفوريلاتيد. بروتوكول مفصل (أقسام 4.1-4.3) لفوسفوريلاتينج والبوليمرة يتم تضمين ميوسين-2b غير عضلة في أنبوب.
    1. لفوسفور NM2b المنقى، وجعل مزيج كيناز 10x مع الشروط التالية: 2 MM CaCl2،1 μM CaM، 1-10 nM MLCK، و 0.1 M ATP. يمكن جلب هذا إلى وحدة التخزين مع 500 ميغا بايت مع 10 MM DTT. إضافة مزيج كيناز 10x إلى الميوسين بنسبة حجمية من 1:10 والسماح لهذا لاحتضان لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عادة، تركيز الميوسين لهذه الخطوة هو 1 ميكرومتر.
    2. لبلمرة الفوسفوريلات الميسين إلى خيوط، وخفض تركيز الملح من NM2b إلى 150 mM NaCl. للقيام بذلك، قم بعمل مخزن مؤقت للحركية 1x (1x MB) بدون ملح عن طريق تخفيف 4x MB أربع مرات في dH2O. يمكن استخدام هذا 1x ميغابايت لخفض تركيز الملح لأنه تم تجميد NM2b في مخزن ملحي 500 mM.
    3. لكل 3 ميكرولتر من المخزون NM2b، أضف 7 ميكرولتر من 1x MB لخفض تركيز الملح إلى 150 mM NaCl واحتضان على الجليد لمدة 20-30 دقيقة لتشكيل خيوط NM2b.
      ملاحظة: الترتيب في الأقسام 4.1-4.3 ليس حاسما طالما أن NM2b هو فوسفوريلاتي وتركيز الملح النهائي هو 150 mM. الحضانة على ترتيب 30 دقيقة -1 ساعة يسمح الوقت الكافي للفوسفور الكامل والبوليمرة.
    4. إعداد الحلول لغيرmuscle myosin 2b المقايسة الحركة المقلوبة الموصوفة في الجدول 3 والاحتفاظ بها على الجليد.
    5. اغسل الغرفة ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا متر ميجابايت مع 1 mM DTT.
    6. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملغم / مل BSA في 150 ميجابايت مع 1 mM DTT كرر هذا غسل مرتين أكثر وانتظر لمدة 1 دقيقة بعد غسل الثالث. استخدم زاوية ورقة نسيج أو ورقة تصفية لتكتيل الحل من خلال القناة.
    7. اغسله ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    8. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin في 150 ميغا بايت مع 1 MM DTT وانتظر لمدة 1 دقيقة.
    9. اغسله ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    10. تدفق في 10 ميكرولتر من bRh-Actin وانتظر لمدة 1 دقيقة. لهذه الخطوة، استخدم طرف ماصة كبير بالملل وتجنب الأنابيب صعودا وهبوطا لتقليل القص من خيوط أكتين الفلورسنت، لضمان أن خيوط أكتين طويلة يمكن إرفاقها إلى السطح (20-30 ميكرومتر أو أكثر). بديل فعال هو قطع مخروط طرف ماصة القياسية.
    11. اغسله ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    12. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول ميوسين 2b غير عضلي (حوالي 30 nM) وانتظر لمدة دقيقة واحدة.
    13. اغسله ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا بايت مع 1 mM DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    14. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي، ثم تحميل فورا على المجهر TIRF وتسجيل بعد العثور على التركيز الأمثل لTIRF طريقة التصوير. مرات التعرض بين 100-200 مللي ثانية مناسبة في 1.4 كيلوواط طاقة الليزر لactin وGFP المسمى ميوزين. وقت الاقتناء المناسب لتحليل السرعة هو 3 دقائق.

4. تحليل الصور

  1. تحليل الصورة لانزلاق actin خيوط المقايسة
    ملاحظة: يمكن تحليل الصور باستخدام البرامج والكتيبات المرتبطة في قائمة المواد. من المهم ملاحظة أن البرنامج الموضح هنا يتطلب مداخن TIFF للتحليل. عملية تحليل مزلق actin خيوط المقايسة على النحو التالي50.
    1. تحميل مكدسات الفيلم الخام في بنية مجلد محدد وإدخال الدليل الأعلى في معظم مجلدات الفيلم في البرنامج.
      ملاحظة: البرنامج بتحليل الملفات عبر هذا الدليل والدلائل الفرعية، معاملة الدلائل أدنى مستوى كما replicates. وسيتم إنتاج إحصاءات متوسطة لكل مجموعة من النسخ المتماثلة. في هذه الحالة، تم استخدام فيلم واحد لكل الميسين. عند توصيف رواية myosin أو التحقيق في حالة تجريبية جديدة ، يوصى بتحليل الأفلام من ثلاثة مجالات للآراء (FOV) لكل غرفة لما مجموعه ثلاث غرف وتكرار سير العمل هذا لثلاثة تحضيرات للميسين التي يجري التحقيق فيها.
    2. استخدم البرنامج النصي "stack2tifs" بالتزامن مع معدل الإطار المدخل من قبل المستخدم لتحويل كل مكدس TIFF إلى مجلد يحتوي على سلسلة من ملفات TIFF الفردية وملف بيانات تعريف مقابلة.txt يحتوي على وقت بدء كل إطار. بالنسبة للبيانات غير بتنسيق مكدس TIFF، يجب أولا تطبيق تحويل باستخدام برامج مثل تلك المدرجة في جدول المواد.
      ملاحظة: هذا البرنامج النصي هو جزء من حزمة البرامج. يمكن العثور على معلومات البرنامج النصي هنا: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. استخدم المعلمة -px، وهي حجم البكسل (بالنم) أثناء الامتلاك. في هذه الحالة، حجم بكسل هو 130 نانومتر. استخدم المعلمات -xmax و-ymax لتوسيع المحاور لمخرجات المخطط المبعثر. هذه تتوافق مع أطول طول خيوط مرسومة والسرعة القصوى المرسومة (في نانومتر / ثانية).
      ملاحظة: هذه قيم مقدرة ويمكن تعيينها إلى قيم أعلى من المتوقع لضمان احتواء البيانات في المخطط. وبعد التحليل، يمكن أيضا تصدير البيانات الأولية لاستخدامها في برامج إحصائية أو رسوم بيانية أخرى للعرض والتحليل.
    4. استخدم المعلمة -minv، وهي معلمة الحد الأدنى لقطع السرعة، لتحديد خيوط التي لا تتحرك، وبالتالي، يمكن استبعادها من التحليل. لبطء myosin مثل NM2b، يجب أن تكون هذه المعلمة منخفضة (في هذا المثال، 5 نانومتر / ثانية) لتجنب الاستغناء عن حركات الانزلاق الحقيقية. للحصول على myosin سريع مثل M5a، يمكن أن تكون هذه المعلمة أعلى (في هذا المثال، 100 نانومتر / ثانية) لتطبيق مرشح أكثر صرامة، مع الاحتفاظ بتوزيع سرعة الانزلاق الحقيقي.
    5. Usethe -pt قطع المعلمة لتحديد حركة سلسة. لكل إطار أخذ عينات، يتم حساب قيمة تعادل سرعة الانحراف المعياري/متوسط السرعة 100 × السرعة. المسارات ذات القيم الأعلى من القطع ، لديها سرعات متغيرة أكثر ويتم استبعادها من مزيد من التحليل. في هذا المثال، تم استخدام قيمة قطع 33. المسارات ذات القيم العالية لها سرعات متغيرة أكثر ويتم استبعادها من مزيد من التحليل.
    6. استخدم -maxd لتعيين مسافة ربط مسموح بها كحد أقصى بين الإطارات. هذه مسافة محسوبة من الإطار إلى الإطار تتحرك بواسطة السنترويد للخيوط في وحدات نانومتر. ويمكن أن يكون مفيدا لاستبعاد الحركات المتفرقة أو الربط غير الصحيح بين خيوط. في الأمثلة هنا، تم ترك المعلمة على القيمة الافتراضية 2000 نانومتر.
  2. تحليل الصورة لإجراء الفحص المجهري TIRF
    ملاحظة: عملية تحليل اختبار TIRF جزيء واحد على برنامج التصوير المدرجة خصيصا في جدول المواد كما يلي29.
    1. انقر واسحب الفيديو المجهري المسجل إلى مساحة عمل البرنامج لفتحه51. ثم، تقسيم قنوات الاستحواذ. انقر على > الصور اللون > تقسيم القنوات.
      ملاحظة: في حالة الانجراف مرحلة ملحوظة أثناء الاستحواذ، يجب تثبيت الصور لتصحيح الانجراف مفيدة على متن الطائرة التصوير. في هذه الحالة، لم يتم استخدام أي تعويض عن الانجراف محور Z كما المجهر المستخدمة للحصول على هذه البيانات يستقر على التركيز Z جيدا. لتثبيت الصورة على برنامج تحليل الصور، قم بتثبيت المكون الإضافي المناسب المثبت المرتبط في قائمة المواد. يفترض مثبت الصورة مواضع ثابتة للكائنات الموجودة في الصورة ويستخدم متوسطا متجددا للإطارات السابقة كمرجع. ولذلك فإن الإجراء الموصى به هو أن تبدأ القناة التي تحتوي على صور من actin المسمى، لأن هذا هو في موقف ثابت.
    2. انقر على الإضافات، ثم العثور على مثبت الصورة؛ تأكد من تحديد الترجمة والاحتفاظ بالإعدادات الافتراضية. حدد المربع بجوار معاملات تحويل السجل. يسمح تطبيق خطوة السجل هذه بتطبيق معلمات الإزاحة المحسوبة على القناة الأخرى في الخطوة التالية. السماح لإكمال العملية.
    3. ثم افتح القناة مع myosin المسمى وتطبيق الاستقرار بالنقر على الإضافات > صورة مثبت سجل التطبيق. إذا لم يتم الحصول على صور أكتين خلال نفس الاستحواذ بسبب شرط التصوير بمعدل أعلى في قناة واحدة ، فإن الانجراف يعمل على استقرار كومة الصور عن طريق اختيار منطقة تحتوي على أجسام ثابتة مثل علامة fiducial ذات اللاتينيات الحيوية أو الفلوروفورات المرتبطة بشكل غير محدد بسطح BIOTIN-PEG. يمكن اقتصاص هذه المنطقة من المكدس الأصلي وتثبيتها، متبوعة بتطبيق قيم الإزاحة الناتجة إلى المكدس الأصلي.
      ملاحظة: في الممارسة العملية، والانجراف لوحظ في التجارب الحركة لن تذكر بالنسبة لحركة الميوسين التي تتحرك في عدة مئات نانومتر / ثانية، ولكن لأبطأ myosins هذا يصبح اعتبارا هاما.
    4. ثم، فتح TrackMate، انقر على الإضافات. ثم، في القائمة المنسدلة انقر على تتبع وأخيرا على TrackMate. عند هذه النقطة ، يخضع تحليل الصورة للتحسين استنادا إلى معلمات ظروف الفلوروفور والحسوب. ومع ذلك، معلمات البدء المثالية كما يلي.
      1. إعدادات المعايرة: احتفظ بجميع القيم الافتراضية.
      2. كاشف: كاشف لوغ.
      3. قطر النقطة المقدر: 0.5-1.0 ميكرون.
      4. العتبة: 25-200. (يمكن تحديد ذلك بالنقر فوق معاينة بعد اختيار رقم لمعرفة ما إذا كانت البقع المكتشفة تتطابق مع الفيلم وضبطها بشكل مناسب.)
      5. العتبات الأولية: لم يتم تعيينها.
      6. طريقة العرض: عرض HyperStack.
      7. تعيين عوامل التصفية على البقع: لم يتم تعيينها.
      8. تعقب: تعقب LAP بسيطة.
        ملاحظة: تعتمد هذه على معدل الإطار وسرعة الميسين ويجب أن تكون كبيرة بما يكفي لربط المواقف اللاحقة مع استبعاد الاتصالات غير المرغوب فيها بين الجسيمات المختلفة.
      9. ربط الحد الأقصى للمسافة: 1.0 ميكرون.
      10. الفجوة إغلاق الحد الأقصى المسافة: 1.0 ميكرون.
      11. الفجوة إغلاق الحد الأقصى للفجوة الإطار: 1.
      12. تعيين المرشحات على المسارات: المسار النزوح (>0.39- لتشمل البقع فقط تتحرك أكثر من 3 بكسل)، البقع في المسارات (>3-لتشمل المسارات فقط مع ما لا يقل عن 3 البقع). قد يتم إدخال مرشحات أخرى مثل الحد الأدنى من السرعة لاستبعاد البقع التي تماطل لفترات طويلة. يجب التحقق من نتائج التصفية عن طريق الفحص البصري للمسارات لضمان إزالة المسارات الزائفة (أي حركة الميوسين في الخلفية التي ليست على طول مسار actin) مع الاحتفاظ بالمسارات المرتبطة actin.
    5. بمجرد أن تظهر شاشة خيارات العرض، انقر على تحليل للمخرجات ذات الصلة. حفظ الجداول الثلاثة المنتجة (تتبع الإحصاءات، وصلات في تتبع الإحصاءات، والبقع في تتبع الإحصاءات). وسيحتوي جدول إحصاءات المسار على بيانات السرعة والتشريد التي يمكن تحليلها بعد ذلك لتوصيف بروتين جديد أو آثار حالة تجريبية معينة، على سبيل المثال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تنقية الميوسين يمكن تقييمها عن طريق أداء الحد من الصوديوم دودسيل كبريتات-بولياكريلاميد (SDS-PAGE) هلام-electrophoresis كما هو موضح في الشكل 2. في حين أن هذا الرقم يمثل الميسين النهائي ، بعد dialyzed ، يمكن إجراء SDS-PAGE على aliquots من مختلف مراحل إجراء التطهير لتحديد أي منتجات فقدت للناموست. Myosin 5a HMM لديه فرقة في نطاق 120-130 kDa وكامل طول myosin 2b غيرmuscle لديه الفرقة في نطاق 200-230 kDa، المقابلة لسلاسل ثقيلة29،44. و5a myosin أيضا فرقة بالقرب من علامة 17 kDa، بمناسبة كالمودولين. و2b myosin nonmuscle لديه الفرقة في ما يقرب من 17 كيلودا، مما يدل على ELC. لأن RLC GFP الموسومة موجودة في هذا الإعداد NM2b، RLC يظهر في حوالي 47 كيلودا; ومع ذلك، فإن RLC غير الموسومة تكون موجودة في حوالي 20 كيلودا إذا لم يتم وضع علامة مع GFP.

