Summary
Dieses Protokoll stellt ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bewertung der Rolle eines Proteins mit uncharakterisierter Funktion bei der alternativen Spleißregulation nach chemotherapeutischer Behandlung dar.
Abstract
Die mRNA-Verarbeitung umfasst mehrere gleichzeitige Schritte, um mRNA für die Translation vorzubereiten, wie z. B. 5'Capping, Poly-A-Addition und Spleißen. Neben dem konstitutiven Spleißen ermöglicht das alternative mRNA-Spleißen die Expression multifunktionaler Proteine aus einem Gen. Da Interkonomstudien in der Regel die erste Analyse für neue oder unbekannte Proteine sind, ist die Assoziation des Köderproteins mit Spleißfaktoren ein Hinweis darauf, dass es am mRNA-Spleißprozess teilnehmen kann, aber zu bestimmen, in welchem Kontext oder welche Gene reguliert werden, ist ein empirischer Prozess. Ein guter Ausgangspunkt, um diese Funktion zu evaluieren, ist die Verwendung des klassischen Minigene-Tools. Hier stellen wir die adenovirale E1A-Minigenverwendung zur Bewertung der alternativen Spleißveränderungen nach verschiedenen zellulären Stressreizen vor. Wir untersuchten das Spleißen von E1A-Minigen in HEK293, das das Nek4-Protein nach verschiedenen Stressbehandlungen stabil überexprimiert. Das Protokoll umfasst E1A-Minigentransfektion, Zellbehandlung, RNA-Extraktion und cDNA-Synthese, gefolgt von PCR- und Gelanalyse und Quantifizierung der E1A-Spleißvarianten. Der Einsatz dieser einfachen und etablierten Methode in Kombination mit spezifischen Behandlungen ist ein zuverlässiger Ausgangspunkt, um zelluläre Prozesse zu beleuchten oder welche Gene durch mRNA-Spleißen reguliert werden können.
Introduction
Das Spleißen gehört zu den wichtigsten Schritten in der eukaryotischen mRNA-Verarbeitung, die gleichzeitig mit dem 5'mRNA-Capping und der 3'mRNA-Polyadenylierung erfolgt, bestehend aus Intronentfernung gefolgt von Exon-Junction. Die Erkennung der Spleißstellen (SS) durch das Spleißosom, einen Ribonukleoproteinkomplex, der kleine Ribonukleoproteine (snRNP U1, U2, U4 und U6), kleine RNAs (snRNAs) und mehrere regulatorische Proteine1 enthält, ist für das Spleißen notwendig.
Neben der Intronentfernung (konstitutives Spleißen) können in Eukaryoten Introns zurückgehalten und Exons ausgeschlossen werden, wodurch der Prozess namens mRNA Alternatives Spleißen (AS) konfiguriert wird. Das alternative Pre-mRNA-Spleißen erweitert die Kodierungskapazität eukaryotischer Genome und ermöglicht die Produktion einer großen und vielfältigen Anzahl von Proteinen aus einer relativ kleinen Anzahl von Genen. Es wird geschätzt, dass 95-100% der menschlichen mRNAs, die mehr als ein Exon enthalten, einem alternativen Spleißenunterzogenwerden können2,3. Dies ist grundlegend für biologische Prozesse wie neuronale Entwicklung, Apoptose-Aktivierung und zelluläre Stressreaktion4, die dem Organismus Alternativen zur Regulierung der Zellfunktion mit dem gleichen Repertoire an Genen bieten.
Die für das alternative Spleißen erforderliche Maschine ist die gleiche, die für das konstitutive Spleißen verwendet wird, und die Verwendung des SS ist die Hauptdeterminante für das Auftreten alternativer Spleißen. Konstitutives Spleißen ist mit der Verwendung von starken Spleißstellen verbunden, die in der Regel Konsensmotiven für die Spleißosomerkennung ähnlicher sind5.
Alternative Exons werden typischerweise weniger effizient erkannt als konstitutive Exons, sobald ihre cis-regulatorischenElemente, die Sequenzen in 5'SS und 3'SS, die diese Exons flankieren, eine geringere Bindungskapazität an das Spleißosom aufweisen. mRNA enthält auch Regionen namens Enhancer oder Schalldämpfer, die sich in Exons (Exonic Splicing Enhancers (ESEs) und Exonic Splicing Silencers (ESSs)) und Introns (Intronic Splicing Enhancers (ISEs) und Intronic Splicing Silencers (ISSs)) befinden, die die Exonnutzung verbessern oder unterdrücken, bzw.5. Diese Sequenzen werden durch transregulatorische Elemente oder Spleißfaktoren (SF) erkannt. SFs werden hauptsächlich durch zwei Proteinfamilien repräsentiert, die Serin/Arginin-reichen Spleißfaktoren (SRSFs), die an ESEs binden, und die Familie der heterogenen nuklearen Ribonukleoproteine (hnRNPs), die an ESS-Sequenzen binden5.
Alternatives Spleißen kann durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung von Transfaktoren moduliert werden, wodurch die Interaktionspartner und die zelluläre Lokalisation der Spleißfaktoren6,7,8modifizieren. Die Identifizierung neuer Regulatoren von Spleißfaktoren kann neue Werkzeuge zur Regulierung des Spleißens und folglich einiger Krebsbehandlungen bieten.
Anufrieva et al. 9 beobachteten ineinemmRNA-Microarray-Genexpressionsprofil konsistente Veränderungen der Spiegel spleißosomaler Komponenten in 101 Zelllinien und nach verschiedenen Stressbedingungen (platinbasierte Medikamente, Gammabestrahlung, Topoisomerase-Inhibitoren, Tyrosinkinase-Inhibitoren und Taxane). Der Zusammenhang zwischen Spleißmuster und Chemotherapie-Wirksamkeit wurde bereits in Lungenkrebszellen nachgewiesen, die chemotherapieresistent sind und Veränderungen in der Caspase-9-Variantenrate10zeigen. HEK293-Zellen, die mit Chemotherapeutika behandelt wurden, zeigen Veränderungen beim Spleißen mit einer Zunahme pro-apoptotischer Varianten. Gabriel et al.11 beobachteten Veränderungen bei mindestens 700 Spleißereignissen nach Cisplatin-Behandlung in verschiedenen Zelllinien und weisen darauf hin, dass Spleißwege cisplatin-beeinflusst sind. Spleißmodulatoren haben bereits eine antitumorale Aktivität gezeigt und gezeigt, dass das Spleißen für die Tumorentwicklung und vor allem für das Ansprechen auf die Chemotherapie wichtig ist12. Daher ist die Charakterisierung neuer Proteine, die das Spleißen nach zellulären Stressoren wie Chemotherapeutika regulieren, sehr wichtig, um neue Behandlungsstrategien zu entdecken.
Die Hinweise auf alternative Spleißregulation aus Interaktomstudien, die besonders wichtig sind, um Funktionen neuer oder uncharakterisierter Proteine zu charakterisieren, können einen allgemeineren und einfacheren Ansatz erfordern, um die tatsächliche Rolle des Proteins bei AS zu überprüfen. Minigenes sind wichtige Werkzeuge für die Analyse der allgemeinen Rolle eines Proteins, das die Spleißregulation beeinflusst. Sie enthalten Segmente aus einem interessierenden Gen, das alternativ gespleißte und flankierende genomische Regionen13enthält. Die Verwendung eines Minigen-Tools ermöglicht die Analyse des Spleißens in vivo mit mehreren Vorteilen, wie z. B. der Länge des Minigens, die geringfügig ist und daher keine Beschränkung auf die Amplifikationsreaktion darstellt; das gleiche Minigen kann in verschiedenen Zelllinien bewertet werden; alle zellulären Komponenten, hauptsächlich ihre regulierende post-translationale Modifikation (Phosphorylierung und Veränderungen in Zellkompartimenten) vorhanden sind und angesprochen werden können13,14. Darüber hinaus können Veränderungen des alternativen Spleißmusters nach zellulärem Stress beobachtet werden und die Verwendung eines Minigensystems ermöglicht es, den durch verschiedene Reize modulierten Signalweg zu identifizieren.
Es gibt bereits mehrere Minigensysteme, die spezifisch für verschiedene Arten von Spleißereignissensind 13,14,jedoch ist das Minigen E1A15 als vorläufiger Assay ein sehr gut etabliertes alternatives Spleiß-Reportersystem für die Untersuchung der 5'SS-Selektion in vivo. Aus nur einem Gen, E1A, werden fünf mRNAs durch alternatives Spleißen erzeugt, basierend auf der Auswahl von drei verschiedenen 5' Spleißstellen und einer großen oder einer kleineren 3' Spleißstelle16,17,18. Die Expression von E1A-Varianten ändert sich entsprechend der Periode der adenoviralen Infektion19,20.
Wir haben bereits gezeigt, dass beide Nek4-Isoformen mit Spleißfaktoren wie SRSF1 und hnRNPA1 interagieren, und während Isoform 2 das Minigen E1A alternative Spleißen ändert, hat Isoform 1 keine Wirkung in diesem21. Da Isoform 1 die am häufigsten vorkommende Isoform ist und die Chemotherapieresistenz und die DNA-Schadensreaktion verändert, bewerten wir, ob sie das alternative Spleißen des Minigens E1A in einem Stresszustand verändern könnte.
Der Minigene-Assay ist eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode, da er nur RNA-Extraktion, cDNA-Synthese, Amplifikation und Agarose-Gel-Analysen benötigt und ein nützliches Werkzeug sein kann, um eine mögliche Wirkung auf das alternative Spleißen durch ein Protein von Interesse bis zur Wirkung verschiedener Behandlungen auf das zelluläre alternative Spleißmuster zu bewerten.
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Protocol
1. Beschichtungszellen
HINWEIS: In diesem beschriebenen Protokoll wurden HEK293 stabile Zelllinien, die zuvor für eine stabile induzierbare Expression von Nek4 erzeugtwurden, 21verwendet, jedoch ist das gleiche Protokoll für viele andere Zelllinien geeignet, wie HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5Y29. Das Expressionsmuster von Minigen-E1A-Isoformen unter basalen Bedingungen variiert zwischen diesen Zellen und sollte für jede Bedingung charakterisiert werden. Dieses Protokoll ist nicht auf stabile Zelllinien beschränkt. Der gebräuchlichste Ansatz bei der Bewertung von Kandidatenproteinen ist die vorübergehende Co-Transfektion der Erhöhung seiner Menge mit einer festen Menge des Minigens. Das gleiche Protokoll eignet sich für Knockout-Zellen.
- Plattenzellen unter Berücksichtigung von Fahrzeug-, nicht-transfizierten und GFP-Kontrollen.
- Kultur-HEK293-Zellen mit stabiler Expression des interessierenden Gens in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 4,5 g/L Glucose, 4 mM L-Glutamin und halten mit 100 μg/ml Hygromycin B, auf gewebekulturbehandelten Platten bei 37 °C in 5% CO2 und einer befeuchteten Atmosphäre.
- Splitten Sie Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA. Platte 3 x 105 Zellen in 6-Well-Platten und inkubieren Sie sie für 24 h bei 37 °C in 5% CO2.
HINWEIS: Für die Transfektion müssen die Zellen zu 70-80% konfluent sein, um den Zelltod nach der Transfektion zu verringern.
2. Zelltransfektion
HINWEIS: Hier wurden 1-2 μg pMTE1A-Minigenplasmid verwendet, jedoch muss die DNA-Menge sowie der Zeitpunkt der Expression minimal gehalten werden, um Toxizität zu vermeiden. Zum Beispiel wurde eine hohe Toxizität in HeLa-Zellen nach 30 h Transfektion mit 1 μg pMTE1A-DNA beobachtet. Für die hier beschriebene Transfektion wurde ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz verwendet
- Überprüfen Sie die Zellkonfluenz 24 h nach der Beschichtung und transfizieren Sie HEK293 stabile Zellen nur, wenn 70-80% konfluent sind.
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium vorsichtig mit einer Pipette, anstatt ein Vakuumpumpensystem zu verwenden. Dann fügen Sie vorsichtig 2 ml vollständiges DMEM-Medium ohne Antibiotika hinzu und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
- Bereiten Sie ein Röhrchen mit dem Transfektionspuffer (200 μL / Well) vor, fügen Sie 2 μg pMTE1A DNA, Wirbel und dann 2 μL Transfektionsreagenz hinzu. Erneut Wirbel und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und fügen Sie die Transfektionsmischung vorsichtig tropfenweise hinzu.
- Zu HEK293 stabilen Zellen Tetracyclin (0,5 μg/ml) für die Nek4-Expressionsinduktion 6 h nach der Transfektion hinzufügen. Ein Medienwechsel ist nicht notwendig.
HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Volumina/Beträge beziehen sich auf eine Vertiefung. Bereiten Sie die Mischung für alle im Experiment verwendeten Vertiefungen im selben Röhrchen vor. - Bereiten Sie eine Vertiefung zur Transfizierung mit EGFP oder ein anderes Fluorophor, das Plasmid exprimiert, vor, um die Transfektionseffizienz abzuschätzen. Bessere Ergebnisse können mit einer Transfektionseffizienz von mindestens 40% beobachtet werden, aber zuvor wurden gute Leistungen mit geringerer Transfektionseffizienz beobachtet.
- Bei der Verwendung von Co-Transfektion (Interessenprotein und Minigen) halten Sie einen Brunnen mit nicht transfizierten Zellen, um Ergebnisse aus endogener mRNA zu vermeiden. Bei E1A exprimieren HEK293-Zellen bereits das E1A-Gen30.
3. Vorbereitung der Medikamente
HINWEIS: Der Zeitpunkt und die Konzentration der Behandlung wurden auf der Grundlage von Literaturergebnissen ausgewählt, die auf Veränderungen im alternativen Spleißen für einige Gene hinweisen.
- Führen Sie vor Beginn des Assays eine Dosis-Wirkungs-Kurve durch, um die minimale Konzentration zur alternativen Spleißinduktion ohne Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen.
- Bereiten Sie eine Paclitaxel-Stammlösung bei einer Konzentration von 5 mM in Ethanol vor. Die Endkonzentration beträgt 1 μM. Bei -20 °C halten. Verwenden Sie 0,02% Ethanol als Fahrzeugkontrolle.
- Eine Cisplatinlösung wird durch Verdünnen in 0,9% NaCl bei etwa 0,5 mg/ml (1,66 mM) zubereitet. Vor Licht, Wirbel schützen und im Thermalbad bei 37 °C 30 min inkubieren. Die Endkonzentration beträgt 30 μM. Frisch vorbereiten oder bei 2-10 °C bis zu einem Monat lagern.
HINWEIS: Alle Medikamente müssen vor lichtgeschützt werden.
4. Zellbehandlung und -sammlung
HINWEIS: HEK293 stabile Zellen wurden 48 h nach der Transfektion gesammelt und dafür 24 h nach der Transfektion behandelt, da das höchste Nek4-Expressionsniveau innerhalb von 48 h erreicht wird. Zu diesem Zeitpunkt wurden jedoch hohe Konzentrationen der 13S-Isoformexpression (bis zu 90%) beobachtet. Um den Anteil der 13S-Isoform zu verringern, versuchen Sie, Zellen 30 h nach der Transfektion maximal zu behandeln und zu sammeln.
- Verwenden Sie RNA / DNase-freie Spitzen und Röhrchen. Führen Sie eine vollständige RNA-Extraktion mit Phenol-Chloroform-Reagenz gemäß der Empfehlung des Herstellers durch.
- Überprüfen Sie 24 Stunden nach der Transfektion die Zellmorphologie und Transfektionseffizienz mit einem Fluoreszenzmikroskop.
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium, vorzugsweise mit einer Pipette anstelle eines Vakuumpumpensystems. Dann fügen Sie Zellkulturmedium mit den Chemotherapeutika in der zuvor beschriebenen Endkonzentration hinzu.
- Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für 18 - 24 h.
- Sammeln Sie RNA, indem Sie das Zellkulturmedium in einem Behälter entsorgen und 0,5 - 1 ml RNA-Extraktionsreagenz direkt in den Brunnen geben. Wenn Vertiefungen sehr konfluent sind, verwenden Sie 1 ml RNA-Extraktionsreagenz, um die RNA-Qualität zu verbessern.
- Mit der Pipette homogenisieren und in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr überführen. An dieser Stelle kann das Protokoll durch Lagerung von Proben bei -80 °C pausiert oder sofort mit der RNA-Extraktion fortfahren.
WARNUNG: Das phenolbasierte RNA-Extraktionsreagenz ist giftig und alle Verfahren sollten in einem chemischen Abzug durchgeführt und die Rückstände ordnungsgemäß entsorgt werden.
5. RNA-Extraktion und cDNA-Synthese
- In einem Abzug die Proben auftauen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 0,1 -0,2 ml Chloroform hinzu und rühren Sie kräftig.
- 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifuge für 15 min bei 12.000 x g und 4 °C.
- Sammeln Sie die obere wässrige Phase und geben Sie sie in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenrohr über. Sammeln Sie etwa 60% des Gesamtvolumens; Sammeln Sie jedoch nicht die DNA oder die organische (untere) Phase.
- Fügen Sie 0,25 - 0,5 ml Isopropanol hinzu und rühren Sie durch Inversion 4 mal. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min, bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie das RNA-Pellet zweimal mit Ethanol (75% in Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser). Zentrifugieren Sie bei 7.500 x g für 5 min und entsorgen Sie das Ethanol.
- Entfernen Sie überschüssiges Ethanol, indem Sie das Rohr auf einem Handtuchpapier umkehren und lassen Sie das Rohr dann in einem Abzug offen, um das Pellet für 5 - 10 minuten teilweise zu trocknen.
- Resuspend das RNA-Pellet in 15 μL DEPC-behandeltem Wasser.
- Quantifizieren Sie die Gesamt-RNA mithilfe der Absorption bei 230 nm, 260 nm und 280 nm, um die RNA-Qualität zu überprüfen.
- Um die Gesamt-RNA-Qualität zu überprüfen, führen Sie ein 1% iges Agarosegel vorbehandelt mit 1,2% (v / v) einer 2,5% igen Natriumhypochloritlösung für 30 min31.
- Führen Sie die cDNA-Synthese mit 1-2 μg Gesamt-RNA durch.
- Pipetten Sie RNA, 1 μL Oligo-dT (50 μM), 1 μL dNTP (10 mM) und bilden Sie das Volumen auf 12 μL mit nukleasefreiem Wasser. Im Thermocycler 5 min bei 65 °C inkubieren.
- Proben aus dem Thermocycler entfernen, um abzukühlen und die Reaktionsmischung vorzubereiten: 4 μL Reverse Transkriptase-Puffer, 2 μL Dithiothreitol (DTT) und 1 μL Ribonuklease-Inhibitor. Bei 37 °C 2 min inkubieren.
- Fügen Sie 1 μL thermostabile Reverse Transkriptase hinzu. 50 min bei 37 °C inkubieren und das Enzym bei 70 °C für 15 min inaktivieren.
HINWEIS: Der cDNA kann mehrere Wochen bei -20 °C gelagert werden. Führen Sie eine Nicht-Reverse-Transkriptase-Kontrolle (NRT) für genomische Kontamination durch mutmaßliche Diskriminierung von Intron-Retentionsereignissen durch.
6. pMTE1A Minigen PCR
- Führen Sie eine PCR mit der Reaktionszusammensetzung (1,5 mMMgCl2,0,3 mM dNTP-Mischung, 0,5 μM jeder Grundierung, 2,5 U einer Heißstart-Taq-Polymerase und 150 ng cDNA) unter folgenden Bedingungen durch:
94 °C für 2 min, 29 Zyklen von: 94 °C für 1 min, 50 °C für 2 min, 72 °C für 2 min, 72 °C für 10 min. - 20-25 μL des PCR-Produkts in ein 3%iges Agarosegel mit Nukleinsäurefleck laden und bei 100 V ca. 1 h laufen lassen.
7. Analyse des Gels mit einer Bildverarbeitungs- und Analysesoftware32
- Fotografieren Sie nach dem Lauf das Gel (mit einem Gel-Imaging-Erfassungssystem), vermeiden Sie eine Bandsättigung und quantifizieren Sie die Bänder mit einer Bildverarbeitungssoftware.
- Zur Quantifizierung betrachten Sie die Bänder bei ~631 bp, ~493 bp und ~156 bp, um den Isoformen 13S, 12S und 9S zu entsprechen.
- Öffnen Sie im Menü Datei der Software die Bilddatei, die Sie vom Bilderfassungssystem erhalten haben. Konvertieren Sie in Graustufen, passen Sie Helligkeit und Kontrast an und entfernen Sie bei Bedarf Ausreißerrauschen.
- Zeichnen Sie mit dem Rechteckauswahl-Werkzeug ein Rechteck um die erste Spur und wählen Sie es über die analyse | Gele | Wählen Sie den Befehl Erste Spur oder drücken Sie die Tastenkombination dafür.
- Klicken und halten Sie mit der Maus in der Mitte des Rechtecks auf der ersten Spur und ziehen Sie es auf die nächste Spur. Gehe zu | analysieren Gele | Wählen Sie Nächste Spuraus, oder drücken Sie die verfügbare Verknüpfung. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle verbleibenden Fahrspuren.
- Nachdem alle Fahrspuren hervorgehoben und nummeriert sind, gehen Sie zu Analysieren | Gele | Plot Lanes, um ein Profildiagramm für jede Lane zu zeichnen.
- Zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug "Gerade Linie" eine Linie über die Basis jedes Peaks, die jedem Band entspricht, wobei das Hintergrundrauschen weggelassen wird. Nachdem alle Gipfel von jeder Spur geschlossen wurden, wählen Sie das Stabwerkzeug und klicken Sie in jede Spitze. Für jeden hervorgehobenen Peak sollten die Messungen im angezeigten Fenster Ergebnisse angezeigt werden.
- Summieren Sie die Intensität aus allen 3 Bändern für jede Probe und berechnen Sie den Prozentsatz für jede Isoform relativ zur Gesamtmenge.
- Zeichnen Sie die Prozentsätze jeder Isoform oder die Unterschiede im Prozentsatz im Verhältnis zu unbehandelten Proben auf.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Summe von drei E1A-Varianten gleich 100% sein muss.
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Representative Results
Ein 5'-Spleißstellen-Assay mit E1A-Minigen wurde durchgeführt, um Veränderungen des Spleißprofils in Zellen nach Chemotherapie-Exposition zu bewerten. Die Rolle von Nek4 - Isoform 1 bei der AS-Regulation in HEK293-stabilen Zellen nach Paclitaxel- oder Cisplatin-Behandlung wurde untersucht.
Die adenovirale E1A-Region ist aufgrund der Verwendung verschiedener Spleißspender für die Produktion von drei Haupt-mRNAs aus einem RNA-Vorläufer verantwortlich. Sie teilen sich gemeinsame 5' und 3' Termini, unterscheiden sich aber in der Größe ihrer ausgeschnittenen Introns. Adenovirale E1A mRNAs werden nach ihren Sedimentationskoeffizienten 13S, 12S und 9S benannt. In der frühen Phase der Adenovirus-Infektion (ca. 7 h) werden Proteine produziert, die für die Vorbereitung der infizierten Zelle auf die virale DNA-Replikation wichtig sind (13S - 723 aa und 12S - 586 aa) und in der späten Phase (ca. 18 h) wird neben diesen ein kleines Protein (9S -249 aa) produziert20. Unter Verwendung eines Plasmids, das das Minigen aus E1A enthält, kann die Wirkung auf das alternative Spleißen in Zellen nach der Transfektion beobachtet werden, wobei der Anteil an mRNA aus jeder produzierten Isoform bewertet wird: 13S: 631 bp, 12S: 493 bp und 9S 156 bp (Abbildung 1A und B).
Die basale Expression von E1A-Isoformen-Varianten hängt von der Zelllinie und dem Zeitpunkt der E1A-Expression ab. Es wurde beobachtet, dass HEK293-stabile Zelllinie (HEK293-Flag) oder HEK293-Rekombinationsstelle (HEK293-FRT - die ursprüngliche Zelllinie) eine höhere Expression von 13S im Vergleich zu HeLa-Zellen (HeLa-PLKO) aufwies, die nach 48 h E1A-Expression ähnliche Konzentrationen von 13S- und 12S-Isoformen aufwiesen (Abbildung 1C und D).
Das hohe Niveau der 13S-Expression, das in stabilen HEK293-Zellen beobachtet wurde, ist unter kürzeren Zeiten der E1A-Expression (etwa 30 h) erheblich verringert. Der Anteil (%) von 13S:12S:9S bei 30 h bzw. 48 h beträgt 60:33:7 bzw. 80:15:5 (nicht vertretene Daten). Aus diesem Grund ist es wichtig, das basale zelluläre Minigen E1A Spleißprofil vor Beginn der Experimente zu charakterisieren.
Zellen, die mit Cisplatin exponiert wurden, zeigten eine Verschiebung der 5'SS-Spleißselektion zugunsten der 12S-Expression (eine Zunahme von etwa 15% im Vergleich zu unbehandelten Zellen). Dieser Effekt wurde bei HEK293 beobachtet, das den leeren Flag-Vektor sowie die Isoform 1 von Nek4 stabil exprimieren. Wenn größere Veränderungen im Prozentsatz des Ausdrucks beobachtet werden, stellt ein Diagramm mit Prozentsätzen die Ergebnisse deutlich dar (Abbildung 2).
Beim Vergleich von zwei Bedingungen (Flag und Nek4-Überexpression), die auf eine Behandlung ansprechen, ist der beste Weg, die Daten darzustellen, in der Regel die Darstellung der Unterschiede in einem Diagramm, da das basale Expressionsniveau unterschiedlich sein kann und die Prozentsätze nicht die tatsächliche Wirkung der Behandlung widerspiegeln. Dies ist in Abbildung 3 zu beobachten. Veränderungen der AS nach der Paclitaxel-Behandlung waren sehr diskret, aber die Richtungen der Veränderungen waren in Flag- und Nek4-exprimierenden Zellen das Gegenteil.
Trotz kleiner Veränderungen nach der Behandlung waren die Ergebnisse konsistent, was darauf hindeutet, dass die Paclitaxel-Behandlung zu einer Abnahme der 13S-Isoform führt, mit einer Zunahme von 12S und 9S in Flag-exprimierenden Zellen, während auf der anderen Seite bei Nek4-exprimierenden Zellen der gegenteilige Effekt beobachtet wird.
Abbildung 1: Das Spleißmuster von Minigene E1A hängt von der Zelllinie ab. A) Schematische Darstellung von Minigen E1A Spleißstellen. Die Pfeile zeigen den Primerglühbereich für die Minigen-E1A-Isoformenverstärkung an. B)Isoformen, die durch alternatives Spleißen des Minigens E1A erzeugt werden. C)HEK293 stabil exprimierender Flag empty vector (HEK293 -Flag), HeLa transfiziert mit PLKO Vector (HeLa - PLKO) oder HEK293 recombinase-haltige Stellen (aus dem HEK293 stabil exprimierendes Flag oder Nek4.1 erzeugt wurden - HEK293-FRT) wurden mit pMTE1A-Plasmid transfiziert. 48h nach der Transfektion wurde die Gesamt-RNA isoliert und E1A-Isoformen in Agarosegel(D)getrennt. Grafik zum Vergleich des Prozentsatzes der 13S-, 12S- und 9S-Isoform in HEK293-Flag- und HeLa-PLKO-Zellen unter basalen Bedingungen. Daten aus drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wirkung der Cisplatin-Behandlung im Minigen E1A-Spleißmuster. HEK293 stabil exprimierender Flag leerer Vektor (Flag) oder Nek4.1 Flag Tag verschmolzen, wurden mit pMTE1A Plasmid transfiziert. Sechs Stunden nach der Transfektion wurde Tetracyclin zur Proteinexpressionsinduktion hinzugefügt. 24 h bis 48 h wurde das Zellkulturmedium durch ein Medium ersetzt, das 30 μM Cisplatin enthielt. Nach 24 Stunden Inkubation wurde die Gesamt-RNA extrahiert und die Produkte der PCR wurden mit 3% Agarosegel getrennt. A)Vorherrschende Minigen E1A Isoformen werden dargestellt. Die Graphen B-D stellen den Prozentsatz jeder Isoform relativ zur Summe von drei Varianten (13S, 12S und 9S) dar. In Ewird die Differenz im Prozent des Ausdrucks zu jeder Isoform relativ zur Fahrzeugsteuerung (medium) dargestellt. Graphen werden als Mittelwert und REM von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. * s< 0,05, ** s<0,01 im ungepaarten t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Wirkung der Paclitaxel-Behandlung im Minigen E1A-Spleißmuster. HEK293 stabil exprimierender Flag empty vector (Flag) oder Nek4.1 Flag verschmolzen, wurden mit pMTE1A Plasmid transfiziert. Sechs Stunden nach der Transfektion wurde Tetracyclin zur Proteinexpressionsinduktion hinzugefügt. 24 h bis 48 h wurde das Zellkulturmedium durch ein Medium ersetzt, das 1 μM Paclitaxel oder Ethanol (0,02%) enthielt und als Fahrzeugkontrolle verwendet wurde. Nach 24 Stunden Inkubation wurde die Gesamt-RNA extrahiert und die Produkte der PCR wurden mit 3% Agarosegel getrennt. A) Vorherrschende Isoformen werden dargestellt. Die Graphen B-D stellen den Prozentsatz jeder Isoform relativ zur Summe von drei Varianten (13S, 12S und 9S) dar. In Ewird die Differenz im Prozentualen der Expression zu jeder Isoform relativ zur Fahrzeugsteuerung (Ethanol) dargestellt. Graphen werden als Mittelwert und REM von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. * S< 0,05 im ungepaarten t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Minigenes sind wichtige Werkzeuge, um die Auswirkungen beim globalen alternativen Spleißen in vivo zu bestimmen. Das adenovirale Minigen E1A wird seit Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt, um die Rolle von Proteinen zu bewerten, indem die Menge dieser in der Zelle erhöht wird13,14. Hier schlagen wir das Minigen E1A zur Bewertung des alternativen Spleißens nach chemotherapeutischer Exposition vor. Es wurde eine stabile Zelllinie verwendet, die die Nek4-Isoform 1 exprimiert, um die Artefakte der Überexpression zu vermeiden, die durch transiente Transfektion verursacht werden. Die Isoform 1 von Nek4 zeigte keine Wirkung im Minigen E1A alternatives Spleißen unter basalenBedingungen 21,hat aber viele spleißbezogene Interaktoren, so dass wir die spezifische Wirkung der chemotherapeutischen Behandlung beim alternativen Spleißen von E1A in diesen Zellen bewerten können.
Trotz seiner geringen Empfindlichkeit, vor allem im Vergleich zu radioaktiven Ansätzen, ist das hier beschriebene Verfahren einfach und erfordert keine speziellen Reagenzien oder Laborbedingungen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Minigen E1A ein globaler Reporter von 5'SS-Selektionen ist, obwohl die 3'SS-Auswahl mit diesem Protokoll ausgewertet werden kann, muss der spezifische Minigene-Reporter verwendet werden14,33,34. Darüber hinaus können die Ergebnisse durch die Zelllinie beeinflusst werden und sollten sorgfältig ausgewertet werden, um Fehlinterpretationen aufgrund des basalen alternativen Spleißprofils zu vermeiden.
Normalerweise werden große Unterschiede im Minigen E1A-Spleißmuster nur beobachtet, wenn die Expression von Spleißfaktoren geändert wird. Andere Veränderungen sind aufgrund der großen Anzahl von Proteinen, die die Aktivität dieser Faktoren modulieren, weniger offensichtlich. Aus diesem Grund sollte beim Studienbeginn für einen indirekten Kandidaten der klassische Ansatz bevorzugt werden, der auf steigenden Mengen dieses Kandidatenproteins basiert. Wenn ein Effekt beobachtet wird, können die Behandlungen durchgeführt werden, um zu untersuchen, ob die Regulation für einen bestimmten zellulären Reiz spezifisch sein kann.
Nach einem vorläufigen positiven Ergebnis kann die Standardisierung von Zeit und Arzneimittelkonzentration durchgeführt werden, um das Experiment zu optimieren.
Dieses einfache Protokoll ist ein vorläufiger Assay, ein Ausgangspunkt, der beantworten kann, ob das interessierende Protein eine Wirkung beim alternativen Spleißen zeigt und auch, wenn bereits eine Wirkung bei der alternativen Spleißregulation bekannt ist, die Studien auf den konsistenteren Weg lenken kann, auf dem das Protein eine Rolle bei der Regulierung des alternativen Spleißens in der Chemotherapie spielt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, durch Grant Temático 2017/03489-1 an JK und Stipendium an FLB 2018/05350-3) und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) für die Finanzierung dieser Forschung. Wir danken Dr. Adrian Krainer für die Bereitstellung des pMTE1A-Plasmids und Zerler und Kollegen für ihre Arbeit im E1A-Klonen. Wir danken auch Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti und Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller, die uns die Nutzung ihrer Laborräume und -geräte ermöglichen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software - FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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