Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.
Abstract
Epitheliale dysregulatie is een knooppunt voor een verscheidenheid aan menselijke aandoeningen en kwalen, waaronder chronische wondvorming, ontsteking en meer dan 80% van alle menselijke kankers. Als voeringsweefsel is het huidepitheel vaak onderhevig aan letsel en heeft het zich evolutionair aangepast door de cellulaire plasticiteit te verkrijgen die nodig is om beschadigd weefsel te herstellen. In de loop der jaren zijn verschillende inspanningen geleverd om epitheliale plasticiteit te bestuderen met behulp van in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen. Deze inspanningen zijn echter beperkt in hun vermogen om de verschillende fasen van epitheliale celplasticiteit samen te vatten. We beschrijven hier een protocol voor het genereren van 3D epidermale sferoïden en epidermale sferoïde-afgeleide cellen van primaire neonatale menselijke keratinocyten. Dit protocol schetst het vermogen van epidermale sferoïde culturen om functioneel verschillende stadia van keratinocyt generatieve plasticiteit te modelleren en toont aan dat epidermale sferoïde re-plating heterogene normale menselijke keratinocyten (NHKc) culturen kan verrijken voor integrinα6hi/EGFRlo keratinocyt subpopulaties met verbeterde stamachtige kenmerken. Ons rapport beschrijft de ontwikkeling en het onderhoud van een systeem met hoge doorvoer voor de studie van de plasticiteit van keratinocyt en epidermale regeneratie van de huid.
Introduction
Het zoogdier gelaagde epitheel is de meest complexe epitheelarchitectuur in alle levende systemen en is meestal onderhevig aan schade en letsel. Als beschermend weefsel is gelaagd epitheel geëvolueerd om een complexe en effectieve weefselschaderespons te genereren. Bij letsel moeten deze cellen afstammingsplasticiteitsprogramma's activeren, waarmee ze naar de gewonde plaats kunnen migreren en reparatie1,2,3kunnen uitvoeren. Deze veelzijdige reactie vindt plaats in verschillende opeenvolgende stappen die slecht begrepen blijven.
Een belangrijk obstakel bij het bestuderen van het ingewikkelde proces van epitheliale regeneratie ligt in het gebrek aan modelsystemen met hoge doorvoer die dynamische cellulaire activiteiten kunnen vastleggen in gedefinieerde stadia van celregeneratie. Hoewel in vivo muismodellen relevant inzicht bieden in wondgenezing en het menselijk regeneratieve proces het meest nauwkeurig samenvatten, vereist hun ontwikkeling moeizame inspanningen en aanzienlijke kosten, waardoor hun doorvoercapaciteit wordt beperkt. Er bestaat daarom een kritieke behoefte aan het opzetten van systemen die functioneel onderzoek van menselijke epitheliale weefselregeneratie op hoge doorvoerschaal mogelijk maken.
In de afgelopen jaren zijn verschillende pogingen gedaan om de schaalbaarheidsuitdaging aan te gaan. Dit wordt gezien door een grote uitbreiding van innovatieve in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen die de in vivo regeneratieve context nauw nabootsen. Dit omvat vooruitgang in organ-on-chip4, sferoïde5, organoïde6en organotypische culturen7. Deze 3D-celgebaseerde systemen bieden elk unieke voordelen en bieden verschillende experimentele beperkingen. Tot op heden blijft sferoïde cultuur het meest kosteneffectieve en meest gebruikte 3D-celcultuurmodel. En hoewel verschillende rapporten hebben aangegeven dat sferoïde culturen kunnen worden gebruikt om huidstamcelkenmerken te bestuderen, zijn deze studies grotendeels uitgevoerd met dierlijk weefsel8,9, of met huidfibroblasten10, met vrijwel geen rapporten die de regeneratieve eigenschappen van menselijke epidermale sferoïdeculturen grondig karakteriseren. In dit protocol beschrijven we de functionele ontwikkeling, cultuur en het onderhoud van epidermale sferoïde culturen van normale menselijke keratinocyten (NHKc). We beschrijven ook het nut van dit systeem om de sequentiële fasen van epidermale regeneratie en keratinocytstamcelplasticiteit in vitro te modelleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor het verzamelen en hanteren van huidmonsters en isolatie van menselijke keratinocyten is herzien door de IRB van de Universiteit van South Carolina (UofSC) en geclassificeerd als "onderzoek waarbij geen menselijke proefpersonen betrokken waren", omdat de voorhuidmonsters chirurgische teruggooi waren die werden geproduceerd tijdens routinechirurgische procedures (besnijdenis van pasgeboren jongens) en volledig verstoken waren van identificerende informatie. Het protocol werd ook regelmatig herzien en goedgekeurd door het UofSC Biosafety Committee en al het laboratoriumpersoneel onderging een opleiding in laboratoriumbioveiligheid. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de veiligheids- en ethische normen van UofSC.
1. Isolatie en kweek van menselijke keratinocyten uit neonatale voorhuidweefsel
- Bereid het wasmedium voor door 0,1 M HEPES-buffer toe te voegen aan 500 ml KSFM-medium en stel het in op een pH van 7,2. Steriliseer medium in een vacuümfilter van 500 ml (poriegrootte van 0,22 μm). MCDB 153-LB basaal medium kan ook worden gebruikt als alternatieve wasoplossing in plaats van KSFM.
- Was in een laminaire stromingskap neonatale voorhuid met 5 ml wasmedia in een conische buis van 50 ml. Herhaal dit twee keer.
- Breng gewassen voorhuid over op een steriele petrischaal. Schraap met behulp van een scalpel en tang vet en losse bindweefsels van de huidlaag af. Spoel de voorhuid opnieuw met 5 ml wasmedia in een conische buis van 50 ml.
- Plaats de voorhuid epidermis naar boven in een 6-put plaat met 2 ml dispase enzym verdund in wasmedia (50 U/ml).
- Breng de plaat gedurende 4 uur over in een incubator (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).
- Verwijder de voorhuid uit de incubator en breng deze onder steriele omstandigheden over in een petrischaal. Scheid met behulp van een fijnpuntige tang de opperhuid van de dermislaag.
- Plaats epidermis in een conische buis van 15 ml met 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA. Verpletter met behulp van een serologische pipet van 5 ml de drijvende epidermis mechanisch. Incubeer gedurende 15 min bij 37 °C met periodieke vortexing gedurende 5 s om de 5 min.
- Voeg na incubatie 2 ml soja trypsineremmer toe en meng door pipetten om de trypsine te neutraliseren.
- Centrifugeer celsuspensie gedurende 2 min bij 450 x gen vervolgens gedurende 8 min bij 250 x g.
- Verwijder drijvend vuil met een tang en zorg ervoor dat u de celkorrel niet loslaat. Aspireer voorzichtig supernatant uit de celkorrel.
- Resuspend pellet in 12 ml compleet KSFM-scm medium en plaat in een schaal van 10 cm. Incubeer de schotel 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).
- Verwijder het medium de volgende dag met een aspirerende pipet en vervang het door 12 ml complete KSFM-scm. Herhaal dit op dag 4 en 7.
- Om een optimale groei van normale menselijke keratinocyt (NHKc) culturen te behouden, passage cellen 1:5 op dag 10 om te voorkomen dat cellen bereiken meer dan 80% confluency.
2. Het genereren van huid epidermosfeer culturen in vitro
- Bereid een 5% agarosemengsel door 2,5 g agarose toe te voegen aan 50 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), in een glazen fles van 50 ml. Autoclaaffles onder vloeibare cyclus. Laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Om borden te bereiden, plaatst u de gekoelde glazen fles met agarose-oplossing in een plastic bekerglas van 1 L gevuld met 200 ml gedeïoniseerd water (dH2O). Smelt het agarosemengsel gedurende maximaal 2 minuten in een magnetron van onderzoekskwaliteit en meng de agar om de 60 s door de fles voorzichtig van links naar rechts te kantelen.
LET OP: Het smelten van agar in de magnetron zorgt ervoor dat de kolfcontainer extreem heet wordt, wat resulteert in drukopbouw. Laat drukopbouw om de 30 s los. Draag geschikte beschermingsmiddelen om letsel te voorkomen. - Voeg 3 ml gesmolten 5% agarose toe aan 12 ml KSFM-scm voorverwarmd tot 42 °C voor een eindconcentratie van 1% agarose (wt/vol).
Optioneel: verwarm de serologische pipetten en pipettips voor om voortijdige polymerisatie van de zachte agar te voorkomen. - Pipetteer snel 200 μL van de 1% agarmix in individuele putten van een 96-put ronde bodemplaat met behulp van een meerkanaals pipettor (figuur 1A). Laat de plaat 4 uur in een steriele omgeving bij 25 °C staan om agarose volledig te laten polymeriseren.
OPMERKING: Het experimenteren kan hier worden gestopt en de volgende dag worden voortgezet. Gepolymeriseerde agaroseplaten kunnen tot 24 uur op 37 °C of tot 4 °C worden gehouden wanneer ze worden afgedicht met parafilmfolie. Warme plaat tot 37 °C in een bevochtigde incubator gedurende ten minste 1 uur voor gebruik. - Passage sferoïdevormende NHKc door aspirerende media en wascellen in 2 ml PBS. Aspireer PBS en voeg 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA toe aan gewassen cellen. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C of totdat alle cellen volledig loskomen. Voeg 2 ml soja trypsine remmer toe aan de plaat en spoel cellen van de plaat af in een buis van 15 ml. Centrifugeer op 250 x g gedurende 5 min.
- Resuspend pellet in 1 mL of PBS. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met behulp van trypan blauwe kleuring en een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.
- Aliquot 2 x 104 NHKc in 100 μL KSFM-scm en zaad in individuele putten van eerder bereide 96-wells ronde bodemplaat. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).
- Met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop, analyseert u goed gezaaid voor epidermosfeervorming.
OPMERKING: Menselijke epidermosfeeren van normale menselijke keratinocyten kunnen in 3D-suspensiecultuur tot 96 uur levensvatbaar blijven, zij het met een aanzienlijke afname van de levensvatbaarheid van cellen (figuur 2).
3. Epidermale sferoïde re-plating assay
- 24-48 uur na 3D epidermosfeervorming, voeg 4 ml voorverwarmde KSFM-scm toe aan een schaal van 6 cm. Gebruik een brede boor van 1 ml pipetpunt om een enkele sferoïde op de plaat over te brengen, zodat deze niet uit elkaar valt. U kunt ook een pipetpunt van 1 ml verbreden met een steriel scheermesje om de punt te snijden.
- Incubeer de plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).
- Analyseer gezaaide sferoïde voor bevestiging aan de bodem van de plaat en observeer voor het vermeerderen van cellen met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop (figuur 3). Voer cellen om de 96 uur door voorzichtig 2 ml van de media in de plaat te verwijderen en langzaam 2 ml verse KSFM-scm media aan de plaat toe te voegen.
- Passage spheroid-afgeleide (SD) NHKc zodra ze 70-80% samenvloeiing bereiken en doorgaan met het maken van een keuzetest. Monitor SD-NHKc regelmatig om te voorkomen dat cellen volledige samenvloeiing in cultuur bereiken, omdat dit resulteert in voortijdige differentiatie en celgroeistilstand (Figuur 3E-F).
- De epidermale sferoïde replating assay modellen keratinocyt-gemedieerde wondherstel door het vastleggen van elk van de belangrijkste opeenvolgende fasen van epidermale regeneratieve plasticiteit: a) homeostatisch onderhoud, b) differentiatie halt /omkering c) stress lineage mobiliteit, en d) weefselherstel (Figuur 1B; Tabel 2). Deze test kan ook worden gebruikt om celpopulaties voor organotypische vlotculturen te produceren of om HPV-gemedieerde neoplasie te modelleren, zoals aangetoond in ons vorige werk 11,12.
4.3D fluorescentiecel het volgen
- In een schaal van 6 cm, transfect sferoïde-vormende 2D monolayer NHKc culturen met 1 μg pMSCV-IRES-EGFP plasmide vector met het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP) gen. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid) microscoop(figuur 4A).
OPMERKING: Het is belangrijk dat transfectie wordt voltooid in serumvrije antibioticavrije omstandigheden. - Zonder transfectiemix te verwijderen, voegt u 2 ml voorverwarmde KSFM-scm toe aan cellen. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).
- Aspireer alle transfectiemedia uit plaat- en voedingscellen met 3 ml voorverwarmde KSFM-scm. Beoordeel op aanwezigheid van EGFP-uitdrukkende cellen onder het FITC-kanaal van een fluorescerende microscoop.
- Passage en zaad 2 x 104 EGFP-getransfecteerde cellen in individuele putten van een eerder bereide 96-put ronde bodemplaat. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid). Visualiseer en bewaak egfppos spheroid celbeweging onder het FITC-kanaal van een fluorescentiemicroscoop (figuur 4B-C).
- Voeg 24 uur na het plateren 3 ml voorverwarmde KSFM-scm toe aan een schaal van 6 cm. Gebruik een brede boor van 1 ml pipetpunt om een enkele sferoïde op de plaat over te brengen, zodat deze niet uit elkaar valt. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).
- Observeer en analyseer de voortplanting van SD-NHKcEGFP met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Voer cellen om de 96 uur door voorzichtig 2 ml de media in de plaat te verwijderen en langzaam 2 ml verse KSFM-scm media aan de plaat toe te voegen.
- Oogst SD-NHKCEGFP voor FACS-isolatie of keuzetesten.
5. Karakterisering van sferoïde-afgeleide (SD) subpopulaties door FACS
- Passage SD-NHKc en bijbehorende autologe 2D monolayer culturen door het aanzuigen van oude media en wascellen in 2 ml PBS. Verwijder PBS en voeg 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA toe aan gewassen cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat alle cellen volledig loskomen.
- Voeg 2 ml soja trypsine remmer toe aan de plaat en breng cellen over in een buis van 15 ml. Centrifugeer op 250 x g gedurende 5 min.
- Resuspend pellets in 1 mL of PBS. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met trypanblauw en een geautomatiseerde celteller van hemocytometer.
- Aliquot 100 μL met 0,1-4 x 106 NHKc-cellen tot 1,5 ml microcentrifugebuizen. Plaats de buis op ijs in een donkere omgeving, gecreëerd door felle lichten in de laminaire kap uit te schakelen.
- Voeg 2 μL FITC-geconjugeerde anti-integrinα6 en 2 μL PE-geconjugeerde anti-EGFR toe aan buizen om een verdunning van 1:50 te bereiken. Bereid een buis voor zonder toegevoegde antilichamen om te dienen als de niet-aangetaste controle. Incubeer buizen op ijs in het donker of bij 4 °C gedurende 30 minuten. Het gebruik van kralen of een huid SCC lijn kan dienen als positieve controle, als huid SCC cellen uitdrukken verhoogde niveaus van integrinα6 en EGFR.
- Voer flowcytometrieanalyse uit met behulp van flowcytometer naar keuze met geschikte lasers.
- Gebruik de negatieve en positieve bedieningselementen om poorten te maken. Sorteer de subpopulatie van integrinα6hi/EGFRlo cellen; dit is de epidermale stamcelfractie. Integrinα6hi/EGFRhi cellen zijn de proliferatieve voorloper celfractie. De integrinα6lo/EGFRhi cellen zijn de geëngageerde voorlopercelfractie (Figuur 4D). Sorteerbuis(en) moet(en) ten minste 1 ml ijskoude KSFM-scm bevatten.
- Test op proliferatieve capaciteit van gesorteerde celsubpopulaties door de inhoud van elke respectieve sorteerbuis over te brengen in een conische buis van 15 ml die 10x het volume gesorteerde cellen in PBS bevat. OPMERKING: Het is belangrijk om alle cellen die aan de rand zijn bevestigd te verwijderen door de wand van de sorteerbuis(en) meerdere keren te pipetten, omdat keratinocyten zich daar vaak kunnen hechten.
- Centrifugeer 15 ml buizen op 250 x g gedurende 5 min. Verwijder supernatant en resuspend pellet in 12 ml KSFM-scm. Breng de geresuspendeerde cellen over in een plaat van 6 cm en incubeer 's nachts (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid).
- Verwijder de volgende dag media in platen en voeg 8 ml voorverwarmde KSFM-scm toe. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid. Voer cellen met een medium van 12 ml om de 3 dagen opnieuw tot 70-80% samenvloeiing (figuur 4E).
6. Immunofluorescentie en kleuring van epidermosfeer voor basale stamcelmarkers
- Breng epidermosfeer over op coverslips bedekt met polylysine. Laat SD-NHKc zich voortplanten tot 75% samenvloeiing.
- Was de cellen tweemaal in PBS (4 °C) gedurende elk 5 minuten.
- Fix cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Permeabiliseer cellen met 0,5% Triton X-100 in 1% glycine. Blokkeer met 0,5% BSA en 5% geitenserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer monsters met antilichamen tegen P63 (1:200) en cytokeratine 14 (1:200) in blokkeeroplossing 's nachts bij 4 °C.
- Was driemaal met PBS (4 °C) met Tween 20 (PBST), gevolgd door incubatie met FITC-en Alexa 568-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:1000 verdunning).
- Vlekkernen met 4', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (1:5000 verdunning) vóór montage van cellen.
- Observeer cellen met behulp van een fluorescentie-compatibele microscoop met FITC- en PE-laserlijnen (figuur 4F).
7. Transcriptieanalyse van epidermosfeerculturen
- Het instellen van drievoudsplaten van NHKc-culturen met een lage passage om RNA te isoleren, kan afkomstig zijn van monolaag-, sferoïde- en sferoïde-afgeleide culturen uit dezelfde autologe cellijn.
- Pool 3-5 overeenkomstige epidermospheres in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Oogst afzonderlijk autologe SD-NHKc- en 2D-monolaagculturen.
- Isoleer het totale RNA van alle drie de groepen.
- Voer omgekeerde transcriptie uit met 1 μg totaal RNA.
- Voer met behulp van cDNA real-time PCR uit, met GAPDH als interne controle (Tabel 1).
- Valideer de productgrootte van amplicon door agarosegelelektroforese (2% v/v).
OPMERKING: Voor transcriptomische profilering van epidermosfeerculturen met behulp van microarrayanalyse van het hele genoom, isoleert u het totale RNA van massaculturen van één NHKc-donor en overeenkomstige SD-NHKc van dezelfde donor, in zes replica's elk. - Beoordeel de RNA-kwaliteit met behulp van een bioanalyzer om RNA Integrity Numbers (RIN) te bereiken, variërend van ten minste 9,0 tot 9,1.
- Voer microarray-experimenten uit door het totale RNA-monster te versterken en te biotinyleren.
- Transcriber 100 ng totaal RNA per monster in ds-cDNA met behulp van NNN random primers die een T7 RNA polymerase promotorsequentie bevatten.
- Voeg T7 RNA-polymerase toe aan cDNA-monsters om RNA te versterken en kopieer RNA naar ss-cDNA. Degradatie overtollige RNA met behulp van RNase H.
- Fragment sscDNA moleculen en label met biotine.
- Bemonstering van etiketten gedurende 16 uur bij 45 °C versterken.
- Hybridiseer monsters met behulp van een hybridisatieoven en een was- en vlekkenset.
- Was en bevlek gehybridiseerde arrays.
- Arrays scannen met behulp van een systeem- en computerwerkstation.
- Na voltooiing van arrayscans importeert u CEL-bestanden (Probe Cell Intensity) in expressieconsolesoftware en verwerkt u op genniveau met behulp van een bibliotheekbestand en het Robust Multichip Analysis (RMA)-algoritme om WKK-bestanden te genereren.
- Nadat u de gegevenskwaliteit in Expression Console hebt bevestigd, importeert u WKK-bestanden met log2-expressiesignalen voor elke sonde in een transcriptoomanalysesoftware om celtypespecifieke transcriptiereacties te analyseren met behulp van eenrichtingsanalyse tussen onderwerpen van variantie.
8. Beoordelen van SD-NHKc kolonievormende efficiëntie
- Aspireer media uit platen wanneer cellen 70-80% samenvloeiing bereiken. Was de cellen driemaal in PBS (4 °C) gedurende elk 5 minuten.
- Fix cellen met 3 ml 100% methanol (4 °C) gedurende 15 min. Was drie keer in PBS gedurende elk 5 minuten.
- Vlekcellen in 3 ml 10% Giemsa gedurende 30 min. Was drie keer in PBS gedurende elk 5 minuten. Laat cellen 's nachts aan de lucht drogen.
- Analyseer de kolonievorming de volgende dag en kwantificeer het aantal verkregen kolonies
9. Bepaal SD-NHKc populatie verdubbeling
- Passage SD-NHKc en bijbehorende autologe 2D monolayer culturen door het aanzuigen van oude media en wascellen in 2mL PBS. Verwijder PBS en voeg 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA toe aan gewassen cellen. Incubeer gedurende 5 minuten of totdat alle cellen volledig loskomen (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).
- Voeg 2 ml soja trypsine remmer toe aan de plaat en breng cellen over in een buis van 15 ml.
- Centrifugeer op 250 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en de resuspend pellet in 12 ml KSFM-scm.
- Zaadcellen met een lage dichtheid 1-2 x 104 NHKc in individuele gerechten van 10 cm en incuberen 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).
- Voerplaten met 8 ml KSMF-scm de volgende dag. Voer om de 4 dagen tot ten minste 25% samenvloeit en voer vervolgens om de 2 dagen.
- Serieel passage cellen 1:5 in 60 cm gerechten totdat celproliferatie capaciteit is uitgeput. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen door blauwe kleuring te proberen. Bepaal de populatieverdubbeling bij elke passage met behulp van de formule: log(N/N0) / log2, waarbij N het totale celnummer vertegenwoordigt dat bij elke passage is verkregen en N0 het aantal cellen vertegenwoordigt dat aan het begin van het experiment is geplateerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens de huidepdermosfeertest worden NHKc-culturen gezaaid in met agarose bedekte putten van een 96-putplaat (figuur 1A). Sferoïdevormende cellen moeten zichzelf binnen 48 uur aggregeren. Autonome sferoïde vorming kan al na 24 uur worden beoordeeld met behulp van een standaard omgekeerde fasecontrastmicroscoop. huid epidermosfeer vorming en re-plating assay model verschillende fasen van epidermale weefsel regeneratie (Figuur 1B). Figuur 2 toont afbeeldingen met hoge resolutie van verschillende NHKc-stammen die zijn onderzocht op epidermale sferoïde vormingscapaciteit in 3D-cultuur. Het is belangrijk om de cellen te onderzoeken op dichte bolvormige aggregatie, omdat dit een kenmerk is van spontane bolvormige vorming. We vonden het nodig om meer dan 2 x 104 cellen te gebruiken om een goede spontane aggregatie te garanderen. Niet-bolvormige celaggregatie, zoals gezien in stammen figuur 2A, wordt niet beschouwd als adequate epidermosfeervorming. Plating niet-sferoïde vormende celsuspensingen terug in 2D monolayer cultuur resulteert zelden in levensvatbare NHKc celgroei. Het plateren van epidermosfeer in 2D-cultuur resulteert echter in de proliferatie van kleine levensvatbare NHKc (figuur 3). Beelden van epidermospheres en SD-NHKc kunnen worden bekeken en gecontroleerd met behulp van een standaard omgekeerde fasecontrastmicroscoop. Het is belangrijk om deze culturen onder de 100% samenvloeiing te houden, omdat dit hun groei en stamceltoestand in cultuur aanzienlijk kan belemmeren (figuur 3E-F). Het proces van epidermale sferoïdevorming kan functioneel worden gevolgd op het niveau van één cel door cellen te transfecteren met een fluorescerende verslaggever (figuur 4A-C). Onder optimale omstandigheden zijn keratinocytsubpopulatie voornamelijk verrijkt in SD-NHKc-culturen Integrinα6hi/EGFRlo-cellen. Deze cellen vormen over het algemeen ongeveer 25% van alle SD-NHKc-culturen en kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd door FACS (Figuur 4D). Het is echter belangrijk om voorste zijstrooigebied (FSC-A) en zijstrooigebied (SSC-A) poorten in te stellen om doubletten uit te sluiten (figuur 4D). Verdere karakterisering van deze stamachtige keratinocytsubpopulatie kan worden bereikt door immunofluorescente kleuringsanalyse van epidermale stamcelmarkerexpressie, zoals basaalcytokeratine 14 (K14) en tumoreiwit 63 (P63) (figuur 4F; Tabel 2).
Figuur 1: Teelt van NHKc-epidermosfeer in 3D-suspensie. (A) Schematische weergave van de epidermale sferoïde replating-assay aangepast van 11. (B) Representatieve fasecontrastbeelden van NHKc-culturen, epidermale sferoïden en SD-NHKc bij elke opeenvolgende stap van de epidermale sferoïde re-plating-test. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beoordeling van de groei vande epidermosfeer van de huid. (A) Afbeeldingen van zes individuele sferoïde niet-vormende en (B) sferoïdevormende NHKc-stammen in zwevende 3D-suspensie. (C) Epidermosfeer verkregen met behulp van verschillende hoeveelheden NHKc. (D) Kwantificering van de gemiddelde epidermosfeergrootte verkregen met behulp van verschillende hoeveelheden NHKc in drijvende 3D-suspensiecultuur. Balken geven standaarddeviatie aan. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Groeiende sferoïde-afgeleide culturen. (A) Tijdsverloop fasecontrast beeldvorming van SD-NHKc monolayer culturen die zich voortplanten uit een bijgevoegde epidermosfeer 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h en (D) 96 h na herplating in 2D plastic cultuur. (E) SD-NHKc-culturen bij respectievelijk 80% samenvloeiing en (F) 100% samenvloeiing 15 en 20 dagen na replating in 2D-plasticcultuur. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van sferoïde-afgeleide (SD) subpopulaties. (A) Schematische weergave van 3D-celtrackingtest van epidermosfeer in vitro zoals beschreven in Woappi et al. 202012. B) EGFP-uitdrukkende epidermosfeerën 2 uur en (C) 24 uur na zaaien in 3D-cultuur. (D) Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) van SD-NHKc subpopulaties. Ongeveer 1/4e van alle cellen moet integrinα6hi/EGFRlo zijn. (E) Integrinα6hi/EGFRlo subpopulaties produceren keratinocyt holoclonen. (F) Immunofluorescente kleuringsanalyse van basale epitheliale stamcelmarkerexpressie in Integrinα6hi/EGFRlo-cellen . Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primer sequentie (5'-3') | ||
| Gennaam | Voorwaartse primer | Omgekeerde primer |
| ALDH1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| EGFR | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | ATGAGGACATAACCAGCCACC |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-Actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC | CAGGCATGGCACGGATAAC |
Tabel 1. Schetst PCR primersequenties die worden gebruikt voor de detectie van geselecteerde genen die betrokken zijn bij neonatale keratinocytplasticiteit.
| Cultuur Conditie | Fasecontrastweergave | Immunostaining | FACS-analyse | Transcriptomische handtekening | |
| Homeostatisch onderhoud | 2D monolaag | Kleine cellen < 30 μm | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Epidermale onderhoudsbeurt (K14, P63, IVL, K10) |
| Differentiatie halt/omkering | 3D sferoïde | Compacte meercellige aggregaat > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | N.V.T | De-differentiatie: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Stress afstamming mobiliteit | 3D-naar-2D sferoïde bevestiging | Verspreiden van kleine cellen (< 20 μm) vanaf de bolvormige rand | K14, P63, Ki-67 | ITGα6hallo/EGFPmed | Proliferatie van huidcellen: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Weefselherstel | 3D-naar-2D sferoïde monolaag | Vermeerdering van kleine cellen < 20 μm | K14, P63, IVL | ITGα6hi/EGFPlo en ITGα6hi/EGFPhi | Vorming van epidermis: K14, IVL, FLG |
Tabel 2. Strategieën voor fenotypische en moleculaire karakterisering van de epidermale sferoïde replating assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van 3D-sferoïde kweeksystemen heeft een breed nut gehad bij het beoordelen van celstamheid. Het is aangetoond dat deze systemen de verrijking van weefselstamcellenverbeteren 13, maar hun nut voor de studie van menselijke epidermale stamcellen is beperkt onderzocht. Hier beschrijven we een strategie voor het verrijken van menselijke keratinocytstamcellen met behulp van 3D-cultuurtechnieken. In dit systeem worden NHKc gekweekt als zelfassemblage multicellulaire sferoïde suspensuspensen, bestaande uit verschillende keratinocytsubtypes die bovenop agarosebedden met KSFM-scm zijn opgehangen. De opstelling voor dit protocol is tijdgevoelig omdat agar snel polymeriseert bij kamertemperatuur. Het voorverwarmen van serologische pipetten, micropipettips en de agar/cel mengbuis, evenals de media tot 42 °C, kan voortijdige polymerisatie drastisch verminderen. We merkten op dat het plaatsen van de 96-putplaat in 4 °C kort na het toevoegen van agar/mediamix aan putten de polymerisatie aanzienlijk kan versnellen en ervoor kan zorgen dat het agarkussen voldoende stevig is voor het later zaaien van cellen. Het is belangrijk om het plaat)-niveau te allen tijde tijdens het polymerisatieproces te handhaven, omdat slechte polymerisatie van de agar / mediamix ertoe zal leiden dat cellen in de zachte agar zaaien of groeien, waardoor de test ongeldig wordt.
Ook beschreven in dit protocol, presenteren we een strategie voor het vermeerderen van epidermospheres in 2D monolayer cultuur om stam-achtige sferoïde-afgeleide cellen te genereren. De epidermale sferoïde re-plating assay verrijkt voor een stamcel-achtige subpopulatie van integrinα6hi/EGFRlo keratinocyten. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor de studie van epidermale reconstructie, psoriasis of cellulaire neoplasie11,12,14. Integrinα6hi/EGFRlo keratinocyten kunnen ook gemakkelijk worden geïsoleerd door FACS en worden gekenmerkt door immunofluorescente kleuring. Bij het uitvoeren van dergelijke experimenten vonden we het nuttig om ongesorteerde autologe 2D-monolaagcellen als besturingselementen te gebruiken., skin SCC-cellijnen zijn een goed alternatief als deze niet beschikbaar zijn.
Samengevat toont dit rapport aan dat menselijke epidermale sferoïde replating modellen keratinocyt regeneratieve plasticiteit in vitro,omdat het elk van de vier fasen van regeneratie vastlegt: homeostatisch onderhoud, differentiatieomkering, mobiliteit van stresslijn en weefselherstel. Een beperking van agar-gebaseerde sferoïde zelfassemblage is echter dat niet alle NHKc-vlekken in staat zijn om spontaan sferoïden te vormen. De ophangingsmethode15 is een goede alternatieve strategie om deze uitdaging te overwinnen en multicellulaire sferoïdevorming te forceren. Deze test kan ook worden gemul veelvoudig met spier-, stromale of immuuncellen om meer inzicht te krijgen in de bijdrage van verschillende celpopulaties aan epidermale regeneratie. het zou interessant zijn om te onderzoeken of toevoeging van Matrigel aan de agar de overleving en potentie van de epidermosfeer kan verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële relaties om openbaar te maken.
Acknowledgments
De UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) bood toegang tot beeldvormings- en celsorteerapparatuur en technische bijstand. Dit werk werd mede ondersteund door subsidie 1R21CA201853. De MCF en de IRF ontvangen gedeeltelijke steun van NIH-subsidie P20GM103499, SC INBRE. Het MCF ontvangt ook steun van NIH-subsidie P20GM109091. Yvon Woappi werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-06A1 (PREP) en R25GM076277 (IMSD), en door een Fellowship door het Grace Jordan McFadden Professors Program aan UofSC. Geraldine Ezeka en Justin Vercellino werden ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-10A1 (PREP) bij UofSC. Sean M. Bloos werd ondersteund door de Magellan Scholar Award 2016 bij UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