يمثل المقايسة المزلقة للخيوط المعروضة في الفيديو 1 والشكل 3 خصائص فيلم مثالي وقابل للتتبع. هذا المقايسة مزلق actin خيوط ملامح الحركة السلسة من خيوط actin المسمى. يضمن غسل أكتين الأسود إزالة رؤوس الميوسين الميتة من مجال القياس ، مما يساهم بشكل أكبر في الحركة السلسة الشاملة لخيوط actin. خيوط وصفت fluorescently قصيرة بما فيه الكفاية أن خيوط واحدة لا تعبر على نفسها، وهو أكثر الأمثل لبرنامج تتبع. سوف خيوط أكتين التي هي طويلة جدا عبر خيوط أخرى، والتي يمكن أن تمثل صعوبات لبرنامج تتبع خيوط actin مزلق. يمكن تجنب هذه المشكلة عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 10-20 مرات لقص خيوط أكتين قبل تحميل على coverlip.

في حالة NM2b ، يمكن أن يؤدي استخدام ميثيلسليلوز إلى تحسين جودة الأفلام المسجلة بشكل كبير لأنه يقلل من انتشار actin بعيدا عن سطح التصوير. هذا ليس ضروريا ل M5a لأن نسبة واجبها الأعلى يسمح لمرفق أقوى من actin إلى سطح المغلفة myosin. إذا تم استخدام ميثيلسليلوز، فتل الحل من خلال الغرفة ضروري لضمان تدفق الحل من خلال. كما هو مبين في الفيديو 2، عندما تكون جميع الشروط الأخرى متطابقة باستثناء استبعاد ميثيلسليلوز ، لا تبقى خيوط أكتين مرتبطة ارتباطا وثيقا بالسطح المغلف بالميوسين.

وعلى العكس من ذلك، فإن الهدف من فحص الحركة المقلوبة المبين في الفيديو 3 والشكل 4 هو إدخال خيوط أكتين الفلورية المربوطة بالسطح التي يمكن على أساسها ملاحظة حركة الميوسين. من المتطلبات الهامة للمقايسة المقلوبة ضمان مراقبة حركة الميوسين باستمرار عبر FOV ، كما هو موضح. استخدام خليط من DTT, الجلوكوز, كاتالاز, وأوكسيديز الجلوكوز يمكن تقليل photobleaching للسماح لقياسات أطول52. وعلاوة على ذلك، إذا كان معدل اقتناء للمقايسة منخفضة، وإغلاق ضوء الإضاءة قبالة بين الحصول على إطارات يمكن أن تساعد مع photobleaching المفرط. يمكن أن يتم إغلاق ضوء الإثارة عن طريق مصراع ميكانيكي ، أو مرشح غير قادر على acousto-optic (AOTF).

Figure 1
الشكل 1: إعداد غرف التدفق الوظيفية الخلية. (أ) تبدأ مع شريحة المجهر تنظيفها، قطعتين من الشريط على الوجهين قطع إلى ما يقرب من 2 سم، وأغطية وظيفية. (B) إضافة الشريط إلى وسط الشريحة المجهر. (ج)إرفاق coverlip إلى الشريط مع طلاء (أي nitrocellulose) التي تواجه أسفل واضغط بلطف على المناطق المتداخلة مع الشريط باستخدام طرف ماصة بلاستيكية لضمان أن غطاء قد التزمت الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: SDS البولي أكريلاميد هلام الكهربائي من NM2b وأعرب وM5a-HMM. (أ) صورة هلام SDS PAGE تمثيلية لسلسلة كاملة الطول من NM2b (≈230 kDa) وGFP-RLC (≈47 kDa) و ELC (≈17 kDa). صورة جل مستنسخة وتعديلها من ميلي وآخرون (2018)29. (ب) صورة هلام SDS PAGE ممثل لسلسلة ثقيلة M5a-HMM مثل (≈120 kDa) وكالمودولين (≈17 kDa). لاحظ أن الجل في هذه الصورة لا يحتوي على GFP إدراجها إلى نهاية C-المحطة الطرفية. وGFP إدراجها في سلسلة الميسين الثقيلة يزيد من الوزن الجزيئي من قبل ≈27 كيلودا. تم نشر صورة هلام مستنسخة وتعديلها في الأصل في مجلة الكيمياء البيولوجية44. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:مزلق actin خيوط نتائج المقايسة المكتسبة عن طريق الإضاءة TIRF. (A) إطار المثال من فيلم يظهر نقل رودامين-phalloidin المسمى خيوط أكتين (باللون الأحمر) على 0.2 μM NM2b في وجود 0.7٪ ميثيلسليلوز في 30 °C. شريط المقياس = 10 ميكرومتر (ب) إخراج صورة تتبع خيوط من برنامج FASTrack لNM2b لنفس FOV كما هو موضح في (A) شريط المقياس = 10 ميكرومتر.(ج)الرسم البياني التمثيلي لسرعة الانزلاق أكتو-NM2b، مما يدل على أن هذه العينة من NM2b يمكن أن تولد سرعة مزلق actin من 77 ± 15 نانومتر / ثانية (متوسط الانحراف المعياري ±؛ عدد المسارات = 550). (D) مثال الإطار من فيلم يظهر نقل رودامين-phalloidin المسمى خيوط أكتين (باللون الأحمر) على 75 NM M5a-HMM. شريط مقياس = 10 ميكرومتر (E) خيوط تتبع إخراج الصورة من قبل برنامج FASTrack لM5a-HMM لنفس FOV كما هو موضح في (D) مقياس شريط = 10 ميكرومتر.(F)رسم بياني تمثيلي لسرعة الانزلاق acto-M5a-HMM، يظهر أن هذه العينة من M5a يمكن أن تولد سرعة مزلقة أكتين من 515 ± 165 نانومتر / ثانية (متوسط الانحراف المعياري ±؛ عدد المسارات = 25098). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نتائج المقايسة المقلوبة المكتسبة عبر إضاءة TIRF. (A)A ) A FOV ممثل من كومة صور مدمجة بقناتين تظهر حركة خيوط NM2b (المعروضة باللون الأخضر) على خيوط أكتين ذات لاتينات حيوية تحمل علامة AF647-phalloidin (معروضة باللون الأزرق) عند 30 درجة مئوية. تتم ملاحظة خيوط بلمرة من NM2b المعرب عنها وتنقية بشكل مجسم مع ELC و GFP-RLC على أنها الجسيمات الخضراء الممدودة في FOV. مقياس شريط = 10 ميكرومتر(ب) الرسم البياني التمثيلي لسرعة خيوط NM2b. تم إجراء التحليل باستخدام برنامج تحليل الصور الموضح في جدول المواد. خيوط NM2b واحد لديها سرعة 84 ± 22 نانومتر / ثانية (متوسط الانحراف المعياري ±؛ عدد الجسيمات تتبع = 133)، عند التحرك على طول خيوط أكتين واحد. (ج)مثال kymograph من حركة خيوط NM2b على طول خيوط أكتين واحد. لاحظ أن بعض مناطق الجسيمات تظهر "دوران" خيوط NM2b ، على طول خيوط actin ، والتي تمثل على الأرجح الوقت الذي ينفصل فيه جانب واحد من خيوط NM2b ثنائي القطب عن خيوطactin ، كما هو موضح سابقا في Melli وآخرون. (D) ممثل FOV لحركة جزيء واحد M5a-HMM (معروض باللون الأخضر) على خيوط أكتين البيوتينية المسماة بالرودامين-فالويدين (المعروض باللون الأحمر). شريط المقياس = 10 ميكرومتر (E) الرسم البياني التمثيلي لطول المدى M5a-HMM، يصلح ل أسي واحد. تم إجراء التحليل باستخدام برنامج تحليل الصور الموضح في قائمة المواد. طول المدى المميز هو 1.3 ميكرومتر مع فاصل ثقة 95٪ من 1.23-1.42 ميكرومتر في هذا المثال. (F)الرسم البياني التمثيلي للجزيء واحد M5a-HMM السرعة على خيوط أكتين واحد. يظهر إخراج البيانات المحلل من تحليل الصور متوسط سرعة 668 ± 258 نانومتر/ثانية (متوسط الانحراف المعياري ±؛ عدد الجسيمات المتعقبة = 684). (G)مثال kymograph من جزيئات واحدة من حركة M5a-HMM على طول خيوط أكتين واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: مقارنة NM2b وM5a-HMM مزلق actin خيوط المقايسة. تم إجراء فحص خيوط ACTIN المزلق NM2b في وجود ميثيلسليلوز (يسار؛ لوحة فيديو A) وM5a-HMM في غياب ميثيلسليلوز (يمين؛ لوحة الفيديو B) عند 30 درجة مئوية. لاحظ أن الطابع الزمني يتقدم بشكل أسرع في لوحة الفيديو NM2b ، مقارنة بلوحة فيديو M5a-HMM لإظهار حركة خيوط actin المسماة رودامين (حمراء) التي هي نفسها تقريبا. هذا هو منذ actin نقل السرعة الفعلية من NM2b هو أقرب إلى 7 مرات أبطأ من ذلك لM5a-HMM (77 نانومتر / ثانية، مقابل 515 نانومتر / ثانية، على التوالي، المستخرجة من ذروة الغاوسية تناسب الرسم البياني في الشكل 3). شريط المقياس = 10 ميكرومتر في كل من لوحات الفيديو. بيانات NM2b المكتسبة بمعدل 0.33 إطار في الثانية مع تعرض 200 مللي ثانية. تم الحصول على بيانات M5a-HMM بمعدل 5 إطارات في الثانية مع تعرض 200 مللي ثانية (مستمر) ثم تم أخذ عينات منها إلى إطار واحد في الثانية. تمت إضافة الطوابع الزمنية باستخدام البرنامج المساعد الموصوف في قائمة المواد. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 2: مزلق actin خيوط المقايسة من NM2b في غياب ميثيلسليلوز. عندما تكون جميع الشروط الأخرى هي نفسها باستثناء غياب ميثيلسليلوز، خيوط أكتين في بعض الأحيان لا عصا بشكل جيد إلى غطاء المغلفة مع 0.2 μM NM2b، مما يؤدي إلى أفلام ذات جودة أقل مع خيوط أكتين "التخبط" على مقربة من سطح غطاء المغلفة NM2b. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. ويمكن حل هذا عن طريق إدخال ميثيلسليلوز لإظهار الحركة السلسة للخيوط أكتين، كما هو مبين في لوحة الفيديو الأيسر من الفيديو 1 (NM2b مزلق actin فحص خيوط). وثمة بديل آخر هو زيادة تركيز NM2b إلى ≈1 ميكرومتر. تم الحصول على هذا الفيلم في 0.33 لقطة في الثانية مع التعرض 200 مللي ثانية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 3: مقارنة NM2b وM5a-HMM المقايسة الحركة المقلوبة. تم إجراء فحص الحركة المقلوب NM2b في وجود ميثيلسليلوز وتم تسجيله بمعدل 0.33 إطارا في الثانية باستخدام مصراع الكاميرا (يسار ؛ لوحة الفيديو A) ، تظهر لوحة الفيديو C نفس FOV ك A ، ولكن مع تحديد الجسيمات وتتبعها باستخدام برنامج تحليل الصور. وبالمثل، تم تسجيل المقايسة الحركية المقلوبة ل M5a-HMM في غياب ميثيلسليلوز بمعدل 5 إطارات في الثانية (يمين؛ لوحة الفيديو B). تظهر لوحة الفيديو D نفس FOV مثل B ، ولكن مع تحديد الجسيمات وتتبعها باستخدام برنامج تحليل الصور. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر في جميع لوحات الفيديو. تم تبديل الليزر اثنين ذهابا وإيابا مع استخدام كاميرا واحدة للحصول على. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

اسم المخزن المؤقت تكوين الخطوة (الخطوات) المستخدمة التعليقات
المخزن المؤقت لاستخراج M5a 0.3 م كلوريد NaCl 1.1 ابق على الجليد.
15 م م MOPS، pH 7.2
15 مللي متر ملغم2
1.5 مليون م EGTA
4.5 مليون طن من النان3
NM2b استخراج المخزن المؤقت 0.5 م كلوريد NaCl 1.1 ابق على الجليد.
15 م م MOPS، pH 7.2
15 مللي متر ملغم2
1.5 مليون م EGTA
4.5 مليون طن من النان3
المخزن المؤقت A 0.5 م كلوريد NaCl 2.2 ابق على الجليد.
10 م م MOPS، pH 7.2
0.1 مليون م EGTA
3 مليون نن3
1 مليون م ATP
1 mM DTT
5 مللي متر ملغم2
المخزن المؤقت B 0.5 م كلوريد NaCl 2.3 ابق على الجليد.
10 م م MOPS، pH 7.2
0.1 مليون م EGTA
3 مليون نن3
1 mM DTT
مخزن Elution المؤقت 0.5 م كلوريد NaCl 3.1 ابق على الجليد.
0.5 ملغم/مل فلاج ببتيد
10 م م MOPS، pH 7.2
0.1 مليون م EGTA
3 مليون نن3
رقم الحموضة 7.2
M5a غسيل الكلى العازلة 500 مليون كيلو متر كلكل 4.1 استخدام الباردة dH2O لجلب إلى حجم.
10 مللي متر ملغم2
10 م م MOPS، pH 7.2
0.1 مليون م EGTA
1 mM DTT
NM2b غسيل الكلى العازلة 25 مليون م كلوريد NaCl 4.1 استخدام الباردة dH2O لجلب إلى حجم.
10 مللي متر ملغم2
10 م م MOPS، pH 7.2
0.1 مليون م EGTA
1 mM DTT
المخزن المؤقت للتخزين NM2b 0.5 م كلوريد NaCl 5.1 ابق على الجليد.
10 م م MOPS، pH 7.2
0.1 مليون م EGTA
3 مليون نن3

الجدول 1: المخازن المؤقتة المستخدمة في تنقية البروتين.

اسم المخزن المؤقت التركيب (M5a) التركيب (NM2b) الخطوة (الخطوات) المستخدمة (M5a/NM2b) التعليقات
4X حركية المخزن المؤقت (4X ميغابايت) 80m MOPS، pH 7.2 80m MOPS، pH 7.2 فلتر فراغ وتخزين في 4°C
20 مللي متر ملغم2 20 مللي متر ملغم2
0.4 مليون م EGTA 0.4 مليون م EGTA
رقم الحموضة 7.4 رقم الحموضة 7.4
50 mM الملح حركية العازلة (50 م م م) 25٪ v/v 4X ميغابايت 25٪ v/v 4X ميغابايت فلتر فراغ وتخزين في 4°C
50 مليون كيلو متر كل عام 50 مليون م NaCl
رفع إلى حجم مع DH2O رفع إلى حجم مع DH2O
500 متر ملح الحركة العازلة (500 م م م) N/A 25٪ v/v 4X ميغابايت فلتر فراغ وتخزين في 4°C
500 مليون متر كلوريد NaCl
رفع إلى حجم مع DH2O
يوسين 0.05-0.1 ميكرومتر ميوزين 0.2 ميكرومتر ميوزين 4.2/5.2 ابق على الجليد.
1 mM DTT 1 mM DTT
تمييع في 50 م م م تمييع في 500 ميجابايت
1 ملغم/مل ألبوم مصل البقر (BSA) 1 ملغم/مل بي أيه 1 ملغم/مل بي أيه 4.3/5.3 ابق على الجليد.
تمييع في 50 م م م تمييع في 500 ميجابايت
1 mM DTT 1 mM DTT
5 ميكرومتر غير مبتل F-actin في 50 ميجابايت (أكتين أسود) 5 ميكرومتر غير مبرمز F-actin 5 ميكرومتر غير مبرمز F-actin 4.5/5.5 ابق على الجليد. القص actin عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 5-10 مرات، أو باستخدام حقنة.
1 ميكرومتر كالمودولين (CaM) 1 مليون م ATP
1 مليون م ATP 0.2 مليون متر كاتكل2
تمييع في 50 م م م 1 ميكرومتر كام
1-10 nM سلسلة ضوء الميسين كيناز (MLCK)
تمييع في 50 م م م
ميغابايت مع 1 MM DTT و 1 MM ATP 1 mM DTT 1 mM DTT 4.6/5.6 ابق على الجليد.
1 مليون م ATP 1 مليون م ATP
تمييع في 50 م م م تمييع في 50 م م م
ميغابايت مع DTT 1 mM DTT 1 mM DTT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 ابق على الجليد.
تمييع في 50 م م م تمييع في 50 م م م
20 nM رودامين-فالويدين F-أكتين (Rh-أكتين) 20 nM رودامين-فالويدين F-أكتين 20 nM رودامين-فالويدين F-أكتين 4.8/5.8 ابق على الجليد. لا دوامة.
1 mM DTT 1 mM DTT
تمييع في 50 م م م تمييع في 50 م م م
المخزن المؤقت النهائي 50 مليون كيلو متر كل عام 0.7٪ ميثيلسليلوز (اختياري) 4.10/5.10 أضف الجلوكوز والجلوكوز والأوكسيديز والكاتالاس مباشرة قبل إجراء التجربة. ابق على الجليد.
20m MOPS، pH 7.2 50 مليون م NaCl
5 مللي متر ملغم2 20m MOPS، pH 7.2
0.1 مليون م EGTA 5 مللي متر ملغم2
1 مليون م ATP 0.1 مليون م EGTA
50 mM DTT 1 مليون م ATP
1 ميكرومتر كالمودولين 50 mM DTT
2.5 ملغم/مل جلوكوز 1-10 مليون مليون ملك
100 ميكروغرام/مل من الجلوكوز أوكسيداز 0.2 مليون متر كاتكل2
40 ميكروغرام/مل كاتالاز 1 ميكرومتر كالمودولين
2.5 ملغم/مل جلوكوز
100 ميكروغرام/مل من الجلوكوز أوكسيداز
40 ميكروغرام/مل كاتالاز

الجدول 2: المخازن المؤقتة المستخدمة في المقايسة المزلقة.

اسم المخزن المؤقت التركيب (M5a) التركيب (NM2b) الخطوة (الخطوات) المستخدمة (M5a/NM2b) التعليقات
4X حركية المخزن المؤقت (4X ميغابايت) 80m MOPS، pH 7.2 80m MOPS، pH 7.2 فلتر فراغ وتخزين في 4°C
20 مللي متر ملغم2 20 مللي متر ملغم2
0.4 مليون م EGTA 0.4 مليون م EGTA
رقم الحموضة 7.4 رقم الحموضة 7.4
50 mM الملح حركية العازلة (50 م م م) 25٪ v/v 4X ميغابايت 25٪ v/v 4X ميغابايت فلتر فراغ وتخزين في 4°C
50 مليون كيلو متر كل عام 50 مليون م NaCl
رفع إلى حجم مع DH2O رفع إلى حجم مع DH2O
150 mM الملح حركية العازلة (150 م م م) 25٪ v/v 4X ميغابايت فلتر فراغ وتخزين في 4°C
150 مليون متر NaCl
رفع إلى حجم مع DH2O
يوسين 30 nM الميسين انظر وصفة "المخزن المؤقت النهائي" /4.12 ابق على الجليد.
1 mM DTT
تمييع في 150 م م م
2 ملغم/مل نيوترافين 2 ملغم/مل نيوترافين 2 ملغم/مل نيوترافين 3.5/4.8 ابق على الجليد.
1 mM DTT 1 mM DTT
تمييع في 50 م م م تمييع في 150 م م م
1 ملغم/مل من ألبوم مصل البقر (BSA) 1 ملغم/مل بي أيه 1 ملغم/مل بي أيه 3.3/4.6 ابق على الجليد.
1 mM DTT 1 mM DTT
تمييع في 50 م م م تمييع في 150 م م م
200 nM رودامين-فالويدين البيوتينية F-أكتين (bRh-أكتين) 200 nM رودامين-فالويدين البيوتينلات F-أكتين 200 nM رودامين-فالويدين البيوتينلات F-أكتين 3.7/4.10 تجنب القص عن طريق عدم الدوامة أو الأنابيب صعودا وهبوطا. لخلط، عكس بلطف.
1 mM DTT 1 mM DTT
تمييع في 50 م م م تمييع في 150 م م م
ميغابايت مع DTT 50 mM DTT 50 mM DTT 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 ابق على الجليد.
تمييع في 50 م م م تمييع في 150 م م م
المخزن المؤقت النهائي 50 مليون كيلو متر كل عام 0.7٪ ميثيلسليلوز (اختياري) 3.9/4.14 أضف الجلوكوز والجلوكوز والأوكسيديز والكاتالاس مباشرة قبل إجراء التجربة. ابق على الجليد.
20m MOPS، pH 7.2 50 مليون م NaCl
5 مللي متر ملغم2 20m MOPS، pH 7.2
0.1 مليون م EGTA 5 مللي متر ملغم2
1 مليون م ATP 0.1 مليون م EGTA
50 mM DTT 1 مليون م ATP
1 ميكرومتر كالمودولين 50 mM DTT
2.5 ملغم/مل جلوكوز 1-10 مليون مليون ملك
100 ميكروغرام/مل من الجلوكوز أوكسيداز 0.2 مليون متر كاتكل2
40 ميكروغرام/مل كاتالاز 1 ميكرومتر كالمودولين
10 nM الميسين 2.5 ملغم/مل جلوكوز
100 ميكروغرام/مل من الجلوكوز أوكسيداز
40 ميكروغرام/مل كاتالاز

الجدول 3: المخازن المؤقتة المستخدمة في اختبار TIRF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا هو سير العمل لتنقية وتوصيف في المختبر من 5a ميوزين و2b غير عضلة ميوسين. هذه المجموعة من التجارب مفيدة لتحديد الخصائص الميكانيكية الكيميائية لبنى الميوسين المنقى بطريقة سريعة وقابلة للاستنساخ. على الرغم من أن اثنين من الميوسين هو مبين هنا ليست سوى مثالين محددين من بين العديد من الاحتمالات، يمكن تطبيق الشروط والتقنيات، مع بعض الخياطة، لمعظم الميوسين والعديد من البروتينات الحركية الأخرى.

تخضع البروتوكولات التي تمت مناقشتها هنا لاختلافات اعتمادا على الاحتياجات الفردية للمختبر والتجارب. على سبيل المثال، كما نوقش في قسم التعبير والبيولوجيا الجزيئية، تم توليد البروتينات المستخدمة في هذه الورقة من عدوى مشتركة لفيروسين أو أكثر. ومع ذلك، يمكن أيضا التعبير البروتين الناجح يمكن أن يتحقق مع ناقلات متعددة التعبيرات مثل p-FastBac ناقلات التعبير المزدوج أو نظام التعبير BiGBac53.

يمكن لعدة عوامل أن تعيق الإنتاج الناجح للبروتين المؤتلف. لمنع تدهور البروتين، من الضروري أن يتم الانتهاء من كل خطوة من تنقية البروتين في درجة الحرارة المناسبة، مع جميع خطوات الطرد المركزي التي تحدث في 4 درجة مئوية وجميع الخطوات الأخرى التي يتم تنفيذها على الجليد. قد تكون العصابات الزائدة واضحة في هلام منتج البروتين dialyzed. وقد يكون ذلك مؤشرا على التدهور أو التلوث. تنقية لاحقة عن طريق حجم الاستبعاد أو الكروماتوغرافيا التبادل الأيونية يمكن أن تعزز نقاءالعينات 54. لهذا الغرض، فمن المستحسن لحفظ aliquots في كل خطوة من عملية تنقية البروتين لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، ينبغي أن يكون هناك انخفاض غلة من الميوسين أو يشتبه في تلوث البروتين. في بعض الأحيان ، يمكن أن يكون هناك ربط غير كاف للlysate للراتنج في الخطوة 1.8 ، مما قد يؤدي إلى فقدان الميوسين إلى الفائق في أجهزة الطرد المركزي اللاحقة. ويمكن حل هذا عن طريق تغيير مدة ربط الراتنج خلال هذه الخطوة، حتى تركها لربط بين عشية وضحاها، إذا لزم الأمر. أوقات الحضانة الأطول إدخال خطر أكبر من تدهور البروتين إذا لم يتم تثبيط البروتياز الملوث بما فيه الكفاية، وسوف تتأثر الميوزين مع المناطق الحساسة بروتيوليكلي سلبا. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الغسل غير السليم للراتنج قبل وبعد الاستخدام إلى تأليه منتج بروتين غير مرغوب فيه، لذلك من الضروري اتباع البروتوكولات المناسبة قبل وبعد استخدام راتنج تقارب FLAG. إذا تم غسل الراتنج مباشرة بعد الاستخدام وتخزينه بشكل مناسب، يمكن إعادة استخدامه حتى 20 مرة.

ومن المهم ملاحظة أن تدهور البروتين يحدث أيضا خلال مرحلة التعبير وتقصير أوقات التعبير قد يكون مفيدا من حيث التدهور، على الرغم من أن هذا يمكن أن يكون على حساب العائد الإجمالي. اتباع الإجراءات المبينة هنا لرصد عينة البروتين في مراحل مختلفة من البروتوكول (أي قبل وأثناء وبعد تنقية) سوف تساعد على تحديد المراحل اللازمة للتحسين. بالنسبة للميوسين التي تقاوم التعبير والتنقية الناجحين بشكل متكرر ، يمكن أن تكون المشاكل الشائعة هي التعبير المشترك مع سلاسل خفيفة غير كافية أو غير مناسبة بالإضافة إلى للطي غير السليم أثناء التعبير المفرط. يجب اختيار سلاسل الضوء المناسبة على أساس التفاعلات المعروفة عندما يكون ذلك ممكنا ويجب اختبار نسب السلسلة الثقيلة إلى سلسلة الضوء baculovirus في تجارب صغيرة النطاق لتحديد الأمثل. بالنسبة للميوسينات التي تجمع أو تنتج القليل من المنتج النشط القابل للذوبان أو لا تنتجه على حده ، يمكن أن يساعد التعبير المشترك مع المرافقين في الحصول على البروتين النشط بنجاح54،55.

منتجات الميوسين المنقى تحتوي حتما على عدد قليل من الميسين التالفة، ويشار إليها باسم "رؤساء القتلى"، والتي يمكن معالجتها بطريقتين. طريقة واحدة، المبينة في هذا البروتوكول، ينطوي على تدفق غير تسمية، أو "أسود"، actin من خلال الغرفة في المقايسة خيوط actin مزلق. غسل في وقت لاحق مع ATP يسبب الميوسين وظيفية للانشقاق عن actin السوداء في حين أن رؤساء القتلى سوف تبقى ملزمة لهذا actin غير مصنفة بسبب عدم قدرتها على تحلل ATP ونظرا لتقاربها عالية. أثناء إجراء غسل أكتين الأسود ، يمكن استخدام حقنة لقص actin بشكل فعال. يمكن إنجاز القص الإضافي عن طريق الدوامة ، شريطة إزالة أي فقاعات ناتجة عن الطرد المركزي. وهناك طريقة بديلة هي أن بيليه بشكل انتقائي رؤساء القتلى من عينة الميوسين عن طريق خلط الميوسين مع F-أكتين وMG-ATP في تركيزات الملح العالي (0.5 M) والترسيب في جهاز طرد فائق أعلى الجدول. و myosins قادرة على التحلل المائي ATP في ظل هذه الظروف لا تبقى ملزمة actin بسبب تقاربها المنخفضة لاكتين في ظل هذه الظروف الملح العالية وتوجد في supernatant, في حين أن رؤساء ميتة myosin لا تزال ملزمة actin في بيليه56. وبالمثل، يمكن أيضا أن تستخدم الترسيب مع أكتين وإعادة الإنفاق من بيليه لإزالة الميوسين التي هي غير قادرة على ملزمة لactin في غياب ATP. لاحظ أن نسبة صغيرة من هذا النوع من الرؤوس الميتة سيكون لها تأثير أقل على هذه الأنواع من المقايسات. من خلال القيام الترسيب الخالية من النيوكليوتيدات وإعادة الإنفاق تليها الطرد المركزي ATP ملزمة وإعادة الإنفاق، يمكن عزل الميوسين التي هي المختصة لكل من الافراج عن أكتين ملزمة وATP تعتمد على من actin.

يمكن أيضا تعديل المقايسات الحركة في عدة طرق. على سبيل المثال، في المقايسة خيوط أكتين مزلق لNM2b، هو الفوسفورية NM2b في الغرفة عن طريق إضافة MLCK، كالمودولين، الكالسيوم، وATP في خطوة أكتين السوداء، وكذلك في المخزن المؤقت النهائي. ومع ذلك ، يمكن أيضا أن يكون NM2b الفوسفورية في أنبوب ، قبل إجراء الفحص. وبذلك، يمكن قياس نسبة NM2b الفوسفورية عن طريق تشغيل هلام أصلي مع مخزن مؤقت لعينة تحتوي على اليوريا أو إجراء قياس الطيف الكتلي57،58. ويمكن أيضا أن يكون تأثير درجة الحرارة على نشاط الميسين التحقيق. ويمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام نظام التدفئة الموضوعية على المجهر أو الضميمة البيئية، بحيث يتم الحفاظ على خلية التدفق في درجة حرارة ثابتة. القوة الأيونية هي اعتبار مهم آخر. بالنسبة للعديد من الميوسين، سيتم زيادة تقارب أكتين والنشاط الأنزيمي في قوة أيونية أقل. بالنسبة للآخرين ، قوة أيونية أعلىضرورية 59. بالإضافة إلى توفير معلومات قيمة حول آلية الميوسين، يمكن لخفض القوة الأيونية تعزيز الحركة وجعل الميوسين أكثر سهولة للتحقيق مع العديد من المقايسات. في المقابل، سوف تظهر بعض المحركات تأثيرات الربط الكهروستاتيكي، والتي سوف تبطئ الحركة في نقاط القوة الأيونية المنخفضة. وأخيرا، عند تقييم حركة خيوط NM2b، من المهم الحفاظ على القوة الأيونية ضمن نطاق ضيق (قوة أيونية 150-200 م)، تقريب تلك الموجودة في معظم أنواع الخلايا. استخدام نقاط القوة الأيونية أقل النتائج في تجميع خيوط الميسين، في حين أن خيوط depolymerize في نقاط القوة الأيونية أعلى.

مع العديد من الميوسين ، ولا سيما تلك التي لها نسب واجب منخفض ، فإن ظروف العازلة النهائية المعطاة ل M5a ستؤدي إلى ربط خيوط أكتين المسماة بالفلورسنت فقط بشكل فضفاض بالسطح أو الانفصال تماما. وهذا يؤدي إلى حركات غير منتظمة تعقد القياس الكمي. يمكن في كثير من الأحيان الحصول على حركة ذات جودة أفضل باستخدام الميثيلسليلوز (0.7٪) في المخزن المؤقت النهائي. ميثيلسليلوز هو عامل الازدحام لزجة ويجبر خيوط أكتين على البقاء على مقربة من السطح حتى عندما كثافة المحركات الميوسين المرفقةمتناثرة 60. وبالمثل ، لوحظ أن إدراج ميثيلسليلوز في العازلة النهائية من المقايسة حركية خيوط واحدة ضروري لمراقبة الحركة مع NM2a ، وتم الإبلاغ عن نفس الظاهرة لخيوط العضلات الميوسين الملساء29،61. وهذا يزيد أيضا من عملية خيوط NM2b. أحد الآثار الجانبية غير المرغوب فيها لاستخدام ميثيلسليلوز في هذا المقايسة هو أن خصائص وكيل الازدحام يمكن أن تعزز الارتباط الجانبي لخيوط الميسين في حزم. بدائل للميثيلسليلوز عند استكشاف عدم وجود حركة أو خيوط أكتين ملزمة بشكل فضفاض في مقايسة خيوط أكتين المزلق هي خفض تركيز الملح في مخازن الحركة أو لزيادة كثافة سطح الميوسين. كما ذكر أعلاه، وقد ثبت قوة أيونية عالية في المخازن المؤقتة الحركة لخفض قدرة بعض الميوسين لربط أكتين29،34،62.

اختلاف آخر من المقايسة خيوط أكتين مزلق هو استخدام الأجسام المضادة لترسيخ الميوسين على غطاء الزجاج. على سبيل المثال، إذا كان GFP موجود في نهاية C-المحطة الطرفية لبناء الميوسين، يمكن استخدام الأجسام المضادة ل GFP لإصلاح GFP-myosin إلى غطاء36،63،64. وهذا يمكن أن يساعد في الحصول على الحركة الناجحة في الحالات التي قد تعوق هندسة النظام خلاف ذلك نقل أكتين، كما هو الحال في حالة اختبار أذرع ذراع اصطناعية أو قصيرة54،64. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التحقيق في تأثير الحمل على سرعات نقل في المقايسة خيوط أكتين مزلق عن طريق استخدام البروتينات actin ملزمة مثل α-أكتينين أو utrophin39،50،65. مثل هذا القياس يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة تأثير الحمل على مجموعة من الميوسين مقابل الحركية التي تعتمد على الحمل من الميوسين واحد التي يمكن قياسها باستخدام المقايسة المحاصرة البصرية66،67. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إضافة كميات متزايدة من البروتين actin ملزمة جنبا إلى جنب مع الميوسين في الخطوة الأولى. يرتبط البروتين الملزم لل أكتين بالسطح ويمارس حمولة احتكاك على خيوط أكتين التي يتم نقلها بواسطة الميوسين ، مما يؤدي إلى سرعة متدرج حيث يتم زيادة تركيز البروتين الملزم لل أكتين على السطح39.

يمكن أيضا تكييف فحص الحركة جزيء / فرقة واحدة للتحقيق في تأثير هياكل أكتين المختلفة على حركة الميوسين. على سبيل المثال، بدلا من مراقبة حركة الميوسين على رأس خيوط أكتين واحد، fascin- أو α-actinin بوساطة حزم أكتين يمكن دراستها كإعادة تشكيل في المختبر من شبكة خيوط أكتين وجدت في الخلايا68،69. تأثير البروتينات actin ملزمة مثل تروبوميوسين ويمكن أيضا أن تدرس65,70,71,72.

من الجدير بالذكر هو براعة في اختيار تسمية لجزيئ واحد / فرقة المقايسة الحركة. في هذا التقرير، تم استخدام تسمية GFP على كل من M5a-HMM و NM2b; ومع ذلك، يمكن استخدام تسميات أخرى كثيرة. ومن الأمثلة على ذلك هالوتاغ أو SNAP-tag، والتي يمكن دمجها وراثيا في الميوسين وربط صبغة اصطناعية بشكل متناقض. تكمن فائدة تقنية HaloTag في تعدد استخداماتها للعديد من التعديلات التجريبية ، مثل وضع العلامات بألوان مختلفة أو إضافة علامة تقارب البيوتين29،73. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تقنية نقطة الكم لتحسين دقة تتبع مضان جزيء واحد ، والذي يعالج أيضا الحد من سطوع GFP المنخفض والميل إلى photobleaching74. يمكن أن تعلق بنجاح العلامات إلى سلاسل خفيفة وكذلك سلسلة ثقيلة11،75،76.

لتحقيق النجاح في اختبار الحركة TIRF جزيء واحد، عامل رئيسي هو استخدام سطح مسدودة بشكل جيد ووظيفية. وهناك طريقة بسيطة لتحقيق حجب معتدل هو استخدام البيوتينيلات-BSA ملزمة إلى سطح النيتروسليلوز. على الرغم من أن هذا سيعمل بشكل جيد بما فيه الكفاية لتوصيف العديد من المحركات ، بما في ذلك M5a ، فإن مستوى الربط غير المحدد على مثل هذا السطح مانع لإعادة إنتاج حركة نظيفة مع عينات مثل NM2b. وكان اختراقا رئيسيا في هذا الصدد الانتقال إلى السطوح PEGylated مخدر مع البيوتين-PEG لوظيفية77. توفر أسطح PEG مستوى أعلى بكثير من الحجب السطحي ويمكن أن يظل السطح الخالي من العيوب خاليا من الربط غير المحدد لفترات طويلة جدا من الزمن. يسمح البروتوكول المحدد المفصل هنا بإنتاج أسطح PEG ذات اللاتينات الحيوية في غضون ساعات ، وإذا تم تخزينها على الفور كما هو موضح ، يمكن استخدام الأسطح لعدة أسابيع مع انخفاض هامشي فقط في الجودة.

ومن الاعتبارات الرئيسية قبل جمع البيانات للتتبع معدل إطار الامتلاك. يجب أن يكون التنقل بين الإطارات اللاحقة كبيرا بما يكفي لتجنب أخطاء الاختزال الزائد. وستسفر معدلات أخذ العينات المرتفعة عن سرعات مبالغ فيها بسبب تقسيم أخطاء التعريب بفاصل زمني صغير وتزيد من الخطأ الظاهر في القياس. في الحالات التي يتم فيها أخذ عينات من البيانات الأولية بدقة، يمكن أخذ عينات البيانات لأسفل عن طريق أخذ كل إطار Nth لإنشاء مكدس جديد والنظر في التغيير في معدل الإطار الذي ينتج. يجب تجنب حركات subpixel بين الإطارات وحركات عدة مئات من النانومتر مطلوبة للحصول على قيم دقيقة. وفي جميع الحالات التي يتم فيها توصيف عينة جديدة، يجب مقارنة النتائج الناتجة عن التحليل الآلي بمجموعة بيانات صغيرة من خيوط متعقبة يدويا من أجل الاتساق.

عند تحليل البيانات من تجارب حركية جزيء واحد، يجب توخي الحذر عند اختيار المعلمات التي يجب قياسها، وكيفية تصفية البيانات، وكيفية احتواء البيانات. وكما ذكر أعلاه، يمكن أن يكون معدل أخذ العينات عاملا هاما عند تحليل بيانات السرعة. بالنسبة للعديد من الميوسين ، ستكون الأشواط العملية قصيرة ومتقربة بشكل جيد من خط مستقيم. في مثل هذه الحالات، قد توفر المسافة من نقطة النهاية إلى نقطة النهاية للمسار مقياسا جيدا لطول المدى ويمكن تقسيم هذا حسب مدة المسار لتحقيق تقدير جيد للسرعة. في الحالات التي تكون فيها المسارات طويلة جدا وتتبع مسارات منحنية حول خيوط عازمة ، فإن هذا النوع من التحليل سوف تسفر عن نتائج غير دقيقة ويجب استخدام المسافة الإجمالية المقطوعة ، وذلك باستخدام معدل الاستحواذ الذي يسمح لنقاط التعريب المتعاقبة لتكون متباعدة بشكل جيد بما فيه الكفاية لتجنب أخطاء الإفراط في الاختماط كما هو موضح أعلاه ، في حين يجري قريبة بما فيه الكفاية معا أن مسافة الخط المستقيم بينهما لا يزال تقريب جيد للمنحنى بين تلك النقاط. وبالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للبروتينات الحركية ذات الأطوال الطويلة فيما يتعلق بطول المسار، يجب إجراء إحصاءات إضافية مثل مقدر كابلان ماير عند حساب أطوال التشغيل78. وينطبق الشيء نفسه على الحالات التي يكون فيها من المرجح بما فيه الكفاية أن يحدث photobleaching قبل نهاية تشغيل العملية. ظاهرة أخرى يمكن ملاحظتها في دراسات مضان جزيء واحد هي الربط الضوئي ، حيث تنتقل الفلوروفوريس بين الحالة قيد التشغيل وخارجها بسرعة ويبدو أنها تومض. لا يحدث هذا عادة في هذه التجارب الحركة; ومع ذلك ، إذا حدث هذا ، يمكن تقليل كثافة الليزر وأوقات التعرض التي ينبغي أن تقلل من التأثير. ويمكن استخدام العديد من المواد الكيميائية، بما في ذلك β ميركابتوثانول، ترولوكس، سيكلوكتاتيرين، ن بروبيل غالات، 4-نيتروبنزيل الكحول، و1،4-diazabicyclo[2.2.2]أوكتان للتخفيف من هذا فضلا عن79.

باختصار، تعرض هذه المقالة بروتوكولات مفصلة قوية في قدرتها على تحديد الخصائص الميكانيكية الكيميائية مثل سرعة نقل الأكتين، وسرعة نقل الميوزين، وطول تشغيل الميوسين. هذه المقايسات قابلة للاستنساخ ويمكن استخدامها لتحديد نوعية الميوسين المنقى حتى في الحالات التي لا تكون فيها الخصائص الحركية هي الهدف النهائي المحدد للدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إدخال تغييرات مثل درجة الحموضة ودرجة الحرارة والمنظمين الكيميائيين على هذه المقايسات لدراسة كيفية تأثر الميكانوتشيميستري للميوزين المدروس. معا، يمكن أن تسمح المقايسات مزلق actin والحركية مقلوب لفهم أفضل للسلوك فرقة الميوسين والاختلافات بين الجزيئية في الميكانيكا الحركية الجزيئية والحركية. تدعم المقايسات المستندة إلى المجهر الفلوري الموصوفة هنا نهج الاختزال في أبحاث الهيكل الخلوي ويمكن أن تكون أداة قوية لفهم ديناميكيات البروتين والبروتين في المختبر. معا، يمكن استخدام البيانات التي تم جمعها من هذه التجارب التي تسيطر عليها للغاية لتقديم المشورة لعلماء الأحياء الميكانيكية من السلوكيات الأكتوميوسين الرئيسية التي قد تكون ذات صلة على المستوى البيولوجي الخلية، وخارجها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونشكر الدكتور فانغ زانغ على المساعدة التقنية في إعداد الكواشف المستخدمة لجمع هذه البيانات. تم دعم هذا العمل من قبل NHLBI / NIH صندوق برنامج البحوث داخل الجافية HL001786 إلى J.R.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032 (2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903 (2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936 (2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554 (2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 168، الميوسين، خيوط أكتين، تنقية البروتين، المجهر الفلوري، المقايسة الحركية، المقايسة جزيء واحد، خيوط ثنائية القطب، المجهر الانعكاس الداخلي الكلي مضان
التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J.… More

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter