Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

מוצג כאן הליך לבטא ולטהר מיוסין 5a ואחריו דיון על אפיון שלה, באמצעות הרכב ומולקולה אחת במבחנה מיקרואורסצנטיות מבוססות בדיקות, וכיצד שיטות אלה ניתן לשנות עבור אפיון של מיוסין nonmuscle 2b.

Abstract

חלבוני מיוסין לאגד אינטראקציה עם אקטין חוטי (F-actin) ונמצאים אורגניזמים על פני העץ phylogenetic. המבנה שלהם ואת המאפיינים אנזימטיים מותאמים לתפקוד מסוים שהם מבצעים בתאים. מיוסין 5a הולך תהליכית על F-actin כדי להעביר מלנוזומים ושלשלות בתאים. לעומת זאת, מיוסין 2b לא-מולקולרי פועל כחם דו קוטבי המכיל כ-30 מולקולות. הוא מזיז F-actin של קוטביות הפוכה לכיוון מרכז חוט, שבו מולקולות המיוסין פועלות באופן אסינכרוני כדי לקשור actin, להקנות שבץ כוח, ולנתק לפני חוזר על המחזור. מיוסין לא-נוסוס 2b, יחד עם המיוסין 2 איזופורמים אחרים שלה, יש תפקידים הכוללים הידבקות תא, ציטוקינזיס, ותחזוקת מתח. המכנוכימיה של מיוסין ניתן ללמוד על ידי ביצוע במבחנה תנועתיות ישבן באמצעות חלבונים מטוהרים. בפעולת ההזזה, המיוסין קשורים למשטח מיקרוסקופ המכסה את פני השטח ואת הפלואורסצנטיות שכותרתו F-actin, אשר ניתן לעקוב. עם זאת, במולקולה/אנסמבל התנועתיות, נצפתה F-actin קשורה לכיסוי ותנועה של מולקולות מיוסין שכותרתן פלואורסצנטית על F-actin נצפתה. בדו"ח זה, טיהור של מיוסין רקומביננטי 5a מתאי Sf9 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה הוא מתואר. לאחר מכן, אנו מתארים שתי בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית: בדיקת חוטי אקטן הזזה ובוחן תנועתיות הפוכה. מבדים אלה, ניתן לחלץ פרמטרים כגון מהירויות טרנסלוקציה actin ואורכי ריצה של מולקולה אחת ומהירויות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. טכניקות אלה ניתן ליישם גם כדי ללמוד את התנועה של חוטים בודדים של מיוסין לאmuscle 2 איזופורמים, נדון כאן בהקשר של מיוסין לאmuscle 2b. זרימת עבודה זו מייצגת פרוטוקול וסדרת כלים כמותיים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את דינמיקת המולקולה וההרכב הבודדת של מיוסין לא-מולקולריים.

Introduction

מיוסינוס הם חלבונים מוטוריים המפעילים כוח על חוטי אקטין באמצעות האנרגיה המופקת מאדנוסין טריפוספט (ATP) הידרוליזה1. מיוסין מכילים תחום ראש, צוואר וזנב. התחום הראשי מכיל את אזור איגוד actin, כמו גם את האתר של כריכת ATP הידרוליזה. תחומי הצוואר מורכבים מוטיבים IQ, אשר נקשרים שרשראות אור, calmodulin, או חלבונים דמויי calmodulin2,3. לאזור הזנב יש מספר פונקציות ספציפיות לכל סוג של מיוסין, כולל אך לא רק עמעום של שתי שרשראות כבדות, כריכה של מולקולות מטען, ורגולציה של המיוסין באמצעות אינטראקציות autoinhibitory עם תחומי הראש1.

המאפיינים הרוטאליים של מיוסין משתנים מאוד בין השיעורים. חלק ממאפיינים אלה כוללים יחס חובה (השבר של המחזור המכני של מיוסין שבו myosin מחויב לפעול) ועיבוד (היכולת של מנוע לעשות צעדים מרובים על המסלול שלה לפני ניתוק)4. מעל 40 הכיתות של מיוסין נקבעו על סמך ניתוחירצף 5,6,7,8. מיוסין בכיתה 2 מסווגים "קונבנציונאלי" מאז הם היו הראשונים ללמוד; כל המעמדות האחרים של המיוסין מסווגים, אם כן, כ"לא שגרתיים".

מיוסין 5a (M5a) הוא מיוסין בכיתה 5 והוא מנוע תהליכי, כלומר הוא יכול לקחת צעדים מרובים לאורך actin לפני ניתוק. יש לו יחס חובה גבוה, המציין כי הוא מבלה חלק גדול מהמחזור המכני שלו מחויב לפעול9,10,11,12,13,14. במשותף עם מיוזינים אחרים, השרשרת הכבדה מכילה תחום מנוע N-terminal הכולל הן אקטין מחייב ואתר הידרוליזה ATP ואחריו אזור צוואר המשמש זרוע ידית, עם שישה מוטיבים IQ להיקשר שרשראות אור חיוניות (ELC) ו calmodulin (CaM)15. אזור הזנב מכיל סלילים מסלילים α-סליליים סליליים, אשר עמעמים את המולקולה, ואחריו אזור זנב כדורי למטען מחייב. הקינטיקה שלה משקפת את מעורבותה בהובלת מלנוזומים במלנוציטים ובריטיקולום אנדופלסמי בנוירונים פורקיניה16,17. M5a נחשב מנוע הובלת מטענים טיפוסי18.

מיוזינים מסוג 2, או מיוזינים קונבנציונליים, כוללים את המאוזינים המעצימים התכווצות של שלד, לב ושריר חלק בנוסף לאיזוסין לא-מומסקל 2 (NM2) איזופורמים, NM2a, 2b ו- 2c19. איזופורמים NM2 נמצאים ציטופלסמה של כל התאים ויש להם תפקידים משותפים ציטוקינזה, הידבקות, מורפוגנזה רקמות, ונדידת תאים19,20,21,22. מאמר זה דן פרוטוקולי מיוסין קונבנציונליים בהקשר של מיוסין לא 1000 (NM2b)23. NM2b, בהשוואה ל- M5a, יש יחס חובה נמוך והוא איטי יותר אנזימטית עםV מקסימום של 0.2 s-123 לעומתV max של M5a של ≈18 s-124. ראוי לציין, מבנים NM2b חתוכים עם שני ראשים אינם נעים בקלות על actin; במקום זאת, כל מפגש עם actin תוצאות שבץ כוח ואחריו דיסוציאציה של המולקולה25.

NM2b מכיל שתי שרשראות כבדות מיוסין, כל אחת עם דומיין ראש כדורי אחד, זרוע ידית אחת (עם ELC אחד ושרשרת אור רגולטורית אחת (RLC)), וגזע מוט סליל סליל / זנב סליל α סלילי, באורך של כ -1,100 חומצות אמינו, המבליט את שתי השרשראות הכבדות הללו. הפעילות אנזימטית ומצב מבני של NM2b מוסדרים על ידי זרחן של RLC23. NM2b לא מפוזר, בנוכחות ATP וכוחות יוניים פיזיולוגיים (כ 150 מ"מ מלח), מאמץ קונפורמציה קומפקטית שבה שני הראשים להשתתף באינטראקציה אסימטרית והזנב מתקפל בחזרה מעל הראשים בשני מקומות23. במצב זה, myosin אינו אינטראקציה חזקה עם actin ויש לו פעילות אנזימטית נמוכה מאוד. על זרחן RLC על ידי קטיעת שרשרת אור מיוסין תלוי מיוסין (MLCK) או קינאז חלבון הקשורים לרו, המולקולה משתרעת ומתחברת למיוזינים אחרים דרך אזור הזנב כדי ליצור חוטים דו קוטביים של כ -30 מולקולות מיוסין23. הזרחן הנ"ל של RLC מוביל גם לפעילות ATPase מוגברת המופעלת על ידי actin של NM2b על ידי כארבע פעמים26,27,28. סידור חוט דו קוטבי זה, הכולל מנועי מיוסין רבים בכל קצה, מותאם לתפקידים בתחזוקת התכווצות ומתח, שם ניתן להזיז חוטי אקטין עם קוטביות מנוגדת ביחס זה לזה23,29. בהתאם, NM2b הוכח לפעול כהרכב של מנועים בעת אינטראקציה עם actin. המספר הגדול של מנועים בתוך חוט זה מאפשרים חוטי NM2b לנוע באופן תהליכי על חוטי actin, מה שהופך את עיבוד חוטי הפריה ישון אפשרי לאפיין29.

בעוד התקדמות נעשתה בהבנת התפקיד של מיוסין בתא, יש צורך להבין את המאפיינים האישיים שלהם ברמת החלבון. כדי להבין אינטראקציות actomyosin ברמת אינטראקציה חלבון-חלבון פשוט, ולא בתוך תא, אנו יכולים לבטא ולטהר מיוסין רקומביננטי לשימוש במחקרים במבחנה. התוצאות של מחקרים כאלה אז ליידע mechanobiologists על המאפיינים הביופיסיים של מיוסין ספציפי כי בסופו של דבר לנהוג תהליכים תאיים מורכבים12,13,14,25,29. בדרך כלל, זה מושג על ידי הוספת תג זיקה למבנה מיוסין באורך מלא או חתוך וטיהור באמצעות כרומטוגרפיהזיקה 29,30,31. בנוסף, ניתן להנדס את המבנה כך שיכלול פלואורופור שניתן להקפיץ גנטית או תג לתיוג חלבונים עם פלואורופור סינתטי. על ידי הוספת תווית פלואורסצנטית כזו, ניתן לבצע מחקרי הדמיה של מולקולה אחת כדי להתבונן במכניקת מיוסין וקינטיקה.

לאחר הטיהור, המיוסין יכול להיות מאופיין במספר דרכים. פעילות ATPase יכולה להימדד בשיטות צבעוניות, המספקות תובנה לגבי צריכת האנרגיה הכוללת וזיקה לפעולה של המנוע בתנאים שונים32. כדי ללמוד על המכנוכימיה של תנועתיותה, נדרשים ניסויים נוספים. מאמר זה מפרט שתי שיטות מבוססות מיקרוסקופיה במבחנה, שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין את המאפיינים הססנים של חלבון מיוסין מטוהר.

הראשון של שיטות אלה הוא בדיקת חוט אקטן הזזה, אשר ניתן להשתמש בו כדי ללמוד כמותית את תכונות ההרכב של מנועי מיוסין, כמו גם ללמוד באופן איכותי את האיכות של אצווה של חלבון מטוהר33. למרות מאמר זה דן בשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) לבדיקה זו, ניסויים אלה יכולים להתבצע ביעילות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה המצויד במצלמה דיגיטלית, שנמצאת בדרך כלל במעבדות רבות34. בבחינה זו, שכבה רוויה של מנועי מיוסין מחוברת לכיסוי. זה יכול להתבצע באמצעות ניטרוצלולוז, נוגדנים, ממברנות, SiO2- משטחים נגזרים (כגון trimethylchlorosilane), בין היתר29,33,35,36,37,38. חוטי אקטין המסומנים בפלואורסצנטית מועברים דרך תא כיסויי השער, שעליו האקטין נקשר למיוסיפן המחובר לפני השטח. עם תוספת של ATP (וקינאזים בחקר NM2), התא הוא התמונה כדי לצפות טרנסלוקציה של חוטי actin על ידי מיוזינים כבול פני השטח. תוכנת מעקב יכולה לשמש כדי לתאם את המהירות והאורך של כל חוט אקטאין הזזה. תוכנת ניתוח יכולה גם לספק מידה של מספר חוטי actin נעים ונייחים, אשר יכול להיות שימושי כדי לקבוע את האיכות של הכנת מיוסין נתון. חלקם של חוטים תקועים יכול גם להיות מווסת בכוונה על ידי קשירת פני השטח של actin חלבונים אחרים ונמדד כדי לקבוע את התלות בעומס של מיוסין39. מכיוון שכל חוט אקטין יכול להיות מונע על ידי מספר רב של מנועים זמינים, בדיקה זו ניתנת לשחזור רב, כאשר המהירות הנמדדת הסופית חזקה להסתבכויות כגון שינויים בריכוז המיוסין ההתחלתי או נוכחות של גורמים נוספים בפתרון. משמעות הדבר היא שניתן לשנות אותו בקלות כדי ללמוד פעילות מיוסין בתנאים שונים, כגון זרחן שונה, טמפרטורה, כוח יוני, צמיגות פתרון, ואת ההשפעות של עומס המושרה על ידי צמיגי פני השטח. למרות גורמים כגון מיוסין חזק מחייב "ראשים מתים" מסוגל הידרוליזה ATP יכול לגרום חוטי actin תקוע, שיטות מרובות קיימות כדי למתן בעיות כאלה ולאפשר מדידות מדויקות. המאפיינים הקינטיים של מיוסין משתנים מאוד בין הכיתות, ובהתאם למיוסין הספציפי המשמש, מהירות גלישת חוטי האקטין בבדיקה זו יכולה להשתנות מתחת ל-20 ננומטר/שניה (מיוסין 9)40,41,ועד 60,000 ננומטר/שניה(Characean myosin 11)42.

הבחינה השנייה הפוך את הגיאומטריה של חוט ההזזה12. כאן, חוטי actin מחוברים משטח כיסוי ואת התנועה של מולקולות בודדות של M5a או של חוטים דו קוטביים בודדים של NM2b הם חזותיים. בדיקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את אורכי הריצה והמהירויות של מולקולות מיוסין יחיד או חוטים על actin. כיסוי מצופה בתרכובת כימית שחוסמת כריכה לא ספציפית ובמקביל מתפקדת את פני השטח, כגון ביוטין-פוליאתילן גליקול (ביוטין-PEG). התוספת של נגזרות אבידין מותאמות לאחר מכן ראשוניים את פני השטח ו actin biotinylated מועבר דרך התא, וכתוצאה מכך שכבה של F-actin קשור ביציבות לתחתית התא. לבסוף, מופעל ופלואורסצנטית שכותרתו מיוסין (בדרך כלל 1-100 ננומטר) זורם דרך התא, אשר לאחר מכן הוא התמונה להתבונן תנועת מיוסין מעל חוטי actin נייח.

שיטות אלה מייצגות שיטות מהירות וניתן לשחזור שניתן להשתמש בהן כדי לבחון את הדינמיקה של מיוסין לא-נואזמי ושרירים כאחד. דו"ח זה מתאר את הנהלים לטהר ולאפיין הן M5a והן NM2b, המייצגים מיוסין לא קונבנציונאלי וקונבנציונלי, בהתאמה. לאחר מכן דיון על כמה עיבודים ספציפיים myosin, אשר ניתן לבצע כדי להשיג לכידה מוצלחת של תנועה בשני סוגי הבחינה.

ביטוי וביולוגיה מולקולרית
יש לשכפל את ה- cDNA עבור המיוסין של העניין בווקטור pFastBac1 שונה המקודד עבור תג דגל מסוף C (DYKDDDDDK) אם הוא מבטא M5a-HMM, או תג דגל N-terminal אם הוא מבטא את המולקולה באורך מלא של NM2b23,43,44,45,46. תגי דגל מסוף C ב- NM2b גורמים לזיקה מוחלשת של החלבון לעמודת זיקת הדגל. לעומת זאת, החלבון המתויג על ידי דגל N בדרך כלל נקשר היטב לעמודת זיקת הדגל23. החלבון המתויג ב- N-סופני שומר על פעילות אנזימטית, פעילות מכנית ותקנה תלוית זרחן23.

במאמר זה, עכבר קטוע M5a כבד meromyosin (הממ) כמו מבנה עם GFP בין תג דגל ואת C-terminus של שרשרת כבד מיוסין שימש. שים לב שבניגוד ל- NM2b, ניתן לתייג ולטהר בהצלחה את M5a-HMM באמצעות תגי דגל N או C-terminal ובשני המקרים המבנה המתקבל יהיה פעיל. השרשרת הכבדה M5a נחתכה בחומצת אמינו 1090 ומכילה מקשר שלוש חומצות אמינו (GCG) בין GFP לאזור הסליל המפותל של M5a47. לא נוסף מקשר נוסף בין ה- GFP לתג FLAG. M5a-HMM בא לידי ביטוי בקלמודולין. מבנה NM2b האנושי באורך מלא בא לידי ביטוי בשיתוף עם ELC ו- RLC. N-termini של RLC הותך עם GFP באמצעות מקשר של חמש חומצות אמינו (SGLRS). מצורף ישירות לתג הדגל היה HaloTag. בין HaloTag ואת N-טרמינל של שרשרת כבד מיוסין היה מקשר עשוי שתי חומצות אמינו (AS).

שתי תכשירי המיוסין טוהרו מליטר אחד של תרבית תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס בצפיפות של כ 2 x 106 תאים / מ"ל. נפחי הבאקולווירוס עבור כל תת-ארון היו תלויים בריבוי הזיהום של הנגיף כפי שנקבע בהוראות היצרן. במקרה של M5a, תאים נדבקו במשותף עם שני baculoviruses שונים - אחד עבור calmodulin, ואחד עבור שרשרת כבדה M5a. במקרה של NM2b, תאים נדבקו במשותף עם שלושה וירוסים שונים - אחד עבור ELC, אחד עבור RLC, ואחד עבור שרשרת כבדה NM2b. עבור מעבדות העובדות עם מגוון של מיוסין (או חלבונים רב-קומתיים אחרים), גישה זו יעילה שכן היא מאפשרת שילובים רבים של שרשראות כבדות וקלות ושרשראות אור נפוצות כגון calmodulin ניתן לבצע שיתוף פעולה עם שרשראות כבדות מיוסין רבות ושונות. כל עבודת התא הושלמה בארון בטיחות ביולוגית עם טכניקה סטרילית נכונה כדי למנוע זיהום.

עבור הביטוי של M5a ו- NM2b, תאי Sf9 המייצרים את המיוסינוסים רקומביננטיים נאספו 2-3 ימים לאחר ההדבקה, באמצעות צנטריפוגה, ואוחסנו ב -80 °C (80 °F). כדורי תאים הושגו על ידי צנטריפוגה של תאי Sf9 נגועים במשותף ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות ב 2,800 x g. תהליך טיהור החלבון מפורט להלן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טיהור חלבונים

  1. תמה של תאים ומיצוי חלבונים
    1. הכן מאגר חילוץ 1.5x המבוסס על טבלה 1. סנן ואחסן ב- 4 °C (7°F).
    2. תתחיל להפשיר את כדורי התא על קרח. בעוד הכדורים מפשירים, תוספת 100 מ"ל של חוצץ החילוץ עם 1.2 mM dithiothreitol (DTT), 5 מיקרוגרם / mL leupeptin, 0.5 μM פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF) ושתי טבליות מעכב פרוטאז. שמור על קרח.
    3. לאחר הכדור הפשיר, להוסיף 1 מ"ל של מאגר החילוץ הנוסף לכל 10 מ"ל של תרבית התא. לדוגמה, אם כדורי התא נוצרו מ 500 מ"ל של תרבית התא, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל של מאגר החילוץ הנוסף לכדור.
    4. Sonicate כדורי התא תוך שמירה אותם על קרח. עבור כל גלולה, השתמש בתנאים הבאים: 5 s ON, 5 s OFF, משך של 5 דקות, כוח 4-5.
    5. לאסוף את כל ליסאט הומוגני לתוך ולהוסיף ATP (פתרון מלאי 0.1 M; pH 7.0) כך הריכוז הסופי של ATP הוא 1 mM. מערבבים במשך 15 דקות בחדר קר. ה- ATP מנתק מיוסין פעיל מ actin, ומאפשר לו להיות מופרד בשלב צנטריפוגה הבא. לכן, חיוני להמשיך לשלב הבא באופן מיידי כדי למזער את האפשרות לדלדול ATP ואיחוד מחדש לפעול.
    6. צנטריפוגות lysates ב 48,000 x גרם עבור 1 שעה ב 4 °C (70 °F). בזמן שזה קורה, להתחיל לשטוף 1-5 מ"ל של 50% רפש של שרף זיקה אנטי-דגל (עבור גלולה שנוצרה מ 1 ליטר של תאים) עם 100 מ"ל תמיסת מלח פוספט-חוצץ (PBS), על פי הוראות היצרן. לדוגמה, עבור 5 מ"ל של שרף, לשטוף 10 מ"ל של 50% רפש. בשלב הכביסה הסופי, resuspend את השרף עם 1-5 מ"ל של PBS עם מספיק נפח כדי ליצור תרחיף 50%.
    7. לאחר צנטריפוגה ליסאט, לשלב את supernatant עם שרף שטף slurry וסלע בעדינות בחדר הקר במשך 1-4 שעות. בזמן ההמתנה, הפוך את המאגרים המתוארים בטבלה 1 ולשמור אותם על קרח.
  2. הכנת טיהור זיקה דגל
    1. צנטריפוגות הפתרון בשלב 1.7 ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (7). השרף יהיה ארוז בתחתית הצינור. מבלי להפריע לשרף, הסר את הסופר-טבעי.
    2. Resuspend את השרף ב 50 מ"ל של חוצץ A כמפורט בטבלה 1 צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). מבלי להפריע לשרף, הסר את הסופר-טבעי.
    3. Resuspend את השרף ב 50 מ"ל של חוצץ B כמפורט בטבלה 1 צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). חזור על שלב זה פעם נוספת וחזק מחדש את השרף ב- 20 מ"ל של מאגר B. לאחר מכן, מערבבים את השרף ואת המאגר ביסודיות על ידי היפוך עדין של הצינור ביד כ 10 פעמים.
  3. אילוטציה וריכוז חלבונים
    1. הפוך 30 מ"ל של חוצץ Elution כמתואר בטבלה 1 ולתת לו לצנן על קרח.
    2. תציב את עמוד ההתחמקות בחדר קר. יוצקים בעדינות את שרף השרף לתוך העמוד. לשטוף את העמודה עם 1-2 אמצעי אחסון של מאגר B כמו שרף חבילות בתחתית, להבטיח כי השרף לא להתייבש.
    3. לזרום 1 מ"ל של מאגר Elution דרך השרף ולאסוף את הזרימה דרך בצינור 1.5 מ"ל. חזור על כך 12, 1 mL שברים נאספים.
    4. בשלב זה, לבצע מבחן ברדפורד גס על השברים כדי לקבוע באופן איכותי אילו שברים הם48המרוכז ביותר . בשורה אחת של צלחת 96-באר, פיפטה 60 μL 1x ברדפורד ריאגנט. כמו שברים נאספים, לערבב 20 μL של כל שבר לכל באר. צבע כחול כהה יותר מציין את השברים המרוכזים יותר.
    5. בצינור 50 מ"ל, לאסוף את החלבון הנותר על ידי בעדינות pipetting מאגר Elution הנותרים דרך העמודה, כדי לשחרר כל מיוסין שנותר קשור שרף בזרימה בעמודה. זרימה זו תרוכז בשלב הבא. ודא כי השרף הוא מחדש לאחר מכן לשימוש חוזר ומאוחסן בהתאם להוראות היצרן.
    6. איחד את שלושת השברים המרוכזים ביותר ורכז עוד יותר את הזרימה בצינור 50 מ"ל, כמו גם את שברי 1 מ"ל הנותרים באמצעות צינור ריכוז 100,000 MWCO. טען את הדגימה במאגר על הצינור המתרכז וצנטריפוגה ב 750 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (7 °F) ולחזור עד כל חלבון eluted כבר מרוכז לנפח סופי של כ 0.5-1 מ"ל.
      הערה: גודל נקבובית זה מאפשר שימור של מולקולות מיוסין, אשר יש מסות כמה פעמים את הניתוק במשקל המולקולרי. שרשראות האור נשארות קשורות קשר הדוק לתחומים המוטוריים במהלך תקופה זו של ריכוז, כפי שאומת על ידי ביצוע אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE במוצר הסופי.
  4. דיאליזה והקפאת הבזק
    1. הפוך 2 L של מאגר דיאליזה, כמתואר בטבלה 1. טען את הדגימה בשקית דיאליזה או בתא ודיאליזה לילה בחדר הקר. שים לב כי הרכב מאגרי הדיאליזה שונה עבור NM2b ו- M5a.
      הערה: במקרה של NM2b, המטרה של שלב דיאליזה זה היא ליצור חוטי מיוסין במאגר כוח יוני נמוך. משקעים של חוטים אלה לאחר מכן מספק שלב טיהור נוסף ומאפשר את הריכוז של המדגם. יהיה, אם כן, משקעים לבנים גלויים בתא הדיאליזה למחרת. סיבים אלה ייאספו על ידי צנטריפוגה ו depolymerized בשלב 5.1. במקרה של M5a-HMM, לאחר הדיאליזה הלילית, החלבון יהיה טהור מספיק לשימוש בבדיקות הבאות. ניתן לבצע שלבי טיהור נוספים כגון סינון ג'ל או כרומטוגרפיה של חילופי יונית, במידת הצורך. עבור שחזור M5a לאחר דיאליזה, עבור לשלב 5.2.
  5. שחזור מיוסין לאחר דיאליזה
    1. עבור NM2b, לפרוק בזהירות את כל המדגם משקית הדיאליזה או התא וצנטריפוגה ב 4 °C (75 °F) במשך 15 דקות ב 49,000 x g כדי לאסוף את חוטי המיוסין. השלך את supernatant ולהוסיף בהדרגה את מאגר האחסון לכדור כמתואר בטבלה 1 עד שהוא נמס. צנרת עדינה למעלה ולמטה מסייעת לתדלק את הכדור. בדרך כלל, זה לא דורש יותר מ 500 μL לכל צינור. לאחר שהבטיח כי הכדור מומס לחלוטין במאגר אחסון חוזק יוני גבוה, שלב צנטריפוגה נוסף (15 דקות ב 49,000 x g) ניתן לבצע כדי להסיר אגרגטים לא רצויים במידת הצורך, שכן המיוסין יהיה עכשיו לא פולימרי ויישאר supernatant.
    2. עבור M5a-HMM, בזהירות לאסוף את המדגם כולו מתא הדיאליזה צנטריפוגה ב 4 °C (5 °F) במשך 15 דקות ב 49,000 x g במקרה כל אגרגטים לא רצויים נוכחים. קח את הסופר-טבעי.
  6. קביעת ריכוז והקפאת הבזק
    1. כדי לקבוע את ריכוז המוצר, למדוד את הספיגה באמצעות ספקטרופוטומטר באורכי גל 260, 280, 290, ו 320 ננומטר. חשב את הריכוז mg/mL (cmg/mL) עם משוואה 1, שבו A280 מייצג את הספיגה ב 280 ננומטר ו A320 מייצג את הספיגה ב 320 ננומטר. הריכוז המתקבל mg / mL ניתן להמיר μM של מולקולות מיוסין עם משוואה 2, שם M הוא המשקל המולקולרי של החלבון כולו (כולל שרשראות כבדות, שרשראות אור, פלואורופורים, וכל התגים).
      cמ"ג/מ"ל = (A280 - A320) / ε (1)
      מולקולות מיקרומטר = 1000c מ"ג / מ"ל/M (2)
      הערה: אם דילול יש צורך, אז זה חייב להיעשות במאגר חוזק יוני גבוה. מקדם ההכחדה (ε) יכול להיקבע על ידי ייבוא רצף חומצות האמינו של החלבון לתוכנית כגון ExPASy. תשואה אופיינית עבור M5a-HMM הוא כ 0.5-1 מ"ל של 1-5 מ"ג / מ"ל חלבון עבור NM2b באורך מלא הוא 0.5-1 מ"ל של 0.5-2 מ"ג / מ"ל. מקדם ההכחדה של M5a-HMM המשמש במאמר זה היה 0.671. מקדם ההכחדה של NM2b המשמש במאמר זה היה 0.611.
    2. לאחסן את המיוסין המטוהר באחת משתי הדרכים. Aliquot בין 10-20 μL לתוך צינור דק קיר, כגון צינור תגובת שרשרת פילמור, ושחרר את הצינור לתוך מיכל של חנקן נוזלי להקפאת הבזק. לחלופין, ישירות pipette בין 20-25 μL של מיוסין לתוך חנקן נוזלי ולאחסן את החרוזים הקפואים של חלבון בצינורות קריוגניים סטריליים. בכל מקרה, הצינורות המתקבלים ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) או חנקן נוזלי לשימוש עתידי.
      הערה: מאחר ששתי התקפות תנועתיות המתוארות להלן דורשות כמויות קטנות מאוד של חלבון, אחסון ב aliquots קטן, כמתואר, הוא חסכוני.

2. גלישה actin חוט אסאי

  1. הכנת כיסוי
    1. הפוך פתרון חנקן 1% אצטט עמיל.
    2. להשיג צלחת תרבית רקמות (150 x 25 מ"מ) ולהוסיף נייר מסנן עגול (קוטר 125 מ"מ) לתחתית המנה.
    3. טען שמונה עובי מס ' 1.5 כיסויים מרובעים 22 מ"מ על מתלה ולשטוף עם כ 2-5 מ"ל של אתנול 200 הוכחה ואחריו 2-5 מ"ל של מים מזוקקים (dH2O). חזור על שלב הכביסה הזה, המסתיים במים. לאחר מכן, יבש את כיסויים לחלוטין באמצעות קו אוויר מסונן או N2-line.
    4. קח כיסוי אחד לאט pipette 10 μL של פתרון 1% ניטרוצלולוז לאורך קצה אחד של להחליק. לאחר מכן, בתנועה חלקה אחת, למרוח אותו על פני שאר כיסוי באמצעות הצד של חלקה 200 μL פיפטה קצה. מניחים את כיסוי זה על צלחת תרבית הרקמות עם הצד הניטרוצלולוז למעלה. חוזרים על הפעולה לקבלת כיסויים הנותרים ומאפשרים להם להתייבש בזמן הכנת ריאגנטים הנותרים ולהשתמש כיסויים בתוך 24 שעות לאחר הציפוי.
  2. הכנה קאמרית
    1. נגב שקופית מיקרוסקופ עם נייר עדשה אופטי לניקוי פסולת גדולה. חותכים שתי חתיכות של סרט דו-צדדי, באורך של כ-2 ס"מ.
    2. מקם חתיכה אחת לאורך אמצע הקצה הארוך של שקופית המיקרוסקופ. ודא שקצה הקלטת מתיישר עם קצה השקופית. מניחים את פיסת הסרט השנייה בערך 2 מ"מ מתחת לפיסת הסרט הראשונה כך שהשניים מקבילים ומיושרים. פעולה זו יוצרת תא זרימה שיכול להכיל כ- 10 מיקרו-אל של פתרון (ראו איור 1).
    3. קח את אחד מהכיסויים מצופים הניטרוצלולוז מחלק 1. יש לתקוע בזהירות את כיסוי הכיסוי על הקלטת כך שהצד מצופה בניטרוסלולוז יוצר קשר ישיר עם הקלטת (ראו איור 1). בעזרת קצה pipette, לחץ בעדינות על ממשק סרט השקופיות כדי לוודא שהכיסוי נדבק כראוי בשקופית. חותכים את הקלטת העודפת התלויה על קצה המגלשה עם סכין גילוח.
  3. הכנת אקטין
    1. הפוך 20 μM F-actin על ידי פילמור אקטין גלובולרי (G-actin) במאגר פילמור (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7.0)) ב 4 °C (4 °F) לילה.
    2. לדלל F-actin ל 5 μM במאגר תנועתיות (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)). תווית עם עודף 1.2x לפחות של רודמין-פאלואידין. להשאיר (מכוסה בנייר אלומיניום) לפחות 2 שעות על קרח. זה יכול לשמש עד 1-2 חודשים, מאוחסן על קרח.
  4. ביצוע myosin 5a גלישה אקטין חוטים
    הערה: בסעיף זה, הפרטים של מיוסין 5a (הממ) גלישה אסאי מסופקים.
    1. הכן את הפתרונות למיוסין 5a המתוארים בטבלה 2 ולשמור אותם על קרח.
    2. לזרום 10 μL של myosin 5a (50-100 ננומטר) דרך תא הזרימה ולחכות 1 דקות.
    3. זרימה ב 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב 50 mM MB עם 1 mM DTT ("מלח נמוך" חוצץ). חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולחכות 1 דקות לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ על ידי הצבה עדינה של פינת הנייר ביציאה תא הזרימה.
    4. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    5. זרימה ב 10 μL של פתרון actin שחור (5 μM F-actin, 1 μM calmodulin, ו 1 mM ATP ב 50 mM MB עם 1 mM DTT) כדי לחסל "ראשים מתים", כפי שנדון בסעיף דיון.
      1. Pipette הפתרון עם מזרק 1 מ"ל ו 27 G מחט כדי לגטות את חוטי actin לפני הצגת הפתרון לתא. חזור על שלב זה פעמיים נוספות והמתן דקה אחת לאחר הפעם השלישית. כ-20 אירועי צנרת מספיקים.
      2. כדי לבצע את ספין "ראש מת", להוסיף כמות סטואישיומטרית של F-actin למיוסין בנוכחות 1 mM ATP ו 1 mM MgCl2 בריכוז מלח של 500 mM. לאחר מכן אולטרה צנטריפוגה ב 480,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). מיוסין המת יהיה בכדור.
    6. זרימה ב 50 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT ו 1 mM ATP כדי לרוקן את החדר של חוטי אקטין חינם.
    7. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות כדי לרוקן את התא של כל ATP.
    8. זרימה ב 10 μL של 20 nM רודמין actin (Rh-Actin) פתרון המכיל 1 mM DTT ב 50 mM MB ולחכות 1 דקות כדי לאפשר קשירת קפדנית של חוטי actin למיוסין 5a מחובר לפני השטח של כיסוי.
    9. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT לשטוף חוטי Rh-Actin לא קשור אל פני השטח. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    10. זרימה ב- 30 μL של המאגר הסופי.
    11. הקלט תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות אורך גל עירור של 561 ננומטר כדי לדמיין את Rh-Actin. זמן חשיפה מתאים הוא 200 אלפיות שני בהספק לייזר של 1.4 מגה-ואט למשך הרכש הכולל של 0.5-1 דקות.
      הערה: ודא שקצב הרכישה משתנה בהתאם למהירות הסיבים הנעים. שיקול חשוב לפני איסוף נתונים לשימוש עם תוכניות מעקב הוא קצב הפריימים של הרכישה. תנועות תת-פיקסל בין מסגרות יביאו להערכת יתר של המהירות, ותנועות של כמה מאות ננומטרים נדרשות כדי להשיג ערכים מדויקים. קצב רכישה אופטימלי כולל גלישת אקטין למרחק פיקסל אחד לפחות בין מסגרות. במקרה של מיקרוסקופ TIRF המשמש להדמיה כאן, סף זה מתורגם ל- 130 ננומטר; לכן, מיוסין צפוי לנסוע 1 מיקרומטר/s חייב להיות בתמונה בקצב של 5 מסגרות / s (מרווח של 0.2 שניות) כדי להשיג 200 ננומטר של תנועה בעוד מיוסין צפוי לנסוע 10 ננומטר / s דורש 0.05 מסגרות / s (מרווחי 20 s). לפיכך, ניתן לצמצם את דגימת הנתונים בשלב זה במידת הצורך (ראה דיון לקבלת פרטים נוספים).
  5. ביצוע מיוסין לא-1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
    הערה: בסעיף זה, הפרטים של מיוסין באורך מלא לא 1000 2b גלישה אסאי מסופקים. מיוסין 2b הזזה לא-1b actin filament פרוטוקול בדיקה שונה מפרוטוקול myosin 5a בשלבים מסוימים. ודא שהמאגרים הנכונים משמשים עבור כל אחד מהצעדים הללו. לדוגמה, בדיקה NM2b דורש חיבור של מיוסין כיסוי במאגר מלח גבוה בעוד M5a יכול להיות מחובר כיסוי במאגרי מלח גבוהים או נמוכים. בנוסף, M5a גלישה אקטין חוט asslament בדיקה משתמש בריכוז נמוך יותר של מיוסין כדי למתן את התדירות של חוטי actin מתפרקים במהלך הרכישה.
    1. הכן את הפתרונות עבור NM2b כמתואר בטבלה 2 ולשמור אותם על קרח.
    2. זרימה ב 10 μL של מיוסין לאmuscle 2b (0.2 μM) ב 500 mM חוצץ תנועתיות (MB) ("מלח גבוה" חוצץ) ו 1 mM dithiothreitol (DTT) דרך תא הזרימה ולחכות 1 דקות.
      הערה: מאגרי המלח הגבוהים לניתוק חוטי מיוסין ולאפשר התקשרות של מולקולות מיוסין יחיד אל פני השטח, כמו מיוסין לאmuscle 2b יכול פולימר לתוך חוטים בריכוז יוני <150 mM.
    3. זרימה ב 10 μL של 1 mg / mL סרום בקר אלבומין (BSA) ב 500 mM MB עם 1 mM DTT ("מלח גבוה" חוצץ) כמתואר בטבלה 2. חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולחכות 1 דקות לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ.
    4. לשטוף עם 10 μL של 500 mM MB עם 1 mM DTT כמתואר בטבלה 2. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    5. לזרום ב 10 μL של פתרון actin שחור כמתואר בטבלה 2 כדי לחסל "ראשים מתים", כפי שנדון עוד בסעיף דיון. פתרון המעשין השחור מכיל 5 מיקרומטר של F-actin ללא תווית, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0.2 מ"מ CaCl2, 1 μM CaM, ו 1 mM DTT ב 50 mM NaCl חוצץ תנועתיות כדי זרחן מיוסין nonmuscle 2b על פני השטח של התא.
      1. Pipette הפתרון עם מזרק 1 מ"ל ו 27 G מחט כדי לגטות את חוטי actin לפני הצגת הפתרון לתא. חזור על שלב זה פעמיים נוספות והמתן דקה אחת לאחר הפעם השלישית. כ- 20 אירועי צנרת מספיקים.
    6. זרימה ב 50 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT ו 1 mM ATP כדי לרוקן את החדר של חוטי אקטין חינם.
    7. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות כדי לרוקן את התא של כל ATP.
    8. זרימה ב 10 μL של 20 nM Rh-Actin פתרון המכיל 1 mM DTT ב 50 mM MB ולחכות 1 דקות כדי לאפשר קשירת קפדניה של סיבי actin למיוסין 2b לא מושמש מחובר לפני השטח של כיסוי.
    9. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT לשטוף חוטי Rh-Actin לא קשור אל פני השטח. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    10. זרימה ב- 30 μL של המאגר הסופי. עבור מיוסין 2b הזזה לא-מוסוקית, החיץ הסופי כולל גם calmodulin, CaCl2, ושרשרת אור מיוסין kinase כדי לספק זרחן מלא של מיוסין 2b nonmuscle במהלך הדמיית וידאו. 0.7% מתילסלולוז יכול להיכלל גם במאגר הסופי אם חוטי actin מאוגדים רק באופן רופף או אינם קשורים לפני השטח. הדבר נדון בהמשך בסעיף הדיון.
    11. הקלט תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות אורך גל עירור של 561 ננומטר. זמן חשיפה מתאים הוא 200 אלפיות שני בהספק לייזר של 1.4 מגה-ואט למשך רכישה כולל של 0.5 -3 דקות.
      הערה: ודא שקצב הרכישה משתנה בהתאם למהירות הסיבים הנעים. שיקול חשוב לפני איסוף נתונים לשימוש עם תוכניות מעקב הוא קצב הפריימים של הרכישה. תנועות תת-פיקסל בין מסגרות יביאו להערכת יתר של המהירות, ותנועות של כמה מאות ננומטרים נדרשות כדי להשיג ערכים מדויקים. קצב רכישה אופטימלי כולל גלישת אקטין למרחק פיקסל אחד לפחות בין מסגרות. במקרה של מיקרוסקופ TIRF המשמש להדמיה כאן, סף זה מתורגם ל- 130 ננומטר; לכן, מיוסין צפוי לנסוע 1 מיקרומטר/s חייב להיות בתמונה בקצב של 5 מסגרות / s (מרווח של 0.2 שניות) כדי להשיג 200 ננומטר של תנועה בעוד מיוסין צפוי לנסוע 10 ננומטר / s דורש 0.05 מסגרות / s (מרווחי 20 s). לפיכך, ניתן לדגום נתונים בשלב זה, במידת הצורך (ראה דיון לקבלת פרטים נוספים).

3. מולקולה בודדת TIRF מראייה

  1. הכנת כיסוי
    1. מחלקים את אבקת המניות ל-10 מ"ג עליקוט (בצינורות של 1.5 מ"ל) של מתוקסי-פג-סילאן (mPEG) ו-10 עליקוטים מ"ג של ביוטין-פג-סילאן (bPEG). יש לאחסן ב-20 °C במיכל אטום וללא לחות ולהשתמש תוך 6 חודשים.
    2. טען שמונה עובי מס ' 1.5H (דיוק גבוה) כיסויים מרובעים 22 מ"מ על מתלה ולשטוף עם 2-5 מ"ל של אתנול 200 הוכחה ואחריו 2-5 מ"ל של מים מזוקקים. חזור על שלב הכביסה הזה, המסתיים במים. לאחר מכן, יבש את כיסויים לחלוטין באמצעות קו אוויר או N2 ופלזמה נקי עם ארגון במשך 3 דקות.
    3. מניחים את כיסויי הניקוי על נייר סינון (90 מ"מ) בצלחת תרבית רקמות (100 x 20 מ"מ) ודגרה בתנור 70 מעלות צלזיוס תוך ביצוע השלבים הבאים.
      הערה: ניקוי פלזמה ניתן להחליף בשיטות ניקוי כימיות אחרות49.
    4. הכן 80% פתרון אתנול עם dH2O ולהתאים את ה- pH ל 2.0 באמצעות HCl. להוסיף 1 מ"ל של זה 10 aliquot מ ג של mPEG ו 1 מ"ל כדי 10 aliquot מ"ג של bPEG. מערבולת להתמוסס, אשר לא צריך לקחת יותר מ 30 s.
    5. קח 100 μL של פתרון bPEG ולהוסיף 900 μL של 80% אתנול (pH 2.0). פתרון זה הוא 1 מ"ג / מ"ל bPEG. לאחר מכן, לעשות פתרון של שני PEGs כדלקמן, ערבוב ביסודיות.
      1. 200 μL של 10 מ"ג / מ"ל mPEG (ריכוז סופי: 2 מ"ג / מ"ל).
      2. 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל bPEG (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מ"ל).
      3. 790 μL של פתרון 80% אתנול (pH 2.0).
    6. מוציאים את הכיסויים מהתנור. יש לחלק בזהירות 100 מיקרו-אל של תמיסה PEG למרכז כל כיסוי, ומבטיח שרק המשטח העליון רטוב. לאחר מכן, מניחים את החלקות בחזרה בתנור ודגרה במשך 20 עד 30 דקות.
    7. כאשר כיסויים מתחילים לקחת על מראה חורי, עם עיגולים קטנים גלויים על פני השטח, להסיר אותם מהתנור.
    8. לשטוף כל כיסוי עם 100% אתנול, יבש עם קו אוויר, ומניחים בחזרה בתנור. דגירה רק לזמן הנדרש ליצירת תאים בשלב 2.
  2. הכנה קאמרית
    1. נקה שקופית מיקרוסקופ לשימוש בהכנת התא. חותכים שתי חתיכות של סרט דו-צדדי, באורך של כ-2 ס"מ.
    2. מקם חתיכה אחת לאורך אמצע הקצה הארוך של שקופית המיקרוסקופ. ודא שקצה הקלטת מתיישר עם קצה השקופית. מניחים את פיסת הסרט השנייה בערך 2 מ"מ מתחת לפיסת הסרט הראשונה כך שהשניים מקבילים ומיושרים.
    3. לוקחים את אחד הכיסויים הפונקציונליים מהתנור (נוצר ב-3.1). יש להקפיד על כיסויי הציפוי לקלטת, כך שהצד המצפוף ב-PEG יהיה עם הפנים כלפי מטה וייצור קשר ישיר עם הקלטת, כפי שמוצג באיור 1. בעזרת קצה pipette, לחץ בעדינות על ממשק סרט השקופיות כדי לוודא שהכיסוי נדבק כראוי בשקופית.
    4. חותכים את הקלטת העודפת התלויה מעל המגלשה עם סכין גילוח. תאים אלה ניתן להשתמש מיד או להציב pairwise לתוך צינור 50 מ"ל ומאוחסן במקפיא -80 °C לשימוש עתידי. חשוב לאחסן מיד או פני השטח יתפרקו.
  3. ביצוע מיוסין 5a TIRF מיקרוסקופיה בדיקה
    1. הכן את הפתרונות לבדיקת תנועתיות הפוכה myosin 5a המתוארת בטבלה 3 ולשמור אותם על קרח.
    2. לשטוף את התא עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT.
    3. זרימה ב 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולחכות 1 דקות לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ.
    4. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    5. זרימה ב 10 μL של פתרון NeutrAvidin ב 50 mM MB עם 1 mM DTT ולחכות 1 דקות.
    6. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    7. זרימה ב 10 μL של אקטין רודמין ביוטינילציה (bRh-Actin) המכיל 1 mM DTT ב 50 mM MB ולחכות 1 דקות. בשלב זה, השתמש בקצה פיפטה משועמם גדול והימנע מצינורות למעלה ולמטה כדי למזער את הגיסה של חוטי actin פלואורסצנטיים כדי להבטיח כי חוטי אקטין ארוכים ניתן לחבר לפני השטח (20-30 מיקרומטר או יותר). חלופה יעילה היא חיתוך החרוט של קצה פיפטה סטנדרטי (עם פתיחה של ≈1-1.5 מ"מ).
    8. לשטוף עם 10 μL של 50 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    9. זרימה ב 30 μL של המאגר הסופי עם 10 ננומטרמטר מיוסין 5a הוסיף, ולאחר מכן מיד לטעון על מיקרוסקופ TIRF ולרשום לאחר מציאת המוקד האופטימלי עבור שיטת הדמיה TIRF. זמני החשיפה בין 100-200 ms מתאימים בהספק לייזר של 1.4 מגה-ואט עבור האקטין והמיוסיפן בעל התווית GFP. זמן רכישה מתאים לניתוח מהירות הוא 3 דקות.
  4. ביצוע מיוסין לא-1000000000000000000000000000000000000000000000000000000
    הערה: בסעיף זה, הפרטים של מיוסין לא 1000 2b TIRF בדיקה באמצעות חוטים פולימריים זרחן מסופקים. פרוטוקול מפורט (סעיפים 4.1-4.3) עבור זרחן ופולימר מיוסין-2b לא מושתן בצינור כלול.
    1. כדי זרחן NM2b מטוהר, לעשות 10x קינאז לערבב עם התנאים הבאים: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK, ו 0.1 mM ATP. זה יכול להיות הביא לנפח עם 500 mM MB עם 10 mM DTT. מוסיפים את תערובת הקינאז 10x למיוסין ביחס נפחי של 1:10 ומאפשרים לזה לדגור במשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר. בדרך כלל, ריכוז מיוסין עבור שלב זה הוא 1 μM.
    2. כדי פולימר מיוסין זרחן לתוך חוטים, להוריד את ריכוז המלח של NM2b ל 150 mM NaCl. כדי לעשות זאת, לעשות חוצץ תנועתיות 1x (1x MB) ללא מלח על ידי דילול 4x MB ארבע פעמים ב dH2O. זה 1x MB יכול לשמש כדי להוריד את ריכוז המלח כי NM2b הוקפא במאגר מלח 500 mM.
    3. על כל 3 μL של מלאי NM2b, להוסיף 7 μL של 1x MB כדי להוריד את ריכוז המלח ל 150 mM NaCl ודגרה על קרח במשך 20-30 דקות כדי ליצור חוטי NM2b.
      הערה: הסדר בסעיפים 4.1-4.3 אינו קריטי כל עוד NM2b הוא זרחן וריכוז המלח הסופי הוא 150 מ"ר. דגירה בסדר גודל של 30 דקות-1 שעות מאפשרת מספיק זמן לזרחן מלא ופילינג.
    4. הכן את הפתרונות עבור myosin 2b הפוך תנועתיות מתואר בטבלה 3 ולשמור אותם על קרח.
    5. לשטוף את התא עם 10 μL של 150 mM MB עם 1 mM DTT.
    6. זרימה ב 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב 150 mM MB עם 1 mM DTT חזור על זה לשטוף פעמיים נוספות ולחכות 1 דקות לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ.
    7. לשטוף עם 10 μL של 150 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    8. זרימה ב 10 μL של פתרון NeutrAvidin ב 150 mM MB עם 1 mM DTT ולחכות 1 דקות.
    9. לשטוף עם 10 μL של 150 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    10. לזרום 10 μL של bRh-Actin ולחכות 1 דקות. בשלב זה, השתמש בקצה פיפטה משועמם גדול והימנע מצינורות למעלה ולמטה כדי למזער את הגיזה של חוטי אקטין פלואורסצנטיים, כדי להבטיח כי חוטי אקטין ארוכים יכולים להיות מחוברים לפני השטח (20-30 מיקרומטר או יותר). חלופה יעילה היא חיתוך החרוט של קצה פיפטה סטנדרטי.
    11. לשטוף עם 10 μL של 150 mM MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    12. לזרום ב 10 μL של פתרון מיוסין 2b לאmuscle (כ 30 ננומטר) ולחכות 1 דקות.
    13. לשטוף עם 10 μL של 150 MB עם 1 mM DTT. חזור על הכביסה הזו פעמיים נוספות.
    14. זרימה ב 30 μL של המאגר הסופי, ולאחר מכן מיד לטעון על מיקרוסקופ TIRF ולרשום לאחר מציאת המוקד האופטימלי עבור שיטות הדמיה TIRF. זמני החשיפה בין 100-200 ms מתאימים בהספק לייזר של 1.4 מגה-ואט עבור האקטין והמיוסיפן בעל התווית GFP. זמן רכישה מתאים לניתוח מהירות הוא 3 דקות.

4. ניתוח תמונה

  1. ניתוח תמונה עבור גלישה actin חוט assay
    הערה: ניתן לנתח את התמונות באמצעות התוכנה והמדריכים המקושרים ברשימת החומרים. חשוב לציין כי התוכנית המתוארת כאן דורשת TIFF-ערימות לניתוח. התהליך לניתוח בדיקת חוטי ההזזה הוא כדלקמן50.
    1. העלה ערימות סרטים גולמיים למבנה תיקיות שצוין והזן את הספריה העליונה ביותר של תיקיות הסרטים לתוכנית.
      הערה: התוכנית מנתחת את הקבצים לאורך ספריה זו וספריות משנה אלה, ומתייחסת לספריות ברמה הנמוכה ביותר כאל שכפולים. סטטיסטיקה ממוצעת עבור כל קבוצה של עותקים משוכפלים תופק. במקרה זה, סרט אחד שימש עבור כל מיוסין. כאשר מאפיינים מיוסין רומן או לחקור מצב ניסיוני חדש, מומלץ לנתח סרטים משלושה שדות של צפיות (FOV) לכל תא עבור סך של שלושה חדרים ולחזור על זרימת עבודה זו במשך שלוש הכנות של המיוסין הנחקר.
    2. השתמש בקובץ ה- Script "stack2tifs" בשילוב עם קצב הפריימים שהוזן על-ידי המשתמש כדי להמיר כל מחסנית TIFF לתיקיה המכילה סידרה של קבצי TIFF בודדים וקובץ מטא-נתונים.txt מתאים המכיל את שעת ההתחלה של כל מסגרת. עבור נתונים שאינם בתבנית מחסנית TIFF, יש להחיל תחילה המרה באמצעות תוכנה כגון אלה המפורטות בטבלת החומרים.
      הערה: קובץ Script זה הוא החלק בחבילת התוכנה. המידע של התסריט ניתן למצוא כאן: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. השתמש בפרמטר -px, שהוא גודל הפיקסלים (ב- nm) במהלך הרכישה. במקרה זה, גודל הפיקסלים הוא 130 ננומטר. השתמש בפרמטרים -xmax ו- -ymax לשינוי קנה המידה של הצירים עבור יציאות התוויית הפיזור. אלה תואמים את אורך הסיב המותווה הארוך ביותר ואת המהירות המותווה המרבית (ב- nm/ s).
      הערה: אלה הם ערכים משוערים וניתן להגדיר אותם לערכים גבוהים מהצפוי כדי להבטיח שהנתונים כלולים בהתוויה. לאחר ניתוח, ניתן לייצא את הנתונים הגולמיים גם לשימוש בתוכנות סטטיסטיות או גרפיות אחרות להצגה וניתוח.
    4. השתמש בפרמטר -minv, שהוא פרמטר ניתוק מהירות מינימלי, כדי להגדיר את הסיבים שאינם נעים, ולכן ניתן לא לכלול אותו בניתוח. עבור מיוסין איטי כגון NM2b, פרמטר זה חייב להיות נמוך (בדוגמה זו, 5 ננומטר/s) כדי למנוע חיתוך תנועות גלישה אמיתיות. עבור מיוסין מהיר כגון M5a, פרמטר זה יכול להיות גבוה יותר (בדוגמה זו, 100 ננומטר/s) כדי להחיל מסנן מחמיר יותר, תוך שמירה על התפלגות מהירות הגלישה האמיתית.
    5. השתמש בפרמטר הניתוק -pt כדי לזהות תנועה חלקה. עבור כל חלון דגימה, ערך מחושב שווה ערך ל- 100 x סטיית תקן מהירות/מהירות ממוצעת. מסלולים עם ערכים גבוהים יותר מהניתוק, כוללים מהירויות משתנות יותר והם אינם נכללים בניתוח נוסף. בדוגמה זו, נעשה שימוש בערך ניתוק של 33. מסלולים בעלי ערכים גבוהים יותר כוללים מהירויות משתנות יותר והם אינם נכללים בניתוח נוסף.
    6. השתמש ב- -maxd כדי להגדיר מרחק הצמדה מרבי המותר בין מסגרות. זהו מרחק מחושב של מסגרת למסגרת המוזז על-ידי המרכז של הסיב ביחידות של nm. זה יכול להיות שימושי עבור אי הכללת תנועות ספורדיות או חיבור שגוי בין סיבים. בדוגמאות כאן, הפרמטר נותר על ערך ברירת המחדל של 2,000 ננומטר.
  2. ניתוח תמונה לבדיקת מיקרוסקופיה TIRF
    הערה: התהליך לניתוח המולקולה היחידה TIRF בבדיקה על תוכנת ההדמיה המפורטת במיוחד ב רשימת חומרים הוא כדלקמן29.
    1. לחץ וגרור את הווידאו המיקרוסקופי המוקלט לסביבת העבודה של התוכנה כדי לפתוח אותו51. לאחר מכן, לפצל את ערוצי הרכישה. לחץ על תמונה > צבע > פיצול ערוצים.
      הערה: במקרה של הסחף שלב ניכר במהלך הרכישה, יש לייצב את התמונות כדי לתקן את הסחף האינסטרומנטלי במישור ההדמיה. במקרה זה, לא נעשה שימוש בפיצוי על סחיפה בציר Z שכן המיקרוסקופ המשמש להשגת נתונים אלה מייצב את הבאר Z-focus. כדי לייצב את התמונה בתוכנית ניתוח התמונה, התקן את יישום ה- Plug-in המתאים לייצב המקושר ברשימת החומרים. מייצב התמונה מניח מיקומים קבועים עבור האובייקטים בתמונה ומשתמש בממוצע מתגלגל של המסגרות הקודמות כהפניה. ההליך המומלץ הוא אפוא להתחיל עם הערוץ המכיל תמונות של actin שכותרתו, שכן זה נמצא במצב קבוע.
    2. לחץ על תוספיםולאחר מכן מצא מייצב תמונה; ודא שהתרגום נבחר ושמור על הגדרות ברירת המחדל. סמן את התיבה לצד יומן רישום של מקדמי המרה. החלת שלב יומן רישום זה מאפשרת להחיל את פרמטרי המשמרת המחושב על הערוץ השני בשלב הבא. אפשר להשלים את התהליך.
    3. לאחר מכן, פתח את הערוץ עם מיוסין שכותרתו ולהחיל את הייצוב על ידי לחיצה על תוספים > מייצב תמונה יומן Applier. אם לא ניתן לרכוש תמונות של אקטין במהלך אותה רכישה עקב דרישה להדמיה בקצב גבוה יותר בערוץ יחיד, להיסחף לייצב את ערימת התמונות על ידי בחירת אזור המכיל אובייקטים סטטיים כגון סמן פיודואלי ביו-טיניל או פלואורופורים הקשורים באופן ספציפי למשטח הביוטין-PEG. ניתן לחתוך אזור זה מהערימה המקורית ולייצב אותו, ולאחר מכן את היישום של ערכי ההזזה המתקבלים למחסנית המקורית.
      הערה: בפועל, הסחף שנצפו בניסויי תנועתיות יהיה זניח ביחס לתנועה של מיוסין אשר נעים בכמה מאות ננומטר / s, אבל עבור myosins האיטי ביותר זה הופך להיות שיקול חשוב.
    4. לאחר מכן, פתח את TrackMate, לחץ על תוספים; לאחר מכן, בתפריט הנפתח שלה לחץ על מעקב ולבסוף על TrackMate. בשלב זה, ניתוח התמונה כפוף לאופטימיזציה בהתבסס על הפרמטרים של תנאי הפלורופור והבוחן. עם זאת, הפרמטרים ההתחלתיים האידיאליים הם כדלקמן.
      1. הגדרות כיול: שמור את כל ערכי ברירת המחדל.
      2. גלאי: גלאי LoG.
      3. קוטר בועה משוער: 0.5-1.0 מיקרון.
      4. סף: 25-200. (ניתן לקבוע זאת על-ידי לחיצה על תצוגה מקדימה לאחר בחירת מספר כדי לראות אם המקומות שזוהו תואמים לסרט ומתאימים כראוי.)
      5. סף ראשוני: לא מוגדר.
      6. תצוגה: מציג היפר-תערועל.
      7. הגדר מסננים על כתמים: לא להגדיר.
      8. גשש: גשש פשוט LAP.
        הערה: אלה תלויים בקצב הפריימים ובמהירות מיוסין וחייבים להיות גדולים מספיק כדי לחבר את המיקומים הבאים תוך אי הכללת קשרים לא רצויים בין חלקיקים שונים.
      9. קישור מרחק מרבי: 1.0 מיקרון.
      10. מרחק מרבי של סגירת פער: 1.0 מיקרון.
      11. פער מסגרת מרבי סוגר פערים: 1.
      12. הגדרת מסננים על רצועות: מעקב אחר תזוזה (>0.39-כדי לכלול רק כתמים הנעים יותר מ-3 פיקסלים), כתמים ברצועות (>3-כדי לכלול רק רצועות עם 3 נקודות לפחות). מסננים אחרים כגון מהירות מינימלית עשויים להיות מוצגים כדי לא לכלול כתמים המעכבים במשך תקופות ארוכות. יש לבדוק את תוצאות הסינון על ידי בדיקה חזותית של מסלולים כדי להבטיח כי מסלולים מזויפים (כלומר, תנועת מיוסין ברקע שאינו לאורך מסלול actin) יוסרו תוך שמירה על הרצועות המשויכות actin.
    5. לאחר שהמסך 'אפשרויות תצוגה' עולה, לחץ על 'ניתוח' עבור הפלטים הרלוונטיים. שמור את שלוש הטבלאות שהופקו (מעקב אחר סטטיסטיקה, קישורים בסטטיסטיקת מעקב ונקודות בסטטיסטיקת מעקב). הטבלה Track Statistics תכיל את נתוני המהירות וההעתקה שניתן לנתח לאחר מכן כדי לאפיין חלבון חדשני או את ההשפעות של מצב ניסיוני מסוים, למשל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להעריך את טיהור המיוסין על ידי ביצוע הפחתת נתרן דודסיל סולפט-פוליאקרילמיד (SDS-PAGE) ג'ל-אלקטרופורזה כפי שמוצג באיור 2. בעוד נתון זה מייצג את המיוסין הסופי, לאחר הדיאליזה, SDS-PAGE יכול להתבצע על aliquots מהשלבים השונים של הליך הטיהור כדי לזהות את כל המוצרים שאבדו supernatant. Myosin 5a הממ יש להקה בטווח 120-130 kDa ואת מיוסין 2b לא באורך מלא יש להקה בטווח 200-230 kDa, המקביל לרשתות כבדות29,44. למיוסין 5a יש גם להקה ליד הסימן 17 kDa, המסמן calmodulin. מיוסין 2b לא-מושתן יש להקה בערך 17 kDa, המציין את ELC. מכיוון ש- RLC מתויג GFP קיים בהכנה זו של NM2b, ה- RLC מופיע בכ- 47 kDa; עם זאת, RLC ללא תווית יהיה נוכח בכ 20 kDa אם לא מתויג עם GFP.

תפילת חוטי הגלישה המוצגת בווידאו 1 ובאיור 3 מייצגת את המאפיינים של סרט אידיאלי וניתן למעקב. זה אקטין נימה אסאי תכונות תנועה חלקה של חוטי actin מתויגים. שטיפת האקטין השחורה מבטיחה שראשי המיוסין המתים יוסרו משדה המדידה, מה שתורם עוד יותר לתנועה החלקה הכוללת של חוטי המעשה. חוטים מתויגים פלואורסצנטית קצרים מספיק כי חוט אחד אינו חוצה על עצמו, וזה אופטימלי יותר עבור תוכנית המעקב. חוטי Actin כי הם ארוכים מדי לחצות חוטים אחרים, אשר יכול להציג קשיים כדי actin נמהם גלישה תוכנית מעקב. ניתן להימנע מבעיה זו על ידי צנרת למעלה ולמטה 10-20 פעמים כדי לגנות את חוטי actin לפני טעינה על כיסוי.

במקרה של NM2b, השימוש במתילצלולוז יכול לשפר באופן משמעותי את איכות הסרטים המוקלטים מכיוון שהוא מפחית את דיפוזיית המעשין הרחק משטח ההדמיה. זה לא הכרחי עבור M5a כי יחס החובה הגבוה שלה מאפשר התקשרות חזקה יותר של actin למשטח מצופה מיוסין. אם נעשה שימוש במתיל צלולוז, יש צורך לפתיל את הפתרון דרך התא כדי להבטיח שהפתרון יזרום. כפי שמוצג בסרטון 2, כאשר כל התנאים האחרים זהים למעט הדרה של methylcellulose, חוטי actin אינם נשארים קשורים קשר הדוק עם משטח מצופה מיוסין.

לעומת זאת, המטרה של בדיקת תנועתיות הפוכה המוצגת בווידאו 3 ובאיור 4 היא להציג חוטי אקטין פלואורסצנטיים הקשורים לפני השטח שעליהם ניתן לצפות בתנועת המיוסין. דרישה חשובה של בדיקה הפוכה היא להבטיח כי תנועת myosin נצפתה בעקביות ברחבי FOV, כפי שמוצג. השימוש בתערובת של DTT, גלוקוז, קטלאז, גלוקוז אוקסידאז יכול למזער את ההלבנה כדי לאפשר מדידות ארוכות יותר52. יתר על כן, אם שיעור הרכישה עבור בדיקה נמוכה, תריס אור התאורה בין רכישת מסגרות יכול לעזור עם הלבנת פוטו מופרזת. תריס של אור העירור יכול להיעשות באמצעות תריס מכני, או מסנן טונה acousto-אופטי (AOTF).

Figure 1
איור 1: הכנת תאי תא זרימה פונקציונליים. (A)התחל עם שקופית מיקרוסקופ נקייה, שתי חתיכות של סרט דו-צדדי שנחתכו לכ - 2 ס"מ, וכיסוי פונקציונלי. (B)הוסף את הקלטת למרכז שקופית המיקרוסקופ. (C)חבר את כיסוי לקלטת עם הציפוי (כלומר, ניטרוצלולוז) הפונה כלפי מטה ולחץ בעדינות על האזורים החופפים עם הקלטת באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק כדי להבטיח שהכיסוי נדבק לתא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אלקטרופורזה של ג'ל פולאקרילמיד SDS של NM2b ו-M5a-HMM. (A)תמונת ג'ל SDS PAGE מייצגת עבור שרשרת כבדה באורך מלא NM2b (≈230 kDa) ו- GFP-RLC (≈47 kDa) ו- ELC (≈17 kDa). תמונת ג'ל שוחזרה ושונתה ממלי ואח ' (2018)29. (B)תמונת ג'ל SDS PAGE מייצגת לשרשרת כבדה דמוית M5a -HMM (≈120 kDa) ו- calmodulin (≈17 kDa). שים לב כי הג'ל בתמונה זו אינו כולל GFP נוסף לקצה מסוף C. GFP מוכנס בשרשרת כבד מיוסין מגדיל את המשקל המולקולרי על ידי ≈27 kDa. תמונת ג'ל ששוחזרה ושונתה פורסמה במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית44. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות בדיקה של חוטי גמישות גולשים שנרכשו באמצעות תאורת TIRF. (A)מסגרת לדוגמה מסרט המציג טרנסלוקציה של חוטי אקטין של רודמין-פאלואידין המסומנים (באדום) ב- 0.2 מיקרומטר NM2b בנוכחות 0.7% מתיל צלולוז ב 30 °C (C). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B)פלט תמונה מעקב סיבים מתוכנית FASTrack עבור NM2b עבור אותו FOV כפי שמוצג ב -A) סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (C) היסטוגרמה מייצגת של מהירות הגלישה acto-NM2b, מראה כי מדגם זה של NM2b יכול ליצור מהירות גלישה אקטינית של 77 ± 15 ננומטר /s (ממוצע ± סטיית תקן; מספר הרצועות = 550). (D)מסגרת לדוגמה מסרט המציג טרנסלוקציה של חוטי actin רודמין-פאלואידין שכותרתו (באדום) על 75 nM M5a-HMM. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (E) פלט תמונת מעקב סיבים על ידי תוכנית FASTrack עבור M5a-HMM עבור אותו FOV כפי שמוצג (D)סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (F) היסטוגרמה מייצגת של מהירות הגלישה acto-M5a-HMM, מראה כי מדגם זה של M5a יכול ליצור מהירות גלישה אקטינית של 515 ± 165 ננומטר /s (ממוצע ± סטיית תקן; מספר הרצועות = 25098). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות בדיקה הפוכות שנרכשו באמצעות תאורת TIRF. (A)נציג FOV מערימת תמונות ממוזגת דו-ערוצית המציגה את התנועה של חוטי NM2b (מוצגים בירוק) על סיבי אקטין ביוטינילציה המסומנים ב- AF647-פאלואידין (מוצג בכחול) ב- 30 מעלות צלזיוס. חוטים פולימריים של NM2b מבוטאים ומטוהרים באופן רקומביננטי בשיתוף עם ELC ו- GFP-RLC נצפים כחלקיקים הירוקים והמוארכים ב- FOV. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B)היסטוגרמה מייצגת של המהירות של חוטי NM2b. הניתוח בוצע באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתוארת בטבלת החומרים. חוטי NM2b יחידים הם בעלי מהירות של 84 ± 22 ננומטר לשנייה (ממוצע ± סטיית תקן; מספר החלקיקים במעקב = 133), בעת תנועה לאורך חוטי אקטין בודדים. (C)kymograph לדוגמה של תנועת חוט NM2b לאורך חוט אקטין יחיד. שים לב כי חלק מהאזורים של החלקיק מראה "סיבוב" של חוט NM2b, לאורך חוט actin, אשר מייצג ככל הנראה את הזמן שבו צד אחד של חוט NM2b דו קוטבי מתנתק חוט actin, כפי שמוצג בעבר Melli et al.29. (D)FOV מייצג של תנועת המולקולה היחידה M5a-HMM (מוצג בירוק) על חוטי אקטין ביוטינילאט המסומנים ברודקמין-פאלואידין (מוצג באדום). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (E)היסטוגרמה מייצגת של אורך ריצה של M5a-HMM, מתאימה מעריכית אחת. הניתוח בוצע באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתוארת ברשימת החומרים. אורך הריצה האופייני הוא 1.3 מיקרומטר עם מרווח ביטחון של 95% של 1.23-1.42 מיקרומטר בדוגמה זו. (F)היסטוגרמה מייצגת של מהירות M5a-HMM מולקולה בודדת על חוטי אקטין יחידים. פלט נתונים מנותח מניתוח תמונה מראה מהירות ממוצעת של 668 ± 258 ננומטר לשנייה (ממוצע ± סטיית תקן; מספר החלקיקים במעקב = 684). (G)kymograph לדוגמה של מולקולות בודדות של תנועת M5a-HMM לאורך חוט אקטין יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: השוואה של NM2b ו- M5a-HMM הזזה אקטין אסתא. ה- NM2b גלישה אקטין אסאי תיל בוצעו בנוכחות מתיל צלולוז (משמאל; לוח וידאו A) ו- M5a-HMM בהיעדר מתיל צלולוז (מימין; לוח וידאו B) ב 30 °C (50 °F). שים לב כי חותמת הזמן מתקדמת מהר יותר בלוח הווידאו NM2b, בהשוואה ללוח הווידאו M5a-HMM כדי להציג את התנועה של חוטי actin המסומנים רודמין (אדום) זה בערך אותו הדבר. זאת מאחר ומהירות טרנסלוקציה בפועל של NM2b איטית פי 7 מזו של M5a-HMM (77 ננומטר לשנייה, לעומת 515 ננומטר לשנייה, בהתאמה, שחולצה מהפסגה הגאוסית שמתאימה להיסטוגרמה באיור 3). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר בשני לוחות הווידאו. נתוני NM2b שנרכשו ב 0.33 פריימים לשנייה עם חשיפה של 200 ms. נתוני M5a-HMM שנרכשו במהירות של 5 פריימים לשנייה עם חשיפה של 200 ms (רציף) ולאחר מכן נדגמו כלפי מטה למסגרת אחת לשנייה. חותמות זמן נוספו באמצעות התוסף המתואר ברשימת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 2: גלישה אקטין חוט בדיקה של NM2b בהיעדר methylcellulose. כאשר כל התנאים האחרים זהים למעט היעדר מתיל צלולוז, חוטי המעשה לפעמים לא נדבקים היטב לכיסוי מצופה 0.2 μM NM2b, מה שמוביל לסרטים באיכות נמוכה יותר עם חוטי אקטין "נופלים" קרוב לפני השטח של כיסוי מצופה NM2b. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. זה יכול להיפתר על ידי הצגת methylcellulose כדי להראות את התנועה החלקה של חוטי actin, כפי שמוצג בלוח הווידאו השמאלי של וידאו 1 (NM2b גלישה אקטין חוט asslament. חלופה נוספת היא להגדיל את ריכוז NM2b ל- ≈1 מיקרומטר. סרט זה נרכש ב 0.33 פריימים לשנייה עם חשיפה של 200 ms. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 3: השוואה של NM2b ו- M5a-הממ הפוך תנועתיות. בדיקת תנועתיות הפוכה NM2b בוצעה בנוכחות מתילצלולוז ונרשמה בקצב של 0.33 פריימים לשנייה עם שימוש בתריס (משמאל; לוח וידאו A), לוח וידאו C מציג את אותו FOV כמו A, אך עם חלקיקים מזוהים ומעקב באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. באופן דומה, מכון תנועתיות הפוך עבור M5a-HMM בהיעדר מתילצלוז נרשם בקצב של 5 פריימים לשנייה (מימין; לוח וידאו B). לוח וידאו D מציג את אותו FOV כמו B, אך עם חלקיקים שזוהו ומעקב באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר בכל לוחות הווידאו. שני הלייזרים הוחלפו הלוך ושוב עם שימוש במצלמה אחת לרכישה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

שם מאגר הרכב שלבים בשימוש הערות
מאגר חילוץ M5a 0.3 מ' נאקל 1.1 שמור על קרח.
15 מ"מ MOPS, pH 7.2
15 מ"מ MgCl2
1.5 מ"מ אגטה
4.5 מ"מ נאן3
מאגר חילוץ NM2b 0.5 מ' נאקל 1.1 שמור על קרח.
15 מ"מ MOPS, pH 7.2
15 מ"מ MgCl2
1.5 מ"מ אגטה
4.5 מ"מ נאן3
מאגר א' 0.5 מ' נאקל 2.2 שמור על קרח.
10 מ"מ MOPS, pH 7.2
0.1 מ"מ אגטה
3 מ"מ נאן3
1 מ"מ ATP
1 מ"מ DTT
5 מ"מ MgCl2
מאגר B 0.5 מ' נאקל 2.3 שמור על קרח.
10 מ"מ MOPS, pH 7.2
0.1 מ"מ אגטה
3 מ"מ נאן3
1 מ"מ DTT
מאגר אלוטיון 0.5 מ' נאקל 3.1 שמור על קרח.
פפטיד דגל מ"ג/מ"ל
10 מ"מ MOPS, pH 7.2
0.1 מ"מ אגטה
3 מ"מ נאן3
pH 7.2
מאגר דיאליזה M5a 500 מ"מ KCl 4.1 השתמש dH קר2O כדי להביא לנפח.
10 מ"מ MgCl2
10 מ"מ MOPS, pH 7.2
0.1 מ"מ אגטה
1 מ"מ DTT
מאגר דיאליזה NM2b 25 מ"ר נאקל 4.1 השתמש dH קר2O כדי להביא לנפח.
10 מ"מ MgCl2
10 מ"מ MOPS, pH 7.2
0.1 מ"מ אגטה
1 מ"מ DTT
מאגר אחסון NM2b 0.5 מ' נאקל 5.1 שמור על קרח.
10 מ"מ MOPS, pH 7.2
0.1 מ"מ אגטה
3 מ"מ נאן3

טבלה 1: מאגרים המשמשים לטיהור חלבונים.

שם מאגר קומפוזיציה (M5a) קומפוזיציה (NM2b) שלבים בשימוש (M5a/NM2b) הערות
מאגר תנועתיות פי 4 (4X MB) 80 mM MOPS, pH 7.2 80 mM MOPS, pH 7.2 מסנן ואקום ומאחסן ב- 4°C
20 מ"מ MgCl2 20 מ"מ MgCl2
0.4 מ"מ אגטה 0.4 מ"מ אגטה
pH 7.4 pH 7.4
חוצץ תנועתיות מלח 50 מ"מ (50 מ"ר) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB מסנן ואקום ומאחסן ב- 4°C
50 מ"מ-למול 50 מ"מ נאקל
העלה לנפח עם dH2O העלה לנפח עם dH2O
חוצץ תנועתיות מלח 500 מ"מ (500 מ"ר) N/A 25% v/v 4X MB מסנן ואקום ומאחסן ב- 4°C
500 מ"מ נקל
העלה לנפח עם dH2O
מיוסין 0.05-0.1 מיקרומטר מיוסין 0.2 מיקרומטר מיוסין 4.2/5.2 שמור על קרח.
1 מ"מ DTT 1 מ"מ DTT
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 500 מ"מ MB
אלבומין סרום בקר מ"ג/מ"ל (BSA) 1 מ"ג/מ"ל BSA 1 מ"ג/מ"ל BSA 4.3/5.3 שמור על קרח.
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 500 מ"מ MB
1 מ"מ DTT 1 מ"מ DTT
5 מיקרומטר F-actin ללא תווית ב 50 mM MB (אקטין שחור) 5 μM ללא תווית F-actin 5 μM ללא תווית F-actin 4.5/5.5 שמור על קרח. גיהה לפעולה על ידי צנרת למעלה ולמטה 5-10 פעמים, או באמצעות מזרק.
1 מיקרומטר קלמודולין (CaM) 1 מ"מ ATP
1 מ"מ ATP 0.2 מ"מ CaCl2
לדלל ב- 50 מ"מ MB 1 מיקרומטר קמט
1-10 nM מיוסין שרשרת אור קינאז (MLCK)
לדלל ב- 50 מ"מ MB
MB עם 1 mM DTT ו- 1 mM ATP 1 מ"מ DTT 1 מ"מ DTT 4.6/5.6 שמור על קרח.
1 מ"מ ATP 1 מ"מ ATP
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 50 מ"מ MB
MB עם DTT 1 מ"מ DTT 1 מ"מ DTT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 שמור על קרח.
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 50 מ"מ MB
20 ננומטר רודמין-פאלואידין F-actin (Rh-Actin) 20 ננומטר רודמין-פאלואידין F-actin 20 ננומטר רודמין-פאלואידין F-actin 4.8/5.8 שמור על קרח. אל תמערבולת.
1 מ"מ DTT 1 מ"מ DTT
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 50 מ"מ MB
מאגר סופי 50 מ"מ-למול 0.7% מתיל צלולוז (אופציונלי) 4.10/5.10 מוסיפים את הגלוקוז, גלוקוז אוקסידאז, קטלאז מיד לפני ביצוע הניסוי. שמור על קרח.
20 mM MOPS, pH 7.2 50 מ"מ נאקל
5 מ"מ MgCl2 20 mM MOPS, pH 7.2
0.1 מ"מ אגטה 5 מ"מ MgCl2
1 מ"מ ATP 0.1 מ"מ אגטה
50 מ"ר DTT 1 מ"מ ATP
1 מיקרומטר קלמודולין 50 מ"ר DTT
2.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז 1-10 nM MLCK
100 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז אוקסידאז 0.2 מ"מ CaCl2
40 מיקרוגרם/מ"ל קטליזה 1 מיקרומטר קלמודולין
2.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז
100 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז אוקסידאז
40 מיקרוגרם/מ"ל קטליזה

טבלה 2: מאגרים המשמשים בהזזת ישבן.

שם מאגר קומפוזיציה (M5a) קומפוזיציה (NM2b) שלבים בשימוש (M5a/NM2b) הערות
מאגר תנועתיות פי 4 (4X MB) 80 mM MOPS, pH 7.2 80 mM MOPS, pH 7.2 מסנן ואקום ומאחסן ב- 4°C
20 מ"מ MgCl2 20 מ"מ MgCl2
0.4 מ"מ אגטה 0.4 מ"מ אגטה
pH 7.4 pH 7.4
50 מ"מ מלח חוצץ תנועתיות (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB מסנן ואקום ומאחסן ב- 4°C
50 מ"מ-למול 50 מ"מ נאקל
העלה לנפח עם dH2O העלה לנפח עם dH2O
חוצץ תנועתיות מלח 150 מ"מ (150 מ"ר) 25% v/v 4X MB מסנן ואקום ומאחסן ב- 4°C
150 מ"ר נקל
העלה לנפח עם dH2O
מיוסין 30 ננומטר מיוסין ראה מתכון "חיץ סופי" /4.12 שמור על קרח.
1 מ"מ DTT
לדלל ב- 150 מ"מ MB
2 מ"ג/מ"ל נויטראבידין 2 מ"ג/מ"ל נויטראבידין 2 מ"ג/מ"ל נויטראבידין 3.5/4.8 שמור על קרח.
1 מ"מ DTT 1 מ"מ DTT
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 150 מ"מ MB
אלבומין סרום בקר מ"ג/מ"ל (BSA) 1 מ"ג/מ"ל BSA 1 מ"ג/מ"ל BSA 3.3/4.6 שמור על קרח.
1 מ"מ DTT 1 מ"מ DTT
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 150 מ"מ MB
200 ננומטר רודמין-פאלואידין ביוטינילאט F-actin (bRh-Actin) 200 ננומטר רודמין-פאלואידין ביוטינילאטן F-actin 200 ננומטר רודמין-פאלואידין ביוטינילאטן F-actin 3.7/4.10 הימנע גיזת על ידי לא מערבולת או צנרת למעלה ולמטה. כדי לערבב, הפוך בעדינות.
1 מ"מ DTT 1 מ"מ DTT
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 150 מ"מ MB
MB עם DTT 50 מ"ר DTT 50 מ"ר DTT 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 שמור על קרח.
לדלל ב- 50 מ"מ MB לדלל ב- 150 מ"מ MB
מאגר סופי 50 מ"מ-למול 0.7% מתיל צלולוז (אופציונלי) 3.9/4.14 מוסיפים את הגלוקוז, גלוקוז אוקסידאז, קטלאז מיד לפני ביצוע הניסוי. שמור על קרח.
20 mM MOPS, pH 7.2 50 מ"מ נאקל
5 מ"מ MgCl2 20 mM MOPS, pH 7.2
0.1 מ"מ אגטה 5 מ"מ MgCl2
1 מ"מ ATP 0.1 מ"מ אגטה
50 מ"ר DTT 1 מ"מ ATP
1 מיקרומטר קלמודולין 50 מ"ר DTT
2.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז 1-10 nM MLCK
100 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז אוקסידאז 0.2 מ"מ CaCl2
40 מיקרוגרם/מ"ל קטליזה 1 מיקרומטר קלמודולין
10 ננומטר מיוסין 2.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז
100 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז אוקסידאז
40 מיקרוגרם/מ"ל קטליזה

טבלה 3: מאגרים המשמשים בבחחון TIRF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מוצג כאן הוא זרימת עבודה עבור טיהור ואפיון במבחנה של מיוסין 5a ומיוסין לא 100b. קבוצה זו של ניסויים שימושית לכימות התכונות המכנוכימיות של מבנים מיוסין מטוהרים באופן מהיר ושחזורי. למרות שני המיוסין המוצגים כאן הם רק שתי דוגמאות ספציפיות מתוך האפשרויות הרבות, ניתן ליישם את התנאים והטכניקות, עם קצת תפירה, לרוב המיוסין ולחלבונים מוטוריים רבים אחרים.

הפרוטוקולים הנדונים כאן כפופים לשינויים בהתאם לצרכים האישיים של המעבדה והניסויים. לדוגמה, כפי שנדון בסעיף ביטוי וביולוגיה מולקולרית, החלבונים המשמשים במאמר זה נוצרו מזיהום משותף של שני וירוסים או יותר; עם זאת, ביטוי חלבון מוצלח יכול להיות מושגת גם עם וקטורים מרובי ביטויים כגון וקטור הבעה הכפול p-FastBac או מערכת הביטוי BiGBac53.

מספר גורמים יכולים לעכב את הייצור המוצלח של חלבון רקומביננטי. כדי למנוע ירידה בחלבון, זה הכרחי כי כל שלב של טיהור החלבון הושלם בטמפרטורה המתאימה, עם כל שלבי centrifugation המתרחשים ב 4 °C (70 °F) וכל השלבים האחרים המבוצעים על קרח. רצועות עודפות עשויות להיות גלויות בג'ל של מוצר החלבון המחויג. זה יכול להצביע על השפלה או זיהום. טיהור לאחר מכן באמצעות אי הכללת גודל או כרומטוגרפיה של חילופי יונית יכול לשפר את טוהר הדגימות54. לשם כך, מומלץ לשמור aliquots בכל שלב של תהליך טיהור החלבון לפתרון בעיות, אם יש תשואה נמוכה של מיוסין או חשד לזיהום חלבון. לפעמים, יכול להיות כריכה לקויה של lysate לשרף בשלב 1.8, אשר יכול לגרום לאובדן המיוסין לסופר-טבעי בצנטריפוגות הבאות. זה יכול להיפתר על ידי שינוי משך כריכת שרף במהלך שלב זה, אפילו להשאיר אותו לאגד לילה, במידת הצורך. זמני דגירה ארוכים יותר מציגים סיכון גדול יותר של השפלת חלבון אם פרוטאזים מזהמים אינם מעוכבים מספיק, ומיוצינים עם אזורים רגישים פרוטאוליטית יושפעו לרעה. בנוסף, שטיפה לא נכונה של השרף לפני ואחרי השימוש עלולה לגרום לתעופה של מוצר חלבון לא רצוי, ולכן חובה על הפרוטוקולים הנכונים לפני ואחרי השימוש בשרף זיקת FLAG. אם השרף נשטף מיד לאחר השימוש ומאוחסן כראוי, ניתן לעשות בו שימוש חוזר עד 20 פעמים.

חשוב לציין כי השפלת חלבון מתרחשת גם בשלב הביטוי וקיצור זמני הביטוי עשוי להיות יתרון במונחים של השפלה, אם כי זה יכול להיות על חשבון התשואה הכוללת. בעקבות ההליכים המתוארים כאן כדי לפקח על דגימת החלבון בשלבים שונים של הפרוטוקול (כלומר, לפני, במהלך ואחרי הטיהור) יעזור לקבוע את השלבים הדרושים לאופטימיזציה. עבור myosins המתנגדים שוב ושוב ביטוי מוצלח וטיהור, בעיות נפוצות יכולות להיות ביטוי משותף עם שרשראות אור לא מספיקות או לא הולמות, כמו גם קיפול לא תקין במהלך ביטוי יתר. יש לבחור שרשראות אור מתאימות על סמך אינטראקציות ידועות כאשר ניתן ויחסי שרשרת כבדים לשרשרת אור יש לבחון בניסויים בקנה מידה קטן כדי לקבוע את האופטימלי. עבור מיוסין כי לצבור או להניב מוצר פעיל מסיס מעט או לא, ביטוי משותף עם המלווים יכול לסייע בהצלחה להשיג חלבון פעיל54,55.

מוצרי מיוסין מטוהרים מכילים בהכרח אוכלוסייה קטנה של מיוסין פגום, המכונה "ראשים מתים", אשר ניתן לטפל בשתי דרכים. שיטה אחת, המתוארת בפרוטוקול זה, כוללת זרימה ללא תווית, או "שחור", לפעול דרך התא בפעולת ההזזה. לאחר מכן כביסה עם ATP גורמת myosins פונקציונלי להתנתק מן המעשין השחור בעוד ראשים מתים יישארו מחויבים זה actin ללא תווית בשל חוסר היכולת שלהם hydrolyze ATP ובשל הזיקה הגבוהה שלהם. בעת ביצוע שטיפת אקטין שחורה, מזרק יכול לשמש כדי לגנוז את המעשה ביעילות. גיזת נוספת יכולה להתבצע על ידי מערבולת, בתנאי שכל בועות התוצאה מוסרות על ידי צנטריפוגה. שיטה חלופית היא באופן סלקטיבי גלולה את הראשים המתים מדגם המיוסין על ידי ערבוב מיוסין עם F-actin ו- Mg-ATP בריכוזים מלח גבוה (0.5 M) משקעים בשולחן אולטרה צנטריפוגה העליון. myosins מסוגל הידרוליזה ATP בתנאים אלה אינם נשארים מחויבים actin בשל הזיקה הנמוכה שלהם actin בתנאי מלח גבוהים אלה נמצאים supernatant, בעוד הראשים המתים myosin להישאר מחויב actin ב גלולה56. באופן דומה, משקעים עם actin ו resuspension של הכדור יכול לשמש גם כדי להסיר מיוזינים אשר אינם מסוגלים מחייב לפעול בהיעדר ATP. שים לב כי חלק קטן מסוג זה של ראשים מתים תהיה פחות השפעה על סוגים אלה של עשייה. על ידי ביצוע משקעים ללא נוקלאוטידים והתחדשות ואחריו צנטריפוגה והתחדשות הקשורים ATP, מיוזינים המוכשרים הן לשחרור מחייב actin והן לשחרור תלוי ATP מ actin ניתן לבודד.

ניתן גם לשנות את בחינות תנועתיות במספר דרכים. לדוגמה, ב- aliding actin filament בחן עבור NM2b, NM2b הוא זרחן בתא באמצעות תוספת של MLCK, calmodulin, סידן, ו- ATP בשלב אקטין שחור, כמו גם במאגר הסופי. עם זאת, NM2b יכול גם להיות זרחן בצינור, לפני ביצוע ההסתה. על ידי כך, אחוז NM2b זרחן ניתן לכמת על ידי הפעלת ג'ל מקומי עם חוצץ מדגם המכיל אוריאה או ביצוע ספקטרומטר מסה57,58. ניתן לחקור גם את השפעת הטמפרטורה על פעילות מיוסין. זה יכול להתבצע על ידי שימוש במערכת חימום אובייקטיבית על המיקרוסקופ או מארז סביבתי, כך תא הזרימה נשמר בטמפרטורה קבועה. כוח יוני הוא שיקול חשוב נוסף. עבור מיוזינים רבים, זיקה actin ופעילות אנזימטית יוגברו בעוצמה יונית נמוכה יותר; עבור אחרים, כוח יוני גבוה יותר הוא הכרחי59. בנוסף למתן מידע בעל ערך על מנגנון המיוסין, הורדת הכוח היוני יכולה לשפר את תנועתיות ולהפוך את המיוסין לנגיש יותר לחקירה עם בדיקות רבות. לעומת זאת, מנועים מסוימים יציגו אפקטים של קשירה אלקטרוסטטית, אשר יאטו את תנועתיות בעוצמות יוניות נמוכות יותר. לבסוף, כאשר בוחנים את התנועה של חוטי NM2b, זה חיוני כדי לשמור על כוח יוני בטווח צר (150-200 mM כוח יוני), קירוב אלה שנמצאו ברוב סוגי התאים. השימוש בעוצמות יוניות נמוכות יותר גורם לצבירה של חוטי מיוסין, בעוד הסיבים depolymerize בעוצמות יוניות גבוהות יותר.

עם מיוסין רבים, במיוחד אלה עם יחסי חובה נמוכים, התנאים של המאגר הסופי שניתן עבור M5a יגרום חוטי actin מתויג פלואורסצנטי להיות קשור רק באופן רופף אל פני השטח או ניתוק לחלוטין. התוצאה היא תנועות לא יציבות שמסבך את ההסמכה. לעתים קרובות ניתן להשיג תנועה באיכות טובה יותר באמצעות מתילצלולוז (0.7%) במאגר הסופי. Methylcellulose הוא סוכן צפיפות צמיג וכוחות חוטי actin להישאר קרוב לפני השטח גם כאשר הצפיפות של מנועי מיוסין מחוברים היא דלילה60. באופן דומה, נצפתה כי הכללת methylcellulose במאגר הסופי של אסת תנועתיות חוט יחיד יש צורך לצפות בתנועה עם NM2a, ואותה תופעה דווחה על חוטי מיוזין שריר חלק29,61. זה גם מגביר את העיבוד של חוטי NM2b. תופעת לוואי אחת לא רצויה של שימוש methylcellulose בבחינה זו היא כי תכונות סוכן צפיפות יכול לקדם את הקשר לרוחב של חוטי מיוסין לתוך חבילות. חלופות methylcellulose בעת פתרון בעיות חוסר תנועה או חוטי actin מאוגדים באופן רופף ב- aliding actin חוט asslament הם כדי להפחית את ריכוז המלח במאגרי תנועתיות או כדי להגדיל את צפיפות פני השטח myosin. כאמור לעיל, כוח יוני גבוה במאגרי תנועתיות הוכח כדי להוריד את היכולת של כמה מיוזינים להיקשר actin29,34,62.

וריאציה נוספת של בדיקה חוט אקטין הזזה היא השימוש בנוגדנים כדי לעגן את המיוסין על כיסוי הזכוכית. לדוגמה, אם GFP קיים בקצה מסוף C של מבנה המיוסין, נוגדן אנטי GFP יכול לשמש כדי לתקן את GFP-myosin כדי כיסוי36,63,64. זה יכול לסייע בהשגת תנועתיות מוצלחת במצבים שבהם הגיאומטריה של המערכת עלולה אחרת לעכב טרנסלוקציה actin, כגון במקרה של בדיקת זרועות ידית מלאכותית או קצרה54,64. בנוסף, ההשפעה של עומס על מהירויות טרנסלוקציה ניתן לחקור את הבדיקה חוטי אקטין הזזה על ידי שימוש בחלבונים מחייבים actin כגון α-actinin או utrophin39,50,65. מדידה כזו יכולה להיות שימושית כדי להשוות את ההשפעה של עומס על הרכב של מיוסין לעומת קינטיקה תלוית עומס של מיוסין יחיד שניתן למדוד באמצעות מלכודת אופטית assay66,67. זה יכול להתבצע על ידי הוספת כמויות הולכות וגדלות של חלבון מחייב actin יחד עם המיוסין בשלב הראשוני. החלבון מחייב actin נקשר לפני השטח ומפעיל עומס חיכוך על חוטי actin כי הם מועברים על ידי מיוזינים, אשר גורם במהירות מדורגת כמו הריכוז של חלבון מחייב actin על פני השטח גדל39.

ניתן להתאים את המולקולה/אנסמבל התנועתיות היחידה גם כדי לחקור את ההשפעה של מבני אקטין שונים על תנועת מיוסין. לדוגמה, במקום להתבונן בתנועת המיוסין על גבי חוטי אקטין יחידים, חבילות אקטין פשיסטיות או α-אקטינין ניתן ללמוד כפעולה במבחנה של רשת חוטי actin שנמצאה בתאים68,69. ההשפעה של חלבונים מחייבים actin כגון tropomyosin ניתן לחקור גם65,70,71,72.

ראוי לציין את הרבגוניות בבחירת תווית לבדיקת תנועתיות מולקולה/הרכב יחיד. בדוח זה, נעשה שימוש בתווית GFP הן ב- M5a-HMM והן ב- NM2b; עם זאת, ניתן להשתמש בתוויות רבות אחרות. דוגמאות כוללות HaloTag או SNAP-tag, אשר ניתן להתמזג גנטית myosin ולקשור קוולנטיות צבע סינתטי. היתרון של טכנולוגיית HaloTag טמון הרבגוניות שלה עבור מספר התאמות ניסיוניות, כגון תיוג עם צבעים שונים או הוספת תג זיקה ביוטין29,73. בנוסף, ניתן להשתמש בטכנולוגיית נקודות קוונטיות כדי לשפר את הרזולוציה של מעקב פלואורסצנטיות של מולקולה בודדת, אשר מתייחס גם להגבלת הבהירות הנמוכה של GFP ולנטייה להלבנה74. תגיות ניתן לצרף בהצלחה לרשתות אור, כמו גם שרשרת כבדה11,75,76.

להשגת הצלחה במולקולה אחת TIRF תנועתיות, גורם מפתח הוא באמצעות משטח חסום היטב פונקציונלי. שיטה פשוטה להשגת חסימה מתונה היא להשתמש ביוטינילאט-BSA מאוגד משטח ניטרוצלולוז. למרות שזה יעבוד מספיק טוב כדי לאפיין מנועים רבים, כולל M5a, רמת הכריכה הלא-מדעית על משטח כזה אסורה לשחזור תנועה נקייה עם דגימות כגון NM2b. פריצת דרך מרכזית בהקשר זה הייתה המעבר למשטחי PEGylated מסוממים עם ביוטין-PEG לפונקציונליזציה77. משטחי PEG מספקים רמה עדיפה בהרבה של חסימת פני השטח ומשטח PEGylated ללא פגמים יכול להישאר ללא כריכה לא-מדעית לפרקי זמן ארוכים מאוד. הפרוטוקול הספציפי המפורט כאן מאפשר ייצור של משטחי PEG ביוטינילאטים בתוך שעות ואם מאוחסנים מיד כמתואר, המשטחים יכולים לשמש במשך מספר שבועות עם ירידה שולית בלבד באיכות.

שיקול מרכזי לפני איסוף נתונים למעקב הוא קצב הפריימים של הרכישה. התנועה בין המסגרות הבאות חייבת להיות גדולה מספיק כדי למנוע שגיאות דגימת יתר. שיעורי דגימה גבוהים יניבו מהירויות מוערמות יתר עקב חלוקת שגיאות לוקליזציה במרווח זמן קטן ויגדילו את השגיאה המסתמנת של המדידה. במקרים שבהם הנתונים הגולמיים נדגמים דק מדי, ניתן לדגום את הנתונים כלפי מטה על-ידי לקיחת כל מסגרת Nth כדי ליצור מחסנית חדשה ובהתחשב בשינוי בקצב הפריימים הנובע מכך. יש להימנע מתנועות תת-פיקסל בין מסגרות ותנועות של כמה מאות ננומטרים נדרשות כדי להשיג ערכים מדויקים. בכל המקרים שבהם מדגם חדש מאופיין, יש להשוות את התוצאות שנוצרו על ידי ניתוח אוטומטי לסט נתונים קטן של חוטים במעקב ידני לעקבות.

בעת ניתוח נתונים מניסויי תנועתיות של מולקולה בודדת, יש לנקוט זהירות בעת בחירת הפרמטרים למדוד, כיצד לסנן נתונים וכיצד להתאים נתונים. כאמור לעיל, קצב הדגימה יכול להיות גורם חשוב בעת ניתוח נתוני מהירות. עבור מיוסין רבים, ריצות תהליכיות יהיו קצרות ומוערות היטב על ידי קו ישר. במקרים כאלה, התחלה עד מרחק נקודת הקצה של המסלול עשוי לספק מידה טובה של אורך הריצה וזה יכול להיות מחולק על ידי משך המסלול כדי להניב אומדן טוב של מהירות. במקרים שבהם המסלולים ארוכים מאוד ועוקבים אחר נתיבים מעוקלים סביב חוטים מכופפים, ניתוח מסוג זה יניב תוצאות לא מדויקות ויש להשתמש במרחק כולל של נסיעה, תוך שימוש בקצב רכישה המאפשר לנקודות לוקליזציה עוקבות להיות מרווחות מספיק כדי למנוע שגיאות דגימת יתר כמתואר לעיל, תוך קרבה מספיק זו לזו כי מרחק הקו הישר ביניהם נשאר קירוב טוב של העקומה בין נקודות אלה. בנוסף, עבור חלבונים מוטוריים עם אורכי ריצה ארוכים ביחס לאורך המסלול, יש לבצע סטטיסטיקות נוספות כגון אומדן קפלן-מאייר בעת חישוב אורכי ריצה78. הדבר נכון גם לגבי מצבים שבהם סבירות מספקת להלבנה לפני תום תהליך. תופעה נוספת שניתן לראות במחקרי פלואורסצנטיות של מולקולה אחת היא פוטובלינקינג, שבו פלואורופורים עוברים במהירות בין מצב ההפעלה והכיבוי ונראה שהם ממצמצים. זה בדרך כלל לא קורה בניסויים תנועתיות אלה; עם זאת, אם זה קורה, ניתן להקטין את עוצמת הלייזר ואת זמני החשיפה אשר אמור למזער את ההשפעה. מספר כימיקלים, כולל β-mercaptoethanol, Trolox, ציקלוקטטריין, n-פרופיל גלאט, 4-אלכוהול ניטרבנזיל, ו 1,4-דיאזאביציקלו[2.2.2]אוקטן ניתן להשתמש כדי למתן את זה גם79.

לסיכום, מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים כי הם חזקים ביכולתם לכמת תכונות mechanochemical כגון מהירות טרנסלוקציה actin, מהירות טרנסלוקציה מיוסין, ואורך ריצה מיוסין. בדיקות אלה ניתנות לשחזור וניתן להשתמש בהן כדי לקבוע את איכות המיוסין המטוהר גם במצבים שבהם המאפיינים הססיפים אינם המטרה הסופית הספציפית של המחקר. בנוסף, שינויים כגון pH, טמפרטורה, ורגולטורים כימיים ניתן להציג בדיקות אלה כדי לבחון כיצד המכנוכימיה של מיוסין הנחקר מושפע. יחד, אקטין גלישה ובוחנות תנועתיות הפוכות יכול לאפשר הבנה טובה יותר של התנהגות אנסמבל myosin וריאציות בין מולקולרי במכניקה מוטורית מולקולרית וקינטיקה. בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות המתוארות כאן תומכות בגישה של רדוקציוניסט למחקר ציטו ושלד ויכולות להיות כלי רב עוצמה להבנת הדינמיקה של חלבון-חלבון במבחנה. יחד, נתונים שנאספו מניסויים מבוקרים אלה יכולים לשמש כדי לייעץ mechanobiologists של התנהגויות actomyosin מפתח שעשוי להיות רלוונטי ברמה הביולוגית של התא, ומעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר פאנג ג'אנג על הסיוע הטכני בהכנת ריאגנטים המשמשים לאיסוף נתונים אלה. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-רחמית NHLBI/NIH מממנת את HL001786 ל- J.R.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032 (2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903 (2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936 (2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554 (2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Tags

ביוכימיה גיליון 168 מיוסין חוטי אקטין טיהור חלבונים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בדיקת תנועתיות בדיקת מולקולה אחת חוטים דו קוטביים מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של השתקפות פנימית כוללת
התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J.… More

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter